本發(fā)明屬于生物保鮮材料領域，具體涉及一種制備收集納米銀的生態(tài)方法。

背景技術：

納米銀(AgNPs)是以納米技術為基礎研制而成的新型抗菌產(chǎn)品，比銀離子具有更穩(wěn)定的物理化學特性，由于小尺寸效應、量子效應和具有極大的比表面積，因而具有傳統(tǒng)無機抗菌劑無法比擬的抗菌效果，且效力持久、安全性高，不易產(chǎn)生耐藥性，可用以解決食品工業(yè)中普遍存在的保鮮防腐問題，其廣闊的應用前景已經(jīng)引起了人們廣泛的重視。

AgNPs制備方法多種多樣，主要有物理法、化學法和生物法三大類。物理或化學還原法制備的AgNPs純度較高，目前在商業(yè)性規(guī)模生產(chǎn)中大多采用這些方法，但制備過程中需要添加多種穩(wěn)定劑和分散劑以形成納米銀的“殼核”結(jié)構(gòu)，在一定程度上對人體和環(huán)境都有危害，因此限制了AgNPs在醫(yī)學、食品等領域的應用。與傳統(tǒng)的物理化學方法相比，采用生物材料體系合成納米微粒，具有很多優(yōu)點，如操作簡單、反應溫和、不需要添加其他還原劑和表面活性劑、且不產(chǎn)生有毒性副產(chǎn)物等，因此，發(fā)展安全、綠色、經(jīng)濟的生物法制備AgNPs具有很大的研究價值，是實現(xiàn)生態(tài)友好及安全可靠目標的一種良好途徑。生物法中有一類方法為微生物還原法，微生物法一般還原速率較慢，反應時間長，通常要數(shù)天(張杰，張映，郭瑞，張琦，楊洪一，王濱松.鉤狀木霉生物合成納米銀及其殺菌性能[J].微生物學通報，2016,43(2)：386-393。)，生產(chǎn)效率較低，不利于工業(yè)過程的開發(fā)，而且微生物的培養(yǎng)和收集也較為麻煩。

利用植物生物質(zhì)是另外一種制備納米金屬粒子的不錯選擇。有一些利用其他植物提取物制備AgNPs的報道，如綠茶、楊梅、芒果葉、番石榴葉、紫蘇葉、辣椒等，但有一些缺點，如需要在反應體系中加入十二烷基硫酸鈉做為表面活性劑(王迎春，陳慧英，藍蓉.綠茶提取物制備納米銀[J].環(huán)境科學與技術，2013，36(12)：122-125)，另外植物中具有合成AgNPs作用的生物分子一般是黃酮類、萜類、還原糖、生物堿類等還原性物質(zhì)進行非酶促反應，植物復雜組分也使得制備組裝的納米粒子表面不潔凈(陸瑤，郭清泉，郭秋蘭，曾金華.植物生物質(zhì)合成金納米粒子的研究進展，現(xiàn)代化工，2013,33(8)：36-41)。

本發(fā)明在前期試驗中用數(shù)十種植物勻漿濾液進行AgNPs的制備，包括百合、馬齒莧、蘆蒿、芥藍、圓白菜、圓青椒、山藥、洋蔥、苦菊、冰草、青菜、西蘭花、魚腥草、草莓、檸檬、蘋果、空心菜、綠茶、藍莓葉、黑莓葉、銀杏葉、小麥苗、萵苣葉、甘薯葉，另外還有沒食子酸、茶多酚、葡萄糖等分析純試劑作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)魚腥草制備AgNPs的反應速度較快，產(chǎn)物抗菌活性高，目前還沒有關于用魚腥草提取物制備AgNPs的報道，因此選用純化的魚腥草提取物作為還原試劑制備AgNPs，同時進一步對魚腥草汁進行分離純化，采用相對純凈的組分進行AgNPs的制備，使得制備出的AgNPs粒徑、形貌均一，表面潔凈。

另外，制備好的納米粒子一般為溶膠體系，由于納米顆粒尺寸小，收集溶膠中的AgNPs需要12000rpm以上的高速離心，給大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)造成困難，而如果不離心富集，直接冷凍干燥，又會造成能耗高的缺點。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過采用一株具有吸附功能的專利菌株，將制備好的AgNPs直接吸附到菌體表面，再通過簡單的過濾或低速離心就可以收集AgNPs，實現(xiàn)安全、綠色、節(jié)能生產(chǎn)，有著廣闊的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是，提供一種制備收集納米銀的生態(tài)方法，以克服現(xiàn)有技術中存在的不足。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案：

1、一種制備收集納米銀的生態(tài)方法，包括如下步驟：

(1)將魚腥草洗凈，加水打漿，固液分離后取上清，得到魚腥草汁；

(2)將步驟(1)得到的魚腥草汁中加入硫酸銨粉末至終濃度為48～52％飽和度，進行沉淀，保留上清；

(3)向步驟(2)得到的上清中加入硫酸銨粉末至終濃度為78～82％飽和度，進行沉淀，保留沉淀；

(4)以水溶解步驟(3)中得到的沉淀，離心并以濾膜過濾，得到魚腥草粗提取物溶液；

(5)將步驟(4)中得到的粗提物，過凝膠色譜柱純化得到魚腥草提取物純化組分；

(6)在步驟(5)中得到的魚腥草提取物純化組分中加入AgNO₃水溶液，室溫靜置，得到納米銀溶膠；

(7)將真菌菌株接種培養(yǎng)，收集并洗滌菌體；

(8)將步驟(6)得到的納米銀溶膠和步驟(7)得到的菌體混合，靜置；

(9)收集步驟(8)中的吸附有納米銀粒子的菌體。

步驟(1)中，所述的魚腥草為市售用于食用的新鮮魚腥草，切成5～10cm長，利于打漿；所述加水體積與魚腥草重量的比為1～1.5mL/g。所述水可以為自來水，蒸餾水，去離子水等，所述打漿可以使用家用或工業(yè)用打漿機或者攪拌器。所述固液分離方法可以是過濾或離心。

步驟(2)或步驟(3)中，硫酸銨粉末在50～60rpm攪拌速率、冰水浴條件下加入。

步驟(4)中，所述離心的條件為10000～11000rpm、4℃下，離心10～15min，所述濾膜孔徑為0.45或0.22μm。溶解沉淀使用的水體積沒有特別要求，能夠完全溶解沉淀即可，優(yōu)選的，使用的體積為能溶解沉淀的最小體積。

步驟(5)中，所述過凝膠色譜柱純化的條件為：凝膠柱填料sephdex G25，有效分子量為1000-5000Da，洗脫流動相為水，用量8～10柱體積，流速為0.10～0.12BV/min。

步驟(6)中，所述的AgNO₃水溶液，其終濃度為0.9～1.1mM，優(yōu)選為1mM，所述室溫靜置條件為：自然光照，放置時間4～5h；所述AgNO₃溶液，可事先配制，濃度可為10～100mM，按一定比例與步驟(5)中的魚腥草提取物純化組分混合。

步驟(7)中，所述的真菌菌株為半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1，CGMCC No.11127，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2015年7月31日，保藏信息見專利文件CN 105087280 A。

步驟(7)中，所述的真菌通過如下步驟獲得：

(A)真菌培養(yǎng)：將斜面保存的半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1接種到Y(jié)PD培養(yǎng)液中，100～120rpm、25～28℃，培養(yǎng)2～3天，得到發(fā)酵液；

(B)收集菌體：將步驟(A)得到的發(fā)酵液，4層醫(yī)用紗布過濾分離菌體，菌體用去離子水洗滌至濾過液無顏色，或者發(fā)酵液以2500～3000rpm離心10～12min，棄去上清，去離子水懸浮菌體沉淀至上清無顏色，收集濕菌體。

步驟(8)中，所述的納米銀溶膠和菌體混合吸附條件為：以納米銀溶膠溶液懸浮菌體混勻，至菌體密度1～5×106孢子/ml，25～28℃靜置2～3h。

步驟(9)中，所述的收集吸附物條件為：2500～3000rpm，優(yōu)選2500rpm，離心10～15min，優(yōu)選10min，所得沉淀即為吸附有納米銀粒子的菌體。

有益效果：納米銀具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物活性，目前在很多領域都有廣泛應用，納米銀的制備方法很多。物理法簡單，所得產(chǎn)品雜質(zhì)少，但是對儀器設備要求較高，生產(chǎn)費用昂貴。化學法則需要使用各種還原劑、絡合劑、保護劑等來控制粒子尺寸、形貌及穩(wěn)定性，容易造成化學試劑的殘留。本發(fā)明采用的生物制備及吸附收集法操作簡單，經(jīng)濟可行，既不需要昂貴精密的設備，也不需要使用有害試劑，解決了一般生物法雜質(zhì)多、富集困難的問題，整個過程非常綠色環(huán)保。

1、本發(fā)明采用經(jīng)過硫酸銨二次沉淀、凝膠色譜柱純化后的魚腥草提取物作為還原劑，制備納米銀粒子。

2、本發(fā)明采用植物提取物純化成分作為一種生物催化劑制備納米銀，條件溫和，操作簡單，反應速度快，是一種生態(tài)友好及安全可靠的途徑。

3、本發(fā)明采用的植物提取物成分經(jīng)過部分純化，與一般的生物制備體系相比組分簡單，雜質(zhì)少，減少對產(chǎn)物AgNPs的干擾，產(chǎn)物粒徑、形貌均勻，表面潔凈。

4、本發(fā)明所采用的魚腥草提取物主要為蛋白類組分，可以有效包裹在AgNPs表面形成殼核結(jié)構(gòu)，不需要再額外添加穩(wěn)定劑防止納米粒子聚合，既簡化了操作，又減少了雜質(zhì)和有害試劑殘留。

5、本發(fā)明采用具有表面吸附功能的半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1的菌體作為載體，吸附溶膠體系中的納米銀粒子。

6、本發(fā)明所采用的制備和收集納米銀粒子的方法均不需要使用特殊設備和試劑，操作簡單，成本低。

附圖說明

圖1魚腥草提取物純化組分的FTIR圖譜

圖2魚腥草提取物與硝酸銀溶液反應體系的溶液外觀。

圖3魚腥草提取物與硝酸銀溶液反應體系的紫外-可見掃描光譜

圖4 AgNPs的透射電鏡圖像

圖5半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1菌體的掃描電鏡圖像

圖6半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1菌體吸附AgNPs的掃描電鏡圖像

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例1：魚腥草汁的制備。

市售新鮮魚腥草，洗凈表面泥土，瀝水5-10min，稱取2kg魚腥草，切成段，不超過10cm長，以利于打漿。加入去離子水，加水體積與魚腥草重量的比為1mL/g，用家用勻漿機打漿1～2min。

勻漿于4000rpm條件下離心10min，倒出上清，上清用快速定性濾紙過濾，保留濾液，約1600ml。

實施例2：魚腥草汁的硫酸銨沉淀

魚腥草汁裝于燒杯中，放入磁力攪拌子，于冰浴、磁力攪拌50rpm條件下，慢慢加入事先用研缽研碎的硫酸銨粉末，至終濃度為50％飽和度。4℃下靜置過夜，12000rpm、4℃下離心15min，保留上清。

參照以上步驟，在離心所得上清中再繼續(xù)加入硫酸銨，至終濃度為80％飽和度，進行二次沉淀，4℃下靜置過夜，12000rpm、4℃下離心15min，棄去上清，保留沉淀。

實施例3：提取物的復溶和過濾

向?qū)嵤├?得到的沉淀中逐漸加入去離子水，同時攪拌或旋渦混合直至溶解，共計約30ml，10000～11000rpm、4℃離心10～15min，上清過0.45μm濾膜。

實施例4：過柱純化和收集

將實施例3中得到的濾液進行凝膠柱層析純化。上樣量1ml，色譜柱尺寸100cm(長)×1.6cm(內(nèi)徑)，凝膠柱填料采用sephdex G25(有效分子量為1000-5000Da)，洗脫用流動相為去離子水，流速0.6ml/min。采用HD-8離子交換層析檢測儀(南京普陽科學儀器研究所)根據(jù)280nm吸光值進行洗脫監(jiān)測，收集第二個出峰組分。圖1為收集到的組分的傅里葉變換紅外光譜圖。

實施例5：納米銀的制備。

稱取硝酸銀AgNO₃ 1.69g，以100ml純凈水溶解，配制成濃度為100mM的AgNO₃溶液。取99ml實施例4中收集的純化組分，加入上述100mM的AgNO₃溶液1ml，使AgNO₃終濃度為1mM。

室溫、自然光照條件下放置4h，可見溶液顏色變?yōu)樽睾稚妶D2所示，即為制備而成的納米銀溶膠。對納米銀溶膠體系進行紫外-可見光譜掃描以及透視電鏡觀察，結(jié)果見圖3、圖4。結(jié)果顯示該溶液在440-450nm范圍內(nèi)有納米銀粒子的特征性等離子吸收峰，制備的納米銀粒子為球形，直徑范圍2-50nm。調(diào)節(jié)放大倍數(shù)至一定程度，可見納米銀粒子表面的晶格條紋。

實施例6：真菌的培養(yǎng)。

半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1菌種，4℃保存于PDA斜面。用接種針取菌絲接種到Y(jié)PD培養(yǎng)液中，120rpm、25℃培養(yǎng)2天，得到活化發(fā)酵液；取活化發(fā)酵液，按10％接種量于新的YPD培養(yǎng)液中120rpm、25℃培養(yǎng)2天。

YPD配方為：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。

實施例7：菌體分離

取實施例6中獲得的真菌培養(yǎng)物，用4層醫(yī)用紗布過濾，棄去濾過液，保留菌體。菌體繼續(xù)用去離子水洗滌至濾過液無顏色，得到濕菌體。

實施例8：納米銀粒子在菌體上的吸附

取實施例7中的濕菌體1g，加入實施例5中得到的納米銀溶膠100ml，混勻，至菌體密度1～5×10⁶孢子/ml，25～28℃靜置2h。

實施例9：納米銀和菌體吸附復合體的收集

將實施例8中所得的納米銀和菌體混合體系于2500rpm，離心10min，所得沉淀即為吸附有納米銀粒子的菌體。圖5、圖6分別為菌體吸附納米銀粒子前后的掃描電鏡圖像，吸附前的對照菌體表面光滑，吸附后菌體表面完全被納米銀粒子覆蓋。

實施例10：魚腥草汁的制備。

市售新鮮魚腥草，洗凈表面泥土，瀝水5-10min，稱取2kg魚腥草，切成5cm長的段，以利于打漿。加入去離子水，加水體積與魚腥草重量的比為1.5mL/g，用家用勻漿機打漿1～2min。

勻漿于4000rpm條件下離心10min，倒出上清，上清用快速定性濾紙過濾，保留濾液，約1600ml。

實施例11：魚腥草汁的硫酸銨沉淀

魚腥草汁裝于燒杯中，放入磁力攪拌子，于冰浴、磁力攪拌60rpm條件下，慢慢加入事先用研缽研碎的硫酸銨粉末，至終濃度為52％。4℃下靜置過夜，12000rpm、4℃下離心15min，保留上清。

參照以上步驟，在離心所得上清中再繼續(xù)加入硫酸銨，至終濃度為82％，進行二次沉淀，4℃下靜置過夜，12000rpm、4℃下離心15min，棄去上清，保留沉淀。

實施例12：提取物的復溶和過濾

向?qū)嵤├?得到的沉淀中逐漸加入去離子水，同時攪拌或旋渦混合直至溶解，共計約30ml，10000～11000rpm、4℃離心10～15min，上清過0.22μm濾膜。

實施例13：過柱純化和收集

將實施例12中得到的濾液進行凝膠柱層析純化。上樣量1ml，色譜柱尺寸100cm(長)×1.6cm(內(nèi)徑)，凝膠柱填料采用sephdex G25(有效分子量為1000-5000Da)，洗脫用流動相為去離子水，流速0.8ml/min。采用HD-8離子交換層析檢測儀(南京普陽科學儀器研究所)根據(jù)280nm吸光值進行洗脫監(jiān)測，收集第二個出峰組分。

實施例14：納米銀的制備。

稱取硝酸銀AgNO₃ 1.69g，以100ml純凈水溶解，配制成濃度為100mM的AgNO₃溶液。取99ml實施例4中收集的純化組分，加入上述100mM的AgNO₃溶液1ml，使AgNO₃終濃度為1mM。

室溫、自然光照條件下放置5h，可見溶液顏色變?yōu)樽睾稚礊橹苽涠傻募{米銀溶膠。

實施例15：真菌的培養(yǎng)。

半乳糖地霉Galactomyces geotrichum KG-1菌種，4℃保存于PDA斜面。用接種針取菌絲接種到Y(jié)PD培養(yǎng)液中，100rpm、28℃培養(yǎng)3天，得到活化發(fā)酵液；取活化發(fā)酵液，按10％接種量于新的YPD培養(yǎng)液中120rpm、25℃培養(yǎng)2天。

YPD配方為：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。

實施例16：菌體分離

取實施例6中獲得的真菌培養(yǎng)物，用4層醫(yī)用紗布過濾，棄去濾過液，保留菌體。菌體繼續(xù)用去離子水洗滌至濾過液無顏色，得到濕菌體。

實施例17：納米銀粒子在菌體上的吸附

取實施例16中的濕菌體1g，加入實施例14中得到的納米銀溶膠100ml，混勻，至菌體密度1～5×10⁶孢子/ml，25～28℃靜置3h。

實施例18：納米銀和菌體吸附復合體的收集

將實施例17中所得的納米銀和菌體混合體系于3000rpm，離心15min，所得沉淀即為吸附有納米銀粒子的菌體。

表1各種植物組分制備AgNPs的結(jié)果比較

表1

^a：在UV-Vis光譜掃描結(jié)果中反應液在最大吸收峰處的吸光值，數(shù)值的大小可以用于表示體系中納米銀粒子的濃度。