本發(fā)明涉及磁性納米材料的領(lǐng)域，特別涉及到一種磁性納米粒子fe3o4@sio2@s-s-py的制備，及該材料在特殊磁響應(yīng)性及吡啶二硫功能基的氧化性在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和催化材料領(lǐng)域?qū)嶋H研究中的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

磁性納米粒子作為一種新型的納米材料，具備納米粒子的化學(xué)和物理性能，并且有著獨(dú)特的磁學(xué)性質(zhì)，能在外加磁場(chǎng)下迅速分離，已應(yīng)用于催化材料、生物工程和生物醫(yī)學(xué)、磁共振成像和環(huán)境保護(hù)等多方面；且磁性納米粒子表面能進(jìn)行各種修飾，在粒子表面進(jìn)行包裹或修飾能避免fe3o4的氧化并保持磁性能、提高粒子的穩(wěn)定性和增加其水分散性的同時(shí)，還能調(diào)節(jié)并豐富粒子各種性能，獲得多功能磁性納米粒子拓寬其應(yīng)用范圍。表面修飾后的磁性納米粒子同時(shí)兼具無(wú)機(jī)納米粒子的磁響應(yīng)性和表面修飾劑的化學(xué)物理特性。

吡啶二硫基能與自由巰基發(fā)生交換且離去基團(tuán)反應(yīng)后的產(chǎn)物不含巰基，是普遍使用的交聯(lián)劑的功能基團(tuán)。將吡啶二硫功能基固定在磁性納米粒子上能利用粒子的磁性，能結(jié)合二者之間的優(yōu)勢(shì)。

該類(lèi)吡啶二硫功能基化的磁性納米粒子的結(jié)構(gòu)通式如圖1.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，開(kāi)發(fā)提供一種具有獨(dú)特磁性性能，獨(dú)特功能基團(tuán)且有在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，和催化材料領(lǐng)域潛在應(yīng)用價(jià)值的磁性材料。

本發(fā)明的提供的磁性fe3o4@sio2@s-s-py納米粒子的制備包括以下方案：

方案一：

工藝步驟為：

(1)磁性納米粒子的合成：共沉淀法合成磁性納米粒子；

(2)合成吡啶二硫功能基的硅烷硅烷偶聯(lián)劑，該類(lèi)分子的結(jié)構(gòu)通式如圖2；

(3)表面吡啶二硫功能基修飾的磁性納米粒子的制備：用步驟1所得的磁性納米粒子及步驟2合成的含吡啶二硫功能基德硅烷偶聯(lián)劑對(duì)粒子表面進(jìn)行功能化。

方案二：

工藝步驟為：

（1）磁性納米粒子的合成：共沉淀法合成磁性納米粒子；

（2）fe3o4-sio2包裹磁性納米粒子:利用步驟1得到的磁性納米粒子，反相微乳液法，在油包水的環(huán)境里合成fe3o4-sio2核殼結(jié)構(gòu)；

（3）表面吡啶二硫功能基修飾的磁性納米粒子的制備：用步驟2所得的磁性納米粒子及合成的含吡啶二硫功能基德硅烷偶聯(lián)劑對(duì)粒子表面進(jìn)行功能化。

方案三：

工藝步驟為：

（1）磁性納米粒子的合成：共沉淀法合成磁性納米粒子；

（2）fe3o4-sio2包裹磁性納米粒子：利用步驟1得到的磁性納米粒子，反相微乳液法，在油包水的環(huán)境里合成fe3o4-sio2核殼結(jié)構(gòu)；

（3）表面硫基功能化磁性納米粒子的制備：用步驟1或步驟2所得的磁性納米粒子與γ巰丙基三乙氧基硅烷對(duì)粒子表面進(jìn)行巰基化；

（4）表面吡啶二硫功能基修飾的磁性納米粒子的制備：用步驟3所得的磁性納米粒子及與二吡啶二硫反應(yīng)，將巰基轉(zhuǎn)化為吡啶二硫功能基

本發(fā)明制備的磁性fe3o4@sio2@s-s-py納米粒子的制備方法中，磁性fe3o4納米粒子的合成中，以氯化鐵、氯化亞鐵和氨水為主要原料，采用化學(xué)共沉淀法制備fe3o4磁性納米粒子，磁性fe3o4納米粒子的結(jié)構(gòu)和形態(tài)由tem圖3可以看出，所得的磁性納米粒子fe3o4納米粒子形貌為球形，粒度均一，分散性良好，粒徑為~10nm。說(shuō)明制備的粒子為納米級(jí)材料并具有良好的熱穩(wěn)定性。圖4磁性fe3o4納米粒子的紅外光譜圖在579cm^-1有強(qiáng)烈的吸收峰，此處對(duì)應(yīng)為fe3o4中的fe-o特征伸縮振動(dòng)吸收峰，峰型完整。從圖5磁性fe3o4納米粒子的xrd譜圖可以看出，磁性fe3o4納米粒子在2θ為220，311，400，511和440出現(xiàn)衍射峰，這些衍射峰和標(biāo)準(zhǔn)的fe3o4譜圖中的相應(yīng)峰相符，表明所得樣品為純凈的尖晶石結(jié)構(gòu)的fe3o4。從圖6磁性fe3o4納米粒子的磁性能分析看可以看出，室溫下測(cè)量的磁性fe3o4納米粒子的飽和磁化強(qiáng)度為36emu/g。

本發(fā)明對(duì)磁性fe3o4納米粒子進(jìn)行了表面改性，先選擇正硅酸乙酯（teos）與磁性fe3o4納米粒子反應(yīng)，在表面用sio2進(jìn)行包裹，然后選擇硅烷偶聯(lián)劑與sio2包裹的磁性納米粒子反應(yīng)，并最終得到吡啶二硫功能基化的磁性fe3o4@sio2@s-s-py納米粒子。

吡啶二硫功能基的硅烷硅烷偶聯(lián)劑的合成反應(yīng)式如圖7。

磁性納米粒子二硫鍵含量的測(cè)定

磁性納米fe3o4@sio2@s-s-py粒子的tem分析

用tem分別對(duì)制備的fe3o4，fe3o4@sio2，@sio2@s-s-py粒子進(jìn)行形貌和粒徑分析圖8，由圖可知，fe3o4@@sio2@s-s-py粒子的粒子的平均粒徑分別約為~200nm。

磁性納米fe3o4，fe3o4@sio2，@sio2@s-s-py粒子的傅里葉紅外變換光譜圖分析

圖9中磁性納米fe3o4，fe3o4@sio2中3426和1616分別對(duì)應(yīng)于-oh的伸縮振動(dòng)峰，791和1087處分別為si-o-si的對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)的伸縮振動(dòng)吸收峰，967和460處分別為si-oh和si-o-si的彎曲振動(dòng)吸收峰，表面fe3o4@sio2修飾成功，3000，1087，579處為吡啶環(huán)的吸收峰。

磁性磁性納米fe3o4，fe3o4@sio2，@sio2@s-s-py粒子的xrd分析

由圖10和表可以看出磁性納米fe3o4，fe3o4@sio2，@sio2@s-s-py粒子的衍射峰的出現(xiàn)位置及強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)的fe3o4基本一致，一次對(duì)應(yīng)于fe3o4的（220），(311),fe3o4晶體的結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，粒子物相為反式尖晶石結(jié)構(gòu)，峰行窄，晶體完整。在對(duì)磁性fe3o4納米粒子進(jìn)行表面功能化的過(guò)程中，fe3o4的晶體結(jié)構(gòu)未有變化，粒子物相為反式尖晶石結(jié)構(gòu)，峰型窄且尖銳，晶體完整。另外磁性納米fe3o4@sio2，e3o4@sio2@s-s-py粒子在2θ為20，25附近出現(xiàn)了寬化的衍射峰，強(qiáng)度不大，這是非晶態(tài)的sio2的衍射峰。

磁性納米fe3o4@sio2@s-s-py粒子的磁性能分析

磁性納米fe3o4@sio2@s-s-py粒子的磁滯曲線見(jiàn)圖11，這種磁性納米粒子的剩余磁化強(qiáng)度和矯頑力都幾乎為零，接近超順磁性。

磁性納米fe3o4粒子的飽和磁化強(qiáng)度為38emu/g，沒(méi)減弱。

對(duì)磁性納米fe3o4粒子的的改性，在其表面連接吡啶二硫鍵，得到吡啶二硫鍵包覆的磁性納米fe3o4@sio2@s-s-py粒子，通過(guò)投射電鏡，傅立葉變換紅外光譜，x-射線衍射，熱重分析儀等表征方法對(duì)制得的納米微球進(jìn)行表征，結(jié)果表明，磁性納米fe3o4@sio2@s-s-py粒子的粒徑約為~200nm，吡啶二硫功能基修飾成功，吡啶二硫鍵的含量為55.22umol/g，晶型結(jié)構(gòu)良好，飽和磁化強(qiáng)度為40.5，能在外在磁場(chǎng)作用下進(jìn)行有效分離。

將本發(fā)明的方法制備的磁性納米fe3o4@sio2@s-s-py粒子的用于木瓜蛋白酶的的富集分離研究。

本發(fā)明提供的磁性納米fe3o4@sio2@s-s-py粒子的制備方法特點(diǎn)為：

1）磁性納米fe3o4@sio2@s-s-py粒子的形貌為球形，粒度均一，分散性好，粒徑為，具有吡啶二硫功能基，含量為55.22umol/g，具有良好的熱穩(wěn)定性，晶型結(jié)構(gòu)良好。

2）具吡啶二硫功能基的硅烷偶聯(lián)試劑的合成

3）用于含巰基蛋白或其他生物分子的富集分離或固化。如含巰基的蛋白-木瓜蛋白酶的富集和分離。

本發(fā)明提供的磁性納米fe3o4@sio2@s-s-py粒子可應(yīng)用于催化領(lǐng)域或生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，如蛋白分離純化、酶的固化、生物傳感和藥物傳遞等領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1吡啶二硫功能基的硅烷硅烷偶聯(lián)劑的結(jié)構(gòu)通式

圖2吡啶二硫功能基化的磁性納米粒子的結(jié)構(gòu)通式

圖3磁性納米粒子fe3o4的tem表征圖

圖4磁性納米粒子fe3o4的紅外表征圖

圖5磁性納米粒子fe3o4的xrd表征圖

圖6磁性納米粒子fe3o4的磁學(xué)性能圖

圖7吡啶二硫功能基的硅烷偶聯(lián)劑的合成反應(yīng)式

圖8磁性納米粒子fe3o4@sio2@s-s-py的tem表征圖

圖9磁性納米粒子fe3o4，fe3o4@sio2，@sio2@s-s-py粒子的紅外表征圖

圖10磁性納米粒子fe3o4，fe3o4@sio2，@sio2@s-s-py粒子的xrd表征圖

圖11磁性納米粒子fe3o4@sio2@s-s-py的磁學(xué)性能圖

圖12利用含吡啶二硫功能基磁性納米粒子對(duì)木瓜蛋白酶的選擇性分離

圖13分離后木瓜蛋白酶的lc/ms/ms分析圖

具體實(shí)施方式

本發(fā)明用下列實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)例。

實(shí)例1

1）磁性納米fe3o4粒子的合成：

在三口燒瓶?jī)?nèi)加入一定量水，加入3.5gfecl2·4h2o和7gfecl3·6h2o與燒瓶中，通高純氮半小時(shí)，除去溶液中的氧氣，加熱至90?c，待反應(yīng)體系均一后，逐滴加入35ml氨水，溶液變?yōu)楹谏?，繼續(xù)加熱1小時(shí)，后降溫，室溫靜置5小時(shí)，磁性吸附，去溶液，分別用蒸餾水反復(fù)洗滌5次，至中性，冷凍干燥，得黑色產(chǎn)品磁性fe3o4納米粒子。

2）磁性fe3o4@sio2納米粒子的合成

將步驟1）的磁性納米粒子0.1g，于250ml三口燒瓶中，加入125ml無(wú)水乙醇，及20ml水，超聲30min，在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌至體系均勻，逐滴加入氨水至ph9.0，加入正硅酸乙酯（teos）1ml，室溫反應(yīng)12h，磁性吸附，分別用水和無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥得到產(chǎn)品fe3o4@sio2納米粒子。

3）磁性納米fe3o4@sio2@s-s-py粒子的合成：

將步驟2)得到的磁性納米fe3o4@sio2粒子0.1g，于三口燒瓶中，加入20ml甲苯，高純氮?dú)獗Ｗo(hù)，劇烈磁力攪拌，是粒子分散均勻，逐滴加入0.1g合成的硅烷偶聯(lián)劑，磁性攪拌反應(yīng)5h，磁性吸附，用無(wú)水乙醇洗滌產(chǎn)品數(shù)次，冷凍干燥得到fe3o4@sio2@s-s-py納米粒子

實(shí)例2

含可吡啶二硫功能基的硅烷偶聯(lián)劑的合成：

稱(chēng)取3-巰丙基乙氧基硅烷1g與5g二吡啶二硫與100ml乙腈中，攪拌，室溫反應(yīng)過(guò)夜，柱層析得到產(chǎn)物。

實(shí)例3

1）磁性納米fe3o4粒子的合成：

在三口燒瓶?jī)?nèi)加入一定量水，加入3.5gfecl2·4h2o和7gfecl3·6h2o與燒瓶中，通高純氮半小時(shí)，除去溶液中的氧氣，加熱至80?c，待反應(yīng)體系均一后，逐滴加入35ml氨水，溶液變?yōu)楹谏?，繼續(xù)加熱50min，后降溫，室溫靜置5小時(shí)，磁性吸附，去溶液，分別用蒸餾水反復(fù)洗滌5次，至中性，冷凍干燥，得黑色產(chǎn)品磁性fe3o4納米粒子。

2）磁性fe3o4@sio2納米粒子的合成

將步驟1）的磁性納米粒子0.1g，于250ml三口燒瓶中，加入125ml無(wú)水乙醇，及20ml水，超聲30min，在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌至體系均勻，逐滴加入氨水至ph9.0，并加入正硅酸乙酯（teos）0.3ml，40oc度反應(yīng)2h，磁性吸附，分別用水和無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥得到產(chǎn)品fe3o4@sio2納米粒子。

3）磁性納米fe3o4@sio2@sh粒子的合成：

將步驟2)得到的磁性納米fe3o4@sio2粒子0.1g，于三口燒瓶中，加入20ml甲苯，高純氮?dú)獗Ｗo(hù)，劇烈磁力攪拌，是粒子分散均勻，逐滴加入0.1g3-巰丙基乙氧基硅烷，磁性攪拌反應(yīng)5h，磁性吸附，用無(wú)水乙醇洗滌產(chǎn)品數(shù)次，冷凍干燥得到fe3o4@sio2@s-s-py納米粒子。

4）磁性納米粒子fe3o4@sio2@s-s-py

將步驟3)得到的磁性納米fe3o4@sio2粒子0.1g，于三口燒瓶中，加入20ml甲苯，高純氮?dú)獗Ｗo(hù)，劇烈磁力攪拌，是粒子分散均勻，逐滴加入0.1g二硫二吡啶，磁性攪拌反應(yīng)5h，磁性吸附，用無(wú)水乙醇洗滌產(chǎn)品數(shù)次，冷凍干燥得到fe3o4@sio2@s-s-py納米粒子。

實(shí)例4

磁性納米粒子對(duì)含自由巰基蛋白（木瓜蛋白酶）的富集

1.5ml試管加入pbs緩沖液100ul，木瓜蛋白酶和卵清白蛋白各100ug，加入超聲分散好的2mg吡啶二硫功能基化的磁性納米粒子，室溫反應(yīng)2小時(shí)；磁性分離，用含0.1%sds，8m尿素的pbs緩沖液洗磁性納米粒子30分鐘；磁性分離，用pbs洗3-5遍；用上樣緩沖液處理磁性納米粒子10分鐘，sds-page檢測(cè)分離的蛋白。分離后的結(jié)果如圖12。圖中顯示磁性納米材料能從蛋白混合液中分離帶自由巰基的木瓜蛋白酶。

實(shí)例5

分離后的木瓜蛋白酶的lc/ms/ms分析

將分離后帶自由巰基的木瓜蛋白酶利用胰酶進(jìn)行酶解，利用lc/ms/ms對(duì)其進(jìn)行分析，得到的質(zhì)譜圖如13.圖中的四個(gè)肽段通過(guò)ms/ms進(jìn)行了分析鑒定為木瓜蛋白酶。