本發(fā)明屬于微生物肥料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種防治馬鈴薯瘡痂病的微生物菌肥及其制備方法。

背景技術(shù)：

馬鈴薯，雙子葉植物，茄科，茄屬草本植物，是除小麥、水稻、玉米外的世界第四大作物。我國是世界上馬鈴薯第一生產(chǎn)大國，種植面積是世界馬鈴薯種植面積的 1/4，產(chǎn)量占世界的 1/5。2012 年我國馬鈴薯種植面積達(dá) 55.3 萬公頃，產(chǎn)量達(dá) 1855.25 萬噸。2015 年 1 月 6 日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國種子協(xié)會、國家食物與營養(yǎng)咨詢委員會在北京舉辦馬鈴薯主糧化發(fā)展戰(zhàn)略研討會，以馬鈴薯主糧化與國家糧食安全為主題，深入研討馬鈴薯主糧化的戰(zhàn)略意義、發(fā)展思路、目標(biāo)任務(wù)和推進(jìn)途徑。我國于今年將啟動馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，推進(jìn)把馬鈴薯加工成米粉、面條、饅頭等主食，馬鈴薯將成為我國繼水稻、小麥、玉米外又一主糧。預(yù)計 2020 年 50%以上的馬鈴薯將作為主糧消費(fèi)。與傳統(tǒng) 3 大作物相比，馬鈴薯耐瘠薄，單產(chǎn)增產(chǎn)潛力大，因此發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)對緩解我國糧食安全壓力起到重要作用。近年來隨著馬鈴薯種植經(jīng)濟(jì)效益的提高，全國馬鈴薯的種植面積不斷擴(kuò)大，預(yù)計至2018年全國馬鈴薯種植面積達(dá) 1億畝。近幾年因重迎茬種植嚴(yán)重，致使馬鈴薯的一些次生病害逐漸凸顯，馬鈴薯瘡痂病就是其中之一。各產(chǎn)區(qū)均有瘡痂病的發(fā)生，其發(fā)生率和嚴(yán)重程度呈逐年上升的趨勢。馬鈴薯瘡痂病是由土壤中習(xí)居的鏈霉菌引起的，因其對馬鈴薯的外觀、等級和品質(zhì)有影響，對全世界的馬鈴薯種植地區(qū)來說都是一種嚴(yán)重的病害。在美國，瘡痂病被認(rèn)為是馬鈴薯生產(chǎn)上的第四大病害。

馬鈴薯瘡痂病的防治方法國外已報道多種，如選育抗病品種、化學(xué)防治、灌溉、輪作并施用綠肥和生物防治等方法。

因為馬鈴薯瘡痂病病原菌存在多樣性，并且會在土壤中存活多年，所以防治工作很難進(jìn)行。據(jù)報道，在沒有種植馬鈴薯作物之前，瘡痂鏈霉菌就已經(jīng)存在于土壤中。國外研究還表明，國外學(xué)者采用生物防治手段來防治馬鈴薯瘡痂病取得了良好的防效。Schottel等報道選用非致病性鏈霉菌菌株對 S. scabies 菌株進(jìn)行生物防治，防治效果顯著。Eckwall 等在大田試驗中使用 S.diastatochromogenes PonSSII 來防治瘡痂病，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘡痂癥狀明顯的減輕。Hiltunen等的研究也表明利用非致病性鏈霉菌也可以有效防治瘡痂病鏈霉菌。另外，Han等報道利用芽孢桿菌產(chǎn)生的代謝物 macrolactin A 可以有效地使瘡痂病的發(fā)病率降低 40％。上述研究表明，國外學(xué)者采取生物防治的手段來防治馬鈴薯瘡痂病確實取得了良好的防治效果。

此外，國內(nèi)劉大群等采用生物防治法對馬鈴薯瘡痂病進(jìn)行防治，發(fā)現(xiàn)不同菌系的防效差異明顯。拮抗菌株 ZWQ-1 對馬鈴薯瘡痂病具有較好的防治作用。李勇等也發(fā)現(xiàn)馬鈴薯瘡痂病菌拮抗菌株 ZWQ-1（根據(jù)拮抗菌株 ZWQ-1 的形態(tài)和生理生化特征與枯草芽孢桿菌一致，因此將其鑒定為枯草芽孢桿菌）通過盆栽接種防病測試，結(jié)果表明拮抗菌株 ZWQ-1 對馬鈴薯瘡痂病具有較好的防治作用，但該菌株目前并未見開發(fā)應(yīng)用到生產(chǎn)中。

崔國臣等在專利號：2013106658443，2013106658439，2013106658246中公開了一種微生物菌劑在拮抗馬鈴薯瘡痂病中的應(yīng)用研究，所述的微生物菌劑采用枯草芽孢桿菌，放線菌，玫瑰黃鏈霉菌作為菌種，制備成發(fā)酵液，能夠高效拮抗馬鈴薯瘡痂病原菌，刺激植物生長，改善作物品質(zhì)，從而達(dá)到增產(chǎn)的目的；喬長晟等在專利號2015109095764中公開了一種防治馬鈴薯瘡痂病的微生物肥料及其制備，使用方法中，按微生物發(fā)酵菌劑，復(fù)合營養(yǎng)素的質(zhì)量比為0.5-2：1，且其中解淀粉芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和熒光假單胞菌各自對應(yīng)的發(fā)酵液以1：1：1的質(zhì)量比混合，所得微生物肥料稀釋施澆于馬鈴薯塊莖，但發(fā)酵菌液一般難以保存持久；趙興民在專利號200810158030X中公開了一種預(yù)防馬鈴薯瘡痂病的有機(jī)肥料，由堆肥化物料，家用過磷酸鈣，硫磺粉，五氯硝基苯粉劑組成，主要是靠化學(xué)原料起到預(yù)防的效果。周波等在專利號2014102728901中公開了一株解淀粉芽孢桿菌及其在防治馬鈴薯瘡痂病中的應(yīng)用，還保護(hù)一種生物菌肥，包括所述解淀粉芽孢桿菌和有機(jī)肥；由于病原菌的多樣性和同步進(jìn)化特性，單一拮抗菌株也無法達(dá)到很理想的防治效果，因此，生防菌的很多生物功能需要依靠兩株或兩株以上的細(xì)菌間的協(xié)同作用，才能發(fā)揮出更好的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的問題是研制出一種能夠高效防治馬鈴薯瘡癡病的微生物菌肥，制備該微生物菌肥的原料按重量份為：阿氏芽孢桿菌菌粉10-30份，沙福芽孢桿菌菌粉10-30份，加德那鏈霉菌菌粉(Streptomyces gardneri10-30份，焦土鏈霉菌菌粉10-30份，黃腐酸鉀20-60份，棉粕粉10-30份；該菌肥復(fù)配的菌種特點(diǎn)主要是適應(yīng)性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，能共生共存，都分離自土壤，對病原菌抑菌性強(qiáng)等特點(diǎn)，并合理利用微生物間的相互作用，配備高技術(shù)的生產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。該微生物菌肥能高效拮抗馬鈴薯瘡癡病的病原菌，具有固氮，刺激植物生長、改善作物品質(zhì)等作用，從而達(dá)到增產(chǎn)、高產(chǎn)的目的。

另一個目的，提供了一種防治馬鈴薯瘡痂病的微生物菌肥的制備方法，其具體制備方法，包括以下步驟：

步驟一、阿氏芽孢桿菌菌粉的制備

取出阿氏芽孢桿菌保藏管，用營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L阿氏液體種子培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前10小時通氣量為200L/min，10小時后通氣量為320L/min ，30℃培養(yǎng)16-24小時，待總菌含量不低于20億cfu/ml，即可作為阿氏芽孢桿菌液體種子；

發(fā)酵：將上述制備的阿氏芽孢桿菌液體種子加至阿氏芽孢固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻，在淺盤上發(fā)酵，堆料厚度為5-10cm，翻料控制發(fā)酵溫度為30-40℃，發(fā)酵36-48小時，待芽孢含量不低于100億cfu/g，即可曬干，待水分含量低于10%，粉碎過40目篩，即得到阿氏芽孢桿菌菌粉；

其中，所述營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20 g，水1000mL，pH7.2；

其中，所述阿氏液體種子培養(yǎng)基：玉米淀粉20 g/L， 豆粉10 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.1 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鈉1.0 g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘；

其中，阿氏芽孢固體發(fā)酵培養(yǎng)基：甘蔗渣60%，麩皮35%，菜粕2%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氫二鉀0.4%，硫酸鎂0.05%，培養(yǎng)基含水量50%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。

步驟二、沙福芽孢桿菌菌粉的制備

取出沙福芽孢桿菌保藏管，用營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基分別劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)48小時。在平板下挑取單個菌落接種至裝有營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，用3000ml無菌水將三個茄子瓶中的菌苔洗脫，接種至裝有300L沙福液體種子培養(yǎng)基的500L發(fā)酵罐中，開攪拌120r/min，前12小時通氣量為200L/min，12小時后通氣量為320L/min ，30℃培養(yǎng)16-24小時，待總菌含量不低于10億cfu/ml，即可作為沙福芽孢桿菌液體種子；

發(fā)酵：將上述制備的沙福芽孢桿菌液體種子加至沙福芽孢固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻，在淺盤上發(fā)酵，堆料厚度為5-10cm，控制發(fā)酵溫度為30-40℃，發(fā)酵36-48小時，待芽孢含量不低于50億cfu/g，即可曬干，待水分含量低于10%，粉碎過40目篩，即得到沙福芽孢桿菌菌粉；

其中，所述營養(yǎng)肉汁固體培養(yǎng)基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂20 g，水1000mL，pH7.2；

其中，所述沙福液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖8g/L，玉米粉10 g/L， 豆粉10 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.1 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鈉1.0 g/L，pH7.0。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘；

其中，沙福芽孢固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮60%， 玉米皮35%，棉粕2%，石粉3%，尿素0.4%，磷酸氫二鉀0.4%，硫酸鎂0.05%，硫酸錳0.01%，培養(yǎng)基含水量50%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。

步驟三，加德那鏈霉菌菌粉的制備

取出加德那鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為加德那鏈霉菌種子液；

發(fā)酵：將上述制備的加德那鏈霉菌種子液以3%的接種量接種至滅菌的加德那鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，菌種與加德那鏈霉菌固體培養(yǎng)基混合均勻后，將接好種的加德那鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤在發(fā)酵槽上，物料高度為3-6cm，控溫28-32℃，第一天空氣濕度保持為60%-75%，過后空氣濕度保持為40%-50%，發(fā)酵3-4天，檢測其孢子含量不低于20億CFU/g，即可低溫風(fēng)干至水分低于8%，粉碎過40目篩，即得到加德那鏈霉菌菌粉；

其中，所述的高氏一號固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5克，硫酸鎂：0﹒5克，氯化鈉：0﹒5克，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml ，PH7﹒2～7﹒4；

其中，所述的加德那鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基：甘蔗渣80%，豆粕2%，玉米芯粉1%，石粉10%，麩皮7%，硫酸錳0.004%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，固體培養(yǎng)基含水量為40%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。

步驟四，焦土鏈霉菌菌粉的制備

取出焦土鏈霉菌菌種保藏管，用高氏一號固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)7天。在平板下挑取單個菌落劃線接種裝有150毫升高氏一號固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)6-8天，待菌苔長滿茄子瓶，產(chǎn)生大量孢子粉即可用500毫升的無菌生理鹽水洗脫，調(diào)節(jié)孢子濃度為0.1億cfu/ml，即為焦土鏈霉菌種子液；

發(fā)酵：將上述制備的焦土鏈霉菌種子液以5%的接種量接種至滅菌的焦土鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，菌種與焦土鏈霉菌固體培養(yǎng)基混合均勻后，將接好種的焦土鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基攤在發(fā)酵槽上，物料高度為5-8cm，控溫28-32℃，前兩天空氣濕度保持為60%-75%，過后空氣濕度保持為40%-50%，發(fā)酵4-6天，檢測其孢子含量不低于10億CFU/g，即可低溫風(fēng)干水分低于8%，粉碎過40目篩，即得到焦土鏈霉菌菌粉；

其中，所述的高氏一號固體培養(yǎng)基：硝酸鉀：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氫二鉀：0﹒5克，硫酸鎂：0﹒5克，氯化鈉：0﹒5克，硫酸亞鐵：0﹒01克，瓊脂：20克，蒸餾水補(bǔ)足1000ml ，PH7﹒2～7﹒4；

其中，所述的焦土鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基：米糠80%，棉粕2%，玉米粉1%，石粉2%，麩皮15%，硫酸錳0.004%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，固體培養(yǎng)基含水量為40%-60%。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。

步驟五，將上面制成的各種菌粉按阿氏芽孢桿菌菌粉10-30份，沙福芽孢桿菌菌粉10-30份，加德那鏈霉菌菌粉(Streptomyces gardneri10-30份，焦土鏈霉菌菌粉10-30份，黃腐酸鉀20-60份，棉粕粉10-30份混合均勻，即為防治馬鈴薯瘡痂病的微生物菌肥。

其中，防治馬鈴薯瘡痂病的微生物菌肥的施用方法為拌種，拌種的用量為馬鈴薯種薯重量的1/10-1/20。

鏈霉菌作為微生物源農(nóng)藥之一，在生物防治中具有很多優(yōu)勢。鏈霉菌分布范圍廣、種類多，自從Cohn(1872)發(fā)現(xiàn)鏈霉菌至今，很多鏈霉菌可產(chǎn)生多種抗生素和酶，在微生物產(chǎn)生的新生物活性物質(zhì)中，鏈霉菌產(chǎn)生的就占到了74%；有些鏈霉菌還可寄生于植物病原菌中;此外，在自然環(huán)境中放線菌可通過產(chǎn)生植物激素和植物生長抑制劑，調(diào)整土壤的微生態(tài)環(huán)境，對提高植物抗性和抑制土傳植物病菌具有重要作用。本發(fā)明中含有加德那鏈霉菌與焦土鏈霉菌，能產(chǎn)生原放線菌素A，B，C，焦土霉素，和一種大環(huán)內(nèi)酯菌素，經(jīng)過平板對峙試驗其能很好的抑制馬鈴薯瘡痂病原鏈霉菌的微生物，而且能產(chǎn)生磷酸酶，增溶土壤中的P元素，更好地促進(jìn)植物吸收。我們發(fā)現(xiàn)這兩株鏈霉菌接種在含磷酸巖的培養(yǎng)基上，能顯著增加馬鈴薯植株N、P含量。

本發(fā)明中含有阿氏芽孢桿菌與沙福芽孢桿菌，這兩株芽孢桿菌都是從土壤和植株中分離得到，能產(chǎn)生耐熱、抗逆性的芽孢，具有顯著的生防潛力，對馬鈴薯的早疫病與晚疫病菌的抑制有明顯的效果；阿氏芽孢桿菌與沙福芽孢桿菌作為根跡促生微生物，它們能寄生根，葉，和其他植物表面。能迅速拓殖植物根毛，樹葉，和其他表面，能防止致病真菌和細(xì)菌的建立。另外，阿氏芽孢桿菌具有較強(qiáng)的固氮的能力，在土壤中能較好的起到固氮的效果。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的微生物菌肥與馬鈴薯拌種后，可以在馬鈴薯周邊快速生長，產(chǎn)生大量的放線菌素A，B，C，焦土霉素，和大環(huán)內(nèi)酯菌素，可以有效的抑制瘡痂病原菌的生長；同時產(chǎn)生磷酸酶與固氮酶活，起到固氮，解磷的作用，并產(chǎn)生一系列的植物激素促進(jìn)馬鈴薯的快速生長；通過將本發(fā)明的微生物菌肥拌種馬鈴薯，改善了馬鈴薯周邊的微環(huán)境，使得土壤疏松透氣，起到保水保肥作用，利于馬鈴薯的膨大，經(jīng)過大田試驗，能明顯減輕馬鈴薯的瘡痂病害，其防效達(dá)到了78.6%以上，增產(chǎn)率也達(dá)到了15.56%，起到明顯的增產(chǎn)增收效果。

選用了四個菌種組合，其中有的可以促進(jìn)作物生長的菌株，也有分泌抗生素物質(zhì)來抑制土壤中病原菌生長的菌株。與普通的化學(xué)肥料和化學(xué)農(nóng)藥不同，微生物菌肥并不是直接給作物提供營養(yǎng)，而是利用微生物菌肥里含有的活微生物的生命活動來改善作物根際生態(tài)環(huán)境，轉(zhuǎn)化土壤中作物不可直接利用的營養(yǎng)元素為作物可利用的速效營養(yǎng)，菌株還可以分泌促生物質(zhì)來刺激作物生長。在治病方面，微生物菌肥采用以菌治菌的原理，利用拮抗菌株分泌的抗生物質(zhì)來抑制土壤中病原菌的生長，使病原菌在土壤中無法達(dá)到致病數(shù)量，從而無法侵染作物，使作物發(fā)病。

實施例2：拮抗馬鈴薯瘡癡病的微生物菌劑田間應(yīng)用效果

拮抗馬鈴薯瘡癡病的微生物菌劑田間應(yīng)用試驗如下。

①試驗方案及設(shè)計:在同一個噴灌圈試驗，總約500畝；分10塊面積，間隔做試驗，即試驗組與對照組相互間隔。前一年瘡痂病發(fā)病較晉重，病情指標(biāo)達(dá)到了34%；

試驗組：250畝，在馬鈴薯瘡癡病嚴(yán)重的試驗田中施用本發(fā)明產(chǎn)品；拌種，用量為種子質(zhì)量的1/10；

對照組：以不施用本產(chǎn)品，常規(guī)用消毒藥包衣

試驗地點(diǎn):河北張家口沽源縣某種植公司，露地直播。

②馬鈴薯瘡癡病分級標(biāo)準(zhǔn):

戴線手套去土，不損壞薯塊表皮。目測。0級:薯塊無病斑;1級:有1-3個明顯病

斑，或有多個小病斑斑點(diǎn)，但總體危害很輕;2級:有4個以上明顯病斑。

③檢測結(jié)果與分析：從表1中可以看出，試驗組的馬鈴薯薯塊皮色光亮、光澤好；對照組生產(chǎn)的馬鈴薯薯塊皮色暗。試驗說明，本發(fā)明產(chǎn)品預(yù)防馬鈴薯瘡癡的防病效果為78. 6%以上。且使馬鈴薯薯塊皮色光亮、光澤好、明顯增長。該試驗土壤地塊系春馬鈴薯連作5年，馬鈴薯瘡癡病發(fā)病已經(jīng)較為嚴(yán)重。試驗組平均產(chǎn)量為4894kg，對照組平均產(chǎn)量只有4235kg，增產(chǎn)率也達(dá)到了15.56%，具有明顯的增產(chǎn)效果。

表1拮抗馬鈴薯瘡癡病的微生物菌肥對病薯防效