本發(fā)明涉及一種結(jié)晶板的制備方法，特別是通過穩(wěn)定的微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的結(jié)晶板。
背景技術(shù)：
解析蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)對(duì)了解蛋白質(zhì)在生命體中的功能具有重要的作用。利用x-射線晶體衍射技術(shù)解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的瓶頸是獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體。蛋白質(zhì)結(jié)晶有兩個(gè)關(guān)鍵步驟，一是獲得較多的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選條件，二是獲得較高質(zhì)量的能用于x-射線衍射的蛋白質(zhì)晶體?，F(xiàn)在已經(jīng)有多種可提高蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)的方法，例如添加籽晶，控制溫度，采用不同的結(jié)晶板等。文獻(xiàn)1：“houh,wangb,husy,etal.acomparativestudyonthequalityofproteincrystalsobtainedusingthecross-diffusionmicrobatchandsitting-dropvapordiffusionmethods[j].crystengcomm,2015,17(29):5365-5371.”報(bào)道基于交互擴(kuò)散的蛋白結(jié)晶板可顯著提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率；文獻(xiàn)2：“d'arcya,villardf,marshm.anautomatedmicroseedmatrix-screeningmethodforproteincrystallization[j].actacrystallographica,2007,63(4):550–554.”報(bào)道，添加蛋白質(zhì)晶體作為蛋白質(zhì)結(jié)晶的籽晶，可以使蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)提高2.5～65倍。然而，盡管該技術(shù)效果很好，但仍然存在如下問題：1)該技術(shù)直接使用蛋白質(zhì)晶體作為籽晶，但是由于蛋白質(zhì)晶體非常脆弱、也不穩(wěn)定，不能在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下長(zhǎng)期儲(chǔ)存或儲(chǔ)存成本昂貴；2)該技術(shù)需要在每次結(jié)晶實(shí)驗(yàn)前，將籽晶添加到結(jié)晶板中，增加了實(shí)驗(yàn)者的人力與時(shí)間成本。由于這些原因，該技術(shù)在推廣應(yīng)用方面受到了明顯的限制。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種在結(jié)晶板上預(yù)布交聯(lián)微、納米級(jí)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶的途徑，能夠在保證結(jié)晶條件篩選的優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，徹底解決籽晶穩(wěn)定性、使用方便性等問題。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案包括以下步驟：
第一步，配制溶解蛋白質(zhì)所需的緩沖液；稱取蛋白質(zhì)溶解于蛋白質(zhì)緩沖液中制得蛋白質(zhì)溶液；吸取蛋白質(zhì)溶液和沉淀劑溶液均勻混合滴入蛋白結(jié)晶板的結(jié)晶孔中；密封蛋白結(jié)晶板，并將結(jié)晶板置于4-20℃環(huán)境中結(jié)晶；
第二步，把蛋白質(zhì)晶體從蛋白結(jié)晶板的結(jié)晶孔中轉(zhuǎn)移到交聯(lián)劑中進(jìn)行交聯(lián)；交聯(lián)實(shí)驗(yàn)體系放置于4-16℃環(huán)境中，反應(yīng)過程不斷攪拌，12-24小時(shí)后制得微、納米級(jí)籽晶儲(chǔ)存液；
第三步，配置體積比為0.1～2％的醋酸溶液作為高分子聚合物殼聚糖、聚乙烯醇的溶劑；稱取高分子聚合物，加入到醋酸溶液中，40-60℃下攪拌5-24小時(shí)，配制成質(zhì)量體積比為0.1～1％的高分子聚合物粘合劑；
第四步，用去離子水洗滌蛋白結(jié)晶板三次，并置于40-80℃加熱烘干；將0.1～1％的高分子聚合物粘合劑均勻的涂布于蛋白結(jié)晶板上，形成一層0.1～0.5μm厚度均勻的透明高分子聚合物粘合膜；將蛋白結(jié)晶板放置在超凈臺(tái)中風(fēng)干1～10分鐘；
第五步，在每個(gè)結(jié)晶孔的高分子聚合物粘合膜上散布微、納米級(jí)交聯(lián)籽晶的懸浮液；將蛋白結(jié)晶板恒溫干燥，直至蛋白結(jié)晶板上溶液完全干燥，即獲得預(yù)布微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶、用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的結(jié)晶板。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明所采用的交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶為微、納米級(jí)，微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶為蛋白質(zhì)分子提供晶格匹配，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)分子形成有序的分子團(tuán)簇，降低形核壁壘，伴隨著晶格的外延生長(zhǎng)，進(jìn)而形成晶核。添加微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶使晶體的形核生長(zhǎng)過程處于結(jié)晶體系溶液濃度較低的狀態(tài)，能夠避免蛋白質(zhì)結(jié)晶體系達(dá)到較高的濃度形核后蛋白質(zhì)晶體依然在高濃度下生長(zhǎng)。這種方法在增加結(jié)晶篩選條件數(shù)的基礎(chǔ)上，同時(shí)也能提高蛋白質(zhì)晶體的衍射質(zhì)量。
本發(fā)明所采用的交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體籽晶可穩(wěn)定存在于常溫環(huán)境并且可以適應(yīng)ph等外界條件的變化。未經(jīng)過交聯(lián)處理的蛋白質(zhì)晶體非常脆弱，很容易被氧化，不能承受大范圍ph值的變動(dòng)，而且只能儲(chǔ)存于4℃溫度條件下。經(jīng)過交聯(lián)的蛋白質(zhì)晶體作為籽晶徹底解決了穩(wěn)定性問題。
本發(fā)明所采用高分子聚合物粘合膜可將籽晶牢固黏附于蛋白質(zhì)結(jié)晶板上。
本發(fā)明所采用高分子聚合物粘合膜對(duì)晶核形成具有促進(jìn)作用。高分子聚合物粘合膜可以幫助吸附并聚集蛋白質(zhì)分子，為結(jié)晶體系由最初均一的蛋白質(zhì)分子狀態(tài)向無序的類液滴分子團(tuán)簇狀態(tài)過度提供幫助，有利于蛋白質(zhì)晶體形核。
本發(fā)明為提高蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)提供一種有效且省時(shí)的方法。直接使用蛋白質(zhì)晶體作為籽晶需要在每次結(jié)晶實(shí)驗(yàn)前將籽晶添加到結(jié)晶板中，增加了實(shí)驗(yàn)者的人力與時(shí)間成本。由于這些原因，該技術(shù)在推廣應(yīng)用方面受到了明顯的限制。而預(yù)布微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶的新型結(jié)晶板提前將微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體布到結(jié)晶板上，解決了方便性問題。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，本發(fā)明包括但不僅限于下述實(shí)施例。
本發(fā)明提供一種預(yù)布微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶、用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板的制備方法，這種微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)籽晶可于室溫穩(wěn)定儲(chǔ)存并且牢固黏附于結(jié)晶板上，可有效提高蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選的成功率，同時(shí)，在研究中，直接使用結(jié)晶板，可減少散布籽晶的流程，大幅減少研究者的時(shí)間和操作成本，能夠取代現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室常用的結(jié)晶板，實(shí)現(xiàn)更高效的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選和優(yōu)化。
本發(fā)明所采用的方案：首先獲得蛋白質(zhì)晶體并利用交聯(lián)方式制得微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)籽晶儲(chǔ)存液，其次將粘合劑均勻涂布于蛋白結(jié)晶板的結(jié)晶孔中，在粘合劑上散布微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體，最后置于恒溫干燥箱中干燥處理，即可獲得預(yù)布微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶、用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板。具體步驟如下：
第一步：獲得蛋白質(zhì)晶體。a)配制溶解蛋白質(zhì)所需的緩沖液。b)稱取蛋白質(zhì)溶解于配制好的蛋白質(zhì)緩沖液中制得蛋白質(zhì)溶液。c)用機(jī)械手吸取蛋白質(zhì)溶液和沉淀劑溶液均勻混合滴入蛋白結(jié)晶板的結(jié)晶孔中。d)密封蛋白結(jié)晶板，并將結(jié)晶板放入4-20℃控溫箱中結(jié)晶；
第二步：利用交聯(lián)方式制得交聯(lián)微、納米級(jí)籽晶。把蛋白質(zhì)晶體用移液器從蛋白結(jié)晶板的結(jié)晶孔中轉(zhuǎn)移到交聯(lián)劑中進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)實(shí)驗(yàn)體系放置于4-16℃環(huán)境中，反應(yīng)過程用轉(zhuǎn)子不斷的進(jìn)行攪拌，12-24小時(shí)后制得微、納米級(jí)籽晶儲(chǔ)存液；
第三步：制取高分子聚合物粘合劑。a)配置體積比為0.1-2％的醋酸溶液作為高分子聚合物殼聚糖、聚乙烯醇的溶劑。b)稱取高分子聚合物，加入到0.1-2％的醋酸溶液中，40-60℃下用轉(zhuǎn)子攪拌5-24小時(shí)，配制成質(zhì)量體積比為0.1-1％的高分子聚合物粘合劑；
第四步：將粘合劑涂布于蛋白結(jié)晶板中。a)用去離子水洗滌蛋白結(jié)晶板三次，并置于40-80℃烘箱中加熱烘干。b)用機(jī)械手將0.1-1％的高分子聚合物粘合劑均勻的涂布于蛋白結(jié)晶板上，形成一層0.1-0.5μm厚度均勻的透明高分子聚合物粘合膜。c)將涂布好0.1-1％的高分子聚合物粘合劑的蛋白結(jié)晶板放置在超凈臺(tái)中風(fēng)干1-10分鐘，以促進(jìn)高分子聚合物粘合膜中水分及醋酸的揮發(fā)；
第五步：將交聯(lián)籽晶散布于蛋白結(jié)晶板結(jié)晶孔的粘合劑上，干燥后即可獲得新型蛋白質(zhì)結(jié)晶板。a)用機(jī)械手在每個(gè)結(jié)晶孔的高分子聚合物粘合膜上散布上微、納米級(jí)交聯(lián)籽晶的懸浮液。b)將散布好籽晶的蛋白結(jié)晶板置入恒溫干燥箱中干燥處理，直至蛋白結(jié)晶板上溶液完全干燥，即可獲得預(yù)布微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶、用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板。
本發(fā)明的實(shí)施例主要包括以下兩個(gè)方面：1.制備預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板；2.利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)。
制備預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板主要包括以下五個(gè)步驟：
第一步：獲得蛋白質(zhì)晶體；
第二步：利用交聯(lián)方式制得交聯(lián)微、納米級(jí)籽晶；
第三步：制備高分子聚合物粘合劑；
第四步：將粘合劑涂布于蛋白結(jié)晶板中；
第五步：將交聯(lián)籽晶散布于蛋白結(jié)晶板結(jié)晶孔的粘合劑上，干燥后即可獲得新型蛋白質(zhì)結(jié)晶板。
利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)：
第一步：用蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)，將蛋白質(zhì)與沉淀劑按一定比例混合，加入新型結(jié)晶板的結(jié)晶孔中，密封結(jié)晶板，將結(jié)晶板放于20攝氏度控溫箱中結(jié)晶；
第二步：統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)并觀察蛋白質(zhì)晶體形貌。
實(shí)例1
檢測(cè)預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板提升了蛋白酶k蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件篩選數(shù)。
檢測(cè)一種預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白酶k蛋白質(zhì)的結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板的具體方案主要包括以下兩個(gè)方面：1.制備預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板；2.利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板進(jìn)行蛋白酶k蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)。
制備預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板主要包括以下五個(gè)步驟：
第一步：獲得溶菌酶蛋白質(zhì)晶體。a)配制溶菌酶蛋白質(zhì)緩沖液：濃度為0.1m，ph為4.6的醋酸鈉緩沖液。b)購買于日本seikagaku公司的溶菌酶蛋白質(zhì)不再作進(jìn)一步的純化等處理直接溶入緩沖液中配成終濃度為20mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。c)用機(jī)械手吸取1μl溶菌酶蛋白溶液和1μl濃度為60mg/ml的氯化鈉溶液混合均勻后滴入蛋白結(jié)晶板的結(jié)晶孔中。d)用膠帶密封蛋白結(jié)晶板，并將蛋白結(jié)晶板放入4℃控溫箱中結(jié)晶；
第二步：利用戊二醛作為交聯(lián)劑制得交聯(lián)微、納米級(jí)籽晶。把溶菌酶晶體用移液器從結(jié)晶板的結(jié)晶孔中轉(zhuǎn)移到溫度為4℃的5％的戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)實(shí)驗(yàn)體系放置于4℃環(huán)境中，反應(yīng)過程用轉(zhuǎn)子不斷的進(jìn)行攪拌，24小時(shí)后制得微、納米級(jí)籽晶儲(chǔ)存液；
第三步：制取0.1％的高分子聚合物殼聚糖粘合劑。a)配置體積比為1％的醋酸溶液作為殼聚糖的溶劑。b)稱取殼聚糖粉末，加入到1％的醋酸溶液中，40℃下用轉(zhuǎn)子攪拌過夜，配制成質(zhì)量體積比為0.1％的殼聚糖溶液；
第四步：將粘合劑涂布于蛋白結(jié)晶板中。a)用去離子水洗滌蛋白結(jié)晶板三次，并置于60℃烘箱中加熱烘干。b)用機(jī)械手系統(tǒng)將0.1％的殼聚糖溶液均勻的涂布于蛋白結(jié)晶板上，形成一層0.1μm厚度均勻的透明殼聚糖膜。c)將涂布好的0.1％的殼聚糖溶液的蛋白結(jié)晶板放置在超凈臺(tái)中風(fēng)干3分鐘，以促進(jìn)殼聚糖膜中水分及醋酸的揮發(fā)；
第五步：將交聯(lián)微、納米籽晶散布于蛋白結(jié)晶板結(jié)晶孔的粘合劑上，干燥后即可獲得新型蛋白質(zhì)結(jié)晶板。a)用機(jī)械手系統(tǒng)在每個(gè)結(jié)晶孔的殼聚糖膜上散布微、納米級(jí)交聯(lián)籽晶懸浮液。b)將散布好籽晶的蛋白結(jié)晶板置入60℃的恒溫干燥箱中干燥處理，直至蛋白結(jié)晶板上溶液完全干燥，即可獲得預(yù)布微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶、用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板。
利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板進(jìn)行蛋白酶k蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)：
利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板檢測(cè)蛋白酶k蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)提升情況主要有三個(gè)步驟。第一步：制備蛋白酶k(美國(guó)sigma公司no.p6556)溶液，將蛋白酶k溶入ph為3，0.5mhepes-na緩沖溶液中配成終濃度為16mg/ml蛋白質(zhì)溶液。第二步：利用indextm結(jié)晶條件篩選試劑盒進(jìn)行結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)。利用機(jī)械手將蛋白質(zhì)溶液與沉淀劑按照1：1比例混合，在每個(gè)結(jié)晶孔中加入2μl的混合溶液，密封結(jié)晶板，置于20攝氏度控溫箱中結(jié)晶7天。實(shí)驗(yàn)組采用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板，對(duì)照組采用普通的蛋白結(jié)晶板。第三步：在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組蛋白酶k蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)，并觀察晶體形貌。
觀察發(fā)現(xiàn)，預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板中晶體形貌優(yōu)于普通的蛋白結(jié)晶板；此外相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的結(jié)晶條件篩選數(shù)有大幅度提升，結(jié)晶條件篩選成功率提高1.6倍。
實(shí)例2
檢測(cè)預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板提升了過氧化氫酶蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件篩選數(shù)。
檢測(cè)一種預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高過氧化氫酶蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板的具體方案主要包括以下兩個(gè)方面：1.制備預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板；2.利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板進(jìn)行過氧化氫酶蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)。
制備預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板主要包括以下五個(gè)步驟：
第一步：獲得溶菌酶蛋白質(zhì)晶體。a)配制溶菌酶蛋白質(zhì)緩沖液：濃度為0.1m，ph為4.6的醋酸鈉緩沖液。b)購買于日本seikagaku公司的溶菌酶蛋白質(zhì)不再作進(jìn)一步的純化等處理直接溶入緩沖液中配成終濃度為20mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。c)用機(jī)械手吸取1μl溶菌酶蛋白溶液和1μl濃度為60mg/ml的氯化鈉溶液混合均勻后滴入蛋白結(jié)晶板的結(jié)晶孔中。d)用膠帶密封蛋白結(jié)晶板，并將蛋白結(jié)晶板放入4℃控溫箱中結(jié)晶；
第二步：利用戊二醛作為交聯(lián)劑制得交聯(lián)微、納米級(jí)籽晶。把溶菌酶晶體用移液器從結(jié)晶板的結(jié)晶孔中轉(zhuǎn)移到溫度為4℃的5％的戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)實(shí)驗(yàn)體系放置于4℃環(huán)境中，反應(yīng)過程用轉(zhuǎn)子不斷的進(jìn)行攪拌，24小時(shí)后制得微、納米級(jí)籽晶儲(chǔ)存液；
第三步：制取0.1％的高分子聚合物殼聚糖粘合劑。a)配置體積比為1％的醋酸溶液作為殼聚糖的溶劑。b)稱取殼聚糖粉末，加入到1％的醋酸溶液中，40℃下用轉(zhuǎn)子攪拌過夜，配制成質(zhì)量體積比為0.1％的殼聚糖溶液；
第四步：將粘合劑涂布于蛋白結(jié)晶板中。a)用去離子水洗滌蛋白結(jié)晶板三次，并置于60℃烘箱中加熱烘干。b)用機(jī)械手系統(tǒng)將0.1％的殼聚糖溶液均勻的涂布于蛋白結(jié)晶板上，形成一層0.1μm厚度均勻的透明殼聚糖膜。c)將涂布好的0.1％的殼聚糖溶液的蛋白結(jié)晶板放置在超凈臺(tái)中風(fēng)干3分鐘，以促進(jìn)殼聚糖膜中水分及醋酸的揮發(fā)；
第五步：將交聯(lián)微、納米籽晶散布于蛋白結(jié)晶板結(jié)晶孔的粘合劑上，干燥后即可獲得新型蛋白質(zhì)結(jié)晶板。a)用機(jī)械手系統(tǒng)在每個(gè)結(jié)晶孔的殼聚糖膜上散布微、納米級(jí)交聯(lián)籽晶懸浮液。b)將散布好籽晶的蛋白結(jié)晶板置入60℃的恒溫干燥箱中干燥處理，直至蛋白結(jié)晶板上溶液完全干燥，即可獲得預(yù)布微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶、用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板。
利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板進(jìn)行過氧化氫酶蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)：
利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板檢測(cè)過氧化氫酶蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)提升情況主要有三個(gè)步驟：第一步：制備過氧化氫酶(美國(guó)sigma公司no.c40)溶液，將過氧化氫酶蛋白質(zhì)溶入ph為3，0.5mhepes-na緩沖溶液中配成終濃度為10mg/ml蛋白質(zhì)溶液。第二步：利用indextm結(jié)晶條件篩選試劑盒進(jìn)行結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)。利用機(jī)械手將蛋白質(zhì)溶液與沉淀劑按照1：1比例混合，在每個(gè)結(jié)晶孔中加入2μl相應(yīng)的混合溶液，密封結(jié)晶板，置于20攝氏度控溫箱中結(jié)晶7天。實(shí)驗(yàn)組采用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板，對(duì)照組采用普通蛋白結(jié)晶板。第三步：在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組過氧化氫酶蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)，并觀察晶體形貌。
觀察發(fā)現(xiàn)，預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板中晶體形貌優(yōu)于普通蛋白結(jié)晶板；相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的結(jié)晶條件篩選數(shù)有大幅度提升，結(jié)晶條件篩選成功率提高2.5倍。
實(shí)例3
檢測(cè)預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板提升了葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件篩選數(shù)。
檢測(cè)一種預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率新型結(jié)晶板的具體方案主要包括以下兩個(gè)方面：1.制備預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板；2.利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板進(jìn)行葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)實(shí)驗(yàn)。
制備預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板主要包括以下五個(gè)步驟：
第一步：獲得溶菌酶蛋白質(zhì)晶體。a)配制溶菌酶蛋白質(zhì)緩沖液：濃度為0.1m，ph為4.6的醋酸鈉緩沖液。b)購買于日本seikagaku公司的溶菌酶蛋白質(zhì)不再作進(jìn)一步的純化等處理直接溶入緩沖液中配成終濃度為20mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。c)用機(jī)械手吸取1μl溶菌酶蛋白溶液和1μl濃度為60mg/ml的氯化鈉溶液混合均勻后滴入蛋白結(jié)晶板的結(jié)晶孔中。d)用膠帶密封蛋白結(jié)晶板，并將蛋白結(jié)晶板放入4℃控溫箱中結(jié)晶；
第二步：利用戊二醛作為交聯(lián)劑制得交聯(lián)微、納米級(jí)籽晶。把溶菌酶晶體用移液器從結(jié)晶板的結(jié)晶孔中轉(zhuǎn)移到溫度為4℃的5％的戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)實(shí)驗(yàn)體系放置于4℃環(huán)境中，反應(yīng)過程用轉(zhuǎn)子不斷的進(jìn)行攪拌，24小時(shí)后制得微、納米級(jí)籽晶儲(chǔ)存液；
第三步：制取0.1％的高分子聚合物殼聚糖粘合劑。a)配置體積比為1％的醋酸溶液作為殼聚糖的溶劑。b)稱取殼聚糖粉末，加入到1％的醋酸溶液中，40℃下用轉(zhuǎn)子攪拌過夜，配制成質(zhì)量體積比為0.1％的殼聚糖溶液；
第四步：將粘合劑涂布于蛋白結(jié)晶板中。a)用去離子水洗滌蛋白結(jié)晶板三次，并置于60℃烘箱中加熱烘干。b)用機(jī)械手系統(tǒng)將0.1％的殼聚糖溶液均勻的涂布于蛋白結(jié)晶板上，形成一層0.1μm厚度均勻的透明殼聚糖膜。c)將涂布好的0.1％的殼聚糖溶液的蛋白結(jié)晶板放置在超凈臺(tái)中風(fēng)干3分鐘，以促進(jìn)殼聚糖膜中水分及醋酸的揮發(fā)；
第五步：將交聯(lián)微、納米籽晶散布于蛋白結(jié)晶板結(jié)晶孔的粘合劑上，干燥后即可獲得新型蛋白質(zhì)結(jié)晶板。a)用機(jī)械手系統(tǒng)在每個(gè)結(jié)晶孔的殼聚糖膜上散布微、納米級(jí)交聯(lián)籽晶懸浮液。b)將散布好籽晶的蛋白結(jié)晶板置入60℃的恒溫干燥箱中干燥處理，直至蛋白結(jié)晶板上溶液完全干燥，即可獲得預(yù)布微、納米級(jí)交聯(lián)蛋白質(zhì)晶體作為籽晶、用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板。
利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板進(jìn)行葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件篩選數(shù)實(shí)驗(yàn)：
利用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶的新型結(jié)晶板檢測(cè)葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)提升情況主要有三個(gè)步驟：第一步：制備葡萄糖異構(gòu)酶(美國(guó)hamptonresearch公司no.hr7)溶液，將葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)溶入ph為3，0.5mhepes-na緩沖溶液中配成終濃度為18mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。第二步：利用indextm結(jié)晶條件篩選試劑盒進(jìn)行結(jié)晶條件篩選實(shí)驗(yàn)。利用機(jī)械手將蛋白質(zhì)溶液與沉淀劑按照1：1比例混合，在每個(gè)結(jié)晶孔中加入2μl相應(yīng)的混合溶液，密封結(jié)晶板，置于20攝氏度控溫箱中結(jié)晶7天。實(shí)驗(yàn)組采用預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板，對(duì)照組采用普通蛋白結(jié)晶板。第三步：在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選數(shù)，并觀察晶體形貌。
觀察發(fā)現(xiàn)，預(yù)布微、納米級(jí)籽晶提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的新型結(jié)晶板中晶體形貌優(yōu)于普通蛋白質(zhì)結(jié)晶板；相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組結(jié)晶條件篩選數(shù)有大幅度提升，成功率提高4.5倍。