本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基制備方法。
背景技術(shù)：
香菇栽培始源于中國，至今已有800年以上的歷史。最早于宋朝浙江慶元縣龍巖村的農(nóng)民吳三公發(fā)明了砍花栽培法，后擴(kuò)散全國。經(jīng)僧人交往傳入日本。香菇的砍花栽培源于中國，現(xiàn)行的段木純菌絲接種栽培則源于日本。至1989年，中國香菇總產(chǎn)首次超過日本，一躍成為世界香菇生產(chǎn)第一大國。
印度梨形孢是一種可進(jìn)行純培養(yǎng)的類菌根真菌，該菌以菌絲體、菌絲卷、分枝或者圓形體的方式定殖于寄主植物根的胞間和胞內(nèi)。已有研究表明：該菌能促進(jìn)12科24種植物的生長，并能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性和提高對逆境脅迫的忍耐性，加快插枝側(cè)根的形成和促進(jìn)微繁殖植物的硬化。
如何將微生物培養(yǎng)基應(yīng)用在香菇的培育中是廣泛研究的問題，現(xiàn)有的微生物培養(yǎng)基也有自己的不足之處，如微生物培養(yǎng)基長期的活性，促進(jìn)機(jī)制研究不精細(xì)等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明提供了一種培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基制備方法，該方法優(yōu)化了印度梨形孢的處理工藝，以期改善現(xiàn)有香菇培養(yǎng)基的不足，并進(jìn)一步的提供了采用印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基進(jìn)行香菇培育的方法。
本發(fā)明第一方面提供了一種培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基制備方法，步驟包括：
(1)將印度梨形孢接種于kafer培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速120～150r/min，26～30℃下振蕩培養(yǎng)6～8d，培養(yǎng)結(jié)束取樣測定活菌數(shù)，并將培養(yǎng)物溶于蒸餾水中使每毫升溶液中活菌數(shù)為1×106個；
(2)將步驟(1)得到的菌數(shù)為1×106個/ml的菌液按接種量1～15％的比例噴灑到秸稈培養(yǎng)基表面，25～37℃下發(fā)酵12～24h后即得培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基。
本發(fā)明第二方面提供了一種香菇培育方法，該方法將上述制備方法得到的培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基用于培育香菇，步驟包括：在無菌條件下，將香菇菇體擦凈、消毒后，取菌柄與菌蓋交界處的菌肉接種至印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基中培養(yǎng)50～60d。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明為制備微生物培養(yǎng)基、提高微生物的臨床應(yīng)用效果提供技術(shù)依據(jù)；本發(fā)明添加了印度梨形孢，能促進(jìn)香菇根絲生長，進(jìn)而提高香菇產(chǎn)量；本發(fā)明通過單因素試驗對印度梨形孢培養(yǎng)基培養(yǎng)香菇進(jìn)行優(yōu)化，得到了最佳的培育條件，為工業(yè)化大生產(chǎn)提供了技術(shù)依據(jù)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明第一方面提供了一種培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基制備方法，步驟包括：
(1)將印度梨形孢接種于kafer培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速120～150r/min，26～30℃下置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)6～8d，培養(yǎng)結(jié)束取樣測定活菌數(shù)，并將培養(yǎng)物溶于蒸餾水中使每毫升溶液中活菌數(shù)為1×106個；
(2)將步驟(1)得到的菌數(shù)為1×106個/ml的菌液按接種量1～15％的比例噴灑到秸稈培養(yǎng)基表面，25～37℃下發(fā)酵12～24h后即得培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基。
優(yōu)選的，所述秸稈培養(yǎng)基配方為：以重量百分比計，玉米秸稈粉62％、木屑26％、麥麩10％、蔗糖1％、石膏1％。按照秸稈培養(yǎng)基配方將原料軋碎，混合均勻即制成秸稈培養(yǎng)基，供后續(xù)使用。
更加優(yōu)選的，步驟(2)所述接種量為5％。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，固定發(fā)酵菌種，將活菌數(shù)為1×106個/ml的菌液接種到秸稈培養(yǎng)基中，接種量分別為1％、5％、10％、15％(v/g)，置于34℃培養(yǎng)24h。在無菌條件下，將菇體擦凈、消毒后，去菌柄于菌蓋交界處的菌肉接種，選擇香菇最佳的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)50-60d。根據(jù)香菇生長狀況選擇最佳的菌種接種量。
更加優(yōu)選的，步驟(2)所述發(fā)酵的時間為18h。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，將其他培養(yǎng)條件固定，將活菌數(shù)為1×106個/ml的菌液均勻噴灑到秸稈培養(yǎng)基表面中，分別培養(yǎng)12h、18h、24h。在無菌條件下，將菇體擦凈、消毒后，去菌柄于菌蓋交界處的菌肉接種，選擇香菇最佳的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)55d。根據(jù)香菇生長狀況選擇最佳的發(fā)酵時間。
優(yōu)選的，步驟(1)中將印度梨形孢接種于kafer培養(yǎng)基后，轉(zhuǎn)速120～150r/min，28℃下振蕩培養(yǎng)7d。
本發(fā)明第二方面提供了一種香菇培育方法，該方法將上述制備方法得到的培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基用于培育香菇，步驟包括：在無菌條件下，將香菇菇體擦凈、消毒后，取菌柄與菌蓋交界處的菌肉接種至印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基中培養(yǎng)50～60d。
優(yōu)選的，所述培養(yǎng)時間為55d。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，根據(jù)確定的最佳發(fā)酵溫度，固定其他培養(yǎng)條件，將活菌數(shù)為1×106個/ml的菌液接種到秸稈培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)50d、55d、60d，根據(jù)香菇生長狀況選擇合理的培養(yǎng)時間。
優(yōu)選的，所述香菇選取菇型正、生長健壯、7成熟的新鮮香菇子實(shí)體。
下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明提供的一種培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基制備方法予以進(jìn)一步說明。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗材料如無特殊說明，均為市場購買得到。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了一種培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基制備方法，并用于培育香菇，并對制備過程中發(fā)酵時間進(jìn)行了篩選。
本實(shí)施例中所用kafer培養(yǎng)基的組成采用本領(lǐng)域常規(guī)配方即可。
所用微生物印度梨形孢由長江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所提供，微生物來源并不僅限于此，市場購買或分離得到的印度梨形孢均能得到近似效果。
所用秸稈培養(yǎng)基配方為：玉米秸稈粉62％、木屑26％、麥麩10％、蔗糖1％、石膏1％。
一種培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基制備方法，步驟包括：
(1)將印度梨形孢接種于kafer培養(yǎng)基，置回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120r/min，28℃下培養(yǎng)17h。培養(yǎng)結(jié)束取樣測定活菌數(shù)，并調(diào)整活菌數(shù)為1×106個/ml。
活菌數(shù)的計數(shù)方法采用顯微直接計數(shù)法。具體的操作方法為：取1g培養(yǎng)物溶于5ml蒸餾水中，備用。去潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)蓋上一塊蓋玻片。將藥物的混懸液搖勻，用移液器吸取少量混懸液，滴入計數(shù)板。靜置片刻后計數(shù)?，F(xiàn)在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。計數(shù)時，若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下4個大方格的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述4個大方格外，還需數(shù)中央1個大方格的菌數(shù)。菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。
每ml混懸液中含有細(xì)菌數(shù)＝每個小格中細(xì)菌平均數(shù)(n)×系數(shù)(k＝4×106)×混懸液稀釋倍數(shù)(d)。
(2)將其他培養(yǎng)條件固定，(1)得到的菌液均勻噴灑到秸稈培養(yǎng)基表面中，分別置于28℃下培養(yǎng)12h、18h、24h，即得不同發(fā)酵條件對應(yīng)的培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基。
將上述培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基分別用于香菇培養(yǎng)，步驟如下：選擇香菇菇型正、生長健壯、7成熟的新鮮香菇子實(shí)體作為接種材料。在無菌條件下，將菇體擦凈、消毒后，去菌柄于菌蓋交界處的菌肉接種，選擇香菇最佳的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)55d。培養(yǎng)結(jié)束后，測定印度梨形孢培養(yǎng)基蘑菇的根絲長度和產(chǎn)量相比于秸稈培養(yǎng)基產(chǎn)量的優(yōu)化比例。結(jié)果見表1。
表1不同發(fā)酵時間下香菇根絲長度和產(chǎn)量優(yōu)化比
根據(jù)表1結(jié)果，確定最佳發(fā)酵時間為18h。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供了一種培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基制備方法，并用于培育香菇，并對制備過程中最佳的菌種接種量進(jìn)行了篩選。
(1)根據(jù)實(shí)施例一的結(jié)果，固定發(fā)酵時間為18h，通過單因素試驗改變培養(yǎng)基的配方，具體配方見表2。
表2印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基的配方
按照秸稈培養(yǎng)基配方將原料軋碎，混合制成秸稈培養(yǎng)基培養(yǎng)備用。
(2)通過單因素試驗改變培養(yǎng)基的配方，按照表2的試驗方案，將活菌數(shù)為1×106個/ml的菌液接種到秸稈培養(yǎng)基中，接種量分別為1％、5％、10％、15％(v/g)，置于34℃培養(yǎng)24h，即得不同發(fā)酵條件對應(yīng)的培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基；
將上述培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基分別用于香菇培養(yǎng)，步驟如下：選擇香菇菇型正、生長健壯、7成熟的新鮮香菇子實(shí)體作為接種材料。在無菌條件下，將菇體擦凈、消毒后，去菌柄于菌蓋交界處的菌肉接種，選擇香菇最佳的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)50d。所述香菇培養(yǎng)溫度可以是28℃。測定印度梨形孢培養(yǎng)基蘑菇的根絲長度和產(chǎn)量相比于秸稈培養(yǎng)基產(chǎn)量的優(yōu)化比例。結(jié)果見表3。
表3不同接種量條件下香菇根絲長度和單位重量優(yōu)化比
根據(jù)表3的結(jié)果，確定微生物培養(yǎng)基為2號，即印度梨形孢：秸稈培養(yǎng)基為5:95。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供了一種培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基制備方法，并用于培育香菇，并對制備過程中最佳的香菇培養(yǎng)時間進(jìn)行了篩選。
一種培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基制備方法，步驟包括：
(1)將印度梨形孢接種于kafer培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速150r/min，28℃下振蕩培養(yǎng)7d，培養(yǎng)結(jié)束取樣測定活菌數(shù)，并將培養(yǎng)物溶于蒸餾水中使每毫升溶液中活菌數(shù)為1×106個；
(2)將步驟(1)得到的菌數(shù)為1×106個/ml的菌液按接種量5％的比例噴灑到秸稈培養(yǎng)基表面，34℃下發(fā)酵24h后即得培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基。
將上述培育香菇的印度梨形孢秸稈培養(yǎng)基分別用于香菇培養(yǎng)，步驟如下：
選擇香菇菇型正、生長健壯、7成熟的新鮮香菇子實(shí)體作為接種材料。在無菌條件下，將菇體擦凈、消毒后，去菌柄于菌蓋交界處的菌肉接種，選擇香菇最佳的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)50d、55d、60d。測定印度梨形孢培養(yǎng)基蘑菇的根絲長度和產(chǎn)量相比于秸稈培養(yǎng)基產(chǎn)量的優(yōu)化比例。結(jié)果見表4。
表4各培養(yǎng)時間下的香菇根絲長度和重量優(yōu)化比
根據(jù)表4的結(jié)果，確定培養(yǎng)蘑菇的時間為55d。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。