間 對(duì)低值水產(chǎn)品發(fā)酵效果的影響。
[0049]2. 5響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0050] 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定了需要優(yōu)化的因素，采用中心組合設(shè)計(jì)（central compositedesign, (XD)，對(duì)關(guān)鍵因子進(jìn)一步研宄，以獲得混和菌株發(fā)酵的最佳條件。
[0051] 2. 6數(shù)據(jù)處理
[0052] 所有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析統(tǒng)計(jì)均采用Design_Expert7. 0軟件進(jìn)行。
[0053] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0054] 3. 1游離氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0055] 以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，游離氨基酸態(tài)氮含量為縱坐標(biāo)，得到游離氨基酸態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)曲線 如圖1所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，得線性回歸曲線為：y=121. 98x-l. 2967,R2= 0. 9982,說明曲 線可信度較高，可以運(yùn)用。
[0056] 3. 2發(fā)酵單因素試驗(yàn)
[0057] 3. 2. 1轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵效果的影響
[0058] 發(fā)酵體系的含氧量是影響微生物生長的重要因素之一，而轉(zhuǎn)速正是決定含氧量的 重要條件。為了確定適宜的轉(zhuǎn)速，本試驗(yàn)設(shè)定種子液接種量5%，溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速分別 設(shè)定為120印111、160印111、200印111、240印111，培養(yǎng)7211后，檢測各樣品的游離氨基態(tài)氮含量，每 組做三個(gè)平行樣。結(jié)果如圖2所示。
[0059]由圖2可知，發(fā)酵液中游離氨基酸態(tài)氮的含量隨搖床轉(zhuǎn)速增大呈先上升后平穩(wěn)、 略微下降的趨勢，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200rpm時(shí)，游離氨基酸態(tài)氮的含量趨于最高值。隨著搖床 轉(zhuǎn)速增加，發(fā)酵液流體湍動(dòng)程度增大，氣相間的傳質(zhì)和液相中的傳質(zhì)過程加快，溶解氧的溶 解速度也越快，對(duì)菌體生長和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化有利。而當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大時(shí)，發(fā)酵液中溶解 氧濃度達(dá)到上限，此時(shí)轉(zhuǎn)速再快溶解氧也不會(huì)增加，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化也達(dá)到平穩(wěn)。故選擇轉(zhuǎn)速 200rpm為較佳參數(shù)。
[0060] 3. 2. 2接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響
[0061] 菌株的接種量直接影響到降解原料中有機(jī)質(zhì)的速度和程度。接種量過少會(huì)導(dǎo)致發(fā) 酵過程緩慢，降解效果不佳；接種量過高，也可能導(dǎo)致菌體過度生長抑制了蛋白酶的分泌， 造成蛋白質(zhì)降解率下降。為了確定適宜的接種量，本試驗(yàn)將接種量分別設(shè)定為5%、10%、 15 %、20 %，搖床溫度28°C，轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)72h，分別測定各組樣品的游離氨基酸態(tài)氮含 量，每組做三個(gè)平行樣。結(jié)果如圖3所示。
[0062]由圖3可知，游離氨基酸態(tài)氮的含量隨接種量的增加呈先上升后緩慢下降的趨 勢，當(dāng)接種量為5%時(shí)，游離氨基酸態(tài)氮的含量趨于最高值。原因?yàn)殡S著接種量的增加，微生 物的延遲期縮短，菌體迅速生長，產(chǎn)生的蛋白酶的總量也多，所以小分子肽和氨基酸含量都 逐漸升高；隨著接種量繼續(xù)增加，可能由于菌種生長過快，造成營養(yǎng)競爭乃至缺乏，蛋白酶 的分泌減少，導(dǎo)致小分子肽和氨基酸含量都有所下降。故選擇接種量5%為較佳參數(shù)。
[0063] 3. 2. 3溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響
[0064] 溫度變化與微生物生長代謝緊密相關(guān)，過高或過低的溫度均不利于微生物生長及 代謝的進(jìn)行。為了確定適宜的溫度范圍，本試驗(yàn)分別設(shè)定溫度為26°C、28°C、30°C、32°C、 34°C，接種量5%，轉(zhuǎn)速160rpm，培養(yǎng)72h，分別檢測各組樣品的游離氨基態(tài)氮含量，每組樣 品做三個(gè)平行樣。結(jié)果如圖4所示。
[0065]由圖4可知，發(fā)酵液中游離氨基酸態(tài)氮的含量隨溫度的增加呈先升后降趨勢，當(dāng) 發(fā)酵溫度為30°C時(shí)，游離氨基酸態(tài)氮的含量趨于最大值。這是因?yàn)闇囟容^低時(shí)，酶活受到影 響，不能很好地降解蛋白質(zhì)，而溫度過高易使酶失活，菌體加速衰老，影響發(fā)酵周期。因此選 擇溫度30°C為較佳參數(shù)。
[0066] 3. 2. 4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響
[0067] 在發(fā)酵過程中，一般隨時(shí)間的延長菌株對(duì)有機(jī)質(zhì)的降解率逐漸增加，但達(dá)到一定 時(shí)間后，降解率趨于不變。為了確定適宜的培養(yǎng)時(shí)間，本試驗(yàn)設(shè)定接種量5%，溫度28°C，轉(zhuǎn) 速160rpm，培養(yǎng)7天，培養(yǎng)期間，每24h取發(fā)酵液檢測游離氨基態(tài)氮含量，平行測定三次。結(jié) 果如圖5所示。
[0068] 由圖5可知，在1?5d里，發(fā)酵液中游離氨基酸態(tài)氮的含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加有 明顯的上升趨勢，第5天含量達(dá)到最高值，之后游離氨基酸態(tài)氮的含量趨于平穩(wěn)。故考慮實(shí) 際生產(chǎn)周期越短越好，確定培養(yǎng)時(shí)間為5d。
[0069] 3. 2. 5料液比對(duì)發(fā)酵效果的影響
[0070] 培養(yǎng)基含水量是決定固態(tài)發(fā)酵成敗的關(guān)鍵因素之一。水分不僅影響微生物的生長 代謝，而且與基質(zhì)的理化性質(zhì)也有復(fù)雜關(guān)系。為了確定適宜的料液比，本試驗(yàn)分別設(shè)定料液 比為1:1、1:2、1 :3、1:4、1:5、1:6、1:7、1 :8、1:9，接種量5%，溫度281：，轉(zhuǎn)速160卬111，培養(yǎng) 72h，分別檢測各組樣品的游離氨基態(tài)氮含量，每組做三個(gè)平行樣。結(jié)果如圖6所示。
[0071]由圖6可知，發(fā)酵液中游離氨基酸態(tài)氮的含量隨料液比的減?。此趾吭龃螅?而不斷增加，當(dāng)料液比為1:9時(shí)，游離氨基酸態(tài)氮的含量趨于最大值，之后變化較小。故確 定料液比為1:9為最優(yōu)條件。
[0072] 4、發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果
[0073] 4. 1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
[0074] 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)轉(zhuǎn)速、接種量、溫度3個(gè)因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以這3個(gè)因 素為自變量，以發(fā)酵液中游離氨基酸態(tài)氮的含量為響應(yīng)值，利用Box-Behnken進(jìn)行中心組 合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1、表2)。
[0075] 表1響應(yīng)面因素水平編碼表
[0076] Table1.Factorsandlevelsofresponsesurfacedesign
[0077]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用混合菌種發(fā)酵水產(chǎn)品下腳料的方法，其特征在于：所述方法是利用組合菌種對(duì)水 產(chǎn)品下腳料進(jìn)行發(fā)酵，具體步驟包括： (1) 種子培養(yǎng)：250mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取組合菌種各一環(huán)，接 入滅菌的種子培養(yǎng)基，用封口膜封口，在30°C，203rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對(duì)數(shù)期取 出；所述種子培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基；所述組合菌種為菌株a、菌株b、菌株c和菌株d ; 所述菌株a為食酸菌、菌株b為假單胞菌、菌株c為黑曲霉、菌株d為酵母； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)：250mL錐形瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50mL，按5%接種量將發(fā)酵菌液接入發(fā) 酵培養(yǎng)基中，在28°C，120rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3d ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基按照重量百分比計(jì)含有： 10 %經(jīng)絞碎的水產(chǎn)品下腳料，90 %蒸餾水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)步驟中：所述菌株a為 菌株a:熱帶假絲酵母Candida tropicalis、 菌株b:羅倫隱球酵母Cryptococcus laurentii、 菌株c:枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis、 菌株d:賭樣芽抱桿菌Bacillus cereus。
3. 按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述水產(chǎn)品下腳料包括魚鱗、魚皮及內(nèi)臟混 合物。
4. 按權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述種子培養(yǎng)步驟：250mL錐形瓶中裝 入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取菌株a、菌株b各一環(huán)，菌株c、菌株d各兩環(huán)，接入滅菌的種 子培養(yǎng)基，用封口膜封口，在30 °C，203rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對(duì)數(shù)期取出；所述種子 培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基。
5. 按權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述種子培養(yǎng)步驟：250mL錐形瓶中裝 入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取菌株a、菌株b和菌株c各一環(huán)、菌株d兩環(huán)，接入滅菌的種 子培養(yǎng)基，用封口膜封口，在30 °C，203rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對(duì)數(shù)期取出；所述種子 培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基。
6. 按權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述種子培養(yǎng)步驟：250mL錐形瓶中裝 入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取菌株a -環(huán)，菌株b、菌株c、菌株d各兩環(huán)，接入滅菌的種子 培養(yǎng)基，用封口膜封口，在30°C，203rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對(duì)數(shù)期取出；所述種子培 養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基。
7. 按權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述種子培養(yǎng)步驟：250mL錐形瓶中裝 入種子培養(yǎng)基50mL，用接種環(huán)取菌株a -環(huán)，菌株b、菌株c、菌株d各兩環(huán)，接入滅菌的種子 培養(yǎng)基，用封口膜封口，在30°C，203rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)至菌種的對(duì)數(shù)期取出；所述種子培 養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用混合菌種發(fā)酵水產(chǎn)品下腳料的方法，其特征在于：所述方法利用組合菌株對(duì)水產(chǎn)品下腳料進(jìn)行發(fā)酵，工藝參數(shù)為：轉(zhuǎn)速203rpm、接種量5％、溫度30℃。在此條件下，發(fā)酵液中游離氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到13.865g/L，較優(yōu)化前(12.365g/L)提高了12.13％，符合水溶性氨基酸肥料標(biāo)準(zhǔn)，也適合制備微生物肥料。
【IPC分類】C05C11-00, C05F11-08
【公開號(hào)】CN104591808
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410842419
【發(fā)明人】羅紅宇, 宋敏, 劉為, 童曉倩, 趙玉謹(jǐn)
【申請(qǐng)人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2014年12月30日