新的草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT)基因本申請是申請日為2004年4月29日，申請?zhí)枮?004800183399.0的、發(fā)明名稱和本發(fā)明相同的發(fā)明專利申請的分案申請。依據(jù)37C.F.R.1.71(E)的版權(quán)通告本發(fā)明文件的一部分分開內(nèi)容包括受到版權(quán)保護的材料。版權(quán)所有者不反對任何人復制此專利文件或者專利公開，對于專利商標局的專利文件或者記錄而言，這是顯而易見的，但是無論如何版權(quán)所有者保留所用的版權(quán)。發(fā)明背景將編碼適當?shù)某輨┐x酶類的基因轉(zhuǎn)移到農(nóng)作物中，可以賦予農(nóng)作物對特定除草劑的選擇性。在某些情況下，這些酶類以及編碼它們的核酸來源于植物。在其他情況下，它們來源于其他生物體，例如微生物。參見，例如，Padgette等人(1996)“Newweedcontrolopportunities：DevelopmentofsoybeanswithaRoundUPReadyTMgene”和Vasil(1996)“Phosphinothricin-resistantcrops”，都出自Herbicide-Resistant公司，Duke編輯(CRC出版社，伯克萊屯，佛羅里達州)第54-84頁和第85-91頁。實際上，已經(jīng)從各種生物來源構(gòu)建了表達各種除草劑耐受性/代謝基因的轉(zhuǎn)基因植物，例如，乙酰羥基酸合酶已經(jīng)可以使表達這種酶的植物對多種類型的除草劑產(chǎn)生抗性，已經(jīng)被導入許多植物中(參見。例如Hattori等人(1995)Mol.Gen.genet.246：419)。賦予對除草劑的抗性的其他基因包括：編碼大鼠細胞色素P4507A1和酵母NADPH-細胞色素P450氧化還原酶嵌合蛋白的基因(Shiota等人(1994)PlantPhysiol.106：17)、谷胱甘肽還原酶基因和超氧化物歧化酶基因(Aono等人(1995)PlantCellPhysiol36：1687)以及各種磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(Datta等人(1992)PlantMol.Biol.20：619)。在這方面，作為許多研究的主題的一種除草劑是N-膦酰基甲基甘氨酸，它通常被稱作為草甘膦。草甘膦是世界上最暢銷的除草劑，2003年的銷售量計劃高達50億美元。它是一種廣譜除草劑，可以殺死闊葉植物和草本植物。轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生草甘膦抗性的一種成功的商業(yè)模式是通過導入被修飾的農(nóng)桿菌屬CP45-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯合酶(下文被稱作為EPSP合酶或者EPSPS)基因來實現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因被靶向葉綠體，存在草甘膦時，轉(zhuǎn)基因在葉綠體中能夠連續(xù)地將磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和莽草酸-3-磷酸酯合成為EPSP。相反，草甘膦會抑制天然的EPSP合酶。如果沒有轉(zhuǎn)基因，噴灑過草甘膦的植物會因為EPSP合酶被抑制而很快死亡，EPSP合酶會阻斷芳香性氨基酸、激素和維生素生物合成所需的下游途徑。例如，Monsanto已經(jīng)研制了食品名為“RoundUPReadyTM”的CP4草甘膦抗性的大豆轉(zhuǎn)基因植物。這種情況下，草甘膦被降解的主要機制是通過土壤微生物代謝進行。已經(jīng)確定土壤中的草甘膦的主要代謝產(chǎn)物是氨基甲基膦酸(AMPA)，它最終被轉(zhuǎn)化為銨鹽、磷酸和二氧化碳。圖8中顯示了描述所提出的在土壤中通過AMPA路徑降解草甘膦的代謝過程。如圖9中所描述，通過某些土壤細菌分解草甘膦的其他代謝途徑，肌氨酸途徑，通過首先斷裂C-P鍵而產(chǎn)生無機磷酸和肌氨酸。另一種成功的除草劑/轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物是草銨膦(膦絲菌素)和例如Aventis銷售的LibertyLinkTM。草銨膦也是一種廣譜除草劑。其靶點是葉綠體的谷氨酸合酶?？剐灾参飻y帶來自吸水鏈霉菌的bar基因，并且通過bar的N-乙?；钚垣@得抗性，bar可修飾并解毒谷氨酸。PCT申請WO00/29596中報道了一種能夠使AMPA的伯胺發(fā)生乙?；拿浮５菦]有描述這種酶能夠使具有仲胺的化合物(例如，草甘膦)發(fā)生乙酰化。如上所述，雖然有各種除草劑抗性的策略可被利用，但是其他方法將具有巨大的商業(yè)價值。本發(fā)明提供賦予除草劑以耐受性的新多核苷酸和多肽，以及在閱讀以下公開內(nèi)容時，許多其他優(yōu)點將會變得顯而易見的。發(fā)明概述本發(fā)明提供方法和試劑，用于通過如下描述的一種或多種實施方案，使一種生物，例如植物，對草甘膦產(chǎn)生抗性。本發(fā)明的一個實施方案提供新的多肽，在此被稱作為草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(“GAT”)多肽。GAT多肽被表征為，當GAT多肽相互比對時，就序列相似性而言，它們的結(jié)構(gòu)是彼此相似的。本發(fā)明的GAT多肽具有草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，即催化草甘膦乙?；幕钚?。這些GAT多肽將乙酰基由乙酰CoA轉(zhuǎn)移到草甘膦的N末端上。此外，一些GAT多肽將丙酰CoA的丙?；D(zhuǎn)移到草甘膦的N末端上。一些GAT多肽還能夠催化草甘膦類似物和/或草甘膦代謝產(chǎn)物的乙?；绨被谆⑺?。示例性的GAT多肽對應(yīng)于SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972。還提供在此被稱作為GAT多核苷酸的新多核苷酸，例如SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952。GAT多核苷酸被表征為具有編碼GAT多肽的能力。在本發(fā)明的一些實施方案中，GAT多核苷酸被工程化，用同義密碼子替代一個或多個親本密碼子，以更好地進行植物表達，相對于親本密碼子，這些同義密碼子在植物中被優(yōu)先使用。在其他實施方案中，引入編碼N-末端葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列來修飾GAT多核苷酸。在其他實施方案中，通過將一個或多個含有G+C的密碼子(例如GCG或GCT)插入在緊接和鄰近Met密碼子的下游，來修飾GAT多核苷酸。GAT多肽、GAT多核苷酸和草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性將在下文被更加詳細地描述。本發(fā)明還包括在此描述的GAT多肽和GAT多核苷酸的某些片段。本發(fā)明包括在此描述的多肽和多核苷酸的非天然變體，其中一個或多個編碼多肽的氨基酸被突變。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的GAT多肽被如下表征。當采用B1OSUM62矩陣，存在一個缺口罰11分，和延伸一個缺口罰1分，最佳地與參比氨基酸序列比對時，獲得至少為460的相似性分值，參比氨基酸序列選自由SEQIDNO：300、445或457組成的組，一個或多個如下位置遵從如下限制：(i)在位置18和38上，為Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，為Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，為Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，為Z2氨基酸殘基，其中：Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。本發(fā)明還提供分離的和重組的多肽，包含選自由如下組成的組的氨基酸序列：(a)與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列；(c)與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列；(d)與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列；(g)與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列；(i)與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列；(m)與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列；和(n)與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列。本發(fā)明還提供分離的和重組的多肽，其包含選自由如下組成的組的氨基酸序列：(a)與SEQIDNO：919的位置2-146至少96％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：917、919、921、923、925、927、833、835、839、843、845、859、863、873、877、891、895、901、905、907、913、915或者950)；(b)與SEQIDNO：929的位置2-146至少97％相同的氨基酸序列(例如，SEQIDNO：929、931、835、843、849或者867)；(c)與SEQIDNO：847的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列(例如，SEQIDNO：845或847)；(d)與SEQIDNO：851位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：853的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：855的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：835或855)(g)與SEQIDNO：857的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：861的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列(例如，SEQIDNO：839、861或者883)；(i)與SEQIDNO：871的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：875的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：881的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：885的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列(例如，SEQIDNO：845或885)；(m)與SEQIDNO：887的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(n)與SEQIDNO：889的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：863、889、891或903)；(o)與SEQIDNO：893的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(p)與sEQIDNO：897的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(q)與SEQIDNO：899的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(r)與SEQIDNO：909的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：883或909)；(s)與SEQIDNO：911的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(t)與SEQIDNO：837的位置2-146至少99％相同的氨基酸序列；(u)與SEQIDNO：841的位置2-146至少99％相同的氨基酸序列；(v)與SEQIDNO：865的位置2-146至少99％相同的氨基酸序列；(w)與SEQIDNO：869的位置2-146至少99％相同的氨基酸序列；和(x)與SEQIDNO：879的位置2-146至少99％相同的氨基酸序列。在本發(fā)明的一些實施方案中，多肽的氨基酸序列在對應(yīng)于參比氨基酸序列的位置2的氨基酸的N末端側(cè)包含Met、Met-Ala或Met-Ala-Ala。本發(fā)明還提供分離的和重組的多肽，其包含與SEQIDNO：929的位置2-146至少95％相同的氨基酸序列，其在對應(yīng)于SEQIDNO：929位置33上包含Gly或者Asn殘基(例如，SEQIDNO：837、849、893、897、905、921、927、929或者931)。在本發(fā)明的一些實施方案中，多肽的氨基酸序列在對應(yīng)于參比氨基酸序列的位置2的氨基酸的N末端側(cè)包含Met、Met-Ala或者Met-Ala-Ala。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。該構(gòu)建體可以是載體，例如植物轉(zhuǎn)化載體。在某些方面，本發(fā)明的載體包含T-DNA序列。該構(gòu)建體任選地包括可操作地連接到GAT多核苷酸上的調(diào)控序列(例如啟動子)，其中啟動子相對于多核苷酸來說是異源的，有效地引起充分表達所編碼的多肽，以提高用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細胞的草甘膦耐受性。在本發(fā)明的某些方面，例如在植物、細菌、放射菌、酵母、藻類或其他真菌中，GAT多核苷酸作為可選擇的標記起作用。例如，可以根據(jù)其在存在草甘膦時生長的能力來選擇用包含GAT多核苷酸的可選擇標記的載體轉(zhuǎn)化的生物體。GAT標記基因被用于選擇或篩選表達該基因的被轉(zhuǎn)化細胞。本發(fā)明還提供具有多重特性的載體，即編碼GAT多肽的載體，并且該載體包括編碼第二種多肽的第二條多核苷酸序列，該第二種多肽可以使以有效水平表達第二種多肽的細胞或生物體具有一種可檢測的表型特性?？蓹z測的表型特性可以作為可檢測的標記，例如，通過提供除草劑抗性、害蟲抗性或提供某些類型的可視標記。在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種包含兩種或多種本發(fā)明的多核苷酸的組合物。優(yōu)選地，GAT多核苷酸編碼具有不同動力學參數(shù)的GAT多肽，即具有較低的Km的GAT變體可以與具有較高的k催化的變體組合。在另一個實施方案中，不同的GAT多核苷酸與葉綠體轉(zhuǎn)運序列或其他信號序列連接，從而在不同細胞腔室、細胞器中表達GAT多肽或者分泌一種或多種GAT多肽。因此，含有兩種或多種GAT多核苷酸或者所編碼的多肽的組合物是本發(fā)明的一個特征。在一些情況下，這些組合物是含有例如至少3種或多種這種核酸的核酸文庫。通過用限制性核酸內(nèi)切酶、DNA酶或者RNA酶消化本發(fā)明的核酸，或者另外地切斷核酸，例如機械剪接、化學斷裂等而生產(chǎn)的組合物，也是本發(fā)明的一種特征，將本發(fā)明的核酸與脫氧核糖核酸三磷酸和核酸聚合酶，例如熱穩(wěn)定的核酸聚合酶，一起溫育而制得的組合物也是本發(fā)明的一種特征。用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的或者另外地摻入了本發(fā)明的核酸的細胞是本發(fā)明的一個方面。在一個優(yōu)選實施方案中，細胞表達由本發(fā)明的核酸編碼的多肽。在一些實施方案中，摻入了本發(fā)明的核酸的細胞是植物細胞。摻入了本發(fā)明的核酸的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細胞以及轉(zhuǎn)基因植物外植體也是本發(fā)明的一個特征。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細胞，或者轉(zhuǎn)基因植物外植體表達本發(fā)明的核酸編碼的具有草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的外源多肽。本發(fā)明還提供由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因種子。本發(fā)明還提供具有增強的對草甘膦的抗性的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細胞、轉(zhuǎn)基因植物外植體，或者轉(zhuǎn)基因種子，這是由于表達了具有草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的多肽和通過其他機制賦予對草甘膦的耐受性的多肽，例如耐受草甘膦的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯合酶和/或耐受草甘膦的草甘膦氧化還原酶。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供具有增強的對草甘膦的耐受性以及對其他除草劑耐受的轉(zhuǎn)基因植物或者轉(zhuǎn)基因植物外植體，這是由于表達了具有草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的多肽，通過其他機制賦予對草甘膦的耐受性的多肽，例如耐受草甘膦的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯合酶和/或耐受草甘膦的草甘膦氧化還原酶以及賦予對其他除草劑的耐受性的多肽，例如突變的羥苯基丙酮酸二氧化酶、耐受磺胺的乙酰乳酸合酶、耐受磺胺的乙酰羥基酸合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰乳酸的合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰羥基酸合酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶和突變的原卟啉原氧化酶。本發(fā)明還提供具有增強的對草甘膦的耐受性以及耐受其他除草劑的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細胞、轉(zhuǎn)基因植物外植體或者轉(zhuǎn)基因種子，這是由于表達了具有草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的多肽以及賦予對其他除草劑的抗性的多肽，例如突變的羥苯基丙酮酸二氧化酶、耐受磺胺的乙酰乳酸合酶、耐受磺胺的乙酰羥酸合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰乳酸的合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰羥酸合酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶和突變的原卟啉原氧化酶。本發(fā)明還提供具有增強的對草甘膦的耐受性以及其他的期望特性的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細胞、轉(zhuǎn)基因植物外植體或者轉(zhuǎn)基因種子，其他期望特性是通過一種或多種其他轉(zhuǎn)基因來賦予的。生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法是本發(fā)明的一個特征，通過將編碼多肽的核酸導入細胞，然后進行表達并任選地從細胞或者培養(yǎng)基中回收。在優(yōu)選實施方案中，表達本發(fā)明的多肽的細胞是轉(zhuǎn)基因植物細胞。提高本發(fā)明的多肽在植物或植物細胞中的表達水平的方法也是本發(fā)明的一個特征，這是通過在多肽編碼序列中，在鄰近于起始甲硫氨酸ATG密碼子和在該密碼子的下游插入一個或多個富含G/C的密碼子(GCG或GCT)，和/或?qū)⒃诙嚯木幋a序列中的一個或多個在植物中較少被利用的密碼子取代為在植物中較常使用的編碼相同氨基酸的密碼子，并且將被修飾的編碼序列插入到植物或者植物細胞中，并表達被修飾的修飾序列而完成的。特異地被與來源于下列的抗原反應(yīng)：SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972，但是不與天然存在的相關(guān)序列反應(yīng)的多克隆抗血清結(jié)合的多肽，例如由GenBank登錄號C從70664的那些序列的子序列表示的肽，以及由施用來源于下列的抗原中的一種或多種而生產(chǎn)的抗體：SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972，和/或特異地結(jié)合到這種抗原上而不特異地結(jié)合到對應(yīng)于GenBank登錄號CAA70664的那些天然存在的多肽上的抗體，都是本發(fā)明的特征。本發(fā)明的另一個方面涉及，通過體外或體內(nèi)重組或突變本發(fā)明的核酸使多核苷酸多樣化，來生成新的GAT多核苷酸和多肽的方法。在一個實施方案中，重組產(chǎn)生至少一種重組的GAT多核苷酸文庫。如此產(chǎn)生的文庫是本發(fā)明的實施方案，包含該文庫的細胞也是本發(fā)明的實施方案。此外，通過突變本發(fā)明的核酸來生產(chǎn)被修飾的GAT多核苷酸的方法是本發(fā)明的實施方案。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的重組和突變的GAT多核苷酸和多肽也是本發(fā)明的實施方案。在本發(fā)明的某些方面，通過采用遞推重組來實現(xiàn)多樣化，可以在體外、在體內(nèi)、在計算機芯片上或者它們的組合中完成。下文中被更加詳細地描述的多樣化方法的一些例子是家族改組方法和合成改組方法。本發(fā)明提供用于生產(chǎn)草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞的方法，包括用編碼草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物或植物細胞，并且任選地從被轉(zhuǎn)化的植物細胞中再生轉(zhuǎn)基因植物。在一些方面，多核苷酸是GAT多核苷酸，任選地GAT多核苷酸來源于細菌來源。在本發(fā)明的一些方面，該方法可以包括使被轉(zhuǎn)化的植物或植物細胞生長在抑制同一物種的野生型植物生長而不抑制被轉(zhuǎn)化的植物生長的草甘膦濃度中。該方法包括使被轉(zhuǎn)化的植物或植物細胞或植物或植物的后代生長在濃度升高的草甘膦中和/或在對同一物種野生型植物或植物細胞有致死作用的草甘膦中。通過這種方法制備的耐受草甘膦的轉(zhuǎn)基因植物可以被繁殖，例如通過將其與第二種植物雜交，使得至少某些雜交后代具有草甘膦耐受性。本發(fā)明還提供用于選擇性地控制具有農(nóng)作物的田間的雜草的方法，包括在田間種植耐受草甘膦的農(nóng)作物種子或者植物，它們轉(zhuǎn)化了編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因，往田間的農(nóng)作物和雜草施用足量的草甘膦，以控制雜草而不會顯著地影響農(nóng)作物。本發(fā)明還提供控制田間雜草和防止在含有農(nóng)作物的田間出現(xiàn)草甘膦抗性雜草的方法，包括在田間種植耐受草甘膦的農(nóng)作物種子或者植物，這些種子或植物轉(zhuǎn)化了編碼草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼通過其他機制賦予對草甘膦的耐受性的多肽的基因，例如耐受草甘膦的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯合酶和/或耐受草甘膦的草甘膦氧化還原酶，給田間的農(nóng)作物和雜草施用足量的草甘膦，以控制雜草而不顯著影響農(nóng)作物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于控制田間雜草和防止在含有農(nóng)作物的田間出現(xiàn)除草劑抗性的雜草的方法，其包括在田間種植耐受草甘膦的農(nóng)作物種子或植物，這些種子或植物轉(zhuǎn)化了編碼草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼通過其他機制賦予對草甘膦的耐受性的多肽的基因，例如耐受草甘膦的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯合酶和/或耐受草甘膦的草甘膦氧化還原酶，以及編碼賦予對其他除草劑耐受性的多肽的基因，例如突變的羥苯基丙酮酸二氧化酶、耐受磺胺的乙酰乳酸合酶、耐受磺胺的乙酰羥酸合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰乳酸的合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰羥酸合酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶和突變的原卟啉原氧化酶。給田間的農(nóng)作物和雜草施用足量的草甘膦和其他除草劑，例如羥苯基丙酮酸二氧化酶抑制劑、磺胺、咪唑啉酮、雙丙氨膦(bialaphos)、膦絲菌素、唑啶草酮(azafenidin)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、磺酸鹽、草銨膦(glufosinate)和原卟啉原氧化酶(protox)抑制劑，以控制雜草而不顯著影響農(nóng)作物。本發(fā)明還提供用于控制田間雜草和防止在含有農(nóng)作物的田間出現(xiàn)除草劑抗性雜草的方法，其包括在田間種植耐受草甘膦的農(nóng)作物種子或植物，這些種子或植物轉(zhuǎn)化了編碼草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼賦予對其他除草劑抗性的多肽的基因，例如例如突變的羥苯基丙酮酸二氧化酶、耐受磺胺的乙酰乳酸合酶、耐受磺胺的乙酰羥酸合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰乳酸的合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰羥酸合酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶和突變的原卟啉原氧化酶，給田間的農(nóng)作物和雜草施用足量的草甘膦和其他除草劑，例如羥苯基丙酮酸二氧化酶抑制劑、磺胺、咪唑啉酮、雙丙氨膦、膦絲菌素，唑啶草酮、氟丙嘧草酯、磺酸鹽、草銨膦和原卟啉原氧化酶抑制劑，以控制雜草而不顯著影響農(nóng)作物。本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化而耐受草甘膦的植物，包括在植物細胞的基因組中插入重組的雙鏈的DNA分子，包含：(i)在植物細胞中起作用以生成RNA序列的啟動子；(ii)產(chǎn)生編碼GAT的RNA序列的結(jié)構(gòu)性DNA序列；和(iii)3′非翻譯區(qū)，其在植物細胞中起作用，以將一段多聚腺苷酸核苷酸添加到RNA序列的3’端；其中啟動子相對于結(jié)構(gòu)性DNA序列是異源的，并且適合于引起充足地表達被編碼的多肽，以提高用DNA分子轉(zhuǎn)化的植物細胞對草甘膦的耐受性；獲得轉(zhuǎn)化的植物細胞；和從被轉(zhuǎn)化的植物細胞中再生對草甘膦的耐受性增強的遺傳轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)農(nóng)作物的方法，包括種植耐受草甘膦的農(nóng)作物，該植物耐受草甘膦是由于用編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因進行了轉(zhuǎn)化，在某種條件下，使得農(nóng)作物植物生產(chǎn)一種農(nóng)作物；和從該農(nóng)作物植物收獲農(nóng)作物。這些方法通常包括將草甘膦以足以控制雜草的濃度應(yīng)用于農(nóng)作物植物。示例性的農(nóng)作物植物包括棉花、玉米和大豆。本發(fā)明還提供計算機、計算機可讀介質(zhì)和集成系統(tǒng)，包括由包括對應(yīng)于SEQIDNO：1-10、16、48、190、193、196、202、205、268、300、442、445、448、454、457、515-830和832-972的字符串的序列記錄組成的數(shù)據(jù)庫。這種集成系統(tǒng)任選地包括一套或多套裝置，用于在對應(yīng)于SEQIDNO：1-10、16、48、190、193、196、202、205、268、300、442、445、448、454、457、515-830和832-972的任何一條或多條字符串之間和/或與任何其他核酸或氨基酸序列之間進行選擇、比對、翻譯、反向翻譯或者視察。附圖簡介圖1描述由草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(“GAT”)催化草甘膦的N-乙酰化。圖2圖解說明質(zhì)譜檢測由示例性的表達天然的GAT活性的桿菌培養(yǎng)物生產(chǎn)的N-乙酰草甘膦。圖3是圖解說明從不同的細菌菌株中分離的GAT序列與來自枯草芽孢桿菌的yitI之間的相對同一性的表格。圖4是用于表達和純化來自大腸桿菌培養(yǎng)物的GAT酶的質(zhì)粒pMAXY2120的圖譜。圖5是顯示在典型的GAT酶反應(yīng)混合物中，N-乙酰草甘膦產(chǎn)量隨著時間而升高的質(zhì)譜結(jié)果。圖6是GAT酶的動力學數(shù)據(jù)的圖形，從該圖形中計算出的草甘膦的KM為2.9mM。圖7是從附圖6中獲得的動力學數(shù)據(jù)的圖形，從該圖形中計算出的乙酰CoA的KM為2μM。圖8是描述在土壤中通過AMPA路徑降解草甘膦的圖解。圖9是描述草甘膦降解的肌氨酸路徑的圖解。圖10是B1OSUM62基質(zhì)。圖11是質(zhì)粒pMAXY2190的圖譜。圖12描述具有可選擇的標記的T-DNA構(gòu)建體。圖13描述具有g(shù)at可選擇標記的酵母表達載體。圖14圖解說明抽穗時草甘膦對植物的高度的影響。圖15A和15B分別提供如實施例18中所述，在缺乏所添加的KC1(無陰影欄)或者存在20mMKC1(陰影欄)時分析的各種GAT酶的動力學參數(shù)Km和k催化/Km的比較，如果存在，誤差欄表示多個分析的標準方差。圖16A、16B和16C提供了本發(fā)明的各種GAT酶(無陰影欄)的動力學參數(shù)Km、k催化和k催化/Km與本發(fā)明的一些進一步進化的GAT酶(陰影欄)的動力學參數(shù)之間的比較，如實施例19中所描述。如果存在，誤差欄表示多個分析的標準方差。圖17描述了在各種溫度下溫育后，仍保留GAT活性，如實施例16中所描述。圖18描述了pH對K催化和KM的作用，如實施例30所描述。發(fā)明詳描本發(fā)明涉及一類新的具有N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的酶。一個方面，本發(fā)明涉及一類新的能夠乙?；莞熟⒑筒莞熟㈩愃莆锏拿?，例如具有草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(“GAT”)活性的酶。這種酶的特征是具有將化合物的仲胺乙?；哪芰?。在本發(fā)明的一些方面，該化合物是除草劑，例如草甘膦，如附圖1示例性地圖解說明。該化合物還可以是草甘膦類似物或者草甘膦降解的代謝產(chǎn)物，例如氨基甲基膦酸。盡管草甘膦的乙?；诓莞熟⒋x分解的代謝路徑中是關(guān)鍵的催化步驟，但是以前沒有描述過由天然的、分離的或重組的酶催化的草甘膦的乙酰化。因此，本發(fā)明的核酸和多肽提供新的用于工程化除草劑抗性的生物化學路徑。一個方面，本發(fā)明提供編碼GAT多肽的新基因。對應(yīng)于天然存在的多核苷酸的分離的和重組的GAT多核苷酸以及重組和工程化的例如多樣化的GAT多核苷酸是本發(fā)明的一個特征。GAT多核苷酸以SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952為例。特異的GAT多核苷酸和多肽序列被提供作為例子，用于闡述本發(fā)明，而不將在此所描述和/或要求保護的GAT多核苷酸和多肽限制在這一范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供用于生成和選擇多樣化文庫的方法，以生成其他GAT多核苷酸，包括編碼具有改良和/或增強特性，例如被改變的草甘膦的Km、升高的催化速度、增強的穩(wěn)定性等的GAT多肽的多核苷酸，根據(jù)對構(gòu)成文庫的多核苷酸進行選擇，以獲得在此描述的新的和改良的活性。這種多核苷酸被特別有利地用于生產(chǎn)草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的GAT多肽具有新的催化特性。特別地，在本發(fā)明之前，酶催化的合成除草劑草甘膦的乙?；€未被認識到。因此，在此描述的多肽，例如以SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972為例，詳細說明了脫毒草甘膦的新生物化學路徑，該路徑在體內(nèi)如植物中起作用。因此，本發(fā)明的核酸和多肽在通過新核酸、多肽和生物化學路徑在轉(zhuǎn)基因植物中工程化除草劑選擇性來產(chǎn)生草甘膦抗性植物中具有重要的用途。定義在詳細描述本發(fā)明之前，應(yīng)當理解，本發(fā)明不限于特定的組合物或生物系統(tǒng)，當然，它們是可改變的。還應(yīng)當理解，在此所用的術(shù)語僅用于描述特定的實施方案，而不用于限制。除非內(nèi)容另外清楚地指出，如在本說明書和附隨的權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式“一個”和“該”包括復數(shù)形式。因此，例如，提及“裝置”包括兩種或多種這種裝置的組合，提及“基因融合構(gòu)建體”包括構(gòu)建體的混合物等。除非另外說明，在此所用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。雖然任何與在此描述類似或等價的方法和材料都可被用于實踐中來驗證本發(fā)明，在此描述了合適的材料和方法的特定實施例。在對本發(fā)明的描述和要求保護的內(nèi)容中，如下的術(shù)語將按照下文給出的定義來使用。因此，用于本發(fā)明的目的，術(shù)語“草甘膦”應(yīng)當被認為是包括任何具有除草活性形式的N-膦?；谆拾彼?包括任何的其鹽)和其他會導致在植物中產(chǎn)生草甘膦陰離子的形式。術(shù)語“草甘膦類似物”是指草甘膦的任何結(jié)構(gòu)類似物，這種結(jié)構(gòu)類似物能夠以一定水平抑制EPSPS，使得草甘膦類似物能夠有效地除草。如在此所用，術(shù)語“草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性”或者“GAT活性”是指催化草甘膦的仲胺基團的乙?；哪芰?，例如，如附圖1中說明的?！安莞熟?N-乙酰轉(zhuǎn)移酶”或“GAT”是一種催化草甘膦、草甘膦類似物和/或草甘膦主要代謝物(即AMPA或肌氨酸)的氨基基團的乙酰化的酶。在本發(fā)明的一些優(yōu)選方案中，GAT能夠?qū)⒁阴oA的乙?；鶊F轉(zhuǎn)移到草甘膦的仲胺和AMPA的伯胺上。此外，某些GAT還能夠?qū)⒈oA的丙?；D(zhuǎn)移給草甘膦，表明GAT還是一種乙酰轉(zhuǎn)移酶。在此描述的示例性GAT在pH5-9時具有活性，在約pH6.5-8.0的范圍內(nèi)具有最佳的活性?？梢杂帽绢I(lǐng)域熟知的各種動力學參數(shù)來量化活性，例如k催化、KM和k催化/KM。可以按照下面的實施例7或?qū)嵤├?9所述，確定這些動力學參數(shù)。術(shù)語“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”用于指核苷酸(A、C、T、U、G等，或者天然存在的或者人工的核苷酸類似物)的聚合體，例如DNA或RNA，或其表示方式，例如字符串等，這取決于相關(guān)的內(nèi)容?？梢詮娜魏翁囟ǖ暮塑账嵝蛄兄写_定給定的多核苷酸或者互補的多核苷酸。類似地，“氨基酸序列”是氨基酸的聚合體(蛋白質(zhì)、多肽等)或者代表氨基酸聚合體的字符串，這取決于內(nèi)容。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”在此可以互換使用。當多核苷酸、多肽或者其他成分部分地或者完全地從通常相關(guān)的成分(其他蛋白質(zhì)、核酸、細胞、合成試劑等)中分離出來時，其是“分離的”。當核酸或者多肽為人造的或者工程化的，或者是來源于人造的或者工程化的蛋白質(zhì)或核酸時，該核酸或者多肽是“重組的”。例如，多核苷酸被插入到載體或者任何其他異源性位置，例如插入到重組生物體的基因組中，使得該多核苷酸不與自然界中發(fā)現(xiàn)的通常位于多核苷酸側(cè)翼的苷酸序列結(jié)合，這種多核苷酸是重組的多核苷酸。在體外或體內(nèi)從重組多核苷酸表達得到的蛋白質(zhì)是重組多肽的一個例子。同樣，不出現(xiàn)于自然界中的多核苷酸序列，例如天然存在的基因的變體，是重組的。術(shù)語“草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶多肽”和“GAT多肽”可以互換使用，用于指在此提供的新多肽家族的任何成員。術(shù)語“草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸”和“GAT的多核苷酸”互換使用，用于指編碼GAT多肽的多核苷酸?！皝喰蛄小焙汀捌巍笔峭暾蛄械娜魏尾糠帧．斁酆象w的特定單體成分(氨基酸殘基、摻入的核苷酸等)的位置對應(yīng)于所選擇的參比多肽或者多核苷酸的相同殘基位置時，氨基酸或核苷酸聚合體的編號對應(yīng)于所選擇的氨基酸聚合體或者核酸的編號。載體是方便用所選擇的核酸轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)化細胞或者方便核酸在細胞中表達的組合物。載體包括，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、YAC、細菌、多聚賴氨酸、染色體整合載體、附加體載體等?！岸嗪塑账峄蛘甙被嵝蛄械幕救L”是指一條序列的至少約70％、通常至少約80％或者典型地約90％或更長。如在此所用，“抗體”是指包含一種或多種多肽的蛋白質(zhì)，該多肽基本上或者部分地由免疫球蛋白基因或者免疫球蛋白基因的片段所編碼。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及各種各樣的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分為κ或者λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，它們依次又決定了免疫球蛋白的類型，分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位包括一種四聚體。每一個四聚體由相同的兩對多肽鏈組成，每對多肽具有一條“輕鏈”(約25kD)和一條“重鏈”(約50-70kD)。各條鏈的N末端定義了由大約100-110個或更多氨基酸組成的主要負責抗體識別的可變區(qū)。術(shù)語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈?？贵w以完整的免疫球蛋白存在或由以各種肽酶消化產(chǎn)生的已經(jīng)清楚地表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)的二硫鍵處消化抗體，以產(chǎn)生F(ab)′2，它是Fab的二聚體，F(xiàn)ab本身是一條通過二硫鍵連接到VH-CH1上的輕鏈。F(ab)′2可以在溫和的條件下被還原，斷裂鉸鏈區(qū)內(nèi)的二硫鍵，從而將(Fab′)2二聚體轉(zhuǎn)化為Fab′單體。Fab′單體實質(zhì)上是具有部分鉸鏈區(qū)的Fab(參見Paul，編輯(1998)FundamentalImmunology(第4版，Raven出版社，紐約州)，關(guān)于其他抗體片段的更加詳細的描述)。雖然按照對完整抗體的消化來定義各種抗體片段，技術(shù)人員將會預期，可以用化學方法或者通過采用重組DNA技術(shù)來重新合成這種Fab′片段。因此，在此使用的術(shù)語抗體還包括修飾整個抗體或者用重組DNA技術(shù)重新合成所生產(chǎn)的抗體片段?？贵w包括單鏈抗體，包括單鏈Fv(sFv)抗體，其中可變重鏈和可變輕鏈被連接在一起(直接地或者通過肽接頭)，形成一條連續(xù)的多肽。“葉綠體轉(zhuǎn)運肽”是一種氨基酸序列，它與一種蛋白質(zhì)一起被翻譯，將該蛋白質(zhì)導向葉綠體或者存在于制造該蛋白質(zhì)的細胞中的其他質(zhì)體類型?！叭~綠體轉(zhuǎn)運序列”是指編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列?！靶盘栯摹笔且环N氨基酸序列，其與一種蛋白質(zhì)一起被翻譯，將該蛋白質(zhì)導向分泌系統(tǒng)中(Cbrispeels(1991)Ann.Rev.PlantPhys.PlantMol.Biol.42：21-53)。如果要將此蛋白質(zhì)導向液泡，可以進一步添加液泡定向信號，或者如果導向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，則可以添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號。如果蛋白質(zhì)將被導向細胞核，則任何存在的信號肽應(yīng)當被去除并插入所包括的細胞核定位信號(Raikhel(1992)PlantPhys.100：1627-1632)。術(shù)語“多樣化”和“多樣性”應(yīng)用于多核苷酸時，是指產(chǎn)生大量被修飾形式的親代的多核苷酸，或者大量親代的多核苷酸。當多核苷酸編碼多肽時，多核苷酸的核苷酸序列的多樣性可以導致相應(yīng)的被編碼多肽的多樣性，例如編碼大量多肽變體的多核苷酸的各種庫。在本發(fā)明的一些實施方案中，該序列的多樣性是通過篩選/選擇多樣化的多核苷酸的文庫中的具有期望的功能性特征的變體而獲得的，這些變體例如編碼具有增強的功能特征的GAT多肽的多核苷酸。術(shù)語“編碼”是指核苷酸序列編碼一種或多種氨基酸的能力。該術(shù)語不要求起始或終止密碼子。氨基酸序列可以在由多核苷酸序列及其補體提供的六個不同閱讀框的任何一個中被編碼。當在此所用時，術(shù)語“人工變體”是指具有GAT活性的多肽，該多肽由被修飾的GAT多核苷酸編碼，例如被修飾形式的SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952中的任何一種或者從生物體中分離的天然存在的GAT多核苷酸的被修飾形式所編碼。當在合適的宿主中被表達時，從被修飾的多核苷酸中生成人工變體，這些被修飾的多核苷酸是通過修飾GAT多核苷酸的人為干預而獲得的。術(shù)語“核酸構(gòu)建體”或者“多核苷酸構(gòu)建體”是指核酸分子，單鏈的或者雙鏈的，從天然存在的基因中分離得到，或者被修飾而以自然界中不存在的方式含有核酸片段。當核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的控制序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”是同義的，術(shù)語“控制序列”在此被定義來包括所有成分，這些成分對于表達本發(fā)明的多肽是必需的或者有利的。每種控制序列對于編碼多肽的核苷酸序列來說，是天然的或者外來的。每種控制序列包括，但是不限于，前導序列、多聚腺苷酸序列、前肽序列、啟動子序列、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。控制序列至少包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號?？梢越o控制序列提供帶接頭，目的是導入特定的限制性位點，以便將控制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區(qū)連接起來。術(shù)語“可操作地連接”在此被定義為一種構(gòu)象，其中控制序列被適當?shù)胤胖迷谂cDNA序列的編碼序列相關(guān)的位置上，使得控制序列能夠指導多肽的表達。當用于此時，術(shù)語“編碼序列”包括直接具體確定其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由以ATG起始密碼子開始的開放閱讀框確定。編碼序列典型地包括DNA、cDNA和/或重組核苷酸序列。在本文中，術(shù)語“表達”包括任何與多肽生產(chǎn)相關(guān)的步驟，包括但是不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。在本文中，術(shù)語“表達載體”包括線性的或者環(huán)狀的DNA分子，其包括編碼本發(fā)明的多肽的區(qū)段，并且被可操作地連接到其他用于其轉(zhuǎn)錄的區(qū)段上。如在此所用，術(shù)語“宿主細胞”包括容易用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的任何細胞類型。術(shù)語“植物”包括整株植物、枝條營養(yǎng)器官/結(jié)構(gòu)(例如葉、莖和塊莖)、根、花和花器官/結(jié)構(gòu)(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花藥和胚珠)、種子(包括胚胎、胚乳和種皮)和果實(成熟的卵巢)、植物組織(例如微管組織、地面組織等)和細胞(例如保衛(wèi)細胞、卵細胞、毛狀體等)，以及它們的后代。用于本發(fā)明的方法中的植物類型通常包括適合于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物和低等植物的種類范圍，包括被子植物(單子葉植物和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物和多細胞藻類。它包括各種倍數(shù)水平的植物，包括非整倍體、多倍體、二倍體、單倍體和半合子。術(shù)語“異源的”用于此來描述兩種或者多種元件之間的關(guān)系，表明這些元件之間實質(zhì)上是不相似的。因此，例如，如果多核苷酸來源于外來物種，或者如果來自同一物種但是對其原始形式進行了修飾，則多核苷酸序列與生物體或者第二條多核苷酸序列是“異源的”。例如，啟動子被可操作地連接到異源的編碼序列上，是指編碼序列來自不同于產(chǎn)生該啟動子的物種的物種，或者如果來源于相同的物種，則編碼序列在自然情況下與此啟動子無關(guān)(例如，遺傳工程化的編碼序列或者來自不同生態(tài)型或者變體的等位基因)。異源多肽的一個例子是在轉(zhuǎn)基因生物體中由重組多核苷酸表達得到的多肽。異源的多核苷酸或者多肽都是重組分子的形式。在此還定義或者另外地表征了各種其他術(shù)語。草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶在一個方面中，本發(fā)明提供了一個在此被稱作為“草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶”、“GAT”或者“GAT酶”的分離的或者重組的酶的新家族。GAT是具有GAT活性的酶，優(yōu)選地是具有足以賦予工程化來表達GAT的轉(zhuǎn)基因植物具有某種程度的草甘膦耐受性的活性。GAT的某些例子包括GAT多肽，將在下文被更加詳細地描述。GAT介導的草甘膦耐受性是GAT活性、轉(zhuǎn)基因植物中的GAT表達水平、特定植物和許多包括但是不限于除草劑應(yīng)用的性質(zhì)和時間安排等的其他因素的復合函數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多的試驗就可以確定在特定條件下產(chǎn)生草甘膦耐受性所需的GAT活性水平?？梢杂贸Ｒ?guī)的動力學參數(shù)k催化、KM和k催化/KM來表征GAT活性。k催化被認為是乙?；俣鹊牧慷龋貏e是在高底物濃度時，KM是GAT對其底物(例如乙酰CoA、丙酰CoA和草甘膦)的親合性的量度，而k催化/KM是同時考慮底物親合性和催化速度時的催化效率的量度。在底物濃度至少部分地是速度的限制因素時，k催化/KM是尤其重要的?？傊?，與具有較低的k催化或者k催化/KM的另一種GAT相比，具有較高的k催化或者k催化/KM的GAT是更有效的催化劑。與具有較高的KM的另一種GAT相比，具有較低的KM的GAT是更加有效的催化劑。因此，為了確定一種GAT是否比另一種GAT更加有效，可以比較兩種酶的動力學參數(shù)。k催化、k催化/KM和KM的相對重要性是變化的，取決于期望GAT起作用的條件，例如期望的草甘膦的有效濃度與草甘膦的KM相關(guān)。還可以根據(jù)大量的功能性特征的任何一種來表征GAT活性，這些功能特征包括但是不限于穩(wěn)定性、對抑制的易感性或者被其他分子活化。草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶多肽在一個方面中，本發(fā)明提供一個在此被稱作為“草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶多肽”或者“GAT多肽”的分離的或者重組多肽的新家族。GAT多肽的特征是它們與新的GAT家族的結(jié)構(gòu)相似性。許多但并不是所有的GAT多肽是GAT。區(qū)別在于GAT是以功能定義的，而GAT多肽是根據(jù)結(jié)構(gòu)定義的。GAT多肽的一個亞組由那些具有GAT活性的GAT多肽組成，GAT多肽優(yōu)選能夠起使有效地表達該蛋白的轉(zhuǎn)基因植物具有草甘膦抗性的作用。一些用于賦予對草甘膦的耐受性的優(yōu)選GAT多肽具有至少1min-1，或者更加優(yōu)選至少10min-1、100min-1或者1000min-1的k催化。其他優(yōu)選用于賦予草甘膦耐受性的優(yōu)選GAT多肽具有不超過100mM，或更加優(yōu)選不超過10mM、1mM或者0.1mM的KM。還有其他用于賦予草甘膦耐受性的優(yōu)選GAT多肽具有至少10mM-1min-1、100mM-1min-1、1000mM-1min-1或者10,000mM-1min-1的k催化/KM。示例性的GAT多肽已經(jīng)從各種細菌菌株中分離和表征。已經(jīng)被分離和表征的單體GAT多肽的一個例子具有約17kD的分子半徑。一種分離自地衣芽孢桿菌菌株的示例性GAT酶，SEQIDNO：7，具有約2.9mM的對草甘膦的Km，和約2μM的對乙酰CoA的Km，并且k催化等于6/分鐘。術(shù)語“GAT多肽”是指任何包含氨基酸序列的多肽，采用B1OSUM62矩陣方法，將氨基酸序列與選自SEQIDNO：300、445或457的氨基酸序列最佳地比對，產(chǎn)生至少為460的相似性分值，存在一個缺口罰11分，延伸一個缺口罰1分，其中至少如下位置之一遵從如下的限制：(i)在位置18和38上，為Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，為Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，為Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，為Z2氨基酸殘基，其中：Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。本發(fā)明的一些方面涉及包含氨基酸序列的GAT多肽，采用B1OSUM62矩陣方法，，存在一個缺口罰11分，延伸一個缺口罰1分，將該氨基酸序列與選自由SEQIDNO：300、445或457組成的組的氨基酸序列最佳地比對，產(chǎn)生至少440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755或760的相似性分值，其中至少如下位置之一遵從如下的限制：(i)在位置18和38上，為Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，為Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，為Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，為Z2氨基酸殘基，其中：Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。兩條序列被“最佳地比對”，是指當它們被比對來進行相似性評分時，采用特定的氨基酸取代矩陣(例如B1OSUM62)、缺口存在罰分和缺口延伸罰分，以獲得該對序列的可能最高得分。氨基酸取代矩陣及其在量化兩條序列之間的相似性中的用途是本領(lǐng)域熟知的，并且被描述在例如Dayhoff等人(1978)“Amodelofevolutionarychangeinproteins″in″AtlasofProteinSequenceandStructure，”第5卷，增刊3(M.O.Dayhoff編輯)，第345-352頁Natl.Biomed.Res.Found.，華盛頓地區(qū)以及Henikoff等人(1992)Proc.Nat′LAcad.Sci.USA89：10915-10919中。B1OSUM62矩陣(附圖10)在缺口B1AST2.0等序列比對方案中通常被用作默認的評分取代矩陣。對在被比對的序列之一中導入單個氨基酸缺口進行缺口存在罰分，而對于在已經(jīng)開口的缺口中插入的各個額外的空氨基酸位置，進行缺口延伸罰分。比對是由各條序列開始和終止比對的氨基酸位置來確定的，任選地在一條或兩條序列中插入一個或多個缺口來確定，以獲得最高的可能分值。盡管最佳比對和評分可以手工完成，但是使用計算機輔助的序列比對算法方便該過程，這種算法如缺口B1AST2.0，在Altschul等人(1997)Nucl.AcidsRes.25：3389-3402中被描述，公眾可以從NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上獲得。最佳比對，包括多重比對，可用如PSI-B1AST來進行，PSI-B1AST可從NCBI網(wǎng)站獲得，其描述見Altschul等人(1997)Nucl.AcidsRes.25：3389-3402。至于與參比序列最佳地比對的氨基酸序列，氨基酸殘基與在比對中相配對的參比序列的位置“相對應(yīng)”。用根據(jù)相對于N末端的位置，隨后確定參比序列中的各個氨基酸的編號來表示“位置”。例如，在SEQIDNO：300中，位置1為M，位置2為I，位置3為E等。當測試序列最佳地與SEQIDNO：300比對時，測試序列中與位置3的E比對的殘基被認為與SEQIDNO：300的“位置3相對應(yīng)”。當確定最佳的序列比對時，必需考慮缺失、插入、平截、融合等，總之，通過簡單地從N末端開始計數(shù)來確定測試序列中的氨基酸殘基的編號，不必與其在參比序列中的相應(yīng)位置的編號相同。例如，在被比對的測試序列中存在缺失的情形下，不存在對應(yīng)于參比序列的缺失位點的位置上的氨基酸。當在被比對的參比序列中存在一個插入時，該插入將不與參比序列中的任何氨基酸位置相對應(yīng)。在為平截或者融合的情況下，則在參比或者被比對的序列中，存在與相應(yīng)序列中的任何氨基酸不對應(yīng)的氨基酸區(qū)段。術(shù)語“GAT多肽”還指包含氨基酸序列的任何多肽，該氨基酸序列選自如下組成的組：(a)與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列；(c)與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列；(d)與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列；(g)與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列；(i)與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列；(m)與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列；和(n)與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列。術(shù)語“GAT多肽”還指任何多肽，該多肽包含與SEQIDNO：677的氨基酸序列的殘基1-96具有至少89％序列同一性的氨基酸序列；與SEQIDNO：697的氨基酸序列的殘基1-96具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；與選自SEQIDNO：584、612和721的氨基酸序列的殘基1-96具有至少96％序列同一性的氨基酸序列；與選自SEQIDNO：578、613和621的氨基酸序列的殘基1-96具有至少97％序列同一性的氨基酸序列；與選自SEQIDNO：577、579、590、602、616和707的氨基酸序列的殘基1-96具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。術(shù)語“GAT多肽”還指任何多肽，該多肽包含與SEQIDNO：677的氨基酸序列的殘基51-146具有至少89％序列同一性的氨基酸序列；與SEQIDNO：697的氨基酸序列的殘基51-146具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；與選自SEQIDNO：584、612和721的氨基酸序列的殘基51-146具有至少96％序列同一性的氨基酸序列；與選自SEQIDNO：578、613和621的氨基酸序列的殘基51-146具有至少97％序列同一性的氨基酸序列；與選自SEQIDNO：577、579、590、602、616和707的氨基酸序列的殘基51-146具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。術(shù)語“GAT多肽”還指任何多肽，該多肽包含選自由如下組成的組的氨基酸序列：(a)與SEQIDNO：919的位置2-146至少96％相同的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO：929的位置2-146至少97％相同的氨基酸序列；(c)與SEQIDNO：847的住置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(d)與SEQIDNO：851位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：853的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：855的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：835或855)；(g)與SEQIDNO：857的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：861的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列(例如，SEQIDNO：839、861或者883)；(i)與SEQIDNO：871的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：875的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：881的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：885的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(m)與SEQIDNO：887的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(n)與SEQIDNO：889的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(o)與SEQIDNO：893的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(p)與SEQIDNO：897的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(q)與SEQIDNO：899的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(r)與SEQIDNO：909的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(s)與SEQIDNO：911的位置2-146至少98％相同的氨基酸序列；(t)與SEQIDNO：837的位置2-146至少99％相同的氨基酸序列；(u)與SEQIDNO：841的位置2-146至少99％相同的氨基酸序列；(v)與SEQIDNO：865的位置2-146至少99％相同的氨基酸序列；(w)與SEQIDNO：869的位置2-146至少99％相同的氨基酸序列；和(x)與SEQIDNO：879的位置2-146至少99％相同的氨基酸序列。術(shù)語“GAT多肽”還指任何多肽，該多肽包含與SEQIDNO：929的位置2-146至少95％相同的氨基酸序列，并且在對應(yīng)于SEQIDNO：929的位置33的氨基酸位置上包含Gly和Asn殘基。術(shù)語“GAT多肽”還指任何多肽，該多肽包含與在此公開的示例性GAT多肽共有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的序列同一性的氨基酸序列。因此，例如本發(fā)明的GAT多肽包含氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO：953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972的任何一種共有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的序列同一性。如在此所用，術(shù)語“同一性”或者“同一性百分數(shù)”用于具體的一對被比對的氨基酸序列時，是指通過ClustalW分析(版本W(wǎng)1.8，可以從EuropeanBioinformaticsInstitute，劍橋，英國獲得)獲得的氨基酸序列同一性百分數(shù)，計算比對中相同配對的數(shù)目，并用該相同配對的數(shù)目除以(i)被比對序列的長度和(ii)96中較大的一個，使用如下的默認ClustalW參數(shù)來進行緩慢/精確切換配對比對——缺口罰分：10；延伸罰分：0.10；蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣：Goimet系列；DNA權(quán)重矩陣：IUB；扳手緩慢/快速配對方式比對＝緩慢或者完全比對。另一個方面，本發(fā)明提供一種分離的或者重組的多肽，其包含選自由如下構(gòu)成的組的氨基酸序列中的至少20個，或者可替代地，至少50個、至少75個、至少100個、至少125個、至少130個、至少135個、至少140個、至少141個、至少142個、至少143個、至少144個或者至少145個連續(xù)的氨基酸：(a)與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列；(c)與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列；(d)與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列；(g)與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列；(i)與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列；(m)與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列；和(n)與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列。另一個方面，本發(fā)明提供包含選自由如下組成的組的氨基酸序列的殘基2-146的多肽：SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、21、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823和825。在本發(fā)明的一些實施方案中，多肽的氨基酸序列在對應(yīng)于參比的氨基酸序列的位置2的氨基酸的N末端一側(cè)上包含Met、Met-Ala或者Met-Ala-Ala。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽可以與選自由SEQIDNO：300、445或457組成的組的參比氨基酸序列最佳地比對，采用B1OSUM62矩陣方法，存在一個缺口罰11分，延伸一個缺口罰1分，生成至少為460的相似性分值，其中至少如下位置之一遵從如下的限制：(i)在位置18和38上，為Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，為Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，為Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，為Z2氨基酸殘基，其中：Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基，并且進一步地，氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少90％地遵從如下限制：(a)在位置2、4、15、19、26、28、31、45、51、54、86、90、91、97、103、105、106、114、123、129、139和/或145上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置3、5、8、10、11、14、17、24、27、32、37、47、48、49、52、57、58、61、63、68、69、79、80、82、83、89、92、100、101、104、119、120、125、126、128、131和/或143上，氨基酸殘基為B2；其中B1為選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；而B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。當用于表示氨基酸或者氨基酸殘基時，單字母名稱A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y具有本領(lǐng)域所用的標準含義，并且提供在表1中。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽可以與選自由SEQIDNO：300、445或457組成的組的參比氨基酸序列最佳地比對，采用B1OSUM62矩陣方法，存在一個缺口罰11分，延伸一個缺口罰1分，生成至少460的相似性分值，其中至少如下位置之一遵從如下的限制：(i)在位置18和38上，為Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，為Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，為Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，為Z2氨基酸殘基，其中：Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基，并且進一步地，氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少80％地遵從如下限制：(a)在位置2、4、15、19、26、28、31、45、51、54、86、90、91、97、103、105、106、114、123、129、139和/或145上，氨基酸殘基為Z1；和(b)在位置31和/或45上，氨基酸殘基為Z2；(c)在位置8上，氨基酸殘基為Z3；(d)在位置89上，氨基酸殘基為Z3或者Z6；(e)在位置82，92，101和/或120上，氨基酸殘基為Z4；(f)在位置3、11、27和/或79上，氨基酸殘基為Z5；(g)在位置18上，氨基酸殘基為Z4或Z5；(h)在位置123上，氨基酸殘基為Z1或Z2；(i)在位置12，33、35、39、53、59、112、132、135、140和/或146上，氨基酸殘基為Z1或Z3；(j)在位置30上，氨基酸殘基為Z1；(k)在位置6上，氨基酸殘基為Z6；(l)在位置81上，氨基酸殘基為Z2或Z4；(m)在位置113上，氨基酸殘基為Z3；(n)在位置138上，氨基酸殘基為Z4；(o)在位置142上，氨基酸殘基為Z2；(p)在位置57和/或126上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(q)在位置5，17和61上，氨基酸殘基為Z4；(r)在位置24上，氨基酸殘基為Z3；(s)在位置104上，氨基酸殘基為Z5；(t)在位置52和/或69上，氨基酸殘基為Z3；(u)在位置14和/或119上，氨基酸殘基為Z5；(v)在位置10、32、63和/或83上，氨基酸殘基為Z5；(w)在位置48和/或80上，氨基酸殘基為Z6；(x)在住置40上，氨基酸殘基為Z1或Z2；(y)在位置96上，氨基酸殘基為Z3或Z5；(z)在位置65上，氨基酸殘基為Z3、Z4或Z6；(aa)在位置84和/或115上，氨基酸殘基為Z3；(ab)在位置93上，氨基酸殘基為Z4；(ac)在位置130上，氨基酸殘基為Z2；(ad)在位置58上，氨基酸殘基為Z3、Z4或者Z6；(ae)在位置47上，氨基酸殘基為Z4或Z6；(af)在位置49和/或100上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(ag)在位置68上，氨基酸殘基為Z4或Z5；(ah)在位置143上，氨基酸殘基為Z4；(ai)在位置131上，氨基酸殘基為Z5；(aj)在位置125和/或128上，氨基酸殘基為Z5；(ak)在位置67上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(al)在位置60上，氨基酸殘基為Z5；和(am)在位置37上，氨基酸殘基為Z4或Z6；其中Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z3是選自由N、Q、S和T組成的組的氨基酸；Z4是選自由R、H和K組成的組的氨基酸；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在對應(yīng)于在(a)-(am)中指定的位置的氨基酸序列中還包含氨基酸殘基，其中至少90％地遵從在(a)-(am)中指定的氨基酸殘基的限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在對應(yīng)于如下位置的氨基酸序列中還包含氨基酸殘基，其中至少90％地遵從如下限制：(a)在位置1、7、9、13、20、36、42、46、50、56、64、70、72、75、76、78、94、98、107、110、117、118、121和/或141上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置16、21、22、23、25、29、34、41、43、44、55、66、71、73、74、77、85、87、88、95、99、102、108、109、111、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為B2；其中B1為選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；而B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在對應(yīng)于如下位置的氨基酸序列中還包含氨基酸殘基，其中至少90％地遵從如下限制：(a)在位置1、7、9、13、20、42、46、50、56、64、70、72、75、76、78、94、98、107、110、117、118、121和/或141上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置16、21、22、23、25、29、34、36、41、43、44、55、66、71、73、74、77、85、87、88、95、99、102、108、109、111、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為B2；其中B1為選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；而B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在對應(yīng)于如下位置的氨基酸序列中還包含氨基酸殘基，其中至少90％地遵從如下限制：(a)在位置1、7、9、13、20、42、50、72、75、76、78、94、98、110、121和/或141上，氨基酸殘基為Z1；(b)在位置13、46、56、70、107、117和/或118上，氨基酸殘基為Z2；(c)在位置23、55、71、77、88和/或109上，氨基酸殘基為Z3；(d)在位置16、21、41、73、85、99和/或111上，氨基酸殘基為Z4；(e)在位置34和/或95上，氨基酸殘基為Z5；(f)在位置22、25、29、43、44、66、74、87、102、108、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為Z6；其中Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z3是選自由N、Q、S和T組成的組的氨基酸；Z4是選自由R、H和K組成的組的氨基酸；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在位置36上還包含選自由Z1和Z3組成的組的氨基酸殘基。一些本發(fā)明的優(yōu)選GAT多肽在位置64上還包含選自由Z1和Z2組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在對應(yīng)于如下位置的氨基酸序列中還包含氨基酸殘基，其中至少80％地遵從如下限制：(a)在位置2上，氨基酸殘基為I或L；(b)在位置3上，氨基酸殘基為E；(c)在位置4上，氨基酸殘基為V或I；(d)在位置5上，氨基酸殘基為K；(e)在位置6上，氨基酸殘基為P；(f)在位置8上，氨基酸殘基為N；(g)在位置10上，氨基酸殘基為E；(h)在位置11上，氨基酸殘基為D或E；(i)在位置12上，氨基酸殘基為T；(j)在位置14上，氨基酸殘基為E或D；(k)在位置15上，氨基酸殘基為L；(l)在位置17上，氨基酸殘基為H；(m)在位置18上，氨基酸殘基為R、E或K；(n)在位置19上，氨基酸殘基為I或V；(o)在位置24上，氨基酸殘基為Q；(p)在位置26上，氨基酸殘基為M、L、V或I；(q)在位置27上，氨基酸殘基為E；(r)在位置28上，氨基酸殘基為A或V；(s)在位置30上，氨基酸殘基為M；(t)在位置31上，氨基酸殘基為Y或F；(u)在位置32上，氨基酸殘基為E或D；(v)在位置33上，氨基酸殘基為T或S；(w)在位置35上，氨基酸殘基為L；(x)在位置37上，氨基酸殘基為R、G、E或Q；(y)在位置39上，氨基酸殘基為A或S；(z)在位置40上，氨基酸殘基為F或L；(aa)在位置45上，氨基酸殘基為Y或F；(ab)在位置47上，氨基酸殘基為R或G；(ac)在位置48上，氨基酸殘基為G；(ad)在位置49上，氨基酸殘基為K、R或Q；(ae)在位置51上，氨基酸殘基為I或V；(af)在位置52上，氨基酸殘基為S；(ag)在位置53上，氨基酸殘基為I或V；(ah)在位置54上，氨基酸殘基為A；(ai)在位置57上，氨基酸殘基為H或N；(aj)在位置58上，氨基酸殘基為Q、K、R或P；(ak)在位置59上，氨基酸殘基為A；(al)在位置60上，氨基酸殘基為E；(am)在位置61上，氨基酸殘基為H或R；(an)在位置63上，氨基酸殘基為E或D；(ao)在位置65上，氨基酸殘基為E、P或Q；(ap)在位置67上，氨基酸殘基為Q或R；(aq)在位置68上，氨基酸殘基為K或E；(ar)在位置69上，氨基酸殘基為Q；(as)在位置79上，氨基酸殘基為E；(at)在位置80上，氨基酸殘基為G；(au)在位置81上，氨基酸殘基為Y、H或F；(av)在位置82上，氨基酸殘基為R；(aw)在位置83上，氨基酸殘基為E或D；(ax)在位置84上，氨基酸殘基為Q；(ay)在位置86上，氨基酸殘基為A；(az)在位置89上，氨基酸殘基為G、T或S；(ba)在位置90上，氨基酸殘基為L；(bb)在位置91上，氨基酸殘基為L、I或V；(bc)在位置92上，氨基酸殘基為R或K；(bd)在位置93上，氨基酸殘基為H；(be)在位置96上，氨基酸殘基為E或Q；(bf)在位置97上，氨基酸殘基為I；(bg)在位置100上，氨基酸殘基為K或N；(bh)在位置101上，氨基酸殘基為K或R；(bi)在位置103上，氨基酸殘基為A或V；(bj)在位置104上，氨基酸殘基為D；(bk)在位置105上，氨基酸殘基為M、L或I；(Bl)在位置106上，氨基酸殘基為L；(bm)在位置112上，氨基酸殘基為T或A；(bn)在位置113上，氨基酸殘基為S或T；(bo)在位置114上，氨基酸殘基為A；(bp)在位置115上，氨基酸殘基為S；(bq)在位置119上，氨基酸殘基為K或R；(br)在位置120上，氨基酸殘基為K或R；(bs)在位置123上，氨基酸殘基為F或L；(bt)在位置125上，氨基酸殘基為E；(bu)在位置126上，氨基酸殘基為Q或H；(bv)在位置128上，氨基酸殘基為E或D；(bw)在位置129上，氨基酸殘基為V或I；(bx)在位置130上，氨基酸殘基為F；(by)在位置131上，氨基酸殘基為D或E；(bx)在位置132上，氨基酸殘基為T；(ca)在位置135上，氨基酸殘基為V；(cb)在位置138上，氨基酸殘基為H；(cc)在位置139上，氨基酸殘基為I；(cd)在位置140上，氨基酸殘基為L或M；(ce)在位置142上，氨基酸殘基為Y；(cf)在位置143上，氨基酸殘基為K或R；(cg)在位置145上，氨基酸殘基為L或I；和(ch)在位置146上，氨基酸殘基為T。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在對應(yīng)于上面的(a)-(ch)中指定的位置的氨基酸序列中還包含氨基酸殘基，其中至少90％地遵從在(a)-(ch)中指定的氨基酸殘基的限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽可以與選自由SEQIDNO：300、445或457組成的組的參比氨基酸序列最佳地比對，采用B1OSUM62矩陣方法，存在一個缺口罰11分，延伸一個缺口罰1分，產(chǎn)生至少為460的相似性分值，其中至少如下位置之一遵從如下的限制：(i)在位置18和38上，存在一個Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，存在一個Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，存在一個Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，存在一個Z2氨基酸殘基；其中：Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基，并且另外地，氨基酸序列對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少80％地遵從如下限制：(a)在位置9、76、94和110上，氨基酸殘基為A；(b)在位置29和108上，氨基酸殘基為C；(c)在位置34上，氨基酸殘基為D；(d)在位置95上，氨基酸殘基為E；(e)在位置56上，氨基酸殘基為F；(f)在位置43、44、66、74、87、102、116、122、127和136上，氨基酸殘基為G；(g)在位置41上，氨基酸殘基為H；(h)在位置7上，氨基酸殘基為I；(i)在位置85上，氨基酸殘基為K；(j)在位置20、42、50、78和121上，氨基酸殘基為L；(k)在位置1和141上，氨基酸殘基為M；(l)在位置23和109上，氨基酸殘基為N；(m)在位置22、25、133、134和137上，氨基酸殘基為P；(n)在位置71上，氨基酸殘基為Q；(o)在住置16、21、73、99和111上，氨基酸殘基為R；(p)在位置55上，氨基酸殘基為S；(q)在位置77上，氨基酸殘基為T；(r)在位置107上，氨基酸殘基為W；和(s)在位置13、46、70和118上，氨基酸殘基為Y。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽還包含氨基酸序列，其中氨基酸殘基滿足至少如下限制之一：(a)在位置36上，氨基酸殘基為M、L、或T；(b)在位置72上，氨基酸殘基為L或I；(c)在位置75上，氨基酸殘基為M或V；(d)在位置64上，氨基酸殘基為L、I或F；(e)在位置88上，氨基酸殘基為T或S；和(f)在位置117上，氨基酸殘基為Y或F。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽還包含氨基酸序列，其中氨基酸殘基滿足至少如下限制之一：(a)在位置14上，氨基酸殘基為D；(b)在位置18上，氨基酸殘基為E；(c)在位置26上，氨基酸殘基為M或V；(e)在位置30上，氨基酸殘基為I；(f)在位置32上，氨基酸殘基為D；(g)在位置36上，氨基酸殘基為M或T；(i)在位置37上，氨基酸殘基為C；(j)在位置38上，氨基酸殘基為D；(j)在位置53上，氨基酸殘基為V；(k)在位置58上，氨基酸殘基為R；(l)在位置61上，氨基酸殘基為R；(m)在位置62上，氨基酸殘基為L；(n)在位置64上，氨基酸殘基為I或F；(o)在位置65上，氨基酸殘基為P；(p)在位置72上，氨基酸殘基為I；(q)在位置75上，氨基酸殘基為V；(r)在位置88上，氨基酸殘基為T；(s)在位置89上，氨基酸殘基為G；(t)在位置91上，氨基酸殘基為L；(u)在位置98上，氨基酸殘基為I；(v)在位置105上，氨基酸殘基為I；(w)在位置112上，氨基酸殘基為A；(x)在位置124上，氨基酸殘基為G或C；(y)在位置128上，氨基酸殘基為D；(z)在位置140上，氨基酸殘基為M；(aa)在位置143上，氨基酸殘基為R；和(ab)在位置144上，氨基酸殘基為W。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽還包含氨基酸序列，其中對應(yīng)于上面的(a)-(ab)中指定的位置的氨基酸殘基至少80％地遵從在(a)-(ab)中指定的氨基酸殘基的限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽具有包含氨基酸殘基的氨基酸序列，至少該氨基酸殘基之一滿足如下的額外限制：(a)在位置41上，氨基酸殘基為H；(b)在位置138上，氨基酸殘基為H；(c)在位置34上，氨基酸殘基為N；和(d)在位置55上，氨基酸殘基為S。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽包含選自由如下組成的組的氨基酸序列：(a)與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列；(c)與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列；(d)與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列；(g)與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列；(i)與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列；(m)與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列；和(n)與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽包含選自由如下組成的組的氨基酸序列：(a)與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列；(c)與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列；(d)與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列；(g)與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列；(i)與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列；(m)與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列；和(n)與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列，其中至少如下位置之一還遵從如下限制：(i)在位置18和38上，存在一個Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62，存在一個Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，存在一個Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，存在一個Z2氨基酸殘基，其中：其中Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽包含選自由如下組成的組的氨基酸序列：(a)與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列；(c)與SEQIDNO：621至少979％相同的氨基酸序列；(d)與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列；(g)與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列；(i)與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列；(m)與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列；和(n)與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列，其中氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少90％地遵從于如下限制：(a)在位置2、4、15、19、26、28、31、45、51、54、86、90、91、97、103、105、106、114、123、129、139和/或145上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置3、5、8、10、11、14、17、24、27、32、37、47、48、49、52、57、58、61、63、68、69、79、80、82、83、89、92、100、101、104、119、120、125、126、128、131和/或143上，氨基酸殘基為B2；其中B1為選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；而B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽包含選自由如下組成的組的氨基酸序列：(a)與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列；(c)與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列；(d)與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列；(g)與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列；(i)與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列；(m)與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列；和(n)與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列，其中氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少80％地遵從于如下限制：(a)在位置2、4、15、19、26、28、31、45、51、54、86、90、91、97、103、105、106、114、123、129、139和/或145上，氨基酸殘基為Z1；和(b)在位置31和/或45上，氨基酸殘基為Z2；(c)在位置8上，氨基酸殘基為Z3；(d)在位置89上，氨基酸殘基為Z3或者Z6；(e)在位置82，92，101和/或120上，氨基酸殘基為Z4；(f)在位置3、11、27和/或79上，氨基酸殘基為Z5；(g)在位置18上，氨基酸殘基為Z4或Z5；(h)在位置123上，氨基酸殘基為Z1或Z2；(i)在位置12、33、35、39、53、59、112、132、135、140和/或146上，氨基酸殘基為Z1或Z3；(j)在位置30上，氨基酸殘基為Z1；(k)在位置6上，氨基酸殘基為Z6；(l)在位置81上，氨基酸殘基為Z2或Z4；(m)在位置113上，氨基酸殘基為Z3；(n)在位置138上，氨基酸殘基為Z4；(o)在位置142上，氨基酸殘基為Z2；(p)在位置57和/或126上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(q)在位置5，17和61上，氨基酸殘基為Z4；(r)在位置24上，氨基酸殘基為Z3；(s)在位置104上，氨基酸殘基為Z5；(t)在位置52和/或69上，氨基酸殘基為Z3；(u)在位置14和/或119上，氨基酸殘基為Z5；(v)在位置10、32、63和/或83上，氨基酸殘基為Z5；(w)在位置48和/或80上，氨基酸殘基為Z6；(x)在位置40上，氨基酸殘基為Z1或Z2；(y)在位置96上，氨基酸殘基為Z3或Z5；(z)在位置65上，氨基酸殘基為Z3、Z4或Z6；(aa)在位置84和/或115上，氨基酸殘基為Z3；(ab)在位置93上，氨基酸殘基為Z4；(ac)在位置130上，氨基酸殘基為Z2；(ad)在位置58上，氨基酸殘基為Z3、Z4或者Z6；(ae)在位置47上，氨基酸殘基為Z4或Z6；(af)在位置49和/或100上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(ag)在位置68上，氨基酸殘基為Z4或Z5；(ah)在位置143上，氨基酸殘基為Z4；(ai)在位置131上，氨基酸殘基為Z5；(aj)在位置125和/或128上，氨基酸殘基為Z5；(ak)在位置67上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(al)在位置60上，氨基酸殘基為Z5；和(am)在位置37上，氨基酸殘基為Z4或Z6；其中Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z3是選自由N、Q、S和T組成的組的氨基酸；Z4是選自由R、H和K組成的組的氨基酸；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在對應(yīng)于在(a)-(am)中指定的位置的氨基酸序列中還包含氨基酸殘基，其中至少90％地遵從在(a-(am)中指定的氨基酸殘基的限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在對應(yīng)于如下位置的氨基酸序列還包含氨基酸殘基，其中至少90％地遵從如下的額外限制：(a)在位置1、7、9、13、20、36、42、46、50、56、64、70、72、75、76、78、94、98、107、110、117、118、121和/或141上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置16、21、22、23、25、29、34、41、43、44、55、66、71、73、74、77、85、87、88、95、99、102、108、109、111、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為B2；其中B1為選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；而B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在對應(yīng)于如下位置的氨基酸序列中還包含氨基酸殘基，其中至少90％地遵從如下的額外限制：(a)在位置1、7、9、13、20、36、42、46、50、56、64、70、72、75、76、78、94、98、107、110、117、118、121和/或141上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置16、21、22、23、25、29、34、41、43、44、55、66、71、73、74、77、85、87、88、95、99、102、108、109、111、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為B2；其中B1為選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；而B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽在對應(yīng)于如下位置的氨基酸序列中還包含氨基酸殘基，其中至少90％地遵從如下限制：(a)在位置1、7、9、20、42、50、72、75、76、78、94、98、110、121和/或141上，氨基酸殘基為Z1；(b)在位置13、46、56、70、107、117和/或118上，氨基酸殘基為Z2；(c)在位置23、55、71、77、88和/或109上，氨基酸殘基為Z3；(d)在位置16、21、41、73、85、99和/或111上，氨基酸殘基為Z4；(e)在位置34和/或95上，氨基酸殘基為Z5；(f)在位置22、25、29、43、44、66、74、87、102、108、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為Z6；其中Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z3是選自由N、Q、S和T組成的組的氨基酸；Z4是選自由R、H和K組成的組的氨基酸；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽還包含一種氨基酸序列，其中位置36上的氨基酸殘基選自由Z1和Z3組成的組。一些本發(fā)明的優(yōu)選GAT多肽還包含一種氨基酸序列，其中位置64上的氨基酸殘基選自由Z1和Z2組成的組。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽還包含一種氨基酸序列，其中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少80％地遵從如下限制：(a)在位置2上，氨基酸殘基為I或L；(b)在位置3上，氨基酸殘基為E；(c)在位置4上，氨基酸殘基為V或I；(d)在位置5上，氨基酸殘基為K；(e)在位置6上，氨基酸殘基為P；(f)在位置8上，氨基酸殘基為N；(g)在位置10上，氨基酸殘基為E；(h)在位置11上，氨基酸殘基為D或E；(i)在位置12上，氨基酸殘基為T；(j)在位置14上，氨基酸殘基為E或D；(k)在位置15上，氨基酸殘基為L；(l)在位置17上，氨基酸殘基為H；(m)在位置18上，氨基酸殘基為R、E或K；(n)在位置19上，氨基酸殘基為I或V；(o)在位置24上，氨基酸殘基為Q；(p)在位置26上，氨基酸殘基為M、L、V或I；(q)在位置27上，氨基酸殘基為E；(r)在位置28上，氨基酸殘基為A或V；(s)在位置30上，氨基酸殘基為M；(t)在位置31上，氨基酸殘基為Y或F；(u)在位置32上，氨基酸殘基為E或D；(v)在位置33上，氨基酸殘基為T或S；(w)在位置35上，氨基酸殘基為L；(x)在位置37上，氨基酸殘基為R、G、E或Q；(y)在位置39上，氨基酸殘基為A或S；(z)在位置40上，氨基酸殘基為F或L；(aa)在位置45上，氨基酸殘基為Y或F；(ab)在位置47上，氨基酸殘基為R或G；(ac)在位置48上，氨基酸殘基為G；(ad)在位置49上，氨基酸殘基為K、R或Q；(ae)在位置51上，氨基酸殘基為I或V；(af)在位置52上，氨基酸殘基為S；(ag)在位置53上，氨基酸殘基為I或V；(ah)在位置54上，氨基酸殘基為A；(ai)在位置57上，氨基酸殘基為H或N；(aj)在位置58上，氨基酸殘基為Q、K、R或P；(ak)在位置59上，氨基酸殘基為A；(al)在位置60上，氨基酸殘基為E；(am)在位置61上，氨基酸殘基為H或R；(an)在位置63上，氨基酸殘基為E或D；(ao)在位置65上，氨基酸殘基為E、P或Q；(ap)在位置67上，氨基酸殘基為Q或R；(aq)在位置68上，氨基酸殘基為K或E；(ar)在位置69上，氨基酸殘基為Q；(as)在位置79上，氨基酸殘基為E；(at)在位置80上，氨基酸殘基為G；(au)在位置81上，氨基酸殘基為Y、H或F；(av)在位置82上，氨基酸殘基為R；(aw)在位置83上，氨基酸殘基為E或D；(ax)在位置84上，氨基酸殘基為Q；(ay)在位置86上，氨基酸殘基為A；(az)在位置89上，氨基酸殘基為G、T或S；(ba)在位置90上，氨基酸殘基為L；(bb)在位置91上，氨基酸殘基為L、I或V；(bc)在位置92上，氨基酸殘基為R或K；(bd)在位置93上，氨基酸殘基為H；(be)在位置96上，氨基酸殘基為E或Q；(bf)在位置97上，氨基酸殘基為I；(bg)在位置100上，氨基酸殘基為K或N；(bh)在位置101上，氨基酸殘基為K或R；(bi)在位置103上，氨基酸殘基為A或V；(bj)在位置104上，氨基酸殘基為D；(bk)在位置105上，氨基酸殘基為M、L或I；(Bl)在位置106上，氨基酸殘基為L；(bm)在位置112上，氨基酸殘基為T或A；(bn)在位置113上，氨基酸殘基為S或T；(bo)在位置114上，氨基酸殘基為A；(bp)在位置115上，氨基酸殘基為S；(bq)在位置119上，氨基酸殘基為K或R；(br)在位置120上，氨基酸殘基為K或R；(bs)在位置123上，氨基酸殘基為F或L；(bt)在位置125上，氨基酸殘基為E；(bu)在位置126上，氨基酸殘基為Q或H；(bv)在位置128上，氨基酸殘基為E或D；(bw)在位置129上，氨基酸殘基為V或I；(bx)在位置130上，氨基酸殘基為F；(by)在位置131上，氨基酸殘基為D或E；(bz)在位置132上，氨基酸殘基為T；(ca)在位置135上，氨基酸殘基為V；(cb)在位置138上，氨基酸殘基為H；(cc)在位置139上，氨基酸殘基為I；(cd)在位置140上，氨基酸殘基為L或M；(ce)在位置142上，氨基酸殘基為Y；(cf)在位置143上，氨基酸殘基為K或R；(cg)在位置145上，氨基酸殘基為L或I；和(ch)在位置146上，氨基酸殘基為T。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽包含氨基酸序列，其中對應(yīng)于在上面的(a)-(ch)中指出的位置的殘基至少90％地遵從于在(a)-(ch)中指出的氨基酸殘基的限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽包含選自由如下組成的組的氨基酸序列：(a)與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列；(b)與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列；(c)與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列；(d)與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列；(g)與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列；(i)與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列；(m)與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列；和(n)與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列，其中氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少80％地遵從于如下限制：(a)在位置9、76、94和110上，氨基酸殘基為A；(b)在位置29和108上，氨基酸殘基為C；(c)在位置34上，氨基酸殘基為D；(d)在位置95上，氨基酸殘基為E；(e)在位置56上，氨基酸殘基為F；(f)在位置43、44、66、74、87、102、116、122、127和136上，氨基酸殘基為G；(g)在位置41上，氨基酸殘基為H；(h)在位置7上，氨基酸殘基為I；(i)在位置85上，氨基酸殘基為K；(j)在位置20、42、50、78和121上，氨基酸殘基為L；(k)在位置1和141上，氨基酸殘基為M；(l)在位置23和109上，氨基酸殘基為N；(m)在位置22、25、133、134和137上，氨基酸殘基為P；(n)在位置71上，氨基酸殘基為Q；(o)在位置16、21、73、99和111上，氨基酸殘基為R；(p)在位置55上，氨基酸殘基為S；(q)在位置77上，氨基酸殘基為T；(r)在位置107上，氨基酸殘基為W；和(s)在位置13、46、70和118上，氨基酸殘基為Y。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽還包含氨基酸序列，其中至少滿足如下標準之一：(a)在位置14上，氨基酸殘基為D；(b)在位置18上，氨基酸殘基為E；(c)在位置26上，氨基酸殘基為M或V；(e)在位置30上，氨基酸殘基為I；(f)在位置32上，氨基酸殘基為D；(g)在位置36上，氨基酸殘基為M或T；(i)在位置37上，氨基酸殘基為C；(j)在位置38上，氨基酸殘基為D；(j)在位置53上，氨基酸殘基為V；(k)在位置58上，氨基酸殘基為R；(l)在位置61上，氨基酸殘基為R；(m)在位置62上，氨基酸殘基為L；(n)在位置64上，氨基酸殘基為I或F；(o)在位置65上，氨基酸殘基為P；(p)在位置72上，氨基酸殘基為I；(q)在位置75上，氨基酸殘基為V；(r)在位置88上，氨基酸殘基為T；(s)在位置89上，氨基酸殘基為G；(t)在位置91上，氨基酸殘基為L；(u)在位置98上，氨基酸殘基為I；(v)在位置105上，氨基酸殘基為I；(w)在位置112上，氨基酸殘基為A；(x)在位置124上，氨基酸殘基為G或C；(y)在位置128上，氨基酸殘基為D；(z)在位置140上，氨基酸殘基為M；(aa)在位置143上，氨基酸殘基為R；和(ab)在位置144上，氨基酸殘基為W。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽還包含氨基酸序列，其中對應(yīng)于在上面的(a)-(ab)中指定的位置的氨基酸殘基至少80％地遵從在(a)-(ab)中指定的氨基酸殘基的限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽還包含氨基酸序列，其中還滿足如下條件：(a)在位置41上，氨基酸殘基為H；(b)在位置138上，氨基酸殘基為H；(c)在位置34上，氨基酸殘基為N；和(d)在位置55上，氨基酸殘基為S。當一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽最佳地與選自由SEQIDNO：300、445或457組成的組的參比序列比較時，采用B1OSUM62矩陣，存在一個缺口罰11分，缺口一個延伸罰1分，產(chǎn)生至少為460的相似性分值，GAT多肽具有一個或多個如下位置滿足如下限制的氨基酸序列：(i)在位置18和38上，存在一個Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，存在一個Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，存在一個Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，存在一個Z2氨基酸殘基，其中：Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。在前述GAT多肽的某些中，多肽中對應(yīng)于位置28的氨基酸殘基為V，I或A。位置28上的纈氨酸或異亮氨酸通常與KM降低有關(guān)，而該位置的丙氨酸通常與k催化升高有關(guān)。位置89上的蘇氨酸和位置58上的精氨酸通常與KM降低有關(guān)。其他優(yōu)選的GAT多肽被表征為具有I27(即位置27上的I)、M30、D34、S35、R37、S39、H41、G48、K49、N57、Q58、P62、T62、Q65、Q67、K68、V75、E83、S89、A96、E96、R101、T112、A114、K119、K120、E128、V129、D131、T131、V132、V134、V135、H138、R144、I145或T146，或者它們的任意組合。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽包含選自由如下組成的組的氨基酸序列：SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823和825。另一個方面，本發(fā)明提供分離的或重組的多肽，其包含選自由如下組成的組的氨基酸序列中的至少20個，或者可替代地至少50個、至少75個、至少100個、至少125個、至少130個、至少135個、至少140個、至少141個、至少142個、至少143個、至少144或至少145個連續(xù)的氨基酸：(a)與SEQIDNO：919至少96％相同的氨基酸序列(例SEQIDNO：917、919、921、923、925、927、833、835、839、43、845、859、863、873、877、891、895、901、905、907、913、915或950)；(b)與SEQIDNO：929至少97％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：929、931、835、843、849或867)；(c)與SEQIDNO：847至少98％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：845或847)；(d)與SEQIDNO：851至少98％的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：853至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：855至少98％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：835或855)；(g)與SEQIDNO：857至少98％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：861至少98％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：839、861或883)；(i)與SEQIDNO：871至少98％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：875至少98％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：881至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：885至少98％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：845或885)；(m)與SEQIDNO：887至少98％相同的氨基酸序列；(n)與SEQIDNO：889至少98％相同的氨基酸序列(例如，SEQIDNO：863、889、891或903)；(o)與SEQIDNO：893至少98％相同的氨基酸序列；(p)與SEQIDNO：897至少98％相同的氨基酸序列；(q)與SEQIDNO：899至少98％相同的氨基酸序列；(r)與SEQIDNO：909至少98％相同的氨基酸序列(例如，SEQIDNO：883或909)；(s)與SEQIDNO：911至少98％相同的氨基酸序列；(t)與SEQIDNO：837至少99％相同的氨基酸序列；(u)與SEQIDNO：841至少99％相同的氨基酸序列；(v)與SEQIDNO：865至少99％相同的氨基酸序列；(w)與SEQIDNO：869至少99％相同的氨基酸序列；和(x)與SEQIDNO：879至少99％相同的氨基酸序列。另一個方面，本發(fā)明提供分離的或重組的多肽，該多肽包含與SEQIDNO：929至少95％相同的氨基酸序列中的至少20個，或者可替代地至少50個、至少75個、至少100個、至少125個、至少130個、至少135個、至少140個、至少141個、至少142個、至少143個、至少144或至少145個連續(xù)的氨基酸，并且在對應(yīng)于SEQIDNO：929的位置33的氨基酸位置上包含Gly或者Asn殘基(例如，SEQIDNO：837、849、893、897、905、921、927、929或931)。另一個方面，本發(fā)明提供包含選自由如下組成的組的氨基酸序列的殘基2-146的多肽，SEQIDNO：833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972。在本發(fā)明的一些實施方案中，多肽的氨基酸序列在對應(yīng)于參比氨基酸序列的位置2的氨基酸的N末端一側(cè)上包含Met、Met-Ala或Met-Ala-Ala。一些優(yōu)選的本發(fā)明的GAT多肽包含選自由如下組成的組的氨基酸序列：SEQIDNO：833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948和950。本發(fā)明還提供優(yōu)選的GAT多肽，其特征為前述的氨基酸位置限制的組合。此外，本發(fā)明提供編碼上述的優(yōu)選GAT多肽的GAT多核苷酸，及其互補核苷酸序列。如在此所描述，本發(fā)明的某些方面特別地涉及具有GAT活性的GAT多肽的上述分類的任何之一的子集。這些GAT多肽是優(yōu)選的，例如用作試劑、賦予植物以草甘膦抗性。GAT活性的期望水平的例子在此被描述。在一個方面中，GAT多肽包含由重組的或者分離形式的天然存在的核苷酸所編碼的氨基酸序列，分離形式的核苷酸從天然來源如細菌菌株中分離得到。用本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)特異性地篩選編碼這種GAT多肽的野生型的多核苷酸。通過表達來自具有GAT活性的桿菌菌株的序列克隆發(fā)現(xiàn)了SEQIDNO：6-10所定義的多肽，這將在下文被更加詳細地描述。本發(fā)明還包括分離的或重組的多肽，其由包含核苷酸序列的分離的或重組的多核苷酸所編碼，該核苷酸序列在嚴緊條件下可以與幾乎全長的選自由SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822和824組成的組的核苷酸序列及其補體雜交，以及與全長的編碼選自由SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823和825組成的組的氨基酸序列的核苷酸序列，包括與其補體雜交。本發(fā)明還包括由分離的或重組的多核苷酸編碼的分離的或重組的多肽，該多核苷酸包含核苷酸序列，該核苷酸序列在嚴緊條件下可以與幾乎全長的選自由SEQIDNO：832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928和930組成的組的核苷酸序列及其補體，以及編碼選自由SEQIDNO：833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972組成的組的氨基酸序列的核苷酸序列雜交。本發(fā)明還包括任何具有GAT活性的多肽，該多肽由在此描述的編碼GAT的多核苷酸的任何之一的片段所編碼。本發(fā)明還提供可以被一起剪接來構(gòu)成功能性GAT多肽的GAT多肽的片段。剪接可以在體外或者體內(nèi)進行，包括順式或反式剪接(即分子外或分子內(nèi)剪接)。片段本身可以具有，但是不是必需具有GAT活性。例如，兩個或多個GAT多肽的區(qū)段被內(nèi)含子分離；通過順式剪接去除該內(nèi)含子序列，生成功能性的GAT多肽。在另一個實施例中，密碼子化的GAT多肽被表達成兩種或多種分離的片段；反式剪接這些區(qū)段，導致恢復為一種功能性的GAT多肽。美國專利申請09/517,933和09/710,686中更加詳細地描述了順式和反式剪接、基因編碼和間插序列的插入的各個方面，這兩份申請在此完全引入作為參考?？傊景l(fā)明包括由被修飾的GAT多核苷酸所編碼的任何多肽，該被修飾的多核苷酸通過在此描述的多核苷酸序列的突變、遞推序列重組和/或多樣化來獲得。在本發(fā)明的某些方面，通過單個或多個氨基酸取代、缺失、插入或者一種或多種這種類型的修飾的組合，來修飾GAT多肽。取代可以是保守的或者不保守的，可以改變功能或者不改變功能，以及可以添加新功能。插入和缺失可以是實質(zhì)性的，例如截短序列的實質(zhì)性片段，或者在內(nèi)部或者在N末端或C末端融合任何其他序列。在本發(fā)明的一些實施方案中，GAT多肽是融合蛋白的一部分，融合蛋白包括功能性添加，例如分泌信號、葉綠體轉(zhuǎn)運肽、純化標記或者大量其他功能性基團的任何一種，這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，本說明書在別處對此有更加詳細的描述。本發(fā)明的多肽可以含有一個或者多個被修飾的氨基酸。存在被修飾的氨基酸可能有利于，例如(a)延長多肽的體內(nèi)半衰期，(b)降低或提高多肽的抗原性，和(c)提供多肽的存儲穩(wěn)定性。在重組生產(chǎn)的翻譯過程中或者翻譯后，氨基酸被修飾(例如在哺乳動物細胞中表達的過程中，在N-X-S/T基序處發(fā)生N連接的糖基化)，或者通過合成手段修飾。被修飾的氨基酸的非限制性例子包括糖基化的氨基酸、硫酸化的氨基酸、異戊二烯基化(例如法尼基化、香葉基化)的氨基酸、乙?；陌被?、酰化的氨基酸、PEG化的氨基酸、生物素化的氨基酸和羧基化的氨基酸、磷酸化的氨基酸等。有很多參考文獻可以指導熟練的技術(shù)人員如何修飾氨基酸。示例性的方法可見Walker(1998)ProteinProtocolsonCD-ROM(Humana出版社，Towata，新澤西)。用于生產(chǎn)和分離本發(fā)明的GAT多肽的重組方法在此被描述。除了重組生產(chǎn)外，可以用固相技術(shù)直接合成肽來生產(chǎn)此多肽(例如，Stewart等人(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis(WHFreeman公司，舊金山)和Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)?？梢杂萌斯ぜ夹g(shù)或者自動化進行肽合成。自動化合成可以例如用AppliedBiosystems431A肽合成儀(PerkinElmer，福斯特城，CA)，按照生產(chǎn)商提供的說明書來進行。例如，可以分別地化學合成亞序列，并且用化學方法進行組合，來提供全長的GAT多肽。這些肽還可以從各種來源訂購。在本發(fā)明的另一個方面，用本發(fā)明的GAT多肽來生產(chǎn)抗體，這些抗體具有診斷用途，例如，涉及GAT多肽在轉(zhuǎn)基因植物的各種組織中的活性、分布和表達。用于抗體誘導的GAT同源多肽不必具有生物學活性；但是，該多肽或者寡肽必須具有抗原性。用于誘導特定的抗體的肽可以具有由至少10個氨基酸，優(yōu)選至少15各個或20個氨基酸組成的氨基酸序列。短的GAT多肽鏈與另一種蛋白質(zhì)，例如匙孔血藍蛋白融合，產(chǎn)生抗嵌合分子的抗體。生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，許多抗體是可獲得的。參見例如，Coligan(1991)CurrentProtocolsinImmunology(Wiley/Greene，紐約州)；Harlow和Lane(1989)Antibodies：ALaboratoryManual(冷泉巷出版社，紐約州)；Stites等人(編輯)BasicandClinicalImmunolo，第4版(LangeMedicalPuBlications，LosAltos，加利福尼亞州)，以及其中引用的文獻；Goding(1986)MonoclinalAntibodies：PrinciplesandPractice，第2版(學術(shù)出版社，紐約，紐約州)；以及Kohler和Milstein(1975)Nature256：495-497。其他適合抗體制備的技術(shù)包括在噬菌體或類似載體中篩選重組抗體的文庫。參見Huse等人(1989)Science246：1275-1281和Ward等人(1989)Nature341：544-546。特異性的單克隆和多克隆抗體和抗血清通常以至少約0.1μM，優(yōu)選地至少約0.01μM或更小，最典型地和優(yōu)選地為0.001μM或更小的K0結(jié)合。其他詳細的抗體生產(chǎn)和工程化技術(shù)可見Borrebaeck編輯(1995)AntibodyEngineering，第2版(Freeman和Company，紐約州)；McCafferty等人(1996)AntibodyEngineering，APracticalApproach(IRL牛津出版社，牛津，英格蘭)；和Paul(1995)AntibodyEngineeringProtocols(HumanaPress，Towata，新澤西)。序列變體本發(fā)明的GAT多肽包括在此以SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972形式公開的序列的保守性修飾的變異。這種保守性修飾的變異包含取代、添加或者缺失，其改變、添加或者缺失了SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972的任何之一中的單個氨基酸或者一小百分數(shù)的氨基酸(典型地少于約5％，更加典型地少于約4％、2％或1％)。例如，在此被確定為SEQIDNO：6的146個氨基酸的多肽的保守性修飾的變異(例如缺失)將具有至少140個氨基酸的長度，優(yōu)選至少141個氨基酸，更加優(yōu)選至少144個氨基酸，以及更加優(yōu)選至少145個氨基酸，對應(yīng)于多肽序列的小于約5％、4％、2％或約1％或者更少的缺失。根據(jù)在表2中列舉的六個取代組，在此被確定為SEQIDNO：6的多肽的保守性修飾變異的另一個例子(例如“保守性替代變體”)，在該146個氨基酸多肽的最多達約7個殘基(即少于約5％)上含有“保守性替代”。本發(fā)明的GAT多肽的同源物，包括保守性替代的序列，可以作為較大的多肽的一部分出現(xiàn)，例如存在于GAT多肽中，GAT多肽為與信號序列融合的GAT融合物形式，信號序列例如為葉綠體靶向序列，或者在添加一個或多個用于蛋白質(zhì)純化的結(jié)構(gòu)域(例如多聚組氨酸區(qū)段，F(xiàn)LAG標記區(qū)段等)后以較大的多肽的一部分出現(xiàn)。在后一種情況下，額外的結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的GAT部分的活性影響很小或者無影響，而額外的結(jié)構(gòu)域可以通過合成后的加工步驟去除，例如通過用蛋白酶處理而去除。通過免疫反應(yīng)確定多肽由于本發(fā)明的多肽提供一類新的具有確定活性的酶，即能夠乙?；王；莞熟ⅲ摱嚯倪€提供例如可以在免疫學分析中被識別的新的結(jié)構(gòu)特征。產(chǎn)生能夠特異性地結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗血清以及被該血清結(jié)合的多肽，都是本發(fā)明的特征。本發(fā)明包括與抗體或者抗血清特異地結(jié)合或者特異地免疫反應(yīng)的GAT多肽，生成的抗體或抗血清抵抗一種免疫原，該免疫原包含選自SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972中的一種或多種的氨基酸序列。為了消除與其他GAT同源物的交叉反應(yīng)，用可獲得的相關(guān)蛋白來減除(subtracted)抗體或抗血清，這些相關(guān)蛋白例如為對應(yīng)于在本申請申請日可獲得的GenBank登錄號的蛋白質(zhì)或者多肽所代表的，以CAA70664、Z99109和Y09476為例。當?shù)卿浱枌?yīng)于一種核酸時，產(chǎn)生由核酸編碼的多肽，并用于減除抗體/抗血清的目的。附圖3列舉了示例性GAT序列和在Genbank中可獲得的最相關(guān)的序列YitI之間的相對同一性。天然的YitI的功能還未被闡明，但是該酶被證明具有可檢測的GAT活性。在一種典型的形式中，免疫分析使用多克隆抗血清，這種血清可以抵抗一種或多種多肽，該多肽包含一條或多條對應(yīng)于SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972或其亞序列(即，所提供的全長序列的至少約30％)的一個或多個的序列。來源于SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972的可能的多肽免疫原的整個集合在下文被統(tǒng)稱為“免疫原性多肽”。最佳地選擇生成的抗血清，其與其他相關(guān)序列交叉反應(yīng)的活性低，在免疫分析中使用多克隆抗血清之前，用一種或多種相關(guān)序列進行免疫吸收，來除去任何這種交叉反應(yīng)活性。為了生產(chǎn)用于免疫分析中的抗血清，如在此所描述，生產(chǎn)和純化一種或多種免疫原性多肽。例如，可以在細菌的細胞系中生產(chǎn)重組蛋白。用免疫原性蛋白質(zhì)結(jié)合標準佐劑，例如Freund佐劑，采用標準的小鼠免疫方法(參見，Harlow和Hane(1988)，Antibodies，AlaboratoryManual(冷泉巷出版社，紐約)，關(guān)于抗體生產(chǎn)、用于確定特定免疫反應(yīng)活性的免疫分析形式和條件的標準描述)，免疫小鼠的近交系(用于該分析是由于這種小鼠實質(zhì)上在遺傳上是相同的，結(jié)果可重復)。可替代地，將來源于在此公開的一種或多種合成的或重組的多肽與載體蛋白相偶聯(lián)，用作免疫原。收集多克隆抗血清，并在免疫分析中，例如在使用固定在固體支持物上的一種或多種免疫原性蛋白的固相免疫分析中，測定抗血清抵抗免疫原性多肽的效價。選擇效價為106或更高的多克隆抗血清，匯集并用相關(guān)多肽減除，以生產(chǎn)減除的、匯集的、效價確定的多克隆抗血清，相關(guān)多肽如所提及的從GENBANK中確定的那些多肽。檢測減除的、匯集的、效價確定的多克隆抗血清抵抗相關(guān)多肽的交叉反應(yīng)活性。優(yōu)選地，至少兩種免疫原性GAT被用于該確定中，優(yōu)選與至少兩種相關(guān)多肽連接，以確定被免疫原性多肽特異性地結(jié)合的抗體。在這種比較分析中，確定用于減除的、匯集的、效價確定的多克隆抗血清的差別性的結(jié)合條件，與相關(guān)多肽的結(jié)合相比，效價確定的多克隆抗血清與免疫原性GAT多肽的結(jié)合信噪比至少高約5-10倍。也就是說，通過加入非特異性的競爭物如白蛋白或者脫脂奶粉，或者調(diào)節(jié)鹽條件、溫度等，可以調(diào)節(jié)此結(jié)合反應(yīng)的嚴緊性。將這些結(jié)合條件用于隨后的分析中，來確定測試的多肽是否被匯集的、效價確定的多克隆抗血清特異地結(jié)合。特別地，在差別性結(jié)合條件下，信噪比至少高出對照多肽2-5倍，并且與免疫原性多肽相比，顯示至少約1/2信噪比的測試多肽與已知的GAT相比，與免疫原性多肽具有實質(zhì)上的結(jié)構(gòu)相似性，并且因此屬于本發(fā)明的多肽。在另一個實施例中，采用競爭結(jié)合形式的免疫分析被用于檢測測試多肽。例如，如所指出，用對照GAT多肽進行免疫吸收，從匯集的抗血清混合物中去除交叉反應(yīng)的抗體。然后將免疫原性多肽固定在固體支持物上，將該固體支持物暴露在減除的、匯集的抗血清中。往分析中加入測試蛋白來競爭與匯集的減除的抗血清的結(jié)合。測試蛋白相對于固定蛋白競爭與匯集的、減除的抗血清的結(jié)合的能力，與加入到分析中的免疫原性多肽競爭結(jié)合的能力相比較(免疫原性多肽有效地與固定的免疫原性多肽競爭，以結(jié)合到匯集的抗血清上)。采用標準的計算方法，計算出測試蛋白的交叉反應(yīng)性的百分率。在平行分析中，任選地測定對照蛋白競爭與匯集的、減除的抗血清結(jié)合的能力，與免疫原性多肽競爭與抗血清結(jié)合的能力相比較。此外，用標準的計算方法，計算出對照多肽的交叉反應(yīng)百分率。當測試多肽的交叉反應(yīng)百分率至少高5-10倍時，該測試多肽被認為特異性地結(jié)合匯集的、減除抗血清?？傊?，免疫吸收和匯集的抗血清可用于在此描述的競爭性結(jié)合免疫分析中，將任何的測試多肽與免疫原性多肽比較。為了進行這種比較，在大的濃度范圍內(nèi)，分別分析兩種多肽，用標準技術(shù)確定各種多肽抑制50％的減除的抗血清與固定蛋白結(jié)合的所需含量。如果所需的測試多肽的含量少于所需的免疫原性多肽含量的兩倍，則認為測試多肽特異地結(jié)合由免疫原性多肽產(chǎn)生的抗體，條件是該含量至少高于對照多肽約5-10倍。作為特異性的最終確定，任選地用免疫原性多肽(而不是對照多肽)完全地免疫吸收匯集的抗血清，直到幾乎沒有或者不能檢測到減除的、匯集的抗血清與免疫原性多肽的結(jié)合。然后，檢測這種被完全免疫吸收的抗血清與測試多肽的反應(yīng)活性。如果只觀察到一點點或者沒有觀察到反應(yīng)活性(即所觀察到的完全免疫吸收的抗血清與免疫原性多肽結(jié)合的信噪比不超過2倍)，則測試多肽被該免疫原性蛋白誘導產(chǎn)生的抗血清特異性地結(jié)合。草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶多核苷酸在一個方面中，本發(fā)明提供在此被稱作為“草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸”或者“GAT多核苷酸”的新的分離的或重組的多核苷酸家族。GAT多核苷酸序列被表征為能夠編碼GAT多肽?？傊?，本發(fā)明包括編碼在此描述的新GAT多肽的任何一種的任何核苷酸序列。在本發(fā)明的一些方面，編碼具有GAT活性的GAT多肽的GAT多核苷酸是優(yōu)選的。在一個方面中，GAT多核苷酸包括從生物體如細菌菌株分離的天然存在的核酸的重組或分離形式。通過表達來自具有GAT活性的桿菌菌株的序列克隆，發(fā)現(xiàn)了示例性的GAT多核苷酸如SEQIDNO：1-5。簡而言之，對約500種桿菌和假單胞菌菌株的集合篩選N-乙?；莞熟⒌奶烊荒芰Α＞暝贚B中生長過夜，通過離心收獲，在稀釋的甲苯中滲透，然后洗滌并重懸在含有緩沖液、5mM草甘膦和200μM乙酰CoA的反應(yīng)混合物中。將細胞在反應(yīng)化合物中培養(yǎng)1-48小時，此時往反應(yīng)中加入等量甲醇。然后在通過母離子模式質(zhì)譜分析之前，離心沉淀細胞，過濾上清液。如附圖2中所示，通過將反應(yīng)混合物的質(zhì)譜圖與N-乙酰草甘膦標準物比較，確定反應(yīng)產(chǎn)物為N-乙酰草甘膦陽性。產(chǎn)品檢測依賴于兩種底物(乙酰CoA和草甘膦)，并且可以用加熱變性細菌細胞來消除。然后通過功能性篩選，從被確定的菌株中克隆單個的GAT多核苷酸。制備基因組DNA，用Sau3A1酶部分地消化。將約4kb的片段克隆到大腸桿菌表達載體中，并轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)大腸桿菌中。按照先前所述的反應(yīng)，通過質(zhì)譜分析確定各種具有GAT活性的克隆，但是用PMBS滲透代替甲苯洗滌。然后對基因組片段進行測序，并確定假定的GAT多肽編碼開放閱讀框。通過在大腸桿菌中表達開放的閱讀框，檢測從反應(yīng)混合物生產(chǎn)的高N-乙酰草甘膦水平，證實了GAT基因的身份。在本發(fā)明的另一個方面中，通過多樣化來制備GAT多核苷酸，例如重組和/或突變一個或多個天然存在的、分離的或重組的GAT多核苷酸。如本文它處更加詳細描述的那樣，通?？梢援a(chǎn)生多樣化的編碼具有較高功能性的GAT多肽的GAT多核苷酸，與用作多樣化加工中的底物或者親本的GAT多核苷酸相比，該GAT多核苷酸表達的GAT多肽的催化功能、穩(wěn)定性和表達水平更高。本發(fā)明的多核苷酸具有各種用途，例如：重組生產(chǎn)(即表達)本發(fā)明的GAT多肽；作為轉(zhuǎn)基因(例如給轉(zhuǎn)基因植物賦予除草劑抗性)；作為轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒保養(yǎng)的可選擇標記；作為免疫原；作為檢測互補的或者部分互補的核酸的可選擇標記(包括檢測天然的GAT編碼核酸)；作為進一步產(chǎn)生多樣性的底物，如重組反應(yīng)或者突變反應(yīng)來生產(chǎn)新的和/或改良的GAT同源物等。值得一提的是，GAT多核苷酸的某些特定的、實質(zhì)性的和可信的用途不要求該多核苷酸編碼具有實質(zhì)性的GAT活性的多肽。例如不編碼活性酶的GAT多核苷酸可以是親本多核苷酸的有價值來源，用于多樣化過程中，來獲得具有期望功能特性(例如高k催化或者k催化/Km、低Km、對熱或其他環(huán)境因子的高穩(wěn)定性、高的轉(zhuǎn)錄或翻譯速度、對蛋白質(zhì)水解斷裂的抗性、減弱的抗原性等)的GAT多核苷酸變體，或非GAT多核苷酸。例如，在DNA改組試驗中，將編碼只有很少或者沒有可檢測活性的蛋白酶變體的核苷酸序列用作親本多核苷酸，生成編碼高活性蛋白酶的后代(Ness等人(1999)NatureBiotech.17：893-96)。通過多樣性產(chǎn)生方法或者遞推序列重組(“RSR”)方法(例如，DNA改組)生產(chǎn)的多核苷酸序列是本發(fā)明的一個特征。使用在此描述的核酸的突變和重組方法是本發(fā)明的一個特征。例如，一種本發(fā)明的方法包括遞推重組一種或多種上下文描述的本發(fā)明的核苷酸序列。重組步驟任選地在體內(nèi)、離體、計算機芯片內(nèi)或體外進行。這種多樣性后代或者遞推序列重組產(chǎn)生至少一個重組修飾的GAT多核苷酸的文庫。本發(fā)明包括這種文庫的成員所編碼的多肽。還包括多核苷酸的用途，多核苷酸在此也被稱作為寡核苷酸，典型地具有至少12個堿基，優(yōu)選至少15個、更加優(yōu)選至少20個、30個或50個或者更多的堿基，其在嚴緊或高度嚴緊條件下與GAT多核苷酸序列雜交。按照在此指出的方法，該多核苷酸可被用作探針、引物、有義和反義試劑等。根據(jù)本發(fā)明，GAT多核苷酸，包括編碼GAT多肽、GAT多肽片段、相關(guān)的融合蛋白或其功能性等價物的核苷酸序列，被用于DNA重組分子中，該重組分子在合適的宿主細胞如細菌或植物細胞中指導GAT多肽的表達。由于遺傳密碼的內(nèi)在簡并性，編碼實質(zhì)上相同或者功能性等價的氨基酸序列的其他核酸序列也被用于克隆和表達GAT多核苷酸。本發(fā)明提供編碼轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)物的GAT多核苷酸，其隨后被剪接并最終生成功能性的GAT多肽。剪接可在體外或者體內(nèi)實現(xiàn)，包括順式或反式剪接。用于剪接的底物可以是多核苷酸(例如RNA轉(zhuǎn)錄)或者多肽。多核苷酸順式剪接的例子是將插入編碼序列的內(nèi)含子去除，兩個側(cè)面連接的外顯子區(qū)域被剪接，生成GAT多肽的編碼序列。反式剪接的例子為將編碼序列分成兩個或多個可以分別轉(zhuǎn)錄的片段，然后將它們拼接成全長的GAT編碼序列。剪接增強子序列(可以被導入本發(fā)明的構(gòu)建體中)的應(yīng)用便于順式或反式剪接。多肽的順式和反式剪接將在下文別處和美國專利申請09/517,933和09/710,686中被更加詳細地描述。因此，某些GAT多核苷酸不直接編碼全長的GAT多肽，而是編碼一個或幾個GAT多肽的片段。通過與剪接相關(guān)的機制，可以用這些GAT多核苷酸表達功能性GAT多肽，其中剪接可以在多核苷酸(例如內(nèi)含子/外顯子)和/或多肽(例如intein/extein)的水平上進行。例如，在控制GAT活性的表達中，這是有用的，因為僅所有所需的片段在允許剪接加工產(chǎn)生功能性產(chǎn)物的條件下被表達時，才表達功能性GAT多肽。在另一個實施例中，將一條或多條序列導入GAT多核苷酸中，便于與低同源性的多肽發(fā)生重組；用內(nèi)含子或內(nèi)含肽來插入序列，便于去除間插序列，從而保留所編碼的變體的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，修飾編碼序列以增強其在特定宿主中的表達是有利的。遺傳密碼富余64個密碼子，但是大部分生物體優(yōu)先使用這些密碼子的一部分。在物種中最常使用的密碼子被稱作為最優(yōu)密碼子，而那些不常使用的密碼子被列為稀有或者低利用度密碼子(參見例如，Zhang等人(1991)Gene105：61-72)?？梢赃M行密碼子取代來反映宿主的優(yōu)先使用的密碼子，這個過程有時被稱作為“密碼子優(yōu)化”或者“對物種密碼子偏愛的控制”。制備含有特定原核或者真核宿主所優(yōu)選的密碼子的優(yōu)化編碼序列(還可以參見Murray等人(1989)Nucl.AcidsRes.17：477-508)，來提高翻譯速度或者產(chǎn)生具有期望特性的重組RNA轉(zhuǎn)錄本，例如，與從未優(yōu)化的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本相比，該轉(zhuǎn)錄本的半衰期更長。也可以修飾翻譯終止密碼子來反映宿主性能。例如，釀酒酵母和哺乳動物的優(yōu)選終止密碼子分別為UAA和UGA。單子葉植物的優(yōu)選終止密碼子為UGA，而昆蟲和大腸桿菌偏愛使用UAA作為終止密碼子(Dalphin等人(1996)Nucl.AcidsRes.24：216-218)。用于優(yōu)化在植物中表達的核苷酸序列的方法在美國專利6,015,891及其引用的參考文獻中提供。本發(fā)明的一個實施方案包括一種GAT多核苷酸，其具有用于在相關(guān)宿主如轉(zhuǎn)基因植物宿主中表達的最佳密碼子。當細菌來源的GAT多核苷酸被導入轉(zhuǎn)基因植物中，例如用于給該植物賦予草甘膦抗性時，特別期望這種多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸序列被工程化以改變GAT多核苷酸，包括但是不限于改變該基因產(chǎn)物的克隆、加工和/或表達的變化。例如，用本領(lǐng)域熟知的方法如定點誘變來引入變化、插入新的限制性位點、改變糖基化模式、改變密碼子偏愛、引入剪接位點等。如在此更加詳細的描述，本發(fā)明的多核苷酸包括編碼新GAT多肽的序列和與該編碼序列互補的序列以及編碼序列的新片段及其補體。多核苷酸可以是RNA的形式或者DNA形式，包括mRNA、cRNA、合成的RNA和DNA、基因組DNA和cDNA。多核苷酸可以是雙鏈的或單鏈的，如果為單鏈的，可以是編碼鏈或者非編碼(反義的，互補的)鏈。多核苷酸任選地包括GAT多肽的編碼序列，可以是(i)分離的，(ii)與其他編碼序列重組，以編碼例如融合蛋白、前體蛋白、前原蛋白等，(iii)與非編碼序列，例如內(nèi)含子或內(nèi)含肽、控制序列如啟動子、增強子、終止元件或?qū)τ诰幋a序列在合適宿主中的表達有效的5′和/或3′非翻譯區(qū)組合，和/或(iv)在載體或宿主環(huán)境中，其中GAT多核苷酸為一種異源基因。還可以發(fā)現(xiàn)該序列與典型的核酸組合物制劑組合，包括在載體、緩沖液、佐劑、賦形劑等的存在下?？梢园凑找阎暮铣煞椒ǎㄟ^標準的固相技術(shù)，來制備本發(fā)明的多核苷酸和寡核苷酸。典型地，分別合成長達100個堿基的片段，然后連接(例如通過酶催化或者化學連接方法或者聚合酶介導的方法)形成任何實際期望的連續(xù)序列。例如，通過化學合成來制備本發(fā)明的多核苷酸和寡核苷酸，采用例如在Beaucage等人(1981)TetrahedronLetters22：1859-6中描述的經(jīng)典氨基亞磷酸酯法或者由Matthes等人(1984)EMBOJ.3：801-05中描述的方法，例如通常在自動合成方法中使用的方法。按照該氨基亞磷酸酯方法，合成寡核苷酸，例如在自動DNA合成儀中合成、純化、退火、連接和克隆到載體中。此外，實際上任何核酸可以向眾多商業(yè)來源之一訂購，例如TheMidlandCertifiedReagentCompany(mcrc@oligos.com)、TheGreatAmericanGeneCompany(www.genco.com)、ExpressGen公司(www.expressgen.com)、OperonTechnologies公司(Alameda，CA)和許多其他公司。類似地，肽和抗體可以向眾多商業(yè)來源之一訂購，例如PeptidoGenic(pkim@ccnet.com)、HTIBio-products公司(www.htibio.com)、BMABiomedicalsLtd(英國)、Bio.Synthesis公司和許多其他公司。還可以用技術(shù)文獻中描述的公知技術(shù)合成多核苷酸。參見，例如Carruthers等人，ColdSpringHarborsymp.Quant.Biol.47：411-418(1982)和Adams等人(1983)JAm.Chem.Soc.105：661。然后通過合成互補鏈并在合適條件下將互補鏈退火，或者通過用合適的引物序列和DNA聚合酶儀器加入互補鏈，來獲得雙鏈的DNA片段。描述可用于此的分子生物學技術(shù)包括誘變的普通教課書，包括Berger和Kimmel，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzyniology，第152卷(學術(shù)出版社公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)；Sambrook等人(1989)MolecularCloning-ALaboratoryManual，第2版，第1-3卷(冷泉巷實驗室，冷泉巷，紐約)；和Ausubel等人編輯(2000)CurrentProtocolsinMolecularBiology(GreenePuBlishingAssociates公司和JohnWiley&Sons公司)。足以引導技術(shù)人員實施體外擴增方法的例子，包括聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)、Qβ-復制酶擴增和其他RNA聚合酶介導的技術(shù)(例如，NASBA)，可見于Berger，Sambrook，和Ausubel，以及Mullis等人(1987)美國專利4,683,202；Innis等人編輯(1990)PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications(學術(shù)出版社公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)；Arnheim&Levinson(1990年10月1日)ChemicalandEngineeringNews36-47；TheJourfzalOfNIHResearch(1991)3：81-94；Kwoh等人(1989)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA86：1173；Guatelli等人(1990)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA87：1874；Lomell等人(1989)J，Clin，Chem，35：1826；Landegren等人(1988)Science241：1077-1080；VanBrunt(1990)Biotechnology8：291-294；Wu和Wallace(1989)Gene4：560；Barringer等人(1990)Gene89：117，以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology13：563-564。體外擴增核酸的改進方法被描述在Wallace等人的美國專利5,426,039中。通過PCR擴增大的核酸的改進方法總結(jié)在Cheng等人(1994)Nature369：684-685及其引用的參考文獻中，其中產(chǎn)生最高達40kb的PCR擴增子。熟練的技術(shù)人員懂得，基本上任何RNA可以被轉(zhuǎn)化為適用于限制性消化、用逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶進行的PCR擴增和測序的雙鏈DNA，參見Ausbel，Sambrook和Berger，均同上文。在一個方面中，本發(fā)明提供分離的或重組的多核苷酸，其選自由SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、06、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952組成的組。本發(fā)明的優(yōu)選多核苷酸包括一種分離的或重組的多核苷酸序列，其編碼一種氨基酸序列，采用B1OSUM62矩陣方法，存在一個缺口罰11分，延伸一個缺口罰1分，該氨基酸與選自由SEQIDNO：300、445或457組成的組的氨基酸序列最佳地比對時，產(chǎn)生至少為460的相似性分值，其中至少如下位置之一遵從如下的限制：(i)在位置18和38上，存在一個Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，存在一個Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，存在一個Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，存在一個Z2氨基酸殘基，其中：Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基，和另外在氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少90％遵從如下限制：(a)在位置2、4、15、19、26、28、31、45、51、54、86、90、91、97、103、105、106、114、123、129、139和/或145上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置3、5、8、10、11、14、17、24、27、32、37、47、48、49、52、57、58、61、63、68、69、79、80、82、83、89、92、100、101、104、119、120、125、126、128、131和/或143上，氨基酸殘基為B2；其中B1是選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；和B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。當用于指定一種氨基酸或者氨基酸殘基殘基時，單字母名稱A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y具有本領(lǐng)域所用的標準含義，并在本文的表1中提供。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當采用B1OSUM62矩陣方法，存在一個缺口罰11分，延伸一個缺口罰1分，將該氨基酸序列與選自由SEQIDNO：300、445或457組成的組的氨基酸序列最佳比對時，產(chǎn)生至少為460的相似性分值，如下位置的一個或多個遵從如下限制：(i)在位置18和38上，有Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，有Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，有Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，有Z2氨基酸殘基，其中：Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基，并且進一步地，氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少80％地遵從如下限制：(a)在位置2、4、15、19、26、28、31、45、51、54、86、90、91、97、103、105、106、114、123、129、139和/或145上，氨基酸殘基為Z1；和(b)在位置31和/或45上，氨基酸殘基為Z2；(c)在位置8上，氨基酸殘基為Z3；(d)在位置89上，氨基酸殘基為Z3或者Z6；(e)在位置82、92、101和/或120上，氨基酸殘基為Z4；(f)在位置3、11、27和/或79上，氨基酸殘基為Z5；(g)在位置18上，氨基酸殘基為Z4或Z5；(h)在位置123上，氨基酸殘基為Z1或Z2；(i)在位置12，33、35、39、53、59、112、132、135、140和/或146上，氨基酸殘基為Z1或Z3；(j)在位置30上，氨基酸殘基為Z1；(k)在位置6上，氨基酸殘基為Z6；(l)在位置81上，氨基酸殘基為Z2或Z4；(m)在位置113上，氨基酸殘基為Z3；(n)在位置138上，氨基酸殘基為Z4；(o)在位置142上，氨基酸殘基為Z2；(p)在位置57和/或126上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(q)在位置5，17和61上，氨基酸殘基為Z4；(r)在位置24上，氨基酸殘基為Z3；(s)在位置104上，氨基酸殘基為Z5；(t)在位置52和/或69上，氨基酸殘基為Z3；(u)在位置14和/或119上，氨基酸殘基為Z5；(v)在位置10、32、63和/或83上，氨基酸殘基為Z5；(w)在位置48和/或80上，氨基酸殘基為Z6；(x)在位置40上，氨基酸殘基為Z1或Z2；(y)在位置96上，氨基酸殘基為Z3或Z5；(z)在位置65上，氨基酸殘基為Z3、Z4或Z6；(aa)在位置84和/或115上，氨基酸殘基為Z3；(ab)在位置93上，氨基酸殘基為Z4；(ac)在位置130上，氨基酸殘基為Z2；(ad)在位置58上，氨基酸殘基為Z3、Z4或者Z6；(ae)在位置47上，氨基酸殘基為Z4或Z6；(af)在位置49和/或100上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(ag)在位置68上，氨基酸殘基為Z4或Z5；(ah)在位置143上，氨基酸殘基為Z4；(ai)在位置131上，氨基酸殘基為Z5；(aj)在位置125和/或128上，氨基酸殘基為Z5；(ak)在位置67上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(al)在位置60上，氨基酸殘基為Z5；和(am)在位置37上，氨基酸殘基為Z4或Z6；其中Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由P、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z3是選自由N、Q、S和T組成的組的氨基酸；Z4是選自由R、H和K組成的組的氨基酸；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，在氨基酸序列中對應(yīng)于在(a)-(am)中指定的位置的氨基酸殘基至少90％地遵從在(a)-(am)中指出的氨基酸殘基的限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當將該氨基酸序列與選自由SEQIDNO：300、445或457組成的組的氨基酸序列最佳比對時，氨基酸序列中的至少90％的氨基酸殘基遵從如下限制：(a)在位置1、7、9、13、20、36、42、46、50、56、64、70、72、75、76、78、94、98、107、110、117、118、121和/或141上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置16、21、22、23、25、29、34、41、43、44、55、66、71、73、74、77、85、87、88、95、99、102、108、109、111、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為B2；其中B1是選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；和B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當將該氨基酸序列與SEQIDNO：300、445或457最佳比對時，氨基酸序列中至少90％的氨基酸殘基遵從如下限制：(a)在位置1、7、9、13、20、42、46、50、56、64、70、72、75、76、78、94、98、107、110、117、118、121和/或141上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置16、21、22、23、25、29、34、36、41、43、44、55、66、71、73、74、77、85、87、88、95、99、102、108、109、111、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為B2；其中B1是選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；和B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當將該氨基酸序列與SEQIDNO：300、445或457最佳比對時，氨基酸序列中的至少90％氨基酸殘基遵從如下限制：(a)在位置1、7、9、20、42、50、72、75、76、78、94、98、110、121和/或141上，氨基酸殘基為Z1；(b)在位置13、46、56、70、107、117和/或118上，氨基酸殘基為Z2；(c)在位置23、55、71、77、88和/或109上，氨基酸殘基為Z3；(d)在位置16、21、41、73、85、99和/或111上，氨基酸殘基為Z4；(e)在位置34和/或95上，氨基酸殘基為Z5；(f)在位置22、25、29、43、44、66、74、87、102、108、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為Z6；其中Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z3是選自由N、Q、S和T組成的組的氨基酸；Z4是選自由R、H和K組成的組的氨基酸；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列在位置36上包含選自由Z1和Z3組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼氨基酸序列，該氨基酸序列在位置64上包含選自由Z1和Z2組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當將該氨基酸序列與SEQIDNO：300、445或457最佳比對時，氨基酸序列中的至少80％的氨基酸殘基遵從如下限制：(a)在位置2上，氨基酸殘基為I或L；(b)在位置3上，氨基酸殘基為E；(c)在位置4上，氨基酸殘基為V或I；(d)在位置5上，氨基酸殘基為K；(e)在位置6上，氨基酸殘基為P；(f)在位置8上，氨基酸殘基為N；(g)在位置10上，氨基酸殘基為E；(h)在位置11上，氨基酸殘基為D或E；(i)在位置12上，氨基酸殘基為T；(j)在位置14上，氨基酸殘基為E或D；(k)在位置15上，氨基酸殘基為L；(l)在位置17上，氨基酸殘基為H；(m)在位置18上，氨基酸殘基為R、E或K；(n)在位置19上，氨基酸殘基為I或V；(o)在位置24上，氨基酸殘基為Q；(p)在位置26上，氨基酸殘基為M、L、V或I；(q)在位置27上，氨基酸殘基為E；(r)在位置28上，氨基酸殘基為A或V；(s)在位置30上，氨基酸殘基為M；(t)在位置31上，氨基酸殘基為Y或F；(u)在位置32上，氨基酸殘基為E或D；(v)在位置33上，氨基酸殘基為T或S；(w)在位置35上，氨基酸殘基為L；(x)在位置37上，氨基酸殘基為R、G、E或Q；(y)在位置39上，氨基酸殘基為A或S；(z)在位置40上，氨基酸殘基為F或L；(aa)在位置45上，氨基酸殘基為Y或F；(ab)在位置47上，氨基酸殘基為R或G；(ac)在位置48上，氨基酸殘基為G；(ad)在位置49上，氨基酸殘基為K、R或Q；(ae)在位置51上，氨基酸殘基為I或V；(af)在位置52上，氨基酸殘基為S；(ag)在位置53上，氨基酸殘基為I或V；(ah)在位置54上，氨基酸殘基為A；(ai)在位置57上，氨基酸殘基為H或N；(aj)在位置58上，氨基酸殘基為Q、K、R或P；(ak)在位置59上，氨基酸殘基為A；(al)在位置60上，氨基酸殘基為E；(am)在位置61上，氨基酸殘基為H或R；(an)在位置63上，氨基酸殘基為E或D；(ao)在位置65上，氨基酸殘基為E、P或Q；(ap)在位置67上，氨基酸殘基為Q或R；(aq)在位置68上，氨基酸殘基為K或E；(ar)在位置69上，氨基酸殘基為Q；(as)在位置79上，氨基酸殘基為E；(at)在位置80上，氨基酸殘基為G；(au)在位置81上，氨基酸殘基為Y、H或F；(av)在位置82上，氨基酸殘基為R；(aw)在位置83上，氨基酸殘基為E或D；(ax)在位置84上，氨基酸殘基為Q；(ay)在位置86上，氨基酸殘基為A；(az)在位置89上，氨基酸殘基為G、T或S；(ba)在位置90上，氨基酸殘基為L；(bb)在位置91上，氨基酸殘基為L、I或V；(bc)在位置92上，氨基酸殘基為R或K；(bd)在位置93上，氨基酸殘基為H；(be)在位置96上，氨基酸殘基為E或Q；(bf)在位置97上，氨基酸殘基為I；(bg)在位置100上，氨基酸殘基為K或N；(bh)在位置101上，氨基酸殘基為K或R；(bi)在位置103上，氨基酸殘基為A或V；(bj)在位置104上，氨基酸殘基為D；(bk)在位置105上，氨基酸殘基為M、L或I；(bl)在位置106上，氨基酸殘基為L；(bm)在位置112上，氨基酸殘基為T或A；(bn)在位置113上，氨基酸殘基為S或T；(bo)在位置114上，氨基酸殘基為A；(bp)在位置115上，氨基酸殘基為S；(bq)在位置119上，氨基酸殘基為K或R；(br)在位置120上，氨基酸殘基為K或R；(bs)在位置123上，氨基酸殘基為F或L；(bt)在位置125上，氨基酸殘基為E；(bu)在位置126上，氨基酸殘基為Q或H；；(bv)在位置128上，氨基酸殘基為E或D；(bw)在位置129上，氨基酸殘基為V或I；(bx)在位置130上，氨基酸殘基為F；(by)在位置131上，氨基酸殘基為D或E；(bz)在位置132上，氨基酸殘基為T；(ca)在位置135上，氨基酸殘基為V；(cb)在位置138上，氨基酸殘基為H；(cc)在位置139上，氨基酸殘基為I；(cd)在位置140上，氨基酸殘基為L或M；(ce)在位置142上，氨基酸殘基為Y；(cf)在位置143上，氨基酸殘基為K或R；(cg)在位置145上，氨基酸殘基為L或I；和(ch)在位置146上，氨基酸殘基為T。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當將該氨基酸序列與SEQIDNO：300、445或457最佳比對時，氨基酸序列中的至少90％的氨基酸殘基遵從在上面的(a)-(ch)中指出的氨基酸殘基限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當采用B1OSUM62矩陣方法，存在一個缺口罰11分，延伸一個缺口罰1分，將該氨基酸序列與選自由SEQIDNO：300、445或457組成的組的氨基酸序列最佳比對時，產(chǎn)生至少為460的相似性分值，如下位置的一個或多個遵從如下限制：(i)在位置18和38上，存在一個Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，存在一個Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上上，存在一個Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，存在一個Z2氨基酸殘基；其中：Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基，并且另外地，氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少80％地遵從如下限制：(a)在位置9、76、94和110上，氨基酸殘基為A；(b)在位置29和108上，氨基酸殘基為C；(c)在位置34上，氨基酸殘基為D；(d)在位置95上，氨基酸殘基為E；(e)在位置56上，氨基酸殘基為F；(f)在位置43、44、66、74、87、102、116、122、127和136上，氨基酸殘基為G；(g)在位置41上，氨基酸殘基為H；(h)在位置7上，氨基酸殘基為I；(i)在位置85上，氨基酸殘基為K；(j)在位置20、42、50、78和121上，氨基酸殘基為L；(k)在位置1和141上，氨基酸殘基為M；(l)在位置23和109上，氨基酸殘基為N；(m)在位置22、25、133、134和137上，氨基酸殘基為P；(n)在位置71上，氨基酸殘基為Q；(o)在位置16、21、73、99和111上，氨基酸殘基為R；(p)在位置55上，氨基酸殘基為S；(q)在位置77上，氨基酸殘基為T；(r)在位置107上，氨基酸殘基為W；和(s)在位置13、46、70和118上，氨基酸殘基為Y。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，其遵從至少如下額外限制之一：(a)在位置36上，氨基酸殘基為M、L或T；(b)在位置72上，氨基酸殘基為L或I；(c)在位置75上，氨基酸殘基為M或V；(d)在位置64上，氨基酸殘基為L，I或F；(e)在位置88上，氨基酸殘基為T或S；(f)在位置117上，氨基酸殘基為Y或F。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，其遵從至少如下額外限制之一：(a)在位置14上，氨基酸殘基為D；(b)在位置18上，氨基酸殘基為E；(c)在位置26上，氨基酸殘基為M或V；(e)在位置30上，氨基酸殘基為I；(f)在位置32上，氨基酸殘基為D；(g)在位置36上，氨基酸殘基為M或T；(i)在位置37上，氨基酸殘基為C；(j)在位置38上，氨基酸殘基為D；(j)在位置53上，氨基酸殘基為V；(k)在位置58上，氨基酸殘基為R；(l)在位置61上，氨基酸殘基為R；(m)在位置62上，氨基酸殘基為L；(n)在位置64上，氨基酸殘基為I或F；(o)在位置65上，氨基酸殘基為P；(p)在位置72上，氨基酸殘基為I；(q)在位置75上，氨基酸殘基為V；(r)在位置88上，氨基酸殘基為T；(s)在位置89上，氨基酸殘基為G；(t)在位置91上，氨基酸殘基為L；(u)在位置98上，氨基酸殘基為I；(v)在位置105上，氨基酸殘基為I；(w)在位置112上，氨基酸殘基為A；(x)在位置124上，氨基酸殘基為G或C；(y)在位置128上，氨基酸殘基為D；(z)在位置140上，氨基酸殘基為M；(aa)在位置143上，氨基酸殘基為R；和(ab)在位置144上，氨基酸殘基為W。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，其中氨基酸序列中對應(yīng)于在上述(a)-(ab)中指定的位置的氨基酸殘基至少80％地遵從在(a)-(ab)中指定的氨基酸殘基的限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，其遵從至少如下的額外限制之一：(a)在位置41上，氨基酸殘基為H；(b)在位置138上，氨基酸殘基為H；(c)在位置34上，氨基酸殘基為N；和(d)在位置55上，氨基酸殘基為S。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸選自由如下組成的組：(a)編碼與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(b)編碼與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)編碼與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(d)編碼與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(e)編碼與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(f)編碼與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(g)編碼與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(h)編碼與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(i)編碼與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(j)編碼與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(k)編碼與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(l)編碼與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(m)編碼與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；和(n)編碼與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸選自由如下組成的組：(a)編碼與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(b)編碼與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)編碼與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(d)編碼與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(e)編碼與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(f)編碼與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(g)編碼與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(h)編碼與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(i)編碼與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(j)編碼與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(k)編碼與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(l)編碼與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(m)編碼與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；和(n)編碼與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列，其中如下位置遵從如下限制：(i)在位置18和38上，存在一個Z5氨基酸殘基；(ii)在位置62上，存在一個Z1氨基酸殘基；(iii)在位置124上，存在一個Z6氨基酸殘基；和(iv)在位置144上，存在一個Z2氨基酸殘基，其中：其中Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸選自由如下組成的組：(a)編碼與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(b)編碼與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)編碼與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(d)編碼與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(e)編碼與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(f)編碼與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(g)編碼與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(h)編碼與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(i)編碼與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(j)編碼與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(k)編碼與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(l)編碼與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(m)編碼與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；和(n)編碼與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列，另外氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少90％遵從如下限制：(a)在位置2、4、15、19、26、28、31、45、51、54、86、90、91、97、103、105、106、114、123、129、139和/或145上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置3、5、8、10、11、14、17、24、27、32、37、47、48、49、52、57、58、61、63、68、69、79、80、82、83、89、92、100、101、104、119、120、125、126、128、131和/或143上，氨基酸殘基為B2；其中B1是選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；和B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸選自由如下組成的組：(a)編碼與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(b)編碼與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)編碼與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(d)編碼與SEQIDNO：579至少989％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(e)編碼與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(f)編碼與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(g)編碼與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(h)編碼與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(i)編碼與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(j)編碼與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(k)編碼與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(l)編碼與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(m)編碼與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；和(n)編碼與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列，另外氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少80％地遵從如下限制：(a)在位置2、4、15、19、26、28、31、45、51、54、86、90、91、97、103、105、106、114、123、129、139和/或145上，氨基酸殘基為Z1；和(b)在位置31和/或45上，氨基酸殘基為Z2；(c)在位置8上，氨基酸殘基為Z3；(d)在位置89上，氨基酸殘基為Z3或者Z6；(e)在位置82、92、101和/或120上，氨基酸殘基為Z4；(f)在位置3、11、27和/或79上，氨基酸殘基為Z5；(g)在位置18上，氨基酸殘基為Z4或Z5；(h)在位置123上，氨基酸殘基為Z1或Z2；(i)在位置12、33、35、39、53、59、112、132、135、140和/或146上，氨基酸殘基為Z1或Z3；(j)在位置30上，氨基酸殘基為Z1；(k)在位置6上，氨基酸殘基為Z6；(l)在位置81上，氨基酸殘基為Z2或Z4；(m)在位置113上，氨基酸殘基為Z3；(n)在位置138上，氨基酸殘基為Z4；(o)在位置142上，氨基酸殘基為Z2；(p)在位置57和/或126上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(q)在位置5，17和61上，氨基酸殘基為Z4；(r)在位置24上，氨基酸殘基為Z3；(s)在位置104上，氨基酸殘基為Z5；(t)在位置52和/或69上，氨基酸殘基為Z3；(u)在位置14和/或119上，氨基酸殘基為Z5；(v)在位置10、32、63和/或83上，氨基酸殘基為Z5；(w)在位置48和/或80上，氨基酸殘基為Z6；(x)在位置40上，氨基酸殘基為Z1或Z2；(y)在位置96上，氨基酸殘基為Z3或Z5；(z)在位置65上，氨基酸殘基為Z3、Z4或Z6；(aa)在位置84和/或115上，氨基酸殘基為Z3；(ab)在位置93上，氨基酸殘基為Z4；(ac)在位置130上，氨基酸殘基為Z2；(ad)在位置58上，氨基酸殘基為Z3、Z4或者Z6；(ae)在位置47上，氨基酸殘基為Z4或Z6；(af)在位置49和/或100上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(ag)在位置68上，氨基酸殘基為Z4或Z5；(ah)在位置143上，氨基酸殘基為Z4；(ai)在位置131上，氨基酸殘基為Z5；(aj)在位置125和/或128上，氨基酸殘基為Z5；(ak)在位置67上，氨基酸殘基為Z3或Z4；(al)在位置60上，氨基酸殘基為Z5；和(am)在位置37上，氨基酸殘基為Z4或Z6；其中Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z3是選自由N、Q、S和T組成的組的氨基酸；Z4是選自由R、H和K組成的組的氨基酸；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，另外其中氨基酸序列中對應(yīng)于在(a)-(am)中指定的位置的氨基酸殘基至少90％地遵從在(a)-(am)中指定的氨基酸殘基的限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，其中氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少90％地遵從如下的額外限制：(a)在位置1、7、9、13、20、36、42、46、50、56、64、70、72、75、76、78、94、98、107、110、117、118、121和/或141上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置16、21、22、23、25、29、34、41、43、44、55、66、71、73、74、77、85、87、88、95、99、102、108、109、111、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為B2；其中B1是選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；和B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當該氨基酸序列與SEQIDNO：300、445或457最佳地比對時，氨基酸序列中的至少90％的氨基酸殘基遵從如下限制：(a)在位置1、7、9、13、20、42、46、50、56、64、70、72、75、76、78、94、98、107、110、117、118、121和/或141上，氨基酸殘基為B1；和(b)在位置16、21、22、23、25、29、34、36、41、43、44、55、66、71、73、74、77、85、87、88、95、99、102、108、109、111、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為B2；其中B1是選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；和B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當該氨基酸序列與SEQIDNO：300、445或457最佳地比對時，氨基酸序列中的至少90％的氨基酸殘基遵從如下限制：(a)在位置1、7、9、20、42、50、72、75、76、78、94、98、110、121和/或141上，氨基酸殘基為Z1；(b)在位置13、46、56、70、107、117和/或118上，氨基酸殘基為Z2；(c)在位置23、55、71、77、88和/或109上，氨基酸殘基為Z3；(d)在位置16、21、41、73、85、99和/或111上，氨基酸殘基為Z4；(e)在位置34和/或95上，氨基酸殘基為Z5；(f)在位置22、25、29、43、44、66、74、87、102、108、116、122、127、133、134、136和/或137上，氨基酸殘基為Z6；其中Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z2是選自由F、W和Y組成的組的氨基酸殘基；Z3是選自由N、Q、S和T組成的組的氨基酸；Z4是選自由R、H和K組成的組的氨基酸；Z5是選自由D和E組成的組的氨基酸殘基；和Z6是選自由C、G和P組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列在位置36上包含選自由Z1和Z3組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼氨基酸序列，該氨基酸序列在位置64上包含選自由Z1和Z2組成的組的氨基酸殘基。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當該氨基酸序列與SEQIDNO：300、445或457最佳地比對時，氨基酸序列中至少80％的氨基酸殘基遵從如下限制：(a)在位置2上，氨基酸殘基為I或L；(b)在位置3上，氨基酸殘基為E；(c)在位置4上，氨基酸殘基為V或I；(d)在位置5上，氨基酸殘基為K；(e)在位置6上，氨基酸殘基為P；(f)在位置8上，氨基酸殘基為N；(g)在位置10上，氨基酸殘基為E；(h)在位置11上，氨基酸殘基為D或E；(i)在位置12上，氨基酸殘基為T；(j)在位置14上，氨基酸殘基為E或D；(k)在位置15上，氨基酸殘基為L；(l)在位置17上，氨基酸殘基為H；(m)在位置18上，氨基酸殘基為R、E或K；(n)在位置19上，氨基酸殘基為I或V；(o)在位置24上，氨基酸殘基為Q；(p)在位置26上，氨基酸殘基為M、L、V或I；(q)在位置27上，氨基酸殘基為E；(r)在位置28上，氨基酸殘基為A或V；(s)在位置30上，氨基酸殘基為M；(t)在位置31上，氨基酸殘基為Y或F；(u)在位置32上，氨基酸殘基為E或D；(v)在位置33上，氨基酸殘基為T或S；(w)在位置35上，氨基酸殘基為L；(x)在位置37上，氨基酸殘基為R、G、E或Q；(y)在位置39上，氨基酸殘基為A或S；(z)在位置40上，氨基酸殘基為F或L；(aa)在位置45上，氨基酸殘基為Y或F；(ab)在位置47上，氨基酸殘基為R或G；(ac)在位置48上，氨基酸殘基為G；(ad)在位置49上，氨基酸殘基為K、R或Q；(ae)在位置51上，氨基酸殘基為I或V；(af)在位置52上，氨基酸殘基為S；(ag)在位置53上，氨基酸殘基為I或V；(ah)在位置54上，氨基酸殘基為A；(ai)在位置57上，氨基酸殘基為H或N；(aj)在位置58上，氨基酸殘基為Q、K、R或P；(ak)在位置59上，氨基酸殘基為A；(al)在位置60上，氨基酸殘基為E；(am)在位置61上，氨基酸殘基為H或R；(an)在位置63上，氨基酸殘基為E或D；(ao)在位置65上，氨基酸殘基為E、P或Q；(ap)在位置67上，氨基酸殘基為Q或R；(aq)在位置68上，氨基酸殘基為K或E；(ar)在位置69上，氨基酸殘基為Q；(as)在位置79上，氨基酸殘基為E；(at)在位置80上，氨基酸殘基為G；(au)在位置81上，氨基酸殘基為Y、H或F；(av)在位置82上，氨基酸殘基為R；(aw)在位置83上，氨基酸殘基為E或D；(ax)在位置84上，氨基酸殘基為Q；(ay)在位置86上，氨基酸殘基為A；(az)在位置89上，氨基酸殘基為G、T或S；(ba)在位置90上，氨基酸殘基為L；(bb)在位置91上，氨基酸殘基為L、I或V；(bc)在位置92上，氨基酸殘基為R或K；(bd)在位置93上，氨基酸殘基為H；(be)在位置96上，氨基酸殘基為E或Q；(bf)在位置97上，氨基酸殘基為I；(bg)在位置100上，氨基酸殘基為K或N；(bh)在位置101上，氨基酸殘基為K或R；(bi)在位置103上，氨基酸殘基為A或V；(bj)在位置104上，氨基酸殘基為D；(bk)在位置105上，氨基酸殘基為M、L或I；(Bl)在位置106上，氨基酸殘基為L；(bm)在位置112上，氨基酸殘基為T或A；(bn)在位置113上，氨基酸殘基為S或T；(bo)在位置114上，氨基酸殘基為A；(bp)在位置115上，氨基酸殘基為S；(bq)在位置119上，氨基酸殘基為K或R；(br)在位置120上，氨基酸殘基為K或R；(bs)在位置123上，氨基酸殘基為F或L；(bt)在位置125上，氨基酸殘基為E；(bu)在位置126上，氨基酸殘基為Q或H；；(bv)在位置128上，氨基酸殘基為E或D；(bw)在位置129上，氨基酸殘基為V或I；(bx)在位置130上，氨基酸殘基為F；(by)在位置131上，氨基酸殘基為D或E；(bx)在位置132上，氨基酸殘基為T；(ca)在位置135上，氨基酸殘基為V；(cb)在位置138上，氨基酸殘基為H；(cc)在位置139上，氨基酸殘基為I；(cd)在位置140上，氨基酸殘基為L或M；(ce)在位置142上，氨基酸殘基為Y；(cf)在位置143上，氨基酸殘基為K或R；(cg)在位置145上，氨基酸殘基為L或I；和(ch)在位置146上，氨基酸殘基為T。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當將該氨基酸序列與SEQIDNO：300、445或457最佳比對時，氨基酸序列中的至少90％氨基酸殘基遵從在上面的(a)-(ch)中指出的氨基酸殘基限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸選自由如下組成的組：(a)編碼與SEQIDNO：577至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(b)編碼與SEQIDNO：578至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)編碼與SEQIDNO：621至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(d)編碼與SEQIDNO：579至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(e)編碼與SEQIDNO：602至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(f)編碼與SEQIDNO：697至少95％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(g)編碼與SEQIDNO：712至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(h)編碼與SEQIDNO：613至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(i)編碼與SEQIDNO：677至少89％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(j)編碼與SEQIDNO：584至少95％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(k)編碼與SEQIDNO：707至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(l)編碼與SEQIDNO：616至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；(m)編碼與SEQIDNO：612至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列；和(n)編碼與SEQIDNO：590至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列，氨基酸序列中對應(yīng)于如下位置的氨基酸殘基至少80％的遵從如下限制：(a)在位置9、76、94和110上，氨基酸殘基為A；(b)在位置29和108上，氨基酸殘基為C；(c)在位置34上，氨基酸殘基為D；(d)在位置95上，氨基酸殘基為E；(e)在位置56上，氨基酸殘基為F；(f)在位置43、44、66、74、87、102、116、122、127和136上，氨基酸殘基為G；(g)在位置41上，氨基酸殘基為H；(h)在位置7上，氨基酸殘基為I；(i)在位置85上，氨基酸殘基為K；(j)在位置20、42、50、78和121上，氨基酸殘基為L；(k)在位置1和141上，氨基酸殘基為M；(l)在位置23和109上，氨基酸殘基為N；(m)在位置22、25、133、134和137上，氨基酸殘基為P；(n)在位置71上，氨基酸殘基為Q；(o)在位置16、21、73、99和111上，氨基酸殘基為R；(p)在位置55上，氨基酸殘基為S；(q)在位置77上，氨基酸殘基為T；(r)在位置107上，氨基酸殘基為W；和(s)在位置13、46、70和118上，氨基酸殘基為Y。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列還包含至少一個滿足如下標準的氨基酸殘基：(a)在位置14上，氨基酸殘基為D；(b)在位置18上，氨基酸殘基為E；(c)在位置26上，氨基酸殘基為M或V；(e)在位置30上，氨基酸殘基為I；(f)在位置32上，氨基酸殘基為D；(g)在位置36上，氨基酸殘基為M或T；(i)在位置37上，氨基酸殘基為C；(j)在位置38上，氨基酸殘基為D；(j)在位置53上，氨基酸殘基為V；(k)在位置58上，氨基酸殘基為R；(l)在位置61上，氨基酸殘基為R；(m)在位置62上，氨基酸殘基為L；(n)在位置64上，氨基酸殘基為I或F；(o)在位置65上，氨基酸殘基為P；(p)在位置72上，氨基酸殘基為I；(q)在位置75上，氨基酸殘基為V；(r)在位置88上，氨基酸殘基為T；(s)在位置89上，氨基酸殘基為G；(t)在位置91上，氨基酸殘基為L；(u)在位置98上，氨基酸殘基為I；(v)在位置105上，氨基酸殘基為I；(w)在位置112上，氨基酸殘基為A；(x)在位置124上，氨基酸殘基為G或C；(y)在位置128上，氨基酸殘基為D；(z)在位置140上，氨基酸殘基為M；(aa)在位置143上，氨基酸殘基為R；和(ab)在位置144上，氨基酸殘基為W。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，使得當將該氨基酸序列與SEQIDNO：300、445或457最佳比對時，氨基酸序列中的至少80％氨基酸殘基遵從在上面的(a)-(ab)中指出的氨基酸殘基限制。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸，其包含編碼選自由如下組成的組的氨基酸序列的核苷酸序列：(a)與SEQIDNO：919至少96％相同的氨基酸序列(例如SEQIDNO：917、919、921、923、925、927、833、835、839、843、845、859、863、873、877、891、895、901、905、907、913、915或950)；(b)與SEQIDNO：929至少97％相同的氨基酸序列(例如，編碼SEQIDNO：929、931、835、843、849或867的核苷酸序列)；(c)與SEQIDNO；847至少98％相同的氨基酸序列(例如編碼SEQIDNO：845或847的核苷酸序列)；(d)與SEQIDNO：851至少98％的氨基酸序列；(e)與SEQIDNO：853至少98％相同的氨基酸序列；(f)與SEQIDNO：855至少98％相同的氨基酸序列(例如編碼SEQIDNO：835或855的核苷酸序列)；(g)與SEQIDNO：857至少98％相同的氨基酸序列；(h)與SEQIDNO：861至少98％相同的氨基酸序列(例如編碼SEQIDNO：839、861或883的核苷酸序列)；(i)與SEQIDNO：871至少98％相同的氨基酸序列；(j)與SEQIDNO：875至少98％相同的氨基酸序列；(k)與SEQIDNO：881至少98％相同的氨基酸序列；(l)與SEQIDNO：885至少98％相同的氨基酸序列(例如編碼SEQIDNO：845或885的核苷酸序列)；(m)與SEQIDNO：887至少98％相同的氨基酸序列；(n)與SEQIDNO：889至少98％相同的氨基酸序列(例如，編碼SEQIDNO：863、889、891或903的核苷酸序列)；(o)與SEQIDNO：893至少98％相同的氨基酸序列；(p)與SEQIDNO：897至少98％相同的氨基酸序列；(q)與SEQIDNO：899至少98％相同的氨基酸序列；(r)與SEQIDNO：909至少98％相同的氨基酸序列(例如，編碼SEQIDNO：883或909的核苷酸序列)；(s)與SEQIDNO：911至少98％相同的氨基酸序列；(t)與SEQIDNO：837至少99％相同的氨基酸序列；(u)與SEQIDNO：841至少99％相同的氨基酸序列；(v)與SEQIDNO：865至少99％相同的氨基酸序列；(w)與SEQIDNO：869至少99％相同的氨基酸序列；和(x)與SEQIDNO：879至少99％相同的氨基酸序列。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸選自由如下組成的組：(a)編碼與SEQIDNO：919至少96％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：916、918、920、922、924、926、832、834、838、842、844、858、862、872、876、890、894、900、904、906、912、914、939、940、941、942、943、944、949、951或952)；(b)編碼與SEQIDNO：929至少97％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：928、930、834、842、848、866、936或937)；(c)編碼與SEQIDNO：847至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：844或846)；(d)編碼與SEQIDNO：851至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：850)；(e)編碼與SEQIDNO：853至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：852)；(f)編碼與SEQIDNO：855至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：834或854)；(g)編碼與SEQIDNO：857至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：856)；(h)編碼與SEQIDNO：861至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：838、860或882)；(i)編碼與SEQIDNO：871至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：870)；(j)編碼與SEQIDNO：875至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：874)；(k)編碼與SEQIDNO：881至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：880)；(l)編碼與SEQIDNO：885至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：844或884)；(m)編碼與SEQIDNO：887至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：886)；(n)編碼與SEQIDNO：889至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：862，888，890或902)；(o)編碼與SEQIDNO：893至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，SEQIDNO：892)；(p)編碼與SEQIDNO：897至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：896)；(q)編碼與SEQIDNO：899至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：898)；(r)編碼與SEQIDNO：909至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：882或908)；(s)編碼與SEQIDNO：911至少98％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：910)；(t)編碼與SEQIDNO：837至少99％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：836)；(u)編碼與SEQIDNO：841至少99％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：840)；(v)編碼與SEQIDNO：865至少99％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：864)；(w)編碼與SEQIDNO：869至少99％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：868)；和(x)編碼與SEQIDNO：879至少99％相同的氨基酸序列的核苷酸序列(例如一種核苷酸序列，如SEQIDNO：878)。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸包含編碼氨基酸序列的核苷酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO：929相比至少95％相同，并且在對應(yīng)于SEQIDNO：929的位置33的氨基酸位置上包含Gly或Asn殘基(例如，編碼SEQIDNO：837、849、893、897、905、921、927、929或931的核苷酸序列)。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸包含編碼氨基酸序列的核苷酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO：929相比至少95％相同，并且在對應(yīng)于SEQIDNO：929的位置33的氨基酸位置上包含Gly或Asn殘基(例如核苷酸序列如SEQIDNO：836、848、892、896、904、920、926、928、930、938)。一些優(yōu)選的本發(fā)明的分離的或重組的多核苷酸編碼一種氨基酸序列，該氨基酸序列還包括一個或多個滿足如下標準的氨基酸殘基：(a)在位置41上，氨基酸殘基為H；(b)在位置138上，氨基酸殘基為H；(c)在位置34上，氨基酸殘基為N；和(d)在位置55上，氨基酸殘基為S。雖然對本發(fā)明的多肽的描述在此有時被表示為一列在特定位置上存在何種氨基酸殘基的可能限制，在有些實施方案中，本發(fā)明的多肽滿足一組特定的可能限制的全部條件。也就是說，在本文的有些情形下，一列可能限制表示為一列通過連接詞“和/或”連接的選項，在有些實施方案中，各個這種連接作為“和”而不是“或”。在有些實施方案中，表示為可替代的可能性的可能限制都存在于本發(fā)明的多肽中；這僅當可替代的可能性不相互排斥時，才是正確的。序列變體本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到，由于遺傳密碼的簡并性，多種編碼本發(fā)明的GAT多肽的核苷酸序列都可以被生產(chǎn)，其中一些和本文明確公開的核苷酸序列具有實質(zhì)上的同一性。表1密碼子表氨基酸密碼子丙氨酸AlaAGCAGCCGCGGCU半胱氨酸CysCUGCUGU天冬氨酸AspDGACGAU谷氨酸GluEGAAGAG苯丙氨酸PheFUUCUUU甘氨酸GlyGGGAGGCGGGGGU組氨酸HisHCACCAU異亮氨酸IleIAUAAUCAUU賴氨酸LysKAAAAAG亮氨酸LeuLUUAUUGCUACUCCUGCUU甲硫氨酸MetMAUG天冬酰胺AsnNAACAAU脯氨酸ProPCCACCCCCGCCU谷氨酰胺GlnQCAACAG精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU絲氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU蘇氨酸ThrTACAACCACGACU纈氨酸ValVGUAGUCGUGGUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUACUAU例如，觀察密碼子表(表1)可以看出，密碼子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU都編碼氨基酸精氨酸。因此，在本發(fā)明的核酸中在由密碼子具體限定的精氨酸的每個位置上，此密碼子可以被改變成上述任何一個相應(yīng)的密碼子，而不改變所編碼的多肽。應(yīng)當理解，RNA序列中的U對應(yīng)于DNA序列中的T。作為一個例子使用，對應(yīng)于SEQIDNO：1的核苷酸1-15的核酸序列(ATGATTGAAGTCAAA(SEQIDNO：826))，該序列的沉默變異包括AGTATCGAGGTGAAG(SEQIDNO：827)；這兩條序列編碼氨基酸序列MIEVK(SEQIDNO：828)，其對應(yīng)于SEQIDNO：6的氨基酸1-5。這種“沉默變異”是“保守性修飾變異”的一種，將在下文中討論。技術(shù)人員將認識到，核酸中的每個密碼子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子)可以用標準方法來修飾，以編碼功能相同的多肽。因此，編碼一種多肽的核酸的各個沉默變異隱含在任何所述序列中。本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的每一種可能變異，其可以通過選擇基于可能的密碼子的組合來制造。這些組合是按照應(yīng)用于編碼本發(fā)明的GAT同源物多肽的核酸序列中的標準三聯(lián)遺傳密碼(例如在表1中所列舉的)來進行。通過考慮序列以及遺傳密碼，特別地提供和描述了本文的每種核酸的所有這種變體?？梢匀缭诖怂赋龅姆绞街苽淙魏巫凅w。一組兩種或多種不同密碼子在同樣的環(huán)境中翻澤時，它們都編碼相同的氨基酸，在此被稱作為“同義密碼子”。如在此所描述，在本發(fā)明的一些方面中，將GAT多核苷酸工程化來在期望的宿主生物體中，例如在植物宿主應(yīng)用優(yōu)化的密碼子。術(shù)語“優(yōu)化的”或“最佳的”不限于最好的密碼子的可能組合，而僅指作為整體該編碼序列相對于衍生此編碼序列的前體多核苷酸。因此，在一個方面中，本發(fā)明提供通過用同義密碼子替換核苷酸序列中的至少一個親本密碼子來生產(chǎn)GAT多肽變體，相對于親代密碼子，該同義密碼子是所需宿主生物如植物優(yōu)選使用的。特定核酸序列的“保守性修飾的變異”或者簡單地說“保守性變異”是指那些編碼相同的或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者，當該核酸不編碼氨基酸序列時是指基本上相同的序列。熟練的技術(shù)人員將認識到，編碼序列中改變、添加或缺失單個氨基酸或小比例氨基酸(通常少于5％、更加典型少于4％、2％或者1％或者更少)的個別取代、缺失或者添加是“保守性修飾的變異”，其中該改變導致氨基酸缺失、氨基酸添加或用化學上類似的氨基酸取代氨基酸。提供功能性相似的氨基酸的保守性替代列表在本領(lǐng)域是公知的。表2列出了6組相互為“保守性替代”的氨基酸。表2保守性替代組1丙氨酸(A)絲氨酸(S)蘇氨酸(T)2天冬氨酸(D)谷氨酸(E)3天冬酰胺(N)谷氨酰胺(Q)4精氨酸(R)賴氨酸(K)5異亮氨酸(I)亮氨酸(L)甲硫氨酸(M)纈氨酸(V)6苯丙氨酸(F)酪氨酸(Y)色氨酸(W)因此，所列舉的本發(fā)明的多肽序列的“保守性替代的變異”包括用相同保守性替代組的保守性選擇的氨基酸替代多肽序列中的氨基酸的小部分，典型地少于代5％、更加典型地少于2％和通常少于1％。因此本發(fā)明的多肽的保守性替代變異含有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個用相同的保守性替代組的保守性替代變異進行的替代。例如，在此確定的多肽如SEQIDNO：6的保守性替代變異將含有上述六個組的“保守性替代”，替代發(fā)生在146個氨基酸的多肽的最多達7個殘基(即，5％的氨基酸)上。在另一個實施例中，如果四個保守性替代位于對應(yīng)于SEQIDNO：6的氨基酸21-30的區(qū)域，根據(jù)列舉在表2中的保守性替代，則該區(qū)域的保守性替代變體的例子，RPNQPLEACM(SEQIDNO：829)，包括：KPQQPVESCM(SEQIDNO：830)和KPNNPLDACV(SEQIDNO：831)等(在上述實施例，保守性替代用下劃線表示)。在此的蛋白質(zhì)序列的列表加上面的替代表格，提供所有保守性替代蛋白質(zhì)的明確列表。最后，加入不改變核酸分子的編碼活性的序列，例如加入非功能性的或者非編碼序列，是基礎(chǔ)核酸的保守性變異。技術(shù)人員將認識到，所公開的核酸構(gòu)建體的許多保守性變異獲得了功能相同的構(gòu)建體。例如，如上所討論，由于遺傳密碼子的簡并性，“沉默替代”(即不會在所編碼的多肽中產(chǎn)生改變的核酸序列中的替代)是每個編碼氨基酸的核酸序列的隱含特征。類似地，氨基酸序列中的一個或幾個氨基酸的“保守性氨基酸替代”被不同的具有高度相似特性的氨基酸替代，也很容易被鑒定為與所公開的構(gòu)建體高度相似。各個所公開序列的這種保守性變體是本發(fā)明的一個特征。特定核酸的非保守性修飾是那些取代任何不被表征為保守性替代的氨基酸的修飾。例如，任何跨越在表2中列舉的六個組的邊界的替代。這些包括用堿性或酸性氨基酸替代中性氨基酸(例如，用Asp、Glu、Asn或Gln替代Val、Ile、Leu或Met)，用芳香氨基酸替代堿性或酸性氨基酸(例如，用Phe、Tyr或Trp取代Asp、Asn、Glu或Gln)或者任何其他不用類似的氨基酸替代一種氨基酸的替代核酸雜交當核酸結(jié)合時，發(fā)生“雜交”，通常在溶液中發(fā)生。核酸雜交是由于各種已知的物理化學力，例如氫鍵、溶劑排斥、堿基堆積等。大量對核酸雜交的教導可見于Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochenaistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分，第2章，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays”，(Elsevier，紐約(“Tijssen”))，以及Ausubel，同上文，Hames和Higgins(1995)GeneProbes1，牛津大學出版社的IRL出版社，牛津，英格蘭(“Haines和Higgins1”)以及Hames和Higgins(1995)GeneProbes2，牛津大學出版社的IRL出版社，牛津，英格蘭(“Haines和Higgins2”)提供關(guān)于合成、標記、缺失和量化DNA和RNA，包括寡核酸的詳細內(nèi)容。核酸雜交試驗中的“嚴緊性雜交洗滌條件”，例如Southern和northern雜交，是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。大量對核酸雜交的教導可見于Tijssen(1993)，同上文，以及可見于Hames和Higgins1以及Hames和Higgins2，同上文。通常，處于本發(fā)明的目的，“高嚴緊性”雜交和洗滌條件被選擇為，在特定離子強度和pH下，比特定序列的熱溶化溫度(Tm)低約5℃或更低(如下文指出，高度嚴緊條件也可以參考相當?shù)男g(shù)語)。Tm是50％的測試序列雜交到優(yōu)選匹配的探針上的溫度(在特定離子強度和pH下)。對于特定探針，選擇與Tm相同的極其嚴緊條件。核酸雙鏈體的Tm表示在所給條件下雙鏈體發(fā)生50％變性的溫度，其表示核酸雜交的穩(wěn)定性的直接測量值。因此，Tm對應(yīng)于從螺旋到隨機卷曲的轉(zhuǎn)換的中點的溫度，其取決于長鏈核苷酸的長度、核苷酸的組成和離子強度。雜交后，通過一系列洗滌去除未被雜交的核酸物質(zhì)，根據(jù)期望結(jié)果調(diào)整雜交嚴緊性。低嚴緊性洗滌條件(例如，采用較高濃度的鹽和較低的溫度)提高靈敏性，但是可能產(chǎn)生非特異性的雜交信號和高背景信號。高嚴緊條件(例如，采用較低的鹽濃度和更為接近雜交溫度的較高溫度)降低背景信號，典型地只保留特異的信號。參見Rapley，R.和Walker，J.M.編輯，MolecularBiomethoodsHandbook(Humana出版社公司1998)(下文稱作“Rapley和Walker”)，出于所有目的，在此完全引入作為參考。用如下的方程1估計DNA-DNA雙鏈體的Tm：Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.72(％f)-500/n，其中M是單價陽離子(通常為Na+)的摩爾濃度，(％G+C)是鳥噪呤(G)和胞嘧啶(C)核苷的百分比，(％f)是縮甲醛化的百分比，而n是雜合體的核苷酸堿基的數(shù)量(即長度)。參見Rapley和Walker，同上文。用如下的方程2估計DNA-DNA雙鏈體的Tm：Tm(℃)＝79.8℃+18.5(log10M)+0.58(％G+C)-11.8(％G+C)2-0.56(％f)-820/n，其中M是單價陽離子(通常為Na+)的摩爾濃度，(％G+C)是鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)核苷的百分比，(％f)是縮甲醛化的百分比，而n是雜合體的核苷酸堿基的數(shù)量(即長度)。同樣。公式1和公式2通常只對長度約100-200個核苷以上的雜交雙鏈體是精確的。同樣。短于50個核苷酸的核酸序列的Tm可按下式計算：Tm(℃)＝4(G+C)+2(A+T)，其中A(腺苷)、C、T(胸苷)和G是對應(yīng)的核苷酸的數(shù)目?；パa殘基超過100個的互補核酸在Southern或northern印跡的濾膜上雜交的嚴緊雜交條件的一個例子是42℃下，在含有1mg肝素的50％福爾馬林中雜交過夜。嚴緊的洗滌條件的一個例子是在65℃下，用0.2×SSC洗滌15分鐘(參見Sambrook，同上文，對SSC緩沖液的描述)。通常在高嚴緊洗滌之前進行低嚴緊洗滌，以除去背景探針信號。一種示例性的低嚴緊洗滌是在40℃下，用0.2×SSC洗滌15分鐘。通常，在特定雜交試驗中，信噪比超過用不相關(guān)探針所觀察到的2.5倍-5倍(或更高)，表明檢測到了特定的雜交。在本發(fā)明中，檢測到兩條序列之間至少發(fā)生嚴緊雜交，指示與如以在此所列舉的序列表提供的本發(fā)明的核酸具有相對較高的結(jié)構(gòu)相似性或同源性。這里提到的“高嚴緊”條件被選定為，在確定的離子強度和pH下，比該特定序列的熱融化溫度(Tm)低5℃或更低。在高嚴緊條件下，可以確定與感興趣的核苷酸序列(如“探針”)密切相關(guān)或相同的靶序列。低嚴緊條件適合于互補性較差的序列。參見，例如Rapley和Walker，同上文。比較性雜交可用于鑒定本發(fā)明的核酸，這種比較性雜交法是區(qū)分本發(fā)明核酸的優(yōu)選方法。對本發(fā)明中的兩條核苷酸序列之間的高嚴緊雜交進行檢測，指示與如以在此所列舉的序列表提供的本發(fā)明的核酸具有相對較高的結(jié)構(gòu)相似性或同源性。兩條核苷酸序列之間發(fā)生高嚴緊雜交，證明了結(jié)構(gòu)、核苷酸堿基組成、排布或順序的相似或相同程度，其好于用嚴緊雜交條件所測得的結(jié)果。特別地，在本發(fā)明中，對高嚴緊雜交進行檢測，指示與如以在此所列舉的序列表提供的本發(fā)明的核酸具有相對較高的結(jié)構(gòu)相似性或結(jié)構(gòu)同源性(例如，核酸結(jié)構(gòu)、堿基組成、排布或順序)。例如，期望在嚴緊條件下，確定雜交到示例性核酸上的測試核酸。因此，嚴緊雜交的一種衡量是，在高嚴緊條件下(或非常嚴緊的條件，或超高嚴緊雜交條件，或超超高嚴緊雜交條件下)，與所列核酸(如，核酸序列SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952，及其互補的多核苷酸序列)之一雜交的能力。對于任何測試核酸，可以容易地根據(jù)經(jīng)驗來確定嚴緊雜交(以及高嚴格、超高嚴緊、或超超高嚴緊雜交條件)和洗滌條件。例如，在確定高嚴緊雜交條件和洗滌條件時，逐漸提高雜交條件和洗滌條件(例如，提高雜交或洗滌時的溫度、降低鹽濃度、增加去污劑濃度和/或增加有機溶劑(如福爾馬林)的濃度)，直至符合所選定的一系列標準。例如，逐漸增加雜交條件和洗滌條件，直至含有選自SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952，及其互補多核苷酸序列中的一條或多條核酸序列的探針，與完全匹配的互補目標(也是含有選自SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952，及其互補多核苷酸序列中的一條或多條核酸序列的核酸)結(jié)合，其信噪比高于所觀察到的探針與不匹配目標雜交結(jié)果至少約2.5倍，較好約高5倍或更高。這種情況下，不匹配的目標是與提交本申請時已存在于如GenBankTM公共數(shù)據(jù)庫中的核酸(不是所附序列表中的那些)相對應(yīng)的核酸。熟練的技術(shù)人員可以在GenBank中確定這種序列。例子包括登錄號Z99109和Y09476。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以在如GenBank中確定其它的此類序列。當測試核酸以探針與完美匹配的互補目標雜交的至少1/2與探針雜交時，即信噪比至少為探針與靶核酸在其中完美匹配的探針與完美匹配的互補靶核酸結(jié)合的條件下雜交的信噪比的1/2時，則測試核酸特異地結(jié)合到探針核酸上，后一比所觀察到的與登錄號為Z99109和Y09476的任何非匹配多核苷酸雜交產(chǎn)生的信噪比至少高約2-10倍，偶而高20倍、50倍或更高。超高嚴緊雜交和洗滌條件是這樣的，其中雜交和洗滌條件的嚴緊性被提高，直至探針與完全匹配的互補靶核酸結(jié)合的信噪比比所觀察到的與Genbank登錄號為Z99109和Y09476的非匹配靶核酸的任何一條雜交的信噪比高至少10倍。在這種條件下，靶核酸以至少為完全匹配的互補靶核酸的信噪比的1/2的信噪比與探針雜交，即被認為在超高嚴緊條件下與探針結(jié)合。類似地，通過逐步提高相關(guān)雜交試驗的雜交和/或洗滌條件，可以確定甚至更高的嚴緊度。例如，其中提高雜交和洗滌條件的嚴緊性，直至探針和完美匹配的互補靶核酸結(jié)合的信噪比，至少比所觀察到的與Genbank登錄號為Z99109和Y09476的非匹配靶核酸的任何一種雜交的信噪比高10倍、20倍、50倍、100倍或500倍或更高。在這種條件下，以至少為完美匹配的互補靶核酸的信噪比的1/2與探針雜交的靶核酸，即被認為在超超高嚴緊條件下與探針結(jié)合。在高、超高和超超高嚴緊條件下，與以SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952為代表的核酸雜交的靶核酸，是本發(fā)明的一個特征。這些核酸的例子包括那些與所給定的核酸序列相比，具有一個或幾個沉默或保守性核酸替代的核酸。如果各種核酸所編碼的多肽基本上是相同的，則在嚴緊條件下這些不相互雜交的核酸實質(zhì)上仍是相同的。這種情況發(fā)生在，例如，當用遺傳密碼允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生某核酸的拷貝或產(chǎn)生抵抗SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972中的一種或多種的一種或多種抗血清時，可以用已知核苷酸序列，包括Genbank登錄號CAA70664的那些核苷酸序列所編碼的多肽來減弱血清。下面是對免疫確定本發(fā)明多肽的進一步詳細描述。此外，為了區(qū)分雙鏈體不到100個核苷酸的序列，可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的TMAC1雜交法。例如參見，Sorg，U.等人，NucleicAcidRes.(1991年9月11日)19(17)，出于所有目的，在此將其全文引入作為參考。一方面，本發(fā)明提供一種核酸，該核酸包含核酸中的選自如下的獨特亞序列：SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952。與對應(yīng)于Genbank登錄號Z99109和Y09476的任何一種的核酸相比，這些獨特亞序列是唯一的?？梢詫EQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952的任何一種與Genbank登錄號Z99109、Y09476代表的一整套核酸或本申請?zhí)峤蝗湛梢詮墓矓?shù)據(jù)庫獲得的其它相關(guān)序列進行序列比對，由此確定這些獨特的亞序列。序列比對用設(shè)置了默認參數(shù)的BLAST算法進行。任何獨特的亞序列都是有用的，例如，作為鑒定本發(fā)明核酸的探針。類似地，本發(fā)明包括一種多肽，在該多肽中包含選自如下的獨特亞序列：SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972。在此，與對應(yīng)于Genbank登錄號CAA70664的多肽相比，這些獨特的亞序列是唯一的。同時，將這些多肽與Genbank登錄號CAA70664代表的序列進行比對。應(yīng)當注意的是，如果該序列對應(yīng)于非翻譯序列，如假基因，則只要將核酸序列在計算機芯片中(insilico)翻譯成氨基酸序列就可以產(chǎn)生相應(yīng)的多肽，其中選擇閱讀框，以與同源GAT多核苷酸的閱讀框相對應(yīng)。本發(fā)明還提供在嚴緊條件下雜交到獨特的編碼寡核苷酸上的靶核酸，該寡核苷酸編碼多肽中選自如下的獨特亞序列：SEQIDNO：568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、621、623、625、627、629、631、633、635、637、639、641、643、645、647、649、651、653、655、657、659、661、663、665、667、669、671、673、675、677、679、681、683、685、687、689、691、693、695、697、699、701、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、727、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763、765、767、769、771、773、775、777、779、781、783、785、787、789、791、793、795、797、799、801、803、805、807、809、811、813、815、817、819、821、823、825、833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929、931、946、948、950、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971和972，其中，與對應(yīng)于對照多肽的任何一種的多肽相比，這種獨特的亞序列是唯一的。如上所述確定這些獨特的亞序列。在一個實施例中，選擇嚴緊條件，使得與該編碼寡核苷酸完美互補的寡核苷酸與該編碼寡核苷酸雜交，其信噪比比該完美互補的寡核苷酸與對應(yīng)于對照多肽的任何一種的對照核酸雜交的信噪比高2.5-10倍，優(yōu)選至少高5-10倍。選擇條件，以使在所用的特定分析中觀察到較高的信噪比，例如為約15倍、20倍、30倍、50倍或更高。在這個實施例中，與對照核酸與該編碼寡核苷酸的雜交相比，靶核酸以至少高2倍的信噪比與該獨特的編碼寡核苷酸雜交。另外，可以選擇較高的信噪比，例如，約2.5倍、5倍、10倍、20倍、30倍、50倍或更高。具體的信號取決于相關(guān)分析中所用的標記，如熒光標記、比色標記、放射性標記等。載體、啟動子和表達系統(tǒng)本發(fā)明還包括含有如上廣泛描述的核酸序列中的一條或多條的重組構(gòu)建體。這種構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、細菌的人造染色體(BAC)、酵母菌人造染色體(YAC)等，其中以正向或反向插入了本發(fā)明的核酸序列。在這個實施方案的優(yōu)選方面，這種構(gòu)建體還包括調(diào)控序列，包括，例如可操作地連接到該序列上的啟動子。大量合適的載體和啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以購買得到。如先前所討論，普通教科書中描述了可用于本發(fā)明的分子生物技術(shù)，包括載體、啟動子的使用和許多其它相關(guān)主題，這些教科書包括Berger和Kimmel，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymology第152卷，學術(shù)出版社公司，圣地亞哥，加利福尼亞州(Berger)；Sambrook等人，MolecularCloning-ALaboratoryManual(第2版)，1-3卷，冷泉巷實驗室，冷泉巷，紐約，1989(“Sambrook”)以及CurrentProtocolsinMolecularBiology，F(xiàn).M.Ausubel等人編輯，CurrentProtocols，GreenePublishingAssociates公司和JohnWiley&Sons公司的合資公司，(1999增補)(“Ausubel”)。足以指導熟練技術(shù)人員通過體外擴增法，包括聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)、Qβ-復制酶擴增和其他RNA聚合酶介導的技術(shù)(例如NASBA)，來例如生產(chǎn)本發(fā)明的同源核酸的技術(shù)例子，可見于Berger，Sambrook和Ausubel以及Mullis等人(1987)美國專利4,683,202；Innis等人編輯(1990)，PCRProtocolsAGuidetoMethodsandapplications(學術(shù)出版社公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)(“Innis”)；Arnheim&Levinson(1990年10月1日)C&EN36-47；TheJournalOfNIHResearch(1991)3：81-94；Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173；Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874；Lomell等人(1989)J.Clin.Chem.35：1826；Landegren等人(1988)Science241：1077-1080；VanBrunt(1990)Biotechnology8：291-294；Wu和Wallace(1989)Gene4：560；Barringer等(1990)Gene89：117；以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology13：563-564。體外克隆擴增核酸的改進方法被描述在Wallace等人的美國專利5,426,039中。通過PCR擴增大型核酸的改進方法總結(jié)在Cheng等人(1994)Nature369：684-685和其中引用的參考文獻中，其中產(chǎn)生了最高達40kb的PCR擴增子。技術(shù)人員將會認識到，幾乎任何RNA可轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，以適合限制性消化、PCR擴增并用逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶進行測序。參見，Ausbel、Sambrook和Berger，同上文。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明載體(如本發(fā)明的克隆載體或本發(fā)明的表達載體)轉(zhuǎn)導(轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)的工程化宿主細胞，以及用重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。此載體可以是，例如質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等。工程化的宿主細胞可以被培養(yǎng)在常規(guī)營養(yǎng)基中，該營養(yǎng)基被改進以活化啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增GAT同系物基因。培養(yǎng)條件，如溫度、pH等是以前用于被選擇用來表達的宿主細胞的培養(yǎng)條件，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且在本文引用的參考文獻中，包括如Sambrook、Ausubel和Berger，以及如Freshney(1994)CultureofAnimalCells，AManualofBasicTechnique，第三版，(Wiley-Liss，紐約)和其中引用的參考文獻?？梢栽谥参?、酵母、真菌等非動物細胞中生產(chǎn)本發(fā)明的GAT多肽。除了Sambrook、Ausubel和Berger外，有關(guān)非動物細胞培養(yǎng)的細節(jié)可以參見Payne等(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystems(JohnWiley&Sons公司，紐約，紐約州)；Gamborg和Phillips(編輯)(1995)PlantCell，TissueandOrganCulture：FundanmentalMethods/SpringerLabManual，(Springer-Verlag，柏林)以及Atlas和Parks(編輯)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRC出版社，伯克萊屯，佛羅里達州。可以將本發(fā)明的多核苷酸摻入到適合表達多肽的任何一種表達載體中。合適的載體包括染色體、非染色體和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；細菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母菌質(zhì)粒；來源于質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合的載體；病毒DNA、如牛痘苗、腺病毒、禽痘病毒、擬狂犬病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和許多其他病毒?？刹捎媚軐⑦z傳物質(zhì)轉(zhuǎn)導入細胞的任何載體，如需要復制，則為在有關(guān)宿主中可復制、有活力的載體。當結(jié)合到表達載體中時，本發(fā)明的多核苷酸被可操作地連接到適當?shù)霓D(zhuǎn)錄控制序列(啟動子)上，引導mRNA合成。特別適合用于轉(zhuǎn)基因植物中的這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、玄參花葉病毒(FMV)、草莓紋理帶病毒(SVBV)啟動子，這些在美國臨時專利申請60/245354中描述了。已知能調(diào)控基因在真核或原核細胞或其他病毒中表達的和可用于本發(fā)明的某些實施方案中的其他啟動子包括SV40啟動子、大腸桿菌lac或trp啟動子、噬菌體λPL啟動子。表達載體任選地含有翻譯啟始的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子，如PinII。該載體還任選地含有用于增強表達的適當序列，如增強子。此外，本發(fā)明的表達載體任選地含有一種或多種可選擇的標記基因，提供用以選擇被轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀。通常，可選擇的標記基因編碼抗生素或者除草劑抗性。合適的基因包括編碼對抗生素奇霉素或鏈霉素具有抗性的基因(例如，aada基因)、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(SPT)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因。其他的可選擇的標記基因包括二氫葉酸還原酶或用于真核細胞培養(yǎng)的新霉素抗性，以及用于大腸桿菌培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。編碼對除草劑抗性的合適基因包括那些抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的基因，特別是編碼對磺酰脲型除草劑的抗性的基因(例如含有產(chǎn)生這種抗性的突變的乙酰乳酸合酶(ALS)，特別是S4和/或Hra突變)、抑制谷氨酸鹽合酶的作用的那些基因，例如草酊磷或者basta(例如bar基因)，或者本領(lǐng)域知曉的其他這種基因。bar基因編碼對除草劑basta的抗性，而ALS基因編碼對除草劑氯磺隆(chlorsulfuron)的抗性。在一些情況下，被改變的GAT基因用作可選擇標記。本發(fā)明的載體可用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗?，使該宿主表達本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽。合適的表達宿主的例子包括：細菌細胞，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌和沙門傷寒桿菌；真菌細胞，如釀酒酵母、畢赤巴斯德酵母和脈胞菌；昆蟲細胞，例如果蠅和草地夜蛾；哺乳動物細胞，如CHO、COS、BHK、HEK293或Bowes黑素瘤；或者植物細胞或外植體等。應(yīng)當理解，并非所有的細胞或細胞系都必須能夠產(chǎn)生功能完全的GAT多肽；例如可能生成GAT多肽的抗原性片段。本發(fā)明不受所用的宿主細胞的限制。在細菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)GAT多肽的使用意圖來選擇多種表達載體。例如，當由于商業(yè)生產(chǎn)或者用于誘導抗體，需要大量GAT多肽或其片段時，引導高水平表達易于純化的融化蛋白的載體是期望的。這種載體包括但不限于，多功能的大腸桿菌克隆和表達載體，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中，可以將GAT多肽編碼序列在讀框內(nèi)與氨基末端為Met和隨后β-半乳糖苷酶的7個殘基的序列一起連接到載體中，生成了一種雜合蛋白；pIN載體(VanHeeke&Schuster(1989)JBiolChem264：5503-5509)；pET載體(Novagen，MadisonWI)；等等。類似地，在釀酒酵母中，有許多含組成型或誘導型啟動子的載體可用來生產(chǎn)本發(fā)明的GAT多肽，這些啟動子例如是α因子、醇氧化酶和PGH。綜述可以參見Ausubel等人(同上)和Grant等人(1987)，MethodsinEmzymology153：516-544。在哺乳類宿主細胞中，可以使用包括以病毒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)的各種表達系統(tǒng)。當將腺病毒用作表達載體時，例如，可將GAT多肽的編碼序列可操作地連接到由晚期啟動子和三聯(lián)前導序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復合體中。在該病毒基因組的非必需E1或E3區(qū)插入GAT多肽編碼區(qū)，將生成能夠在被感染的宿主細胞中表達GAT的活病毒(Logan和Shenk(1984)ProcNatlAcadSciUSA81：3655-3659)。此外，可以使用轉(zhuǎn)錄增強子，如羅斯肉瘤病毒(RSV)增強子，以增加在哺乳動物宿主細胞中的表達。類似地，在植物細胞中，可以驅(qū)動被整合到植物染色體中的轉(zhuǎn)基因表達，或由附加體或病毒核酸在胞質(zhì)中進行表達。對于穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因，常常期望提供能夠驅(qū)動本發(fā)明GAT多核苷酸的組成型或誘導型表達的序列，例如，使用病毒，如CaMV，或植物來源的調(diào)控序列。大量植物來源的調(diào)控序列已經(jīng)被描述，包括以組織特異性方式引導表達的序列，如TobRB7、patatinB33、BRP基因啟動子、rbcS-3A啟動子等?；蛘?，可以通過瞬時表達植物病毒載體(如，TMV、BMV等)的外源序列，來實現(xiàn)高水平表達。通常，組成型表達本發(fā)明GAT多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物是優(yōu)選的，并選擇其調(diào)控序列，以確保組成性穩(wěn)定表達GAT多肽。用于在高等植物中表達核酸的典型載體是本領(lǐng)域熟知的，包括來源于Rogers等人(1987)Mets.Enzymol.153：253-277中描述的根瘤農(nóng)桿菌的腫瘤誘導型(Ti)質(zhì)粒的載體?？捎糜诖说氖纠愿鲛r(nóng)桿菌載體為Schardl等人(1987)Gene61：1-11和Berger等人(1989)Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.86：8402-8406描述的質(zhì)粒pKYLX6和pKYLX7。另一種可用于此的載體為質(zhì)粒pBI101.2，可以從ClontechLaboratories公司(PaloAlto，加利福尼亞州)購買得到?？捎米鬏d體的各種植物病毒在本領(lǐng)域是已知的，包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、雙生病毒(geminivirus)、雀麥草花葉病毒和煙草花葉病毒。在本發(fā)明的一些實施方案中，制備了適合轉(zhuǎn)化植物細胞的GAT多肽構(gòu)建體。例如，將所需的GAT多核苷酸摻入到重組表達盒中，以便于將該基因?qū)胫参?，并隨后表達所編碼的多肽。表達盒通常包括可操作地連接到啟動子序列和其它轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)控序列上的GAT多核苷酸或其功能片段，這些控制序列指導了該序列在被轉(zhuǎn)化植物的特定組織(例如，整個植物、葉、種子)中的表達。例如，可以使用強或弱的組成型植物啟動子，它將引導GAT多肽在植物的所有組織中表達。在大多數(shù)環(huán)境條件下和在發(fā)育或細胞分化階段中，這種啟動子都有活性。組成型啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、來源于根瘤農(nóng)桿菌T-DNA的1’-或2’-啟動子、泛素1啟動子、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(美國專利5,683,439)、Nos啟動子、pEmu啟動子、核酮糖-1，5-磷酸羧化酶-加氧酶啟動子、GRP1-8啟動子和技術(shù)人員知曉的來自各種植物基因的其他轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。當GAT多核苷酸過度表達對植物有害或不需要時，通過閱讀本文，技術(shù)人員將懂得可以使用弱的組成型啟動子，以低水平表達。當高水平表達對植物無害時，可以使用強啟動子，如t-RNA或其它polIII啟動子，或強polII啟動子，如花椰菜花葉病毒啟動子?？商娲?，植物啟動子在環(huán)境控制之下。這種啟動子在此被稱為“誘導型”啟動子?？赏ㄟ^誘導型啟動子來進行轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括病原體攻擊、厭氧條件或光照的存在。特別地，誘導型啟動子的例子為由缺氧或者冷刺激誘導的Adh1啟動子、由熱應(yīng)激誘導的Hsp70啟動子、由光照誘導的PPDK啟動子。化學誘導的啟動子也是有用的。用于本發(fā)明的啟動子可以是“組織特異的”以及，這樣，處于發(fā)育控制之下，其中多核苷酸只在某些組織，如葉、根、果實、花和/或種子中表達。示例性的啟動子是花藥特異性啟動子5126(美國專利5,689,049和5,689,051)。種子優(yōu)選的啟動子的例子包括，但是不限于，27kD的γ玉米蛋白啟動子和蠟狀啟動子，Boronat等人(1986)PlantSci.47，95-102；Reina等人(1990)NucleicAcidsRes.18(21)：6426；以及Kloesgen等人(1986)Mol.Gen.Genet.203：237-244。在胚胎、果皮和胚乳中表達的啟動子被公開在美國專利申請1998年8月20日申請的60/097,233和1998年8月28日申請的60/098,230中。這兩份專利公開的內(nèi)容在此完全引入作為參考。在實施方案中，在構(gòu)建體中引入了一種或多種植物系統(tǒng)的內(nèi)源核酸序列，可以使用這些基因的內(nèi)源啟動子(或其變體)，以在轉(zhuǎn)基因植物中指導這些基因的表達。也可以用組織特異性啟動子，來指導異源多核苷酸的表達。總之，用于植物表達盒中的特定啟動子取決于特定應(yīng)用?？梢允褂卯愒吹幕蚍钱愒吹?內(nèi)源的)啟動子，來指導本發(fā)明的核酸的表達。這些啟動子可以用在如表達盒中，來驅(qū)動反義核酸的表達，以在期望的組織中降低、升高或改變本發(fā)明的蛋白質(zhì)的濃度和/或組成。許多在植物細胞中指導轉(zhuǎn)錄的啟動子中的任何一種都是合適的。啟動子可以是組成型或誘導型的。除了上述啟動子外，在植物中起作用的細菌來源的啟動子包括章魚堿合酶啟動子、胭脂堿合酶啟動子和其它來源于天然Ti質(zhì)粒的啟動子(參見Herrara-Estrella等人(1993)Nature303：209-213)。病毒啟動子包括花椰菜花葉病毒的35S和19SRNA啟動子(Odell等(1985)Nature313：810-812)。其它的植物啟動子包括核酮糖-1，3-二磷酸羧化酶小亞基啟動子和菜豆蛋白啟動子。也可以使用來自E8基因和其它基因的啟動子序列。E8啟動子的分離和序列被詳細描述在Deikman和Fischer(1988)EMBOJ.7：3315-3327中。為了鑒定候選啟動子，對基因組克隆的5’部分作啟動子序列的序列特征分析。例如，啟動子序列元件包括TATA框共有序列(TATAAT)，它通常在轉(zhuǎn)錄起始位點上游的20-30個堿基對處。在植物中，在TATA框上游，在-80到-100的位置上，通常有啟動子元件和一系列圍繞三核苷酸G(或T)的腺苷酸，正如Messing等人(1983)GeneticEngineeringinPlants，Kosage等人(編輯)，第221-227頁所述。在制備本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體，如載體時，也可以使用啟動子以外的序列和共連接的多核苷酸。如果需要正常的多肽表達，可以在GAT-編碼區(qū)3’-末端包含多聚腺苷酸化區(qū)域。例如，多聚腺苷酸化區(qū)域可來源于各種植物基因，或來自T-DNA。將要被添加的3’端序列可以來源于如胭脂堿合酶或者章魚堿合酶基因，或者可替代地來源于另一種植物基因，或者較不優(yōu)選地來源于任何其他的真核基因。將內(nèi)含子序列添加到編碼序列的5’非翻譯區(qū)或者部分編碼序列中，以增加所積累的成熟信息的含量?？梢詤⒁娙鏐uchman和Berg(1988)Mol.CellBiol.8：4395-4405以及Callis等人(1987)GenesDev.1：1183-1200。玉米內(nèi)含子Adh1、內(nèi)含子1、2和6以及黃銅-1內(nèi)含子的用途是本領(lǐng)域已知的。通常參見Freeling和Walbot編輯的(1994)TheMaizeHandbook(Springer，紐約)，第116章。此構(gòu)建體還可以包括賦予植物細胞以可選擇表型的標記基因。例如，這種標記可以是編碼對殺蟲劑的耐受性、對特定抗生素的耐受性，如對卡那霉素、G418、博來霉素和潮霉素的耐受性，或?qū)Τ輨┑哪褪苄?，例如對氯磺隆或膦絲菌素(除草劑雙丙氨膦和Basta中的活性成分)的耐受性。特定的起始信號有助于本發(fā)明的GAT多核苷酸編碼序列的有效翻譯。這些信號包括，例如，ATG起始密碼子和毗鄰序列。如果是GAT多肽編碼序列，則將其起始密碼子和上游序列插入合適的表達載體中，不需要其它的翻譯控制信號。然而，如果只插入了編碼序列(如成熟蛋白編碼序列)或其部分，則必須提供包括起始密碼子的外源轉(zhuǎn)錄控制信號。此外，起始密碼子必需位于正確的閱讀框中，以確保整個插入片段的轉(zhuǎn)錄。外源轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子可以是各種來源的，可以是天然的或合成的?？梢栽谒褂玫募毎到y(tǒng)中加入適合的增強子，以提高表達效率(ScharfD等人(1994)ResultsProblCellDiffer20：125-62；Bittner等人(1987)MethodsinEnzymol153：516-544)。分泌/定位序列本發(fā)明的多核苷酸還可以，例如在閱讀框內(nèi)被融合到編碼分泌/定位序列的核酸上，以將多肽表達靶向所期望的宿主細胞的細胞區(qū)腔室、膜、或細胞器中，或引導多肽分泌到周質(zhì)間隙中或分泌到細胞培養(yǎng)介質(zhì)中。這些序列是技術(shù)人員已知的，包括分泌前導肽、細胞器靶向肽(如核定位序列、ER保留信號、線粒體轉(zhuǎn)運序列、葉綠體轉(zhuǎn)運序列)、膜定位/錨定序列(如停止轉(zhuǎn)移序列、GPI錨定序列)等。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸在閱讀框內(nèi)融合了N-末端葉綠體轉(zhuǎn)移序列(或葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列)，該轉(zhuǎn)運序列來源于編碼通常被靶向葉綠體的多肽的基因。這種序列通常富含絲氨酸和蘇氨酸；缺乏天冬氨酸、谷氨酸和酪氨酸；并且通常含有富含正電荷氨基酸的中心區(qū)域。表達宿主在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細胞。這種宿主細胞可以是真核細胞，如哺乳動物細胞、酵母細胞或植物細胞，或者該宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞。可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、電穿孔或其它常規(guī)技術(shù)，將該構(gòu)建體導入宿主細胞中(Davis等人，BasicMethodsinMolecularBiology)。任選地對宿主細胞調(diào)節(jié)所插入的序列的表述或以期望的形式加工所表達的蛋白質(zhì)的能力進行選擇。蛋白質(zhì)的這種修飾包括但不限于乙?；?、羧化、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化和酰化。切割蛋白質(zhì)的“前”或“前原”形式的翻譯后加工對于正確插入、折疊和/或功能也是重要的。不同的宿主細胞，如大腸桿菌、桿菌屬、酵母或哺乳動物細胞，如CHO、Hela、BHK、MDCK、293、WI38等，具有特定的有關(guān)例如翻譯后活性的細胞機理和特征機制，可以對此進行選擇，以確保如所期望地修飾和加工所導入的外源蛋白質(zhì)。為了長期、高產(chǎn)量地生產(chǎn)重組蛋白，可以使用穩(wěn)定的表達系統(tǒng)。例如，用含有病毒性復制起點或外源表達元件和可選標記基因的表達載體來轉(zhuǎn)導穩(wěn)定地表達本發(fā)明多肽的植物細胞、外植體或組織，如芽、葉盤。在導入載體后，可以讓細胞在富集培養(yǎng)基中生長與細胞類型相適應(yīng)的一段時間，如讓細菌細胞生長1小時或幾小時，讓植物細胞生長1-4天，讓一些植物外植體生長2-4周，然后換成選擇性培養(yǎng)基?？蛇x標記的目的是賦予對選擇的抗性，它的存在使成功表達導入序列的細胞可以生長并被回收。例如，可以就除草劑、草甘膦的抗性直接選擇表達本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物。例如可采用適合細胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)，來繁殖來源于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的外植體的抗性胚。將使用編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞任選地培養(yǎng)在適合該編碼蛋白質(zhì)表達并從細胞培養(yǎng)物中回收的條件下。重組細胞生產(chǎn)的蛋白質(zhì)或其片段可以是分泌的、膜結(jié)合的或含在細胞內(nèi)，這取決于所用的序列和/或載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，可以設(shè)計含有本發(fā)明GAT多核苷酸的表達載體，使其具有指導成熟多肽分泌通過原核或真核細胞膜的信號序列。其它多肽序列本發(fā)明的多核苷酸還可以包括在閱讀框內(nèi)融合到標記序列上的編碼序列，標記序列例如便于純化所編碼的多肽。這種方便純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于，金屬螯合肽，如允許在固定化的金屬上純化的組氨酸-色氨酸組件、結(jié)合谷胱甘肽的序列(如GST)、血凝素(HA)尾(對應(yīng)于來源于流感血凝素蛋白的表位；Wilson等(1984)Cell37：767)、麥芽糖結(jié)合蛋白序列、用于FLAGS延伸/親和純化系統(tǒng)的FLAG表位(Immunex公司，西雅圖，華盛頓州)等。在純化結(jié)構(gòu)域和GAT同系物序列之間包含蛋白酶可切割的多肽接頭序列，對于方便純化是有用的。用于本文所述組合物和方法中的一個表達載體，可用于表達含有本發(fā)明多肽的融合蛋白，該多肽被融合到通過腸激酶切割位點分開的多聚組氨酸區(qū)域上。組氨酸殘基便于在IMIAC(固定的金屬離子親和層析，如Porath等(1992)ProteinExpressionandPurification3：263-281)所述)上進行純化，而腸激酶切割位點提供了一種從融合蛋白上分離GAT同系物多肽的手段。也可以用pGEX載體(Promega；麥迪遜，威斯康星州)以與胱甘肽S-轉(zhuǎn)化酶(GST)的融合蛋白的形式來表達外源多肽?？傊?，這種融合蛋白是可溶的，并可以通過吸附于配體-瓊脂糖珠(如在GAT-融合時使用谷胱甘肽-瓊脂糖)，然后在存在游離配體時進行洗脫，這樣可以容易地從溶解的細胞中將其純化。多肽的生產(chǎn)和回收在轉(zhuǎn)導合適的宿主菌株并使宿主菌株生長至合適的細胞密度后，用合適的手段(如改變溫度或化學誘導)誘導所選的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。通常通過離心收獲細胞，用物理或化學方法破裂，并將所得粗制提取物用于進一步純化。可以用任何常規(guī)的方法破裂用于表達蛋白質(zhì)的微生物細胞，這些方法包括冷凍-解凍循環(huán)、超聲波、機械破碎或使用細胞溶解劑或其它方法，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。值得一提的是，有許多關(guān)于培養(yǎng)和生產(chǎn)許多細胞，包括細菌、植物、動物(尤其是哺乳動物)和古細菌來源的細胞的參考文獻。參見例如Sambrook、Ausubel和Berger(都同上文)，以及Freshney(1994)CultureofAnimalCells：AManualofBasicTechnique，第三版，(Wiley-Liss，紐約)和其中引用的參考文獻；Doyle和Griffiths(1997)MammalianCellCulture：EssentialTechniques(JohnWiley&Sons，紐約州)；Humason(1979)AnimalTissueTechniques，第四版(W.H.Freeman和Company)；以及Ricciardelli等人(1989)InvitroCellDev.Biol.25：1016-1024。有關(guān)植物細胞的培養(yǎng)和再生，可以參見Payne等人(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystems(JohnWiley&Sons公司，紐約，紐約州)；Gamborg和Phillips(編輯)(1995)PlantCell，TissueandOrganCulture：FundanmentalMethods/SpringerLabManual(Springer-Verlag，柏林)；Jones編輯(1994)PlantGeneTransferandExpressionProtocols(Humana出版社，Towata，新澤西州)；以及Croy編輯(1993)PlantMolecularBiolgy(BiosScientific出版社，牛津，英國)，ISBN0121983706。細胞培養(yǎng)介質(zhì)通常列在Atlas和Parks編輯(1993)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(CRC出版社，伯克萊屯，佛羅里達州)。關(guān)于細胞培養(yǎng)的其它信息可以在以下市售文獻中找到，如Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密蘇里州)的LifeScienceResearchCellCultureCatalogue(1998)(“Simga-LSRCCC”)和例如，同樣來自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密蘇里州)的ThePlantcultureCatalogue及增補本(1997)(“Simga-PCCS”)。其它有關(guān)植物細胞轉(zhuǎn)化和制造轉(zhuǎn)基因植物的詳述可以在下面找到。用任何本領(lǐng)域熟知的方法，可以從重組細胞培養(yǎng)物中回收并純化本發(fā)明的多肽，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水反應(yīng)層析、親和層析(如使用本文提到的任何標記系統(tǒng))、羥基磷灰石層析以及凝集素層析。如果需要，在完成成熟蛋白的構(gòu)型時采用蛋白質(zhì)再折疊步驟。最后，在最終的純化步驟中使用高效液相色譜(HPLC)。除了上述參考文獻外，各種純化方法是本領(lǐng)域熟知的，包括例如在以下文獻中提到的方法，Sandana(1997)BioseparationofProteins，學術(shù)出版社公司；Bollag等(1996)ProteinMethods，第二版(Wiley-Liss，紐約州)；Walker(1996)TheProteinProtocolsHandbook(Humuna出版社，新澤西州)；Harris和Angal(1990)ProteinPurificationApplications：APracticalApproach(牛津IRL出版社，牛津，英國)；Scopes(1993)ProteinPurification：PrinciplesandPractice第三版(SpringerVerlag，紐約州)；Janson和Ryden(1998)ProteinPurification：Priciples，HighResolutionMethodsandApplications，第二版(Wiley-VCH，紐約州)；以及Walker(1998)ProteinProtocolsonCD-ROM(Humana出版社，新澤西州)。在某些情況下，需要以適合工業(yè)和/或商業(yè)應(yīng)用的大規(guī)模來生產(chǎn)本發(fā)明的GAT多肽。在這種情況下，可采用批量發(fā)酵程序。簡單地說，可將GAT多核苷酸或編碼本發(fā)明GAT多肽的其它核酸克隆進表達載體中，該多核苷酸包括516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952的任何之一。例如，Widner等人的美國專利5,955,310“在桿菌細胞中生產(chǎn)多肽的方法”中描述了一種載體，其帶有串聯(lián)的增強子和可操作地連接到多肽編碼序列上的穩(wěn)定序列。將感興趣的多核苷酸插入載體后，將該載體轉(zhuǎn)化入細菌宿主，如枯草芽孢桿菌菌株P(guān)L1801IIE(amyE、apr、npr、spoIIE：：Tn917)中。在芽孢桿菌細胞中引入表達載體，可采用如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如參見Chang和Cohen(1979)Mol.Gen.Genet.168：111)、采用感受態(tài)細胞(例如參見Young和Spizizin(1961)J.Bacteriol.81：823，或Dubnau和Davidoff-Abelson(1971)J.ofMol.Bio.56：209)、電穿孔(例如參見Shigekawa和Dower(1998)Biotechniques6：742)、或通過偶聯(lián)(例如參見Koehler和Thorne(1987)J.ofBacteriol.169：5271)，以及Ausubel、Sambrook、Berger(都同上文)來實施。用本領(lǐng)域已知的方法，將轉(zhuǎn)化的細胞培養(yǎng)在適合生產(chǎn)多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。例如，可以在合適的培養(yǎng)基和多肽能夠被表達和/或分離的條件下，在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中，通過搖床培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批補料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。采用本領(lǐng)域已知的程序，在含有碳源和氮源以及無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得，或按照所公布的組成(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備?？梢詮呐囵B(yǎng)基中直接回收分泌的多肽。可用本領(lǐng)域已知的方法分離所生成的多肽。例如，可用常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中分離多肽，這些方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后可以用本領(lǐng)域已知的各種方法，來進一步純化分離的多肽，其中包括但不限于層析法(如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和排阻)、電泳法(如制備型等電聚焦)、差別性溶解(如硫酸銨沉淀)或提取(例如參見Bollag等(1996)ProteinMethods第二版(Wiley-Liss，紐約州)；Walker(1996)TheProteinProtocolsHandbook(Humana出版社，新澤西州)。也可以使用無細胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，用本發(fā)明的DNA或RNA來生產(chǎn)多肽。幾個這種系統(tǒng)可以購買得到。有關(guān)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的一般介紹可見于Tymms(1995)InvitroTranscriptionandTranslationProtocols：MethodsinMolecularBiology(Gerland出版社，紐約州)，第37卷。用于序列重組的底物和模式除了用于如Ausubel、Berer和Sambrook列舉的標準克隆方法中來生產(chǎn)具有所需特性的其它GAT多核苷酸和多肽的用途外，本發(fā)明的多核苷酸任選地被用作各種產(chǎn)生多樣性的方法的底物，多樣性過程例如是突變、重組和遞推重組反應(yīng)。各種產(chǎn)生多樣性的方法是可獲得的，并且在本領(lǐng)域中有描述。這些方法可以單獨使用，和/或聯(lián)合使用以生產(chǎn)多核苷酸或一組多核苷酸的一種或多種變體，以及所編碼蛋白的變體。無論是單獨還是聯(lián)合，這些過程提供了產(chǎn)生多樣化的多核苷酸和多核苷酸組(例如包括多核苷酸文庫)的強有力的、廣泛適用的方法，這些多樣化的多核苷酸和多核苷酸組可用于例如工程化或快速進化具有新的和/或改進特性的多核苷酸、蛋白質(zhì)、路徑、細胞和/或生物體。這種改變序列的方法會產(chǎn)生，例如，單個核苷取代、多個核苷酸取代以及核酸序列區(qū)域的插入或缺失。雖然在為了確保清楚地討論的過程中進行區(qū)分和分類，但是應(yīng)理解，這些技術(shù)通常不是相互排斥的。實際上，各種方法可以單獨或聯(lián)合、平行或依次地使用，以獲得不同的序列變體。本文所述的任何產(chǎn)生多樣性的方法的結(jié)果可能是產(chǎn)生了一種或多種多核苷酸，可以從中選擇或篩選編碼具有或賦予所需特性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。在用一種或多種本文所述的方法或技術(shù)人員可獲得的其它方法進行多樣化后，可以從中選擇具有所需活性或特性的多核苷酸，如改變的對草甘膦的Km、改變的對乙酰CoA的Km、使用備選的輔因子(如丙酰CoA)提高了k催化等。這包括，例如以自動或可自動化的形式，通過本領(lǐng)域的分析方法之一，確定任何可被檢測的活性。例如，用質(zhì)譜法，通過分析草甘膦轉(zhuǎn)變?yōu)镹-乙酰草甘膦，來檢測特定活性升高的GAT同系物。或者，可以將使用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化的細菌生長在含有濃度遞增的草甘膦的瓊脂上，或用草甘膦噴灑含有本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因植物，這樣可以測定增強的賦予草甘膦抗性的能力。根據(jù)實踐者的判斷力，可以連續(xù)或平行地評價各種相關(guān)(或者甚至是不相關(guān))的特性。有關(guān)重組和選擇除草劑抗性的其它詳細描述可見于，例如，1999年8月12申請的“生產(chǎn)除草劑抗性農(nóng)作物的DNA改組”(美國專利公開2002/0058249)。對各種產(chǎn)生多樣性的方法的描述，包括多基因改組和用于產(chǎn)生編碼多個酶促結(jié)構(gòu)域的被修飾核酸序列的方法，可以見于如下公開物及其中引用的參考文獻：Soong，N.等人(2000)Nat.Genet.25(4)：436-39；Stemmer等人(1999)TumorTargeting4：1-4；Ness等人(1999)NatureBiotech.17：893-896；Chang等人(1999)NatureBiotech.17：793-797；Minshull和Stemmer(1999)CurrentOpinioninChemicalBiology3：284-290；Christians等人(1999)NatureBiotech.17：259-264；Crameri等人(1998)Nature391：288-291；Crameri等人(1997)NatureBiotech.15：436-438；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Patten等人(1997)CurrentOpinioninBiotechnology8：724-733；Crameri等人(1996)NatureMed.2：100-103；Crameri等人(1996)NatureBiotech.14：315-319；Gates等人(1996)J.Mol.Biol.255：373-386；Stemmer(1996)，“SexualPCRandAssemblyPCR”，分子生物學百科全書(VCH出版社，紐約)第447-457頁；Crameri和Stemmer(1995)，BioTechuigues18：194-195；Stemmer等人(1995)，Gene164：49-53；Stemmer(1995)，Science270：1510；Stemmer(1995)，Bio/Technolagy13：549-553；Stemmer(1994)Nature370：389-391；和Stemmer(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：10747-10751。產(chǎn)生多樣性的突變方法包括，如定點誘變(Ling等人(1997)，“DNA誘變的方法：綜述”，AnalBiQchem.254(2)：157-178；Dale等人(1996)，“使用硫代磷酸酯法進行寡核苷酸指導的隨機誘變”MethodsMol.Biol.57：369-374；Smith(1995)，“體外誘變”Ann.Rev.Genet.19：423-462；Botstein&Shortle(1985)，“體外誘變的策略和應(yīng)用”Science229：1193-1201；Carter(1986)，“定點誘變”，BiochemJ.237：1-7；和Kunkel(1987)，“寡核苷酸指導的誘變效率”，NucleicAcids&MolecularBiology(Eckstein，F(xiàn).和Lilley，D.M.J.編輯，SpringerVerlag，柏林)；使用含有尿嘧啶的模板進行的誘變(Kunkel(1985)“不進行表型選擇的快速和有效的位點特異性誘變”Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492；Kunkel等(1987)“不進行表型選擇的快速和有效的位點特異性誘變”MethodsinEnzymol.154：367-382；和Bass等(1988)“具有新的DNA-結(jié)合特異性的突變Trp阻抑物”Science242：240-245)；寡核苷酸指導的誘變(MethodsinEnzymol.100：468-500(1983)；MethodsinEuzymol.154：329-350(1987)；Zoller&Smith(1982)“使用M13衍生的載體進行寡核苷酸指導的誘變：在DNA片段中產(chǎn)生點突變的有效和一般方法”NucleicAcidsRes.10：6487-6500；Zoller&Smith(1983)“克隆入M13載體中的DNA片段的寡核苷酸指導的誘變”MethodsinEnzymol.100：468-500；和Zoller&Smith(1987)“寡核苷酸指導的誘變：使用兩種寡核苷酸引物和單鏈DNA模板的簡單方法”MethodsinEnzymol.154：329-350)；硫代磷酸酯修飾的DNA誘變(Taylor等人(1985)“在限制酶反應(yīng)中使用硫代磷酸酯修飾的DNA制備裸DNA”Nucl.AcidsRes.13：8749-8764；Taylor等(1985)“使用硫代磷酸酯修飾的DNA以高頻率快速產(chǎn)生寡核苷酸指導的突變”Nucl.AcidsRes.13：8765-8787；Nakamaye&Eckstein(1986)“硫代磷酸酯基團對限制性核酸內(nèi)切酶NciI切割的抑制及其在寡核苷酸指導的誘變中的應(yīng)用”，Nucl.AcidsRes.14：9679-9698；Sayers等人(1988)“基于硫代磷酸酯的寡核苷酸指導的誘變中的Y-T核酸外切酶”Nucl.AcidsRes.16：791-802；和Sayers等人(1988)“通過在溴乙錠的存在下與限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)對含有硫代磷酸酯的DNA進行鏈特異性切割”Nucl.AcidsRes.16：803-814)；使用帶缺口的雙鏈體DNA進行的誘變(Kramer等人(1984)“用于寡核苷酸指導的突變構(gòu)建的帶缺口的雙鏈體DNA方法”Nucl.AcidsRes.12：9441-9456；Kramer&Fritz(1987)MethodsinEnzymol.“通過帶缺口的雙鏈體DNA進行的寡核苷酸指導的構(gòu)建的突變”154：350-367；Kramer等人(1988)“對于寡核苷酸指導的突變構(gòu)建在帶缺口的雙鏈體DNA方法中，改進的體外酶反應(yīng)”Nucl.AcidsRes.16：7207；和Fritz等人(1988)，“寡核苷酸指導的突變構(gòu)建：沒有體外酶反應(yīng)的帶缺口的雙鏈體DNA法”Nucl.AcidsRes.16：6987-6999)。其他的合適方法包括點錯配修復(Kramer等人(1984)“點錯配修復”Cell38：879-887〕，使用修復缺陷的宿主細胞株進行的誘變(Carter等人(1985)“使用M13載體改進寡核苷酸定點誘變”Nucl.AcidsRes.13：4431-4443；和Carter(1987)“使用M13載體進行改進的寡核苷酸指導的誘變”MethodsinEnzymol154：382-403)，缺失誘變(Eghtedarzadeh&Henikoff(1986)“使用寡核苷酸產(chǎn)生大的缺失”Nucl.AcidsRes.14：5115)，限制性選擇和限制性純化(Wells等人(1986)“氫鍵形成對穩(wěn)定枯草蛋白酶過渡態(tài)的重要性”Phil.Trans.R.Soc.Lond.A，317：415-423)，通過總基因合成進行的誘變(Nambiar等人(1984)“編碼核糖核酸酶S蛋白的基因的總合成和克隆”Science223：1291-1301；Sakamar和Khorana(1988)“用于牛桿菌外片段鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(轉(zhuǎn)導素)的亞基的基因的總合成和表達”Nucl.AcidsRes.14：6361-6372；Wells等人(1985)，“表達盒誘變：在特定位點上產(chǎn)生多個突變的有效方法”Gene34：315-323；和等(1985)，“通過微量‘鳥槍’基因合成進行的寡核苷酸指導的誘變”Nucl.AcidsRes.13：3305-3316)；雙鏈斷裂修復(Mandecki(1986)；Arnold(1993)“用于異常環(huán)境的蛋白質(zhì)工程”CurrentOpinioninBiotechnolgy4：450-455；和“大腸桿菌質(zhì)粒中的寡核苷酸指導的雙鏈斷裂修復：一種定點誘變方法”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181)。上述方法的其他詳細內(nèi)容可見于MethodsinEnzymology第154卷，其中還描述了用各種誘變方法有效控制打靶故障的問題。關(guān)于各種產(chǎn)生多樣性的方法的其他詳細描述可見于如下的美國專利、PCT公開和EPO公開：Stemmer的美國專利5,605,793(1997年2月25日)，“體外重組方法”；Stemmer等人的美國專利5,811,238(1998年9月22日)，“通過反復選擇和重組產(chǎn)生具有所需特性的多核苷酸的方法”；Stemmer等人的美國專利5,830,721(1998年11月3日)，“采用隨機片段化和重裝配進行DNA誘變”；Stemmer等人的美國專利5,834,252(1998年11月10日)，“未端互補聚合酶反應(yīng)”；Minshull等人的美國專利5,837,458(1998年11月17日)，“用于細胞和代謝工程的方法和組合物”；WO95/22625，Stemmer和Crameri，“采用隨機片段化和裝配進行的誘變”；Stemmer和Lipschutz的WO96/33207，“未端互補聚合酶鏈式反應(yīng)”；Stemmer和Crameri的WO97/20078，“通過反復選擇和重組產(chǎn)生具有所需特性的多核苷酸的方法”；Minshull和Stemmer的WO97/35966，“用于細胞和代謝工程的方法和組合物”；Punnonen等人的WO99/41402，“遺傳疫苗載體的靶標”；Punnonen等人的WO99/41383，“抗原庫免疫”；Punnonen等人的WO99/41369，“遺傳疫苗載體工程”；Punnonen等人的WO99/41368，“遺傳疫苗的免疫調(diào)節(jié)性能的優(yōu)化”；Stemmer和Crameri的EP752008，“采用隨機片段化和重裝配進行的DNA誘變”；Stemmer的EP0932670，“采用遞推序列重組促進細胞DNA攝取”；Stemmer等的WO99/23107，“采用病毒基因組改組進行的病毒嗜性和宿主范圍的修飾”；Apt等人的WO99/21979，“人乳頭瘤病毒載體”；delCardayre等人的WO98/31837，”“用遞推序列重組推進全細胞和生物體”；Patten和Stemmer的WO98/27230，“用于多肽工程的方法和組合物”；Stemmer等人的WO98/13487，“采用遞推序列改組和選擇優(yōu)化基因治療的方法”，WO00/00632，“產(chǎn)生高度多樣化文庫的方法”，WO00/09679，“獲得體外重組多核苷酸序列庫和所產(chǎn)生的序列的方法”；Arnold等人的WO98/42832，“使用隨機的或限定的引物重組多核苷酸序列”；Arnold等人的WO99/29902，“產(chǎn)生多核苷酸和多肽序列的方法”；Vind的WO98/41653，“構(gòu)建DNA文庫的體外方法”；Borchert等WO98/41622，“使用DNA改組構(gòu)建文庫的方法”；Pati和Zarling的WO98/42727，“用同源重組進行序列改變”；Patten等人的WO00/18906，“密碼子改變的基因改組”；Cardayre等人的WO00/04190，“采用遞推序列重組的全細胞和生物體進化”；Crameri等人的WO00/42561，“寡核苷酸介導的核酸重組”；Selifonov和Stemmer的WO00/42559，“用于進化模擬中的繁殖數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的方法”；Salifonov等人的WO00/42560，“制備具有所需特征的特征鏈串、多核苷酸和多肽的方法”；Welch等人的WO01/23401，“將密碼子改變的寡核苷酸合成法用于合成改組”；以及Affholter的PCT/US01/06775，“單鏈核酸模板介導的重組和核酸片段分離”。某些美國申請還提供了關(guān)于產(chǎn)生多樣性的方法的更詳細的描述，包括：Patten等人在1999年9月28日申請的“密碼子改變的基因的改組”(USSN09/407800)；delCardayre等人在1998年7月15日(USSN09/166188)和1999年7月15日(USSN09/354922)申請的“采用遞推序列重組進化全細胞和生物體”；Crameri等人在1999年9月28日申請的“寡核苷酸介導的核酸重組”(USSN09/408392)；Crameri等人在2000年1月18日申請的“寡核苷酸介導的核酸重組”(PCT/US00/01203)；Welch等人在1999年9月28日申請的“將基于密碼子的寡核苷酸合成用于合成性改組”(USSN09/408393)；Selifonov等人在2000年1月18日申請的“具有所需特征的制備特字符串多核苷酸和多肽的方法”(PCT/US00/01202)；Selifonov等人在200年7月18日申請的“制備具有所需特征的字符串、多核苷酸和多肽的方法”(USSN09/618579)；Selifonov和Stemmer在2000年1月18日申請的“用于進化模擬中的繁殖數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的方法”(PCT/US00/01138)；Affholter的“單鏈核酸模板介導的重組和核酸片段分離”(USSN60/186482，2000年3月2日申請)。簡而言之，幾類不同的常規(guī)序列修飾方法，如突變、重組等，可應(yīng)用于本發(fā)明，并且在上述參考文獻中列舉。也就是說，在序列共連接之前或在共連接步驟之后，用任何一種上述方案改變核酸序列的組成，產(chǎn)生修飾的基因融合構(gòu)建體。下面在本發(fā)明文中例舉了一些不同類型的優(yōu)選形式，用于產(chǎn)生多樣化，包括，例如某些基于多樣化產(chǎn)生形式的重組。用上述參考文獻中討論的各種技術(shù)，進行核酸的體外重組，包括，例如DNA酶消化要被重組的核酸，然后連接和/或PCR重組該核酸。例如，可以使用有性PCR誘變，其中DNA分子被隨機(或假隨機，或甚至非隨機)斷裂，然后基于具有不同但相關(guān)DNA序列的DNA分子之間的相似性進行體外重組，然后通過在聚合酶鏈式反應(yīng)中延伸來固定交換體。此過程和多種該過程的變化形式被描述在上述幾個參考文獻中，例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751。類似地，可以在體內(nèi)遞推重組核酸，例如使細胞內(nèi)的核酸之間發(fā)生重組。上面提到的參考文獻中列出了許多這種體內(nèi)重組形式。這種形式通常任選地在感興趣的核酸之間直接重組，或在含有感興趣的核酸的載體、病毒、質(zhì)粒等之間進行重組，以及其它形式。有關(guān)該過程的詳細描述可見于上述參考文獻。也可以使用全基因組重組法，其中細胞或其它生物的全基因組被重組，任選地包括摻入帶有所需文庫成分(如對應(yīng)于本發(fā)明的路徑的基因)的基因組重組混合物。這些方法有許多應(yīng)用，包括靶基因特性不清楚的那些應(yīng)用。關(guān)于這種方法的詳細描述可見于，例如delCardayre等人的WO98/31837，“用遞推序列重組推進全細胞和生物體”，和例如delCardayre等人的WO0/004190，標題為“用遞推序列重組推進全細胞和生物體”。因此，可以單獨或聯(lián)合使用這些用于重組、遞推重組以及全基因組重組的方法和技術(shù)中的任何一種，來生產(chǎn)本發(fā)明的經(jīng)修飾的核酸序列和/或經(jīng)修飾的基因融合構(gòu)建體。也可以采用合成重組法，其中在PCR或連接反應(yīng)中，合成并重組了對應(yīng)于感興趣靶子的寡核苷酸，包括與一個以上的親代核酸相對應(yīng)的寡核苷酸，因此生成新的重組核酸?？梢杂脴藴实暮塑账峒映煞ㄉa(chǎn)寡核苷酸，或者可以例如通過三聯(lián)核苷酸合成法來生產(chǎn)寡核苷酸。有關(guān)這種方法的詳細描述可見于上述參考文獻，包括，例如Crameri等人的WO00/42561，“寡核苷酸介導的核酸重組”；Welch等人的WO01/2340，“將基于密碼子的寡核苷酸合成用于合成性改組”；Selifonov等人的WO00/42560，“制備具有所需特征的字符串、多核苷酸和多肽的方法”；Selifonov和Stemmer的WO00/42559，“用于進化模擬中的繁殖數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的方法”?？刹捎糜嬎銠C芯片內(nèi)(insilico)重組方法，其中在計算機中使用遺傳算法，重組對應(yīng)于同源(乃至非同源)核酸的序列鏈。通過合成對應(yīng)于重組序列的核酸，如與寡核苷酸合成/基因重裝配技術(shù)協(xié)同，將生成的重組序列鏈任選地轉(zhuǎn)化成核酸。這種方法可產(chǎn)生隨機的、部分隨機的或所設(shè)計的變體。關(guān)于計算機芯片內(nèi)重組的許多細節(jié)，包括遺傳算法、遺傳操縱子在計算機系統(tǒng)中的應(yīng)用、結(jié)合與相應(yīng)的核酸(和/或蛋白質(zhì))的產(chǎn)生相結(jié)合、以及與所設(shè)計的核酸和/或蛋白質(zhì)(如基于橫跨位點的選擇)以及設(shè)計的、假隨機的或隨機的組合相結(jié)合的方法，被描述在Selifonov等人的WO00/42560，“制備具有所需特性的字符串、多核苷酸和多肽的方法”；Selifonov和Stemmer的WO00/42559，“用于進化模擬中增加數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的方法”。關(guān)于計算機芯片內(nèi)重組方法的更多詳細描述可見于這些申請。通?？蓪⑦@種方法用于本發(fā)明，以在計算機芯片內(nèi)將編碼參與各種代謝途徑(如類胡蘿卜素生物合成途徑、外蛋白(ectoine)生物合成途徑、聚羥基鏈烷酸酯生物合成途徑、芳族聚酮化合物生物合成途徑等)的蛋白質(zhì)的核酸序列和/或基因融合構(gòu)建體進行重組，和/或產(chǎn)生相應(yīng)的核酸或蛋白質(zhì)?？深愃频夭捎迷u估天然多樣性的許多方法，如通過使不同的核酸或核酸片段與單鏈模板雜交，然后經(jīng)過聚合和/或連接，重新生成全長序列，然后任選地降解模板，回收所生成的修飾核酸。在使用單鏈模板的一種方法中，使來源于基因組文庫的片段群與對應(yīng)于相反鏈的部分的或通常約全長的ssDNA或RNA退火。然后，使用核酸酶除去非雜交片段末端，聚合填滿這些片段之間的空隙，接著進行單鏈連接，從而介導由此群體裝配得到復雜的嵌合基因。通過消化(例如如果含有RNA或尿嘧啶)、在變性條件下的磁力分離(以有益于這種分離方式進行標記)和其它可利用的分離/純化方法，去除親本多核苷酸鏈。或者，任選地將親本鏈與嵌合鏈共純化，并在隨后的篩選和加工步驟中除去。關(guān)于這種方法的其他詳細描述可見于Affholter的WO01/64864，“單鏈核酸模板介導的重組和核酸片段分離”。在另一種方法中，將單鏈分子轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA(dsDNA)，然后通過配體介導的結(jié)合使該dsDNA分子結(jié)合到固相支持物上。在將未結(jié)合的DNA分離后，從支持物上釋放所選擇的DNA分子，然后將其導入合適的宿主細胞中，產(chǎn)生富含與該探針雜交的序列的文庫。以這種方式生成的文庫為采用在此描述的任一種方法進一步多樣化提供了所需的底物。前述的常規(guī)重組形式的任何一種都可以重復進行(如一輪或多輪突變/重組，或者其它產(chǎn)生多樣性的方法，任選地采用一種或多種選擇方法)，產(chǎn)生一組更加多樣化的重組核酸。還提出了用多核苷酸鏈終止法進行誘變(參見，例如Short的美國專利5,965,408，“中斷合成重組DNA的方法”，以及上面的文獻)，并且可以將該方法應(yīng)用于本發(fā)明。在該方法中，在存在或缺乏該基因的特異性引物的情況下，將對應(yīng)于具有序列相似性區(qū)域的一個或多個基因的雙鏈DNA混合并變性。然后使這些單鏈多核苷酸退火，并在聚合酶和鏈終止劑(如，紫外光、γ射線或X-射線；溴化乙錠或其它嵌入劑；DNA結(jié)合蛋白，如單鏈結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄激活因子或者組蛋白；多環(huán)芳烴；三價鉻或三價鉻鹽；或者由快速熱循環(huán)介導的簡易聚合；等等)的存在下進行溫育，得到部分雙鏈體分子。然后使這些例如含有部分延伸鏈的部分雙鏈體分子變性，并在隨后的復制和部分復制循環(huán)中再退火，產(chǎn)生共有不同程度的序列相似性的多核苷酸，與起始的DNA分子群相比，這些多核苷酸被多樣化。任選地，在該方法的一個或多個階段中，將產(chǎn)物或者部分產(chǎn)物的集合擴增。通過上述的鏈式終止法制備的多核苷酸是用于任何其它所述的重組方式的合適底物。還可采用Ostermeier等人(1999)在“與DNA同源性無關(guān)的雜交酶的組合方法”NatureBiotech，17：1205中所述的“產(chǎn)生雜交酶的漸進截短”(“ITCHY”)中命名的重組方法，在核酸或核酸群中產(chǎn)生多樣性?？刹捎眠@種方法產(chǎn)生變體的起始文庫，該變體任選地作為一種或多種體外或體內(nèi)重組方法的底物。還可參見Ostermeier等人(1999)，“采用漸進截短進行的組合蛋白質(zhì)工程”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：3562-67；Ostermeier等人(1999)，“在新穎的生物催化劑的工程中以漸進截短作為策略”，Biol.Med.Chem，7：2139-44?？捎欣夭捎脤е聠蝹€核苷酸或者鄰接或非鄰接核苷酸組改變的突變方法，將核苷酸多樣性導入本發(fā)明的核酸序列和/或基因融合構(gòu)建體中。許多誘變方法可見于上述參考文獻；關(guān)于誘變方法的其他詳細描述可見在下文，它們也被應(yīng)用于本發(fā)明。例如，可采用易錯PCR產(chǎn)生核酸變體。采用這種技術(shù)，在DNA聚合酶復制保真性低的條件下進行PCR，使得在PCR產(chǎn)物的整個長度獲得高比例的點突變。這些技術(shù)的例子可見于上述參考文獻，例如Leung等人(1989)，Technique1：11-15；和Caldwell等人(1992)，PCRMethodsApplic.，2：28-33。類似地，在涉及從小DNA片段的混合物裝配PCR產(chǎn)物的過程中，可采用裝配PCR。在同一反應(yīng)混合物中，同時發(fā)生大量不同的PCR反應(yīng)，一個反應(yīng)的產(chǎn)物引發(fā)另一反應(yīng)的產(chǎn)物。可采用寡核苷酸指導的誘變，在感興趣的核酸序列中導入位點特異性突變。這種技術(shù)的例子可見于上述參考文獻，以及如Reidhaar-Olson等人(1988)，Science241：53-57。類似地，在使用與天然序列不同的合成寡核苷酸表達盒替換雙鏈DNA分子的小區(qū)域的過程中，可采用表達盒誘變。寡核苷酸可含有如完全和/或部分隨機化的天然序列。遞推集團誘變(recursiveensemblemutagenesis)是一種將蛋白質(zhì)誘變的算法用于產(chǎn)生表型相關(guān)的突變體的多樣化群體的方法，該群體中的成員在氨基酸序列上不同。這種方法使用反饋機制來監(jiān)測數(shù)輪組合型表達盒的誘變。這種方法的例子可見于Arkin&Youvan(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7811-7815。采用指數(shù)集團誘變法，用于產(chǎn)生含有高比例的獨特和功能性的突變體的組合文庫。感興趣的序列中的少量殘基被平行地隨機化，以鑒定在各改變位置上產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)的氨基酸。這類方法的例子可見于Delegrave&Youvan(1993)，Biotech.Res.11：1548-1552?？刹捎皿w內(nèi)誘變，通過在攜帶一個或多個DNA修復途徑中的突變的大腸桿菌菌株中繁殖DNA，在感興趣的任何克隆DNA中產(chǎn)生隨機突變。這些“突變子”株比野生型親本具有較高的隨機突變率。在這些菌株之一中繁殖DNA，最終將在該DNA中產(chǎn)生隨機突變。這些方法在上述參考文獻中有描述。在如細菌、真菌、動物或植物基因組的一種基因組中產(chǎn)生多樣性的其它方法可與上述和/或所參考的方法一起使用。例如，除了上述方法外，還提出了生產(chǎn)適用于轉(zhuǎn)化到各種物種中的核酸多聚體的技術(shù)(例如，可參見Schellenberger，美國專利5,756,316和上述參考文獻)。用這類由相互之間不同的基因(如從天然的多樣性得到的，或者通過采用定點誘變、易錯PCR獲得的，通過誘變細菌菌株傳代獲得的等)組成的多聚體轉(zhuǎn)化合適的宿主，提供用于DNA多樣化的核酸多樣性的來源，如通過上述體內(nèi)重組方法?；蛘?，將多種共有部分序列相似區(qū)域的單體多核苷酸轉(zhuǎn)化入宿主物種中，由宿主細胞在體內(nèi)進行重組。接下來的多輪細胞分裂可用來產(chǎn)生文庫，文庫的成員包括單一的同源群體，或者單體多核苷酸的集合。或者，可采用標準的技術(shù)，如PCR和/或克隆，來回收單體核酸，然后以任何一種重組方式，包括上述遞推重組方式進行重組。已描述了產(chǎn)生多物種表達文庫的方法(除了上述參考文獻以外，還參見Peterson等人(1998)，美國專利5,783,431，“產(chǎn)生和篩選新穎代謝途徑的方法”；和Thompson等人(1998)，美國專利5,824,485，“產(chǎn)生和篩選新穎代途徑的方法”)，還提出了它們在鑒定感興趣的蛋白質(zhì)活性方面的用途〔除了上述文獻以外，還可參見Short(1999)的美國專利5,9586,72，“具有從非培養(yǎng)的微生物DNA的克隆的蛋白質(zhì)活性篩選”〕。通常，多物種表達文庫包括含有多種物種或菌株的、在表達盒中可操作地連接到適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列的cDNA或基因組序列的文庫。該cDNA和/或基因組序列任選地隨機連接，以進一步提高多樣性。載體可以是適用于在一種以上宿主生物體中，如在細菌物種、真核細胞中轉(zhuǎn)化和表達的穿梭載體。在某些情形下，通過預先選擇編碼感興趣的蛋白質(zhì)的序列，或者與感興趣的核酸雜交的序列，使得該文庫被偏倚?？商峁┻@樣的文庫用作本文所述任一方法的底物。已廣泛采用上述方法來增加核酸和/或編碼的蛋白質(zhì)多樣性。但是，在許多情況下，并不是所有的多樣性都是有用的，如功能方面，多樣性僅僅有助于增加變體的背景，必須對這些變體進行篩選或選擇來確定少數(shù)有利的變體。在一些應(yīng)用中，需要在多樣化之前預先選擇或預先篩選文庫(如擴增的文庫、基因組文庫、cDNA文庫、歸一化文庫等)或其它底物核酸。例如，在抗體工程中，在采用上述任一種方法進行操作前利用體內(nèi)重組活動，有可能使產(chǎn)生多樣性的方法偏向具有功能性抗原結(jié)合位點的抗體。例如，可在采用本文所述的任一種方法進行多樣化之前，先擴增來源于B細胞cDNA文庫的重組CDR，然后裝配到構(gòu)架區(qū)域中〔如Jirholt等人(1998)，“利用序列空間：在體內(nèi)將形成的互補性決定簇區(qū)域改組到主要構(gòu)架中”Gene215：471〕。文庫偏向于編碼具有所需酶活性的蛋白質(zhì)的核酸。例如，在從具有特殊活性的文庫中鑒定到一個克隆后，可采用任何已知的用于導入DNA改變的方法來誘變該克隆。然后根據(jù)所需的活性篩選含有誘變同系物的文庫，該活性可能與初始的特殊活性相同或者不同。這種方法的一個例子是Short(1999)在美國專利5,939,250，“通過誘變產(chǎn)生具有所需活性的酶”中提出的?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法鑒定所需的活性。例如WO99/10539提出，可通過將基因文庫的提取物與從代謝旺盛的細胞獲得的成分相組合，并且鑒定具有期望活性的組合。還提出(如WO98/58085)，可通過將生物活性底物插入文庫的樣品中，然后使用熒光分析儀，如流式細胞儀裝置、CCD、熒光計或光譜儀，并且檢測對應(yīng)于具有期望活性的產(chǎn)物的生物活性熒光，從而鑒定出具有期望活性的克隆。文庫還可偏向于具有特殊特性的核酸，例如與選擇的核酸探針雜交的核酸。例如，WO99/10539提出，可以從基因組DNA序列中鑒定出編碼期望活性(酶活性，例如：脂肪酶、酯酶、蛋白酶、糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶、激酶、加氧酶、過氧化物酶、水解酶、水合酶、腈水解酶、轉(zhuǎn)氨酶、酰胺酶或?；D(zhuǎn)移酶)的多核苷酸。特別地，來自基因組DNA群體的單鏈DNA分子與配體偶聯(lián)的探針雜交。基因組DNA來源于培養(yǎng)的或非培養(yǎng)的微生物，或者來源于環(huán)境樣品中?；蛘?，基因組DNA可來源于多細胞生物或其組織?？梢杂檬孪葟牟东@培養(yǎng)基中釋放的或未釋放的用于捕獲的雜交探針直接進行第二鏈合成，或者可采用本領(lǐng)域已知的各種其它策略進行?；蛘撸恍柽M一步克隆，將分離的單鏈基因組DNA群體片段化，直接用于例如基于重組的方法，如上所述，該方法使用單鏈模板。在Short的WO00/46344“基因疫苗和酶的非隨機性產(chǎn)生”中描述了產(chǎn)生核酸和多肽的“非隨機性”方法。這些方法，包括所提出的非隨機性多核苷酸重新裝配和位點飽和性誘變方法都可用于本發(fā)明。采用摻雜或簡并寡核苷酸進行的隨機或半隨機誘變也有描述，如Arkin和Youvan(1992)，“優(yōu)化核苷酸混合物，以編碼用于半隨機誘變氨基酸的特殊亞組”，Biotechnology10：29-300；Reidhaar-Olson等人(1991)，“使用寡核苷酸盒對蛋白質(zhì)序列進行隨機誘變”，MethodsEnzymol.208：564-86；Lim和Sauer(1991)，“內(nèi)部包裝相互作用在決定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性中的作用”J.Mol.Biol.219：359-76；Breyer和Sauer(1989)，“單克隆抗體51F與λ阻抑物的良好特異性結(jié)合的突變分析”J.Biol.Chem.264：13355-60；和“初排(walk-through)誘變”(Crea，R，美國專利5,830,650和5,798,208，和歐洲專利0527809B1)。不難理解，上述適用于在多樣化前富集文庫的技術(shù)也可用于篩選由產(chǎn)生多樣性方法獲得的產(chǎn)物或者產(chǎn)物文庫?？梢赃f推地或聯(lián)合地實施上述方法的任何一種，以改變核酸，如GAT編碼多核苷酸。用于誘變、文庫構(gòu)建和其它產(chǎn)生多樣性的方法的試劑盒也可購買得到。例如，可從Stratagene(如QuickChangeTM定點誘變試劑盒；和ChameleonTM雙鏈、定點誘變試劑盒)；Bio/CanScientific、Bio-Rad(例如，使用上述Kunkel方法)；BoehringerMannheim公司；Clonetech實驗室；DNATechnologies；EpicentreTechnologies(如5引物3引物試劑盒)；Genpak公司；Lemargo公司；LifeTechnologies(GibcoBRL)；NewEnglandBiolabs；PharmaciaBiotech；Promega公司；QuantumBiotechnologies；AmershamInternationalplc(例如，采用上述Eckstein法)和AnglianBiotechnology有限公司(例如，采用上述Carter/Winter法)。上述參考文獻提供了許多突變方式，包括重組、遞推重組、遞推突變和重組或者具有其它誘變形式的重組，以及這些方式的許多改變形式。不管采用哪種產(chǎn)生多樣性的方式，都可以重組本發(fā)明的核酸(相互之間，或者與相關(guān)的(乃至無關(guān)的)序列之間)，來產(chǎn)生用于本發(fā)明的基因融合構(gòu)建體和修飾的基因融合構(gòu)建體的重組核酸的不同組合，包括例如同源核酸以及相應(yīng)的多肽。上述許多產(chǎn)生修飾的多核苷酸、序列的方法產(chǎn)生了親本序列的大量多樣性變體。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，采用經(jīng)改動的技術(shù)(如某些形式的改組)，來產(chǎn)生變體的文庫，然后篩選此文庫中的修飾的多核苷酸或者修飾的多核苷酸的集合，這些多核苷酸編碼一些期望的功能特性，如改進的GAT活性?？捎糜诤Y選的示例性酶活性的例子包括催化速率(通常以動力學常數(shù)如k催化和KM為特征)、底物特異性和對底物、產(chǎn)物或其它分子(如抑制劑或激活劑)的激活或抑制的易感性。選擇期望的酶活性的一個例子要求使宿主細胞生長在抑制不能充分表達感興趣的酶活性如GAT活性的細胞生長和/或生存的條件下。采用這種選擇方法，可以不用考慮編碼期望酶活性的修飾核酸以外的所有被修飾的核酸。例如，在本發(fā)明的一些實施方案中，將宿主細胞維持在缺乏足夠水平的草甘膦時抑制細胞生長或存活的條件下。在這些條件下，僅僅含有修飾核酸的宿主細胞能生存和生長，該修飾核酸編碼能催化產(chǎn)生足夠水平的產(chǎn)物的酶活性。本發(fā)明的某些實施方案采用在濃度遞增的草甘膦或草甘膦類似物中進行多輪篩選。在本發(fā)明的某些實施方案中，采用質(zhì)譜來檢測草甘膦、草甘膦類似物或代謝物的乙?；?。在以下實施例中更加詳細地描述質(zhì)譜應(yīng)用。為了方便以及獲得高通量，常常需要在微生物，如細菌，如大腸桿菌中篩選/選擇期望的修飾核酸。另一方面，在某些情況下，在植物細胞或植物中進行篩選是優(yōu)選的，其最終的目的是產(chǎn)生用于在植物系統(tǒng)中表達的修飾核酸。在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案中，通過對表達不同的修飾核酸的宿主細胞集合進行篩選，單獨地或者作為基因融合構(gòu)建體的一部分，來增加通量?？蓪︼@示出顯著活性的任何集合進行反褶積，以確定表達期望活性的單個克隆。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，相關(guān)分析、篩選或選擇方法將根據(jù)所需宿主生物和本領(lǐng)域知曉的其他參數(shù)而改變。通常，采用可以以高通量形式實施的分析是有利的。在高通量分析中，有可能在一天內(nèi)就篩選到幾千種不同的變體。例如，使用微量滴定板的各個孔來進行分離分析，或者，如果要觀察濃度或培育時間的效果，每5-10個孔可以測試一種變體。除了液體方法以外，如上所述，有可能簡單地使細胞生長在培養(yǎng)基平板上，選擇期望的酶功能或代謝功能。這種方法提供了一種簡單和高通量的篩選方法。也已經(jīng)開發(fā)了許多眾所周知的機器人系統(tǒng)，用于分析系統(tǒng)中的溶液相化學。這些系統(tǒng)包括自動工作站，如TakedaChemicalIndustries有限公司(大阪，日本)開發(fā)的自動合成裝置和許多使用機械臂的機器人系統(tǒng)(ZymateII，Zymark公司，Hopkinton，MA；Orca，Hewlett-Packard，PaloAlto，加利福尼亞州)，該系統(tǒng)模擬科學家進行的人工合成操作。上述任一設(shè)備都適合在本發(fā)明中應(yīng)用。對這些裝置進行改動(如果有的話)，以使它們?nèi)绫疚乃鰠⒄占上到y(tǒng)進行操作，這些改動的性質(zhì)和實施對于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。高通量篩選系統(tǒng)可以購買得到(例如，參見Zymark公司，Hopkinton，MA；AirTechnicalIndustries，Mentor，OH；BeckmanInstruments公司.Fullerton，加利福尼亞州；PrecisionSystems公司，Natick，MA等)。這些系統(tǒng)通常自動操作整個過程，包括所有樣品和試劑的吸取、液體分散、定時培育和在適用于該分析的檢測器中對微滴定板進行最后讀數(shù)。這些可配置的系統(tǒng)提供了高通量和快速起始，以及高度的靈活性和用戶化。這類系統(tǒng)的制造商為各種高通量設(shè)備提供了詳細的方案。因此，例如，Zymark公司提供了描述用于檢測基因轉(zhuǎn)錄、配體結(jié)合等調(diào)節(jié)的篩選系統(tǒng)的技術(shù)手冊。CaliperTechnologies(MountainView，加利福尼亞州)也開發(fā)了試劑操作的微流體方法。在本文所述的實施方案中，還任選地用照相機或其它記錄設(shè)備(如光電二極管和數(shù)字存儲設(shè)備)觀察(以及任選地記錄)光學圖像，例如通過使圖像數(shù)字化和/或在計算機上存儲和分析該圖像?？墒褂酶鞣N可購買得到的外圍設(shè)備和軟件，使錄像或光學圖像數(shù)字化，并進行存儲和分析，如使用PC(Intel×86或者與奔騰芯片相容的DOSTM、OSTMWINDOWSTM、WINDOWSNTTM或者WINDOWS95TM為基礎(chǔ)的機器)、MACINTOSHTM或者UNIX為基礎(chǔ)的(如SUNTM工作站)計算機。一個常規(guī)系統(tǒng)將來自分析設(shè)備的光線傳送給本領(lǐng)域常用的冷卻的電荷耦合的裝置(CCD)的照相機。CCD照相機包括圖像元素的一個陣列(像素)。樣品的光線在CCD上成像。對應(yīng)于該樣品的各區(qū)域的具體的像素(如在生物聚合物的陣列上的單個雜交位點)被取樣，以獲得各位置上的光強度讀數(shù)。平行加工多個像素，以增加速度。不難采用本發(fā)明的裝置和方法來觀察任何樣品，例如通過熒光或暗視野顯微鏡技術(shù)來觀察樣。其它多核苷酸組合物本發(fā)明還包括一種組合物，其含有兩種或多種本發(fā)明的多核苷酸(如，作為重組底物)。這種組合物可以包含重組核酸文庫，該文庫含有至少2種、3種、5種、10種、20種或50種或更多種的多核苷酸。這些多核苷酸任選地被克隆入表達載體，提供表達文庫。本發(fā)明還包括用限制性內(nèi)切酶、RNA酶或DNA酶消化一種或多種本發(fā)明的多核苷酸而生成的組合物(例如，如以上述某些重組形式進行)；以及通過機械方法(如超聲、渦旋等)斷裂或剪切一個或多個本發(fā)明的多肽而產(chǎn)生的組合物，機械方法也可被用于提供在上述方法中用于重組的底物。類似地，含有若干組與本發(fā)明的一種以上的核酸相對應(yīng)的寡核苷酸的組合物可以被用作重組底物，并且是本發(fā)明的一個特點。為了簡便，這些斷裂的、剪切的、或寡核苷酸合成的混合物被稱為片段化的核酸組。本發(fā)明還包括在核糖核苷酸或脫氧核糖核苷三磷酸和核酸聚合酶存在時通過培養(yǎng)一種或多種片段化的核酸組而制得的組合物。所產(chǎn)生的組合物形成了可用于上述許多重組模式的重組混合物。核酸聚合酶可以是RNA聚合酶、DNA聚合酶或RNA-引導的DNA聚合酶(即“反轉(zhuǎn)錄酶”)；聚合酶可以是，例如，熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(如VENT、TAQ等)。集成系統(tǒng)本發(fā)明提供了計算機、計算機可讀介質(zhì)和含有與本文的多肽和核酸的序列信息相對應(yīng)的字符串的集成系統(tǒng)，所述序列例如包括這里列出的那些序列及其各種沉默取代和保守取代。例如，本領(lǐng)域已知的各種方法和遺傳算法(GA)可用來測定不同字符串之間的同源性或相似性，或者可用來完成其它所需的功能，比如控制輸出文件、提供用于呈現(xiàn)包括序列在內(nèi)的信息的基礎(chǔ)。其例子包括上述的BLAST。因此，在本文的集成系統(tǒng)中，可以檢測并識別具有各種嚴緊性和長度的不同類型的同源性和相似性。例如，為了比較分析生物多聚物的序列、在字處理中進行拼寫檢查以及為從各種數(shù)據(jù)庫中獲得數(shù)據(jù)，已經(jīng)設(shè)計了許多確定同源性的方法。隨著對天然多核苷酸中4個基礎(chǔ)核堿基之間雙螺旋互補配對反應(yīng)的了解，模擬互補同源多核苷酸鏈退火的模型，也可用作序列比對的基礎(chǔ)，或典型地針對與本文的序列相對應(yīng)的字符串進行的其他操作(如字處理操作、構(gòu)建含有序列或亞序列字符串的圖表、輸出表格等)的基礎(chǔ)。用于計算序列相似性的具有GA的軟件包的例子是BLAST，通過輸入與本文序列相對應(yīng)的字符串，BLAST可適用于本發(fā)明。類似地，通過輸入與本發(fā)明GAT同系物(核酸或蛋白質(zhì)，或這兩者)相對應(yīng)的字符串，可以使標準桌面應(yīng)用如字處理軟件(例如MicrosoftWordTM或CorelWordPerfectTM)和數(shù)據(jù)庫軟件(例如電子制表軟件如MicrosoftExcelTM、CorelQuattroProTM，或數(shù)據(jù)庫程序如MicrosoftAccessTM或ParadoxTM)適用于本發(fā)明。例如，此集成系統(tǒng)可以包括上述具有合適字符串信息的軟件，例如和用戶界面結(jié)合使用(如Windows、Macintosh或LINUX系統(tǒng)等標準操作系統(tǒng)中的GUI)，以處理字符串。值得注意的是，也可以將專門的序列比對程序如BLAST合并入本發(fā)明的系統(tǒng)用于核酸或蛋白質(zhì)(或相應(yīng)的字符串)的序列的比對。用于本發(fā)明分析的集成系統(tǒng)通常包括數(shù)字計算機、裝有序列對比GA軟件以及進入包含本文任何序列的軟件系統(tǒng)的數(shù)據(jù)組。計算機可以是，例如，PC(Intel×86或者與奔騰芯片相容的以DOSTM、OSTMWINDOWSTM、WINDOWSNTTM或者WINDOWS95TM為基礎(chǔ)的機器)、MACINTOSHTMPowerPC或者以UNIX(如SUNTM工作站)為基礎(chǔ)的機器或技術(shù)人員已知的其它商品化普通計算機。用于序列對比或其它處理序列的軟件是可以獲得的，或者可以由技術(shù)人員采用Visualbasic、Fortan、Basic、Java等標準編程語言進行編寫。任何控制器或計算機任選地包括一監(jiān)測器，它通常是陰極射線管(“CRT”)顯示器、平板顯示器(如活性基質(zhì)液晶顯示器、液晶顯示器)或其它設(shè)備。計算機線路通常被置于含有許多集成電路芯片如微處理器、儲存器、接口電路等的機箱中。機箱也任選地包括硬盤驅(qū)動器、光盤驅(qū)動器、高容量可移動驅(qū)動器如可寫CD-ROM和其它普通的外圍元件。鍵盤或鼠標等輸入設(shè)備可選地提供了用了由用戶輸入和用戶選擇作為比較或在有關(guān)計算機系統(tǒng)中進行其它處理的序列。計算機通常包括合適的接收用戶指令的軟件，它要么以用戶輸入一組參數(shù)字段的形式，如在GUI中，要么以預排程序的指令的形式，如為各種不同的特殊操作預排程序。然后，軟件將這些指令轉(zhuǎn)換成合適的語言，用于指導數(shù)據(jù)流方向的操作并讓控制器實施所需的操作。軟件還可以包括控制核酸合成(如基于本文序列或序列的對比)的輸出元件或其它在序列對比后進行的操作或其它采用本文序列相應(yīng)的字符串進行的操作。因此，核酸合成設(shè)備可以是本文的一種或多種集成系統(tǒng)的一個組件。其它方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的方法、組合物、系統(tǒng)和設(shè)備的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒任選地含有以下一種或多種：(1)本發(fā)明所述的設(shè)備、系統(tǒng)、系統(tǒng)組件或設(shè)備組件；(2)用于實施本發(fā)明所述方法，和/或操作本發(fā)明的裝置或裝置組件，和/或使用本發(fā)明組合物的說明書；(3)一種或多種GAT組合物或成分；(4)裝載各組分或組合物的容器；以及(5)包裝材料。在另一方面，本發(fā)明提供了任何本文的裝置、裝置組件、組合物或試劑盒，用于實施任何本文所述的方法或試驗的用途，和/或任何裝置或試劑盒在實施任何本文所述的分析或方法中的用途。宿主細胞和生物宿主細胞可以是真核的，例如真核細胞、植物細胞、動物細胞、原生質(zhì)體或者組織培養(yǎng)細胞。宿主細胞任選地含有多種細胞，例如生物體?；蛘?，宿主細胞可以是原核的，包括但不限于細菌(即革蘭陽性菌、紫色細菌、綠硫菌、綠色非硫菌、藍細菌、螺旋體、棲熱袍菌(thermatogale)、黃桿菌和類菌體)和古細菌(即Korarchaeota、熱變形桿菌(Thermoproteus)、熱網(wǎng)菌屬(Pyrodictium)、熱球菌屬(Thermococcales)、產(chǎn)甲烷菌、古生球菌屬(Archaeoglobus)和極端嗜鹽菌)。含有GAT核酸和/或表達本發(fā)明GAT多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞是本發(fā)明的一個特征。實際上，可以用植物分子生物學領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的各種方法進行植物細胞和原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，這些方法包括但不限于本文所描述的方法。通?？梢詤⒁奧u和Grossman編寫的MethodsinEnzymology，第153卷(RecombinantDNA第D部分)1987，學術(shù)出版社；以及Weising等人，Ann.Rev.Genet.22：421-477(1988)，在此引入作為參考。例如，將DNA構(gòu)建體直接導入植物細胞的基因組DNA中，采用如電穿孔、PEG介導的轉(zhuǎn)化、粒子轟擊、硅纖維呈遞或者顯微注射植物細胞原生質(zhì)體或胚發(fā)生愈傷組織的方法。參見，例如Tome等人(1995)“通過顯微投影轟擊將DNA轉(zhuǎn)移到完整的植物細胞中”，在Gamborg和Philips編輯的Plantcell，TissueandOrganCulture，F(xiàn)undamentalMethods(Springer-Verlag，柏林)，第197-213頁中。用于轉(zhuǎn)化各種宿主細胞的其他方法被公開在Klein等人(1992)“通過粒子轟擊進行的微生物、植物和動物的轉(zhuǎn)化”Bio/Technol.10(3)：286-291.用聚乙二醇沉淀來導入DNA構(gòu)建體被描述在Paszkowski等人(1984)EMBOJ.3：2717-2722中。電穿孔技術(shù)被描述在Fromm等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：5824中。彈道轉(zhuǎn)化技術(shù)描述在Klein等人(1987)Nature327：70-73中。此外，可以將DNA構(gòu)建體與適當?shù)腡-DNA側(cè)翼區(qū)組合，并且導入到常規(guī)的根癌農(nóng)桿菌宿主載體中。當用細菌感染細胞時，根癌農(nóng)桿菌宿主毒力功能將引導構(gòu)建體與相鄰標記插入到植物細胞DNA中。參加美國專利5,591,616。已經(jīng)在科技文獻中充分地描述了根癌農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化技術(shù)。參見，例如Horsch等人(1984)Science233：496-498，以及Fraley等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80：4803。例如，在美國專利5,550,318和5,981,840中描述了用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米。其他的轉(zhuǎn)化方法包括(1)毛根農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化(參見，例如Lichtenstein和Fuller的GeneticEngineering，第6卷，PWJRigby編輯，倫敦，學院出版社，1987；Lichtenstein，C.P.和Draper，J，DNACloning，第II卷，D.M.Glover編輯，牛津，IRI出版社，1985；WO88/02405描述了毛根農(nóng)桿菌菌株A4及其Ri質(zhì)粒以及根癌農(nóng)桿菌載體pARC8或pArC16的用途)；(2)脂質(zhì)體介導的DNA攝取(參見，例如Freeman等人(1984)PlantCellPhysiol.25：1353；(3)旋渦方法(參見，例如Kindle(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1228。還可以如Zhou等人(1983)MethodsinEnzymology101：433；D.Hess(1987)InternRev.Cytol.107：367和Luo等人(1988)PlantMol.Biol.Reporter6：165中所描述，通過將DNA轉(zhuǎn)移到花粉中，將DNA導入到植物中?？梢匀鏟ena等人(1987)Nature325：274中所描述，將DNA注射到植物的繁殖器官中，來獲得對多肽編碼核酸的編碼。如Neuhaus等人(1987)Theor.Appl.Genet.75：30以及Benbrook等人(1986)在ProceedingsBioExpo1986，Butterworth，Stoneham，Mass.第27-54頁中描述，將DNA直接注射到未成熟的胚胎的細胞中，再水合干燥胚胎。動物和低等真核生物(例如酵母)的宿主細胞能夠轉(zhuǎn)化或者被恢復為能夠通過各種方法來轉(zhuǎn)化。有多種將DNA導入動物細胞中的公知方法。這些方法包括：磷酸鈣沉淀；受體細胞與含有DNA的細菌原生質(zhì)體的融合；用含有DNA的脂質(zhì)體處理受體細胞；DEAE葡聚糖；電穿孔；生物導彈轟擊法(biolistics)；以及將DNA直接顯微注射到細胞中。用本領(lǐng)域熟知的方法來培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的細胞。參見Kuchler，R.J.(1977)BiochemicalMethodsinCellCultureandVirology(Dowden，Hutchinson和Ross公司)。當用于本文時，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指通過引入核酸序列，如“異源”或“外源”核酸序列，來改變宿主植株的基因型。異源核酸序列不一定來自不同的來源，但有些時候來自其將導入的細胞之外。除了Berger、Ausubel和Sambrook之外，用于植物細胞克隆、培養(yǎng)和再生的一般性參考文獻包括：Jones編輯(1995)PlantGeneTransferandExpressionProtocols-MethodsinMolecularBiology第49卷(Humana出版社，Towata，新澤西州)；Payne等人(1992)，PlantCellandTissueCultureinLiquidSystems(JohnWiley&Sons公司，紐約，紐約州)(″Payne″)；和Gamborg和Philips編輯(1995)，PlantCell，TissueandOrganCulture；FundamentalMethods/SpringeLabManual，(Springer-Verlag，柏林)(“Gamborg”)。在以下文獻中描述了各種細胞培養(yǎng)基：Atlas和Parks(編輯)HandbookofMicrobiologicalMedia(CRC出版社，BocaRaton，佛羅里達州)(“Atlas”)。植物細胞培養(yǎng)的其它信息可從商業(yè)文獻中獲得，如來自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密蘇里州)的LifeScienceResearchCellCultureCatalogue(1998)(Sigma-LSRCCC)，以及得自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密蘇里州)的PlantCultureCatalogue增刊(1997)(Sigm-PCCS)。其它有關(guān)植物細胞培養(yǎng)的細節(jié)可以在Croy編輯(1993)PlantMolecularBiology(BiosScientific出版社，牛津，英國)中找到。在本發(fā)明的實施方案中，制備了適合植物細胞轉(zhuǎn)化的含有一種或多種GAT多核苷酸的重組載體。編碼期望的GAT多肽的DNA序列可方便地用來構(gòu)建可以被引入期望的植物中的重組表達盒，所述DNA序列選自SEQIDNO：516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、947、949、951和952。在本發(fā)明文中，此表達盒通常包括可操作地連接到啟動子序列的所選擇的GAT多核苷酸和其它轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)控序列，其中調(diào)控序列足以引導GAT序列在被轉(zhuǎn)化植物的特定組織(如整個植株、葉、根等)中的轉(zhuǎn)錄。許多啟動子可以被用于實施本發(fā)明?？梢愿鶕?jù)期望的結(jié)果來選擇啟動子。也就是說，核酸可以與組成型的、組織特異性的或者其他的啟動子結(jié)合，用于在植物中進行表達。組成型啟動子包括，例如Rsyn7和在WO99/43838和美國專利6,072,050中描述的其他組成型啟動子的核心啟動子；核心CaMV35S啟動子(Odell等人(1985)Nature313：810-812)；水稻actin(McElroy等人(1990)PlantCell2：163-171)；泛素(Christensen等人(1989)PlantMol.Biol.12：619-632以及Christensen等人(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBOJ.3：2723-2730)；ALS啟動子(美國專利5,659,026)等。其他的組成型啟動子包括，例如在美國專利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142和6,177,611中公開的那些啟動子。可用化學調(diào)控型啟動子來通過使用外源性的化學調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)基因在植物中的表達。根據(jù)目的不同，啟動子可以是化學誘導型啟動子，使用化學藥品來誘導基因表達，或者可以是化學抑制性啟動子，使用化學藥品來抑制基因表達?；瘜W誘導型啟動子在本領(lǐng)域是已知的，包括，但是不限于，玉米In2-2啟動子，其被苯磺胺除草劑安全劑激活；玉米GST啟動子，其被用作發(fā)芽前的除草劑的疏水性親電子化合物所激活；煙草PR-1a啟動子，其被水楊酸激活。感興趣的其他化學調(diào)控啟動子包括類固醇響應(yīng)性啟動子。參見，例如，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425的McNellis等人(1998)PlantJ.14(2)：247-257中描述的糖皮質(zhì)激素誘導型啟動子，以及四環(huán)素誘導型和四環(huán)素抑制型啟動子，例如Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美國專利5,814,618和5,789,156，在此引入作為參考。還可以用組織優(yōu)選的啟動子來將GAT表達靶向于特定的植物組織中。組織優(yōu)選的啟動子包括在Yamamoto等人(1997)PlantJ12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)PlantCellPhysiol.3(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.GenGenet，254(3)：337-343；Russell等人(1997)TransgenicRes.6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)PlantPhysiol.112(3)：1331-1341；VanCamp等人(1996)PlantPhysiol.112(2)：525-535；Canevascini等人(1996)PlantPhysiol，112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)PlantCellPhysiol.35(5)：773-778；Lam(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20：181-196；Orozco等人，(1993)PlantMolBiol，23(6)：112-1138；Matsuoka等人(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590；以及Guevara-Garcia等人(1993)PlantJ4(3)：495-505中公開的那些啟動子。如果需要，可以修飾這種啟動子，來進行弱表達。葉子特異性的啟動子在本領(lǐng)域中是已知的。參見，例如Yamamoto等人(1997)PlantJ.12(2)：255-265；Kwon等人(1994)PlantPhysiol.105：357-67；Yamamoto等人(1994)PlantCellPhysiol.35(5)：773-778；Gotor等人(1993)PlantJ3：509-18；Orozco等人(1993)PlantMol，Biol，23(6)：1129-1138；和Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590。根的優(yōu)選啟動子是已知的，可從許多可獲得的文獻中選擇或者重新從各種相容的物種中分離得到。參見，例如Hire等人(1992)PlantMol.Biol.20(2)：20-218(大豆根特異性谷氨酸鹽合成酶基因)；Keller等人(1991)PlantCell3(10)：1051-1061(法國菜豆GRP1.8基因中的根特異性調(diào)控元件)；Sanger等人(1990)PlantMol，Biol.14(3)：433-443(根癌農(nóng)桿菌的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；以及Miao等人(1991)PlantCell3(1)：11-22(編碼胞質(zhì)谷氨酸鹽合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆的根和根節(jié)結(jié)中表達)。還可以參見Bogusz等人(1990)PlantCell2(7)：633-641，其中公開兩種從固氮的非豆科類Parasponiaandersonii和相關(guān)的非固氮的非豆科類Trematomentosa的血色素基因中分離得到的根特異性啟動子。將這些基因的啟動子連接到β-葡萄糖苷酸酶報導基因上，導入非豆科類煙草(Nicotianatabacum)和豆科Lotuscorniculatus中，在這兩種情形下，保留了根特異性啟動子活性。Leach等人(1991)描述了他們對高度表達毛根農(nóng)桿菌的rolC和rolD根誘導型基因的啟動子的分析(參見PlantScience(Limerick)79(1)：69-76)。他們的結(jié)論是，在這些啟動子中，增強子和組織優(yōu)選的DNA決定簇是相互分離的。Teeri等人(1989)EMBOJ.8(2)：343-350使用融合到lacZ上的基因融合物，證明編碼章魚堿合酶的農(nóng)桿菌T-DNA基因在根尖表皮尤其活躍，在完整的植株中，TR2′基因是根特異性的，由葉肉組織中的創(chuàng)傷刺激，在與殺蟲基因或殺幼蟲基因一起使用時，這是特別期望的特征的組合。融合到nptII(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)上的TR1′基因具有相似的特征。其他的根優(yōu)選的啟動子包括VfENOD-GRP3基因啟動子(Kuster等人(1995)PlantMol.Biol.29(4)：759-772)；ZRP2啟動子(美國專利5,633,636)；IFS1啟動子(美國專利申請10/104,706)和rolB啟動子(Capana等人(1994)PlantMol.Biol.25(4)：681-691)。還參見美國專利5,837,876；5,750,386；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179?！胺N子優(yōu)選的”啟動子包括“種子特異性”啟動子(在種子發(fā)育過程中具有活性的那些啟動子，例如種子存儲蛋白的啟動子)，以及“種子萌發(fā)的”啟動子(在種子萌發(fā)過程中具有活性的啟動子)。參見Thompson等人(1989)BioEssays10：108，在此引入作為參考。這種種子優(yōu)選的啟動子包括，但是不限于，Ciml(細胞分裂素誘導的信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)；milps(myo-肌糖-1-磷酸合酶)；以及celA(纖維素合酶)(參見美國專利6,225,529，在此引入作為參考)。玉米蛋白γ是一種胚乳特異性啟動子。Glob-1是胚胎特異性啟動子。對于雙子葉植物來說，種子特異性啟動子包括，但是不限于，大豆β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、cruciferin等。對于單子葉植物來說，種子特異性啟動子包括，但是不限于，玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、waxy、shrunken1、shrunken2、球蛋白1等。還可以參見WO00/12733，其公開了來自end1和end2基因的種子優(yōu)選啟動子；在此引入作為參考。特別地，可以使用引導GAT核酸在植物的所有組織中表達的強或者弱的組成型植物啟動子。在大多數(shù)環(huán)境條件下和發(fā)育或者細胞分化的狀態(tài)下，這種啟動子是有活性的。除了上面提及的啟動子外，組成型啟動子的例子包括根瘤農(nóng)桿菌的1’-或2’-啟動子，來自各種植物基因的其他轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是技術(shù)人員已知的。當本發(fā)明的GAT多肽的過度表達對植物有害時，技術(shù)人員將認識到可以使用弱的組成型啟動子來進行低水平表達。總之，所述“弱啟動子”是指以低水平驅(qū)使編碼序列的表達的啟動子。“低水平”是指水平為每個細胞從約1/1000轉(zhuǎn)錄本到約1/100,000轉(zhuǎn)錄本，到約低至1/500,000轉(zhuǎn)錄本。此外，應(yīng)當認識到，弱啟動子還包括僅在少數(shù)細胞中被表達而不在其他細胞中表達的啟動子，產(chǎn)生總體的低水平表達。當啟動子以不可接受的高水平表達時，可以刪除或修飾啟動子序列部分，來降低表達水平。當高水平表達對植物無害時，可以使用強啟動子，如t-RNA或其它polIII啟動子，或強polII啟動子(如花椰菜花葉病毒啟動子、CaMV、35S啟動子)?；蛘?，植物啟動子可以處于環(huán)境控制之下。這種啟動子被稱為“誘導型”啟動子。可能通過誘導型啟動子改變轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括病原體攻擊、厭氧條件或光照的存在。在某些情況下，需要使用“組織特異的”和/或處于發(fā)育控制之下的啟動子，這樣GAT多核苷酸只在某些組織或其發(fā)育階段，如葉、根和芽等中表達。與除草劑耐受性相關(guān)的基因的內(nèi)源啟動子和相關(guān)的表型對于驅(qū)動GAT核酸的表達特別有用，例如P450單加氧酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、同型谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、草甘膦氧化還原酶和5-烯醇丙酮酰莽草酸鹽-2-磷酸合酶。也可用組織特異性啟動子來引導異源結(jié)構(gòu)基因，包括本文所述GAT多核苷酸的表達。因此，這種啟動子可用于重組表達盒中，驅(qū)動期望在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物中表達的任何基因的表達，例如GAT和/或其它賦予除草劑抗性或耐受性的基因，影響其它有用特征(如雜種優(yōu)勢)的基因。類似地，如來自5’調(diào)控序列或異源基因內(nèi)含子的增強子元件，也可用來改善異源性結(jié)構(gòu)基因，如GAT多核苷酸的表達?？傊?，用于植物表達盒中的特定啟動子取決于特定應(yīng)用。能在植物細胞中引導轉(zhuǎn)錄的大量啟動子的任何一種都是合適的。啟動子可以是組成型或誘導型的。除了上述啟動子，可在植物中起作用的細菌來源的啟動子包括章魚堿合酶啟動子、胭脂堿合酶啟動子和其它來源于Ti質(zhì)粒的啟動子。參見Herrera-Estrella等人(1993)Nature303：209。病毒啟動子包括CaMV的35S和19SRNA啟動子。參見Odell等人(1985)Nature313：810-812。其它的植物啟動子包括核酮糖-1，3-二磷酸羧化酶小亞基啟動子和菜豆蛋白啟動子。也可以使用來自E8基因(參見Deikman和Fischer(1988)EMBOJ.7：3315)和其它基因的啟動子序列。還考慮了對單子葉植物種類特異的啟動子(McElroy和Brettell(1994)“Foreigngeneexpressionintransgeniccereals”TrendsBiotech.12：62-68)?；蛘?，采用本領(lǐng)域已知的方法，包括序列分析、增強子或啟動子捕獲等，可以從任何的病毒、細菌或植物來源中鑒定出具有有用特征的新啟動子。在制備本發(fā)明的表達載體時，也可以使用除啟動子和GAT編碼基因以外的序列。如果期望合適的多肽表達，聚腺苷酸化區(qū)域可來源于天然基因、各種其它植物基因或T-DNA。也可以使用信號/定位肽，這些肽例如能促進被表達的多肽轉(zhuǎn)運進入內(nèi)部細胞器(如葉綠體)或進行胞外分泌。含有GAT多核苷酸的載體還可以包括賦予植物細胞以可選擇表型的標記基因。例如，這種標記可以編碼抗微生物劑耐受性、特定的抗生素耐受性，如對卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素的耐受性，或除草劑耐受性，例如對氯磺隆(chlorosulfuron)或者膦絲菌素的耐受性?？梢允褂脠蟾婊?，通過可視化反應(yīng)產(chǎn)物(如β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)或通過直接可視化基因產(chǎn)物自身(如綠熒光蛋白、GFP；Sheen等(1995)ThePlantJournal8：777)，來監(jiān)測基因表達和蛋白質(zhì)定位，用于例如監(jiān)測植物細胞中的瞬時基因表達。例如，在篩選具有除草劑耐受性活性的植物細胞培養(yǎng)物時，可以將瞬時表達系統(tǒng)應(yīng)用于植物細胞。植物轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體在本領(lǐng)域中可利用許多用于建立各種植物種類的可轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體以及隨后轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的原生質(zhì)體的方法，在此引入作為參考。例如參見Hashimoto等人(1990)PlantPhysiol.93：857；Fowke和Constabel(編輯)(1994)PlantProtoplasts；Saunders等人(1993)ApplicaiontofPlantInVitroTechnologysymposium，UPM16-18；以及Lyznik等人(1991)BioTechniques10：295，在此引入作為參考。葉綠體葉綠體是一些除草劑耐受性活性的作用部位，在一些情況下，可將GAT多核苷酸融合到葉綠體轉(zhuǎn)運序列肽上，以便將基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到葉綠體中。在這些情況下，可有利地將GAT多核苷酸轉(zhuǎn)化到植物宿主細胞的葉綠體中。在本領(lǐng)域中有許多方法可實現(xiàn)葉綠體的轉(zhuǎn)化和表達(例如可參見Daniell等人(1998)，NatureBiotech16：346；O’Neill等人(1993)，ThePlantJournal3：729；Maliga(1993)，TIBTECH11：1)。此表達構(gòu)建體含有在植物中起作用的可操作地連接到編碼GAT多肽的多核苷酸上的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。設(shè)計用于在葉綠體中起作用的表達盒(如含有GAT多核苷酸的表達盒)使其包含確保在葉綠體中進行表達所需的序列。通常，此編碼序列的兩側(cè)是葉綠體基因組的兩個同源區(qū)域，以進行與葉綠體基因組的同源重組；可選擇的標記基因還常常出現(xiàn)在側(cè)面連接的質(zhì)粒DNA序列中，以便在所生成的轉(zhuǎn)原生質(zhì)體(transplastonic)植物細胞中選擇遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化葉綠體(例如，可參見Maliga(1993)和Daniell(1998)，及其引用的參考文獻)。通用的轉(zhuǎn)化方法可采用各種常規(guī)的技術(shù)，將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體導入期望的植物宿主的基因組中。用于轉(zhuǎn)化各種高等植物物種的技術(shù)是熟知的，并在科技文獻中有描述。參見，例如Payne、Gamborg、Croy、Jones等，皆同上文，以及如Weising等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：421以及美國專利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931，在此引入作為參考。各種其他的轉(zhuǎn)化方法也包括在本發(fā)明中。轉(zhuǎn)化操作以及用于將核苷酸序列導入到植物中的操作可能根據(jù)用于轉(zhuǎn)化的植物或植物細胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)而改變。適合將核苷酸序列導入植物細胞中并接著插入到植物基因組中的方法包括顯微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques4：320-334)、電穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606)、農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化(美國專利5,563,055和5,981,840)、直接的基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人(1984)EMBOJ.3：2717-2722)和彈道粒子加速(參見，例如美國專利4,945,050；美國專利5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes等人(1995)“通過顯微注射轟擊直接將DNA轉(zhuǎn)移到完整的植物細胞中”，PlantCell，Tissue，andOrganCulture：FundamentalMethods，Gamborg和Phillips編輯(Springer-Verlag，柏林)；McCabe等人(1988)Biotechnology6：923-926)；以及Lecl轉(zhuǎn)化(WO00/28058)。還可以參見Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet22：421-477；Sanford等人(1987)ParticulateScienceandTechnology5：27-37(洋蔥)；Christou等人(1988)PlantPhysiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)BiolTechnology6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)InvitroCellDev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology8：736-740(水稻)；Klein等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology6：559-563(玉米)；美國專利5,240,855；5,322,783；5,324,646；Klein等人(1988)PlantPhysiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology8：833-839(玉米)；Hooykass-VanSlogteren等人(1984)Nature(倫敦)311：763-764；美國專利5,736,369(谷)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(百合)；DeWet等人(1985)TheExperimentalManipulationofOvuleTissue，Chapman等人編輯(Longman，紐約)，197-209(花粉)；Kaeppler等人(1990)PlantCellReports9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(根須介導的轉(zhuǎn)化)；D’Halluiin等人(1992)PlantCell4：1495-1505(電穿孔)；Li等人(1993)PlantCellReports12：250-255和Christon和Ford(1995)AnnalsofBotany75：407-413(水稻)；Osjoda等人(1996)NatureBiotechnology14：745-750(通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的玉米)，全部在此引入作為參考。例如，可采用電穿孔和顯微注射植物細胞原生質(zhì)體而將DNA直接導入植物細胞的基因組DNA中，或者可使用彈道法，如DNA微粒轟擊來將DNA構(gòu)建體直接導入植物組織中。或者，可使該DNA構(gòu)建體與合適的T-DNA側(cè)翼區(qū)域組合，然后一起導入常規(guī)的根癌農(nóng)桿菌宿主載體中。當用該細菌感染細胞時，農(nóng)桿菌宿主的毒力功能將指導該構(gòu)建體和相鄰標記插入到植物細胞的DNA中。顯微注射技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并且在科學和專利文獻中有很好的描述。Paszkowski等人(1984)MEBOJ3：2717中描述了使用聚乙二醇沉淀導入DNA構(gòu)建體。Fromm等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：5824中描述了電穿孔技術(shù)。Klein等人(1987)Nature327：70和Week等人(1993)PlantPhysiol102：1077描述了彈道轉(zhuǎn)化技術(shù)。在一些實施方案中，采用農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化技術(shù)，將本發(fā)明的GAT序列轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)基因植物中。農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化廣泛地用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化，但是，某些單子葉植物也可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。例如，以下文獻描述了稻米的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：Hiei等人(1994)PlantJ.6：271；美國專利5187073；美國專利5,591,616；Li等人(1991)ScienceinChina34：54；和Raineri等人(1990)Bio/Technology8：33。此外，用農(nóng)桿菌感染轉(zhuǎn)化玉米、大麥、黑小麥和蘆筍也被描述(Xu等人(1990)ChineseJBot2：81)。農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化技術(shù)利用根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(Ti)性質(zhì)粒整合到植物細胞基因組中的能力，將感興趣的核酸共轉(zhuǎn)染到植物細胞中。通常，制備一種表達載體，其中感興趣的核酸，如本發(fā)明的GAT多核苷酸被連接到自主復制的質(zhì)粒上，該質(zhì)粒還含有T-DNA序列。T-DNA序列通常位于感興趣的表達盒核酸的側(cè)面，并含有該質(zhì)粒的整合序列。除了該表達盒外，T-DNA通常還含有標記序列，如抗生素抗性基因。然后將具有T-DNA和此表達盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到根癌農(nóng)桿菌細胞中。通常，為了有效地轉(zhuǎn)化植物細胞，根癌農(nóng)桿菌在質(zhì)粒上含有必需的vir區(qū)域，或者使該區(qū)域整合進染色體中。關(guān)于根癌農(nóng)桿菌的討論，可參見Firoozabady和Kuehnle，(1995)PlantCellTissueandOrganCultureFundamentalMethods，Gamborg和Phillips(編輯)。在一些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸增加了感興趣的多核苷酸序列的任何組合，以生成具有期望表型的植物。例如，本發(fā)明的多核苷酸添加了任何其他的編碼具有殺蟲的和/或殺蟲活性的多肽的多核苷酸，例如蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白(在美國專利5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene48：109中描述)、凝集素(VanDamme等人(1994)PlantMol.Biol.24：825、pentin(在美國專利5,981,722中描述)等。產(chǎn)生的組合還可以包括多拷貝的感興趣的多核苷酸的任何之一。本發(fā)明的多核苷酸還可以添加任何其他基因或者基因的組合，產(chǎn)生具有多種期望特性組合的植物，這些特性包括，但是不限于，期望的用于動物飼養(yǎng)的特性，例如高脂肪基因(例如，美國專利6,232,529)；平衡氨基酸(例如hordothionin(美國專利5,990,389；5,885,801；5,885,802和5,703,409)；大麥高賴氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO98/20122)和高甲硫氨酸的蛋白質(zhì)(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene71：359；和Musumura等人(1989)PlantMol.Biol.12：123))；提高的消化性(例如，修飾的存儲蛋白(2001年11月7日申請的美國專利申請10/053,410)；和硫氧還蛋白(2001年12月3日申請的美國專利申請10/005,429))；該專利的公開在此引入作為參考。本發(fā)明的多核苷酸還可以添加所期望的用于疾病或者除草劑抗性的特性(例如，串珠鐮孢菌素解毒基因(美國專利5,792,931)；毒性和疾病抗性基因(Jones等人(1994)Science266：789；Martin等人(1993)Science262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell78：1089)；會產(chǎn)生對除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體例如S4和/或Hra突變體；谷氨酰胺合酶抑制劑例如草酊磷(phosphinothricin)或者basta(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；和用于處理產(chǎn)品期望的特性如高油(例如美國專利6,232,529)；改良的油(例如脂肪酸飽和酶基因(美國專利5,952,544；WO94/11516))；修飾的淀粉(例如ADPG焦磷酸酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE))；和聚合體或者原生質(zhì)體(例如，美國專利5.602,321；β-酮硫解酶、多聚羥基丁酸鹽合酶和乙酰CoA還原酶(Schubert等人(1988)JBacteriol.170：5837-5847)，便于多羥基鏈烷酸鹽(PHAs)的表達)；它們的公開在此引入作為參考。還可以將本發(fā)明的多核苷酸與提供農(nóng)業(yè)特性的多核苷酸組合，如雄性不育(例如，參見美國專利5,583,210)、莖桿強度、開花時間，或者轉(zhuǎn)化技術(shù)特性例如細胞周期調(diào)控或者基因打靶(例如，WO99/61619，WO00/17364和WO99/25821)；其公開在此引入作為參考?？梢酝ㄟ^任何方法來產(chǎn)生這些累積的組合，包括但是不限于，通過任何常規(guī)或者TopCross方法，或者遺傳轉(zhuǎn)化來雜交植物。如果通過遺傳轉(zhuǎn)化植物來累積特性，可以在任何時間和以任何順序來組合感興趣的多核苷酸序列。例如，包含一種或多種期望特性的轉(zhuǎn)基因植物被用作目標，通過隨后的轉(zhuǎn)化引入另一種特性?？梢栽诠厕D(zhuǎn)化操作中，與由任何轉(zhuǎn)化表達盒的組合提供的任何感興趣的多核苷酸一起引入該特性。例如，如果導入兩條序列，可以將兩條序列包含在分開的轉(zhuǎn)化表達盒(反式)或者包含有在同一轉(zhuǎn)化表達盒(順式)中。通過相同的啟動子或者通過不同的啟動子來驅(qū)動序列的表達。在某些情形下，期望導入一種轉(zhuǎn)化表達盒，其抑制感興趣的核苷酸的表達。這可以與任何的其他抑制表達盒或者過度表達盒的組合一起組合，在植物中產(chǎn)生期望的特性組合。還應(yīng)當認識到，可以采用點特異性重組系統(tǒng)，在期望的基因組位置上累積該多核苷酸序列。參見，例如W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855和W099/25853，它們均在此引入作為參考。轉(zhuǎn)基因植物的再生可以培養(yǎng)通過植物轉(zhuǎn)化技術(shù)(包括上面討論的那些)得到的轉(zhuǎn)化植物細胞，以至產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)化的基因型(即GAT多核苷酸)從而具有期望表型(如所需的對草甘膦或草甘膦類似物的抗性(即耐受性))的完整植物。這種再生技術(shù)依賴于操縱組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中的某種植物激素，通常依賴于已與所需的核苷酸序列一起導入的殺生物劑和/或除草劑標記物。對于玉米的轉(zhuǎn)化和再生，參見Gordon-Kamm等人，ThePlantCell，2：603-618(1990)?；蛘?，可以對本發(fā)明GAT多核苷酸賦予的對草甘膦抗性進行選擇。由培養(yǎng)原生質(zhì)體再生植物被描述在Evans等人(1983)ProtoplastsIsolationandCulture，HandbookofPlantCellCulture，第124-176頁，Macmillian出版公司，紐約；和Binding(1985)RegenerationofPlants，PlantProtoplasts，第21-73頁，CRC出版社，BocaRaton。還可從植物愈傷組織、外植體、器官或其部分中獲得再生。這些再生技術(shù)被一般性地描述在Klee等人(1987)Ann.Rev.ofPlantPhys38：467中。還可參見Payne和Gamborg。將轉(zhuǎn)化的植物細胞、愈傷組織(calli)或者外植體培養(yǎng)在再生培養(yǎng)基中，在黑暗中數(shù)周，通常約1-3周，使體細胞胚成熟。優(yōu)選的再生培養(yǎng)基包括含有MS鹽的培養(yǎng)基。然后，在光照/黑暗循環(huán)中，將植物細胞、愈傷組織(calli)或者外植體培養(yǎng)在生根培養(yǎng)基中，直到發(fā)育成幼芽和根。用于植物再生的方法在本領(lǐng)域是已知的，優(yōu)選方法提供在Kamo等人(Bot.Gaz.146(3)：324-334，1985)；West等人(ThePlantCell5：1361-1369，1993)和Duncan等人(Planta165：322-332，1985)。然后，將小的植物幼芽轉(zhuǎn)移到含有生根培養(yǎng)基的試管中，再生長約1周和發(fā)育出更多的根。然后，將該植物轉(zhuǎn)移到溫室的盆中的土壤混合物中。可以如Horsch等人Science，227：1229-1231(1985)和Fraley等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803(1983)所描述，來實現(xiàn)再生含有通過農(nóng)桿菌導入的外源基因的植物。這種方法通常在2-4周內(nèi)生成幼芽，然后，將這些轉(zhuǎn)化體幼芽轉(zhuǎn)移到合適的誘導根的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有可選擇試劑和抗生素，以防止細菌生長。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是能夠繁育的或者不育的。還可以由愈傷組織、外植體、器官或其部分實現(xiàn)再生。這種再生技術(shù)通常被描述在Klee等人，Arasz.Rev.ofPlantPhys.38：467-486(1987)中。從簡單的植物原生質(zhì)體或者各種外植體再生植物是本領(lǐng)域已知的。參見，例如MethodsforPlantMolecularBiology，A.Weissbach和H.Weissbach編輯，學院出版社公司，圣地亞哥，加利福尼亞州(1988)。對于玉米細胞的培養(yǎng)和再生，通常參見，TheMaizeHandbook，F(xiàn)reeling和Walbot編輯，Springer，紐約(1994)；CornandCornImprovement，第3版，Sprague和Dudley編輯，AmericanSocietyofAgronomy，麥迪遜，成斯康星州(1988)。在用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后，將外植體轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中。技術(shù)人員將認識到，選擇培養(yǎng)基的選擇依賴于被共轉(zhuǎn)染到該外植體中的可選擇標記。經(jīng)過適當長的時間后，轉(zhuǎn)化子將開始形成幼芽。在幼芽長約1-2厘米后，將其轉(zhuǎn)移到合適的根和幼芽培養(yǎng)基中。應(yīng)該在根和幼芽培養(yǎng)基中維持選擇壓力。通常，在1周到約2周中，轉(zhuǎn)化子長出根并形成小植株。在小植株高約3-5厘米后，可將它們外植在纖維罐(fiberpot)中的無菌土壤中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，應(yīng)使用不同的氣候環(huán)境以獲得不同的的轉(zhuǎn)化植物。例如，在生成根和幼芽后，將轉(zhuǎn)化植物的切片以及體細胞胚轉(zhuǎn)移到用于建立小植株的培養(yǎng)基中。關(guān)于轉(zhuǎn)化植物的選擇和再生的描述，可參見Dodds和Roberts(1995)ExperimentsinPlantTissueCulture，第3版，劍橋大學出版社。還有采用真空滲濾(BechtoldN.，EllisJ.和PelletierG.，1993，InplantaAgrobacteriummediatedgenetransferbyinfiltrationofadultArabidopsisthalianaplants.CRAcadSciParisLifeSci316：1194-1199)和簡單浸漬開花植物(Desfeux，C.，CloughS.J.和BentA.F.，2000，F(xiàn)emalereproductivetissuearetheprimarytargetofAgrobacterium-mediatedtransformationbytheArabidopsisfloral-dipmethod.PlantPhysiol.123：895-904)進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥屬的方法。采用這些方法，無需組織培養(yǎng)就可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子。對于一些植物品種，還未研究出有效的農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法。例如，對于一些最有經(jīng)濟價值的棉花品種，還未見報道與再生的轉(zhuǎn)化組織偶聯(lián)來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物成功的組織轉(zhuǎn)化。然而，可用于這些植物的方法包括通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化穩(wěn)定地將多核苷酸引入有關(guān)植物品種中，確認可操作性，然后用標準有性雜交或回交技術(shù)，將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到期望的經(jīng)濟作物品種中。例如，如果是棉花，可以用農(nóng)桿菌來轉(zhuǎn)化陸地棉(Gossypiumhirustum)的Coker品系(如Coker品系310，312，5110Deltapine61或Stoneville213)，然后通過回交，將轉(zhuǎn)基因引入其它更具經(jīng)濟價值的陸地棉品種中。可以從基因型或表型上來表征本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，來確定存在本發(fā)明GAT多核苷酸?？梢杂萌魏我环N熟知的技術(shù)進行基因型分析，包括對基因組DNA的PCR擴增以及將基因組DNA與特異性標記的探針雜交。表型分析包括，例如，暴露在一種經(jīng)過選擇的除草劑(如草甘膦)中的植物或植物組織的存活力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到，在將含有GAT基因的表達盒穩(wěn)定地整合到轉(zhuǎn)基因植物中并且被證實是可操作的之后，可以通過有性雜交導入到其他植物中。可以采用大量的標準繁育技術(shù)的任何一種，這取決于將要雜交的種類。在生長傳代的農(nóng)作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物通過收割或者組織培養(yǎng)技術(shù)來繁育，生成多個相同的植物。選擇期望的轉(zhuǎn)基因植物，獲得新品種，通過生長繁育用于商業(yè)目的。在種子繁育的農(nóng)作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物進行自交，生成純合的純種植物。這些純種植物生成含有新導入的異源核酸的種子。種植這些種子，生成將會產(chǎn)生所選擇的表型的植物。從再生植物上獲得的部分，例如花、種子、葉子、枝條、果實等包括在本發(fā)明中，只要這些部分包含含有分離的GAT核酸的細胞。再生植物的后代和變體以及突變體也包括在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，條件是這些部分包括導入的核酸序列。通過標準的免疫印跡和DNA檢測技術(shù)，針對對GAT核酸的傳播篩選表達可選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物。通常還在異源核酸的表達水平上，對轉(zhuǎn)基因品系進行評價。首先在RNA水平上確定表達以鑒定和量化陽性表達植物。采用用于RNA分析的標準技術(shù)，包括使用被設(shè)計來僅擴增異源RNA模板的寡核苷酸引物的PCR擴增分析和使用異源核酸特異探針的溶液雜交分析。然后，使用本發(fā)明的特異性反應(yīng)抗體，通過Western印跡分析來分析RNA陽性植物的蛋白質(zhì)表達。此外，分別使用異源核酸特異的多核苷酸探針和抗體，進行按照標準操作的原位雜交和免疫細胞化學，從而在轉(zhuǎn)基因組織內(nèi)定位表達部位。通常，對大量轉(zhuǎn)基因品系中的插入核酸進行篩選，來鑒定和選擇具有最合適的表達模式的植物。優(yōu)選的實施方案是與所添加的異源核酸純合的轉(zhuǎn)基因植物；即含有兩條所添加的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物，在染色體對的各個染色體的相同基因座上各有一個基因?？梢酝ㄟ^有性雜交(自交)和那樣單一的添加的異源核酸的雜合轉(zhuǎn)基因植物來獲得純合的轉(zhuǎn)基因植物，使所生成的種子發(fā)芽，分析所生成的植物中相對于對照植物(即天然的非轉(zhuǎn)基因的)的改變的細胞分化。還包括與親本植物回交，以及與非轉(zhuǎn)基因植物進行遠交。基本上任何植物都可使用本發(fā)明的GAT多核苷酸來進行轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化和表達本發(fā)明的新穎的GAT多核苷酸的合適植物包括農(nóng)藝上和園藝上重要的種類。這些種類包括但不限于這些家族的成員：禾本科(包括玉米、黑麥、黑小麥、大麥、粟、稻、小麥、燕麥等)；豆科(包括豌豆、菜豆、扁豆、花生、薯蕷豆、豇豆、絨毛黧豆、大豆、苜蓿、紫苜蓿、羽扇豆、野豌豆、荷花、草木樨、紫藤和香豌豆)；菊科(維管植物的最大家族，包括至少1000種屬，包括重要的經(jīng)濟作物，如向日葵)和薔薇科(包括懸鉤子、杏樹、杏仁、桃樹、玫瑰等)。以及堅果樹(包括胡桃、山核桃、榛子等)，和林木〔包括松屬(Pinus)、櫟屬(Quercus)、黃杉屬(Pseudotsuga)、紅杉屬(Sequoia)、楊屬(Populus)等〕。其它可用本發(fā)明的GAT多核苷酸修飾的目標植物以及上述那些包括下述種屬的植物：剪股穎屬(Agrostis)、蔥屬(Allium)、金魚草屬(Antirrhinum)、旱芹屬(Apium)、擬南芥屬(Arabidopsis)、花生屬(Arachis)、蘆筍屬(Asparagus)、顛茄屬(Atropa)、燕麥屬(Avena)(如燕麥)、山白竹屬(Bambusa)、蕓苔屬(Brassica)、雀麥屬(Bromus)、博洛瓦阿拉屬(Browaalia)、山茶屬(Camellia)、大麻屬(Cannabis)、辣椒屬(Capsicum)、鷹嘴豆屬(Cicer)、藜屬(Chenopodium)、菊苣屬(Chiehorium)、柑桔屬(Citrus)、咖啡屬(Coffea)、薏苡屬(Coix)、香瓜屬(Cucumis)、葫蘆屬(Curcubita)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬(Dactylis)、曼陀羅屬(Datura)、胡蘿卜屬(Daucus)、毛地黃屬(Digitalis)、薯蕷屬(Dioscorea)、油棕屬(Elaeis)、Eleusine、羊矛屬(Festuca)、草莓屬(Fragaria)、老鸛草屬(Geranium)、大豆屬(Glycine)、向日葵屬(Helianthus)、龍骨角屬(Heterocallis)、三葉膠屬(Hevea)、大麥屬(Hordeum)(如大麥)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番薯薯(Ipomoea)、萵苣屬(Lactuca)、兵豆屬(Lens)、百合屬(Lilium)、亞麻屬(Linum)、黑麥草屬(Lolium)、百脈根屬(Lotus)、番茄屬(Lycopersicon)、甘牛至屬(Majorana)、蘋果屬(Malus)、芒果屬(Mangifera)、木薯屬(Manihot)、苜蓿屬(Medicago)、龍面花屬(Nemesia)、煙草屬(Nicotiana)、驢食豆屬(Onobrychis)、稻屬(Oryza)(如稻)、稷屬(Panicum)、天竺葵屬(Pelargonium)、狼尾草屬(Pennisetum)(如粟)、碧冬茄屬(Petunia)、豌豆屬(Pisum)、菜豆屬(Phaseolus)、梯牧草屬(Phleum)、早熟禾屬(Poa)、李屬(Prunus)、毛茛屬(Ranunculus)、蘿卜屬(Raphanus)、茶庶子屬(Ribes)、蓖麻屬(Ricinus)、懸鉤子屬(Rubus)、甘蔗屬(Saccharum)、蛾蝶花屬(Salpiglossis)、黑麥屬(Secale)(如黑麥)、千里光屬(Senecio)、狗尾草屬(Setaria)、白芥屬(Sinapis)、茄屬(Solanum)、蜀黍?qū)?Sorghum)、鈍葉草屬(Stenotaphrum)、可可樹屬(Theobroma)、車軸草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、小麥屬(Triticum)(如小麥)、野豌豆屬(Vicia)、豇豆屬(Vigna)、葡萄屬(Vitis)、玉蜀黍?qū)?Zea)(如玉米)、Olyreae、Pharoideae以及其它。應(yīng)注意的是，禾本科(Graminae)的植物是本發(fā)明方法的特選目標植物。作為本發(fā)明的目標的普通農(nóng)作物包括玉米、稻米、黑小麥、黑麥、棉花、大豆、高粱、小麥、燕麥、大麥、粟、向日葵、加拿大油菜、豌豆、菜豆、小扁豆、花生、薯蕷豆、豇豆、絨毛黧豆、大豆、苜蓿、紫苜蓿、羽扇豆、野豌豆、荷花、草木樨、紫藤和香豌豆、番茄、香蕉和堅果植物(如胡桃、山核桃等)。一方面，本發(fā)明提供了一種方法，通過在可使農(nóng)作物植株生產(chǎn)出農(nóng)作物的條件下，種植由于轉(zhuǎn)化了編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因而耐受草甘膦的農(nóng)作物植株，來制造農(nóng)作物和收獲農(nóng)作物。優(yōu)選地，給植株或在植株附近施用草甘膦，其濃度足以控制雜草而不抑制轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物植株生長和生產(chǎn)農(nóng)作物。可以在種植之前，或在種植后的任何時間包括收獲時施用草甘膦。草甘膦可以施用一次或多次。草甘膦施用的時間安排、用量、施用模式和其它參數(shù)將根據(jù)農(nóng)作物植株和生長環(huán)境的具體性質(zhì)而改變，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定。本發(fā)明還提供了用這種方法制造的農(nóng)作物。本發(fā)明提供了繁殖含有GAT多核苷酸轉(zhuǎn)基因的植物的方法。這種植物可以是，例如，單子葉植物或雙子葉植物。一方面，繁殖包括將含有GAT多核苷酸轉(zhuǎn)基因的植物和第二種植物雜交，這樣至少一些雜交后代顯示草甘膦抗性。一方面，本發(fā)明提供了選擇性地控制種植農(nóng)作物的田間的雜草的方法。此方法包括種植由于轉(zhuǎn)化了編碼GAT(如GAT多核苷酸)的基因而具有草甘膦耐受性的農(nóng)作物種子或植株，然后對農(nóng)作物和任何雜草施用足量的草甘膦，以控制雜草而對農(nóng)作物沒有明顯不利影響。重要的是應(yīng)注意，農(nóng)作物不必完全對除草劑不敏感，只要從抑制雜草得到的好處超過草甘膦或草甘膦類似物對農(nóng)作物或農(nóng)作物植株的不利影響即可。另一方面，本發(fā)明提供了將GAT多核苷酸用作可選擇標記基因的用途。在本發(fā)明的一個實施方案中，細胞或生物體中GAT多核苷酸的存在賦予了該細胞或生物體以草甘膦耐受性的可檢測特征，從而使技術(shù)人員可以挑選已用與GAT多核苷酸連接的感興趣基因轉(zhuǎn)化的細胞或生物體。因此，例如，可將GAT多核苷酸導入核酸構(gòu)建體中，如載體中，由此可通過在草甘膦存在時培養(yǎng)該宿主，選擇成活和/或生長能力明顯高于缺乏此核酸構(gòu)建體的宿主存活或生長速度的植株，以鑒定含有此核酸構(gòu)建體的宿主(如細胞或轉(zhuǎn)基因植物)。在許多對草甘膦敏感的宿主中，包括植物、大多數(shù)細菌(包括大腸桿菌)、放線菌、酵母、藻類和真菌，GAT多核苷酸都可用作一種可選擇標記。就抗常規(guī)的抗生素抗性而言，采用除草劑抗性作為植物中一種標記的一個好處是，它消除了某些人對抗生素抗性可能泄漏到環(huán)境中的擔心。在本說明書的實施例部分描述了一些實驗數(shù)據(jù)，這些實驗顯示了GAT多核苷酸在各種宿主系統(tǒng)中作為可選標記的應(yīng)用。GAT多核苷酸的選擇賦予轉(zhuǎn)基因植物以增強的草甘膦抗性在按照本文所述方法多樣化的GAT編碼核酸的文庫中，進行可賦予轉(zhuǎn)基因植物以草甘膦抗性的能力的選擇。經(jīng)過一輪或多輪多樣化和選擇后，可采用修飾的GAT基因作為選擇標記，以便生產(chǎn)和評價轉(zhuǎn)基因植物，還可用作賦予實驗作物或農(nóng)作物以除草劑抗性的方法。例如，在將SEQIDNO：1-SEQIDNO：5中的一個或多個多樣化以產(chǎn)生一個多樣化的GAT多核苷酸文庫后，可以通過在大腸桿菌中表達該GAT編碼序列文庫，來進行最初的功能評價。如上所述，可純化或部分純化表達的GAT多肽，并用質(zhì)譜儀篩選具有改進的動力學的菌株。經(jīng)一輪或幾輪初步多樣化和選擇后，將編碼改進的GAT多肽的多核苷酸克隆入植物表達載體，將植物表達載體連接到，例如，強組成型啟動子，如CaMV35S啟動子上。通常經(jīng)農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化，將含有修飾的GAT核酸的表達載體轉(zhuǎn)化入擬南芥宿主植株。例如，將花序浸在農(nóng)桿菌溶液中，然后使它們生長并結(jié)籽，可容易地轉(zhuǎn)化擬南芥屬宿主。在大約6周內(nèi)回收數(shù)千粒種子。然后從浸過的植物中大批收集種子并使其生長在土壤中。用這種方法，可以產(chǎn)生數(shù)千株獨立轉(zhuǎn)化的植株，以供評價、建立高產(chǎn)量(HTP)植物轉(zhuǎn)化模式。用草甘膦噴灑成批生長的幼芽，具有草甘膦抗性的存活幼芽可在選擇過程中存活，而非轉(zhuǎn)基因的植株和摻入了不太有利修飾的GAT核酸的植株由于除草劑處理而被傷害或被殺死。任選地，例如可以利用該文庫插入物側(cè)面的T-DNA引物，通過PCR擴增來回收可賦予改善的草甘膦抗性的GAT編碼核酸，并將其用于進一步的多樣化步驟或用來產(chǎn)生相同或不同種類的其他轉(zhuǎn)基因植物。如果需要，可以在各個隨后的選擇中，采用濃度增加的草甘膦，再進行多輪多樣化和選擇。用這種方法，可以獲得在農(nóng)田情況下有用的賦予草甘膦濃度抗性的GAT多核苷酸和多肽。除草劑抗性本發(fā)明提供一種組合物，其包括兩種或多種本發(fā)明的多核苷酸。優(yōu)選地，GAT多核苷酸編碼具有不同動力學參數(shù)的GAT多肽，即可以將具有較低Km的GAT變體與具有較高k催化的變體組合。在另一個實施方案中，不同的GAT多核苷酸與葉綠體轉(zhuǎn)運序列或者其他信號序列連接，從而在不同的細胞腔室、細胞器中表達GAT多肽或分泌一種或多種GAT多肽。可以將本發(fā)明的草甘膦抗性機制與本領(lǐng)域已知的其它草甘膦抗性模式結(jié)合，以制造具有較高草甘膦抗性的植物和植物的外植體。例如，通過在植物基因組中插入具有產(chǎn)生高水平5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯合酶(EPSP)能力的序列，生成耐受草甘膦的植物，這在以下美國專利：6,248,876B1、5,627,061、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、4,940,835、5,866,775、6,225,114B1、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、Re.36,449、RE37,287E和5,491,288以及國際出版物WO97/04103、WO00/66746、WO01/66704和WO00/66747中有更加完整的描述，出于所有目的，在此將它們?nèi)囊胱鳛閰⒖肌＿€可向表達編碼草甘膦氧化-還原酶基因的植物傳遞草甘膦抗性，這在美國專利5,776,760和5,463,175中有更加完整的描述，出于所有目的，在此將它們?nèi)囊胍怨﹨⒖?。此外，本發(fā)明的草甘膦抗性機制可以和除草劑抗性的其它模式結(jié)合，以使植物和植物外植體對草甘膦和一種或多種其它除草劑具有抗性。例如，羥苯基丙酮酰二氧化酶是催化對-羥苯基丙酮酸(HPP)轉(zhuǎn)化成尿黑酸的反應(yīng)的酶。抑制此酶并與此酶結(jié)合以抑制HPP轉(zhuǎn)化為尿黑酸的分子可用作除草劑。對某些除草劑抗性更強的植物描述在美國專利6,245,968B1、6,268,549和6,069,115以及國際出版物WO99/23886中，出于所有目的，在此將它們?nèi)囊胱鳛閰⒖??；酋ｋ搴瓦溥蜻輨┩ㄟ^阻遏乙酰乳糖合酶(ALS)或乙酰羥酸合酶(AHAS)，也抑制高等植物的生長?；酋ｋ搴瓦溥蜻剐灾参锏纳a(chǎn)在美國專利5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937和5,378,824以及國際出版物WO96/33270中有更加完整的描述，出于所有目的，在此將它們?nèi)囊胱鳛閰⒖?。谷氨酸合成?GS)似乎是大多數(shù)植物細胞發(fā)育和生長必需的基礎(chǔ)酶。GS的抑制劑對植物細胞是有毒的。根據(jù)GS抑制植物的毒性作用，已經(jīng)開發(fā)了草銨膦除草劑。這些除草劑是非選擇性的。它們抑制現(xiàn)有植物所有不同種類的生長，引起它們整體毀滅。對含有外源膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的植物的開發(fā)描述在美國專利5,969,213、5,489,520、5,550,318、5,874,265、5,919,675、5,561,236、5,648,477、5,646,024、6,177,616B1和5,879,903中，出于所有目的，在此將它們?nèi)囊胱鳛閰⒖?。原卟啉原氧化?protox)是產(chǎn)生植物存活必需的葉綠素所必需的。protox酶是許多除草化合物的靶標。這些除草劑也抑制現(xiàn)有植物所有不同種類的生長，引起它們整體毀滅。耐受這些除草劑的具有改變的protox活性的植物的開發(fā)描述在美國專利6,288,306B1、6,282,837B1和5,767,373中，出于所有目的，在此全文引入作為參考。因此，本發(fā)明提供用于選擇性地控制具有農(nóng)作物的田間的雜草的方法，包括在田間種植由于轉(zhuǎn)化了編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因而耐受草甘膦的農(nóng)作物種子或植物，給田間的農(nóng)作物和雜草施用足量的草甘膦，以控制雜草而不顯著地影響農(nóng)作物。本發(fā)明還提供一種方法，以控制田間的雜草并且防止在具有農(nóng)作物的田間出現(xiàn)草甘膦抗性雜草，包括在田間種植農(nóng)作物種子或植物，它們由于轉(zhuǎn)化了編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼通過另一種途徑賦予草甘膦耐受性的多肽的基因而耐受草甘膦，給田間的農(nóng)作物和雜草施用足量的草甘膦，以控制雜草而不顯著地影響農(nóng)作物，所述另一種多肽如耐受草甘膦的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯合酶和/或耐受草甘膦的草甘膦氧化還原酶。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于控制田間雜草和防止在具有農(nóng)作物的田間出現(xiàn)除草劑抗性雜草的方法，包括在田間種植農(nóng)作物種子或植物，它們由于轉(zhuǎn)化了編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼通過另一種途徑賦予草甘膦耐受性的多肽(如耐受草甘膦的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸酯合酶和/或耐受草甘膦的草甘膦氧化還原酶)的基因和編碼賦予對其他除草劑(例如突變的羥苯基丙酮酸二氧化酶、耐受磺胺的乙酰乳酸合酶、耐受磺胺的乙酰羥基酸合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰乳酸的合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰羥基酸合酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶和突變的原卟啉原氧化酶)耐受性的基因而耐受草甘膦，給田間的農(nóng)作物和雜草施用足量的草甘膦和其他除草劑(例如羥苯基丙酮酸二氧化酶抑制劑、磺胺、咪唑啉酮、雙丙氨膦、膦絲菌素、唑啶草酮、氟丙嘧草酯、硫酸鹽、草銨膦和原卟啉原氧化酶抑制劑)，以控制雜草而不顯著地影響農(nóng)作物。本發(fā)明還提供用于控制田間雜草和防止在具有農(nóng)作物的田間出現(xiàn)除草劑抗性雜草的方法，包括在田間種植農(nóng)作物種子或植物，它們由于轉(zhuǎn)化了編碼草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因和編碼賦予對其他除草劑(例如突變的羥苯基丙酮酸二氧化酶、耐受磺胺的乙酰乳酸合酶、耐受磺胺的乙酰羥基酸合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶、耐受咪唑啉酮的乙酰羥基酸合酶、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶和突變的原卟啉原氧化酶)耐受性的基因而耐受草甘膦，給田間的農(nóng)作物和雜草施用足量的草甘膦和其他除草劑(例如羥苯基丙酮酸二氧化酶抑制劑、磺胺、咪唑啉酮、雙丙氨膦、膦絲菌素、唑啶草酮、氟丙嘧草酯、硫酸鹽、草銨膦和原卟啉原氧化酶抑制劑)，以控制雜草而不顯著地影響農(nóng)作物。實施例如下實施例是說明性的，而非限制性的。技術(shù)人員將認識到，可以改變許多非關(guān)鍵性的參數(shù)以獲得實質(zhì)上類似的結(jié)果。實施例1：分離新的天然GAT多核苷酸通過表達克隆來自具有GAT活性的桿菌菌株的序列，發(fā)現(xiàn)了五種天然GAT多核苷酸(即在非遺傳修飾的生物中天然存在的GAT多核苷酸)。它們的核苷酸序列被確定，并在此以SEQIDNO：1-5提供。簡單地說，就對N-乙酰草甘膦的天然能力，篩選了大約500株桿菌和假單胞菌菌株。將菌株在LB中培養(yǎng)過夜，離心收集，在稀釋的甲苯中滲透，然后洗滌并重懸在含有緩沖液、5mM草甘膦和200μM乙酰-CoA的反應(yīng)混合物中。將細胞在反應(yīng)混合物中培養(yǎng)1-48小時，培養(yǎng)結(jié)束后在反應(yīng)物中加入等體積的甲醇。然后離心沉淀細胞，濾去上清液，然后用母離子型質(zhì)譜儀進行分析。如圖2所述，通過比較反應(yīng)混合物與N-乙酰草甘膦標準品的質(zhì)譜圖，將反應(yīng)產(chǎn)物陽性地鑒定為N-乙酰草甘膦。產(chǎn)物檢測同時依賴于兩種底物(乙酰CoA和草甘膦)，并通過加熱變性細菌的細胞而停止。然后通過功能性篩選，從鑒定的菌株中克隆了各個GAT多核苷酸。制備基因組DNA并用Sau3A1酶部分消化。將大約4Kb的片段克隆入大腸桿菌表達載體中，并將其轉(zhuǎn)化入電感受態(tài)大腸桿菌。在上述反應(yīng)后，用質(zhì)譜儀鑒定各個顯示GAT活性的克隆，但以PMBS滲透替代甲苯。對基因組片段進行測序，并鑒定假定的GAT多肽編碼的開放閱讀框。在大腸桿菌中表達該開放閱讀框，以及檢測到在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生高水平的N-乙酰草甘膦，證實了對GAT基因的鑒定結(jié)果。實施例2：分離自地衣芽孢桿菌菌株B6的GAT多肽的表征純化地衣芽孢桿菌菌株B6的基因組DNA，用Sau3A1部分消化，并將1-10Kb的片段克隆入大腸桿菌表達載體中。通過質(zhì)譜分析，確定了賦予大腸桿菌草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT)活性的帶有2.5kb插入物的克隆。此插入物的測序揭示了一個含有441個堿基對的完整開放閱讀框。此開放閱讀框隨后的克隆證實它編碼GAT酶。圖4顯示質(zhì)粒pMAXY2120。將編碼B6GAT酶的基因轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1Blue品系中。在Luria肉湯中加入10％無害的飽和培養(yǎng)物，將該培養(yǎng)物在37℃培養(yǎng)1小時。以1mM的濃度加入IPTG，誘導GAT的表達。將培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后離心收集細胞，并將細胞沉淀保藏在-80℃下。在0.2g細胞中加入1ml以下緩沖液使細胞裂解：25mMHEPES，pH7.3；100mMKCl和10％甲醇(HKM)，加有0.1mMEDTA、1mMDTT、1mg/ml雞蛋溶菌酶和蛋白酶抑制劑混合物(cocktail)(得自Sigma，并按制造商的建議使用)。在室溫(例如22-25℃)培育20分鐘后，短暫超聲完成裂解。將溶解產(chǎn)物離心并取上清液，通過HKM平衡的SephadexG25將上清液脫鹽。在CoA瓊脂糖(Sigma)上進行親和層析部分純化，將此柱用HKM平衡，并在流體靜力壓下讓澄清的提取物通過此柱。通過HKM洗滌除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，并用含1mM輔酶A的HKM洗脫GAT。這一過程提供了4倍的純化。這時，用粗制的溶解產(chǎn)物上樣SDS聚丙烯酰胺凝膠，觀察到大約65％的染色蛋白質(zhì)是GAT，另外的20％是該載體編碼的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。通過Superdex75(Pharmacia)凝膠過濾部分純化的蛋白質(zhì)，實現(xiàn)了均質(zhì)性純化。流動相是HKM，其中GAT活性是在相當于分子半徑為17kD的體積處洗脫的。取3μgGAT樣品在厚1mm的12％丙烯酰胺凝膠上進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯染色判斷此物質(zhì)是均質(zhì)的。純化使得此活性提高了6倍。在含有飽和(200μM)乙酰CoA、不同濃度的草甘膦和1μM純化的GAT(在含有5mM嗎啉的用乙酸和20％乙二醇將pH調(diào)至7.7緩沖液中)的反應(yīng)混合物中，測定了對草甘膦的表觀KM。通過在235nm(E＝3.4OD/mM/cm)處連續(xù)監(jiān)測乙酰CoA硫酯鍵的水解，確定初始反應(yīng)速度。觀察到了雙曲線樣的飽和動力學曲線(圖5)，由此得到2.9±0.2(SD)的表觀KM。在含有5mm草甘膦、不同濃度的乙酰CoA和0.19μMGAT(含有5mM嗎啉的在用乙酸和20％乙二醇將pH調(diào)至7.7的緩沖液中)的反應(yīng)混合物中，測定了對乙酰CoA的表觀KM。用質(zhì)譜測定N-乙酰草甘膦，確定了初始反應(yīng)速度。在此裝置中反復注入5μl反應(yīng)混合物，并將反應(yīng)時間對積分的峰面積作圖而得到了反應(yīng)速度(圖6)。觀察到了雙曲線樣的飽和動力學曲線(圖7)，由此得到2μM的表觀KM。從已知酶濃度下獲得的Vmax值計算出k催化為6/min。實施例3：質(zhì)譜(MS)篩檢過程以每個樣品26秒的速度從96孔微量滴定板中取出樣品(5μl)，無需分離，將其注入質(zhì)譜儀(MicromassQuattroLC，三組四倍器質(zhì)譜儀)。通過水/甲醇(50∶50)流動相以500UI/min的流速將樣品帶進質(zhì)譜儀。通過負電噴射電離方法(針電壓-3.5KV；錐電壓20V；電子源溫度120℃；去溶劑化溫度250℃；錐氣流90L/Hr；去溶劑化氣流600L/Hr)，將注入的各個樣品離子化。通過第一個四極選擇此過程中形成的分子離子(m/z210)，用于在第二個四極中進行碰撞誘導的解離(CID)，其中將壓力設(shè)置為5×10-4毫巴，將碰撞能量調(diào)節(jié)為20Ev。設(shè)定第三個四極用于僅允許從母離子(m/z210)產(chǎn)生的一個子離子(m/z124)進入用于記錄信號的檢測器中。將第一和第三四極設(shè)定在單位分辨度并在650V操作光電倍增管。將純N-乙酰草甘膦標準品用于比較并且使用峰積分來估計濃度。用這種方法可以檢測出少于200Nm的N-乙酰草甘膦。實施例4：天然或低活性GAT酶的檢測天然或低活性的GAT酶的K催化通常約為1min-1，對草甘膦的KM為1.5-10Mm。對乙酰CoA的KM通常小于25μM。使細菌培養(yǎng)物生長在96孔深孔板的富集培養(yǎng)基中，離心收集0.5ml靜止相細胞，用5mMpH8的醋酸嗎啉洗滌，并重懸浮在0.1ml含有200μM乙酰CoA銨、5mM草甘膦銨和5μg/mlPMBS(Sigma)的5mMpH8醋酸嗎啉反應(yīng)混合液中。PBMS滲透過細胞膜，允許底物和產(chǎn)物從細胞移至緩沖液而不釋放所有細胞成分。在25-37℃下進行反應(yīng)1-48小時。用等體積的100％乙醇淬滅反應(yīng)，并用0.45μm的MAHVMultiscreen濾板(Millipore)過濾所有混合物。如上所述用質(zhì)譜儀分析樣品并與合成的N-乙酰草甘膦標準品進行比較。實施例5：高活性GAT酶的檢測高活性GAT酶的k催化通常最高達400min-1，并且KM通常低于0.1mM草甘膦。將編碼GAT酶的基因克隆入大腸桿菌表達載體pQE80(Qiagen)中，并將其導入大腸桿菌菌株XL1Blue(Stratagene)。讓培養(yǎng)物在淺U底96孔聚苯乙烯平板中的150ul富集培養(yǎng)基(含有50μg/ml羧芐青霉素的LB)中生長至對數(shù)后期，并用新鮮的含有1mMIPTG(USB)的培養(yǎng)基作1∶9稀釋。培育4-8小時后，收集細胞，用pH6.8的5mM醋酸嗎啉洗滌，重懸于等體積的同樣的嗎啉緩沖液中。用最多達10ul洗滌過的細胞進行反應(yīng)。在較高的活性水平，先將細胞最多稀釋到1∶200，將5μl加入100μl反應(yīng)混合物中。為了測量GAT活性，對于低活性，可以使用上述一樣的反應(yīng)混合物。然而，為了測量高活性GAT酶，應(yīng)將草甘膦濃度降至0.15-0.5mM，pH降至6.8，在37℃下進行反應(yīng)1小時。反應(yīng)后處理和MS檢測如本文所述。實施例6：GAT酶的純化通過在CoA-瓊脂糖上親和層析細胞裂解物并在Superdex-75上凝膠過濾來進行酶的純化。用下述方法獲得了數(shù)量最多達10mg純化的GAT酶：將100ml在pQE80載體上帶有GAT多核苷酸的大腸桿菌培養(yǎng)物在含50μg/ml羧芐青霉素的LB中培養(yǎng)過夜，用于接種1L加有50ug/ml羧芐青霉素的LB。1小時后，加入IPTG至1mM，使培養(yǎng)物再生長6小時。離心收集細胞。將細胞懸浮在25mMHEPES(pH7.2)、100mMKCl、10％甲醇(稱為HKM)、0.1mMEDTA、1mMDTT、Sigma-Aldrich提供的蛋白酶抑制劑混合物和1mg/ml雞蛋溶菌酶中進行裂解。在室溫下30分鐘后，短暫超聲細胞。離心除去顆粒物質(zhì)，使溶解產(chǎn)物通過輔酶A-瓊脂糖柱。用幾倍柱床體積的HKM洗滌柱，并用1.5倍柱床體積的含有1mM乙酰輔酶A的HKM洗脫GAT。洗脫液中的GAT保留在CentriconYM50超濾膜上而濃縮。通過一系列0.6ml注射使此蛋白質(zhì)通過Superdex75柱而獲得進一步純化。GAT活性峰在相應(yīng)于分子量為17kD的體積處被洗脫出來。這種方法使得GAT酶被純化至均一，回收率＞85％。用類似方法，每次可以獲得0.1-0.4mg含量的最多96個改組的變體。將誘導的培養(yǎng)物的體積減至1-10ml，可在裝在MAHV濾板(Millipore)中的0.15ml柱子中進行輔酶A-瓊脂糖親和層析，Superdex75層析可以省略。實施例7：測定K催化和KM的標準方法使用連續(xù)的分光光度測定，確定了純化的蛋白質(zhì)對草甘膦的K催化和KM，其中在235nm下監(jiān)測乙酰CoA的硫酯鍵的水解。在室溫(約23℃)下，在96-孔測定板的孔中進行反應(yīng)，孔中裝有最終體積為0.3ml的以下成分：20mMHEPESpH6.8、10％乙二醇、0.2mM乙酰輔酶A和不同濃度的草甘膦銨。比較兩種GAT酶的動力學，應(yīng)該在同等條件下(如都在23℃)測定兩種酶。由Vmax和通過Bradford測定確定的酶濃度，計算出K催化。采用Michaelis-Menten方程的Lineweaver-Burke轉(zhuǎn)化，從范圍為0.125-10mM的草甘膦濃度獲得的初始反應(yīng)速度計算出KM。通過將測定的K催化的值除以KM的測定值而得到K催化/KM。使用這種方法，確定了本文例舉的大量GAT多肽的動力學參數(shù)。例如，用上述試驗條件，確定與SEQIDNO：445相應(yīng)的GAT多肽的K催化、KM和K催化/KM分別為322min-1、0.5mM和660mM-1min-1。用上述試驗條件已經(jīng)確定與SEQIDNO：457相應(yīng)的GAT多肽的K催化、KM和K催化/KM分別為118min-1、0.1mM和1184mM-1min-1。用上述試驗條件已經(jīng)確定與SEQIDNO：300相應(yīng)的GAT多肽的K催化、KM和K催化/KM分別為296min-1、0.65mM和456mM-1min-1。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用這些數(shù)字證實，GAT活性試驗產(chǎn)生的GAT動力學參數(shù)適合與這里所給的數(shù)值進行比較。例如，如本文所報告，當條件是用來比較實驗GAT和本文例舉的GAT多肽時，用于比較GAT活性的條件對于SEQIDNO：300、445和457應(yīng)該產(chǎn)生同樣的動力學常數(shù)(在正常的實驗方差內(nèi))。在反應(yīng)過程中重復取樣，用質(zhì)譜方法測定對乙酰CoA的KM。將乙酰CoA和草甘膦(銨鹽)以50×的濃縮儲備液添加到質(zhì)譜樣品平板中。加入適當?shù)叵♂屧趽]發(fā)性緩沖液(如乙酸鹽或碳酸銨，pH6.8或7.7)中的酶來起始反應(yīng)。重復地將樣品注射到儀器中，從保持時間和峰面積的圖形中計算出起始速度。計算對于草甘膦的KM。實施例8：時轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的選擇將進化的GAT基因(具有直接連接到GAT編碼序列的5′端上的天然地衣芽孢桿菌核糖體的結(jié)合位點(AACTGAAGGAGGAATCTC；SEQIDNO：515)的嵌合體)克隆到表達載體pQE80(Qiagen)的EcoRI和HindIII位點之間，產(chǎn)生質(zhì)粒pMAXY2190(圖11)。再從質(zhì)粒中除去His標記結(jié)構(gòu)域，而保留賦予對抗生素氨卡青霉素和羧芐青霉素的抗性的B-內(nèi)酰胺酶基因。將pMAXY2190電穿孔(BioRadGenePulser)到XL1Blue(Stratagene)大腸桿菌中。將該細胞懸浮在SOC富集培養(yǎng)基中，讓其恢復1小時。然后，溫和地沉淀細胞，用缺乏芳香氨基酸的M9最小培養(yǎng)基(12.8g/LNa2HPO4.7H2O、3.0g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4Cl、0.4％葡萄糖、2mMMgSO4、0.1mMCaCl2、10mg/L維生素B，10mg/L脯氨酸、30mg/L羧芐青霉素)洗滌細胞一次，重懸在20ml的相同M9培養(yǎng)基中。以250rpm在37℃下過夜生長后，將等體積的細胞置于M9培養(yǎng)基或者添加了1mM草甘膦的M9培養(yǎng)基中。將無GAT基因的pQE80載體以類似的方式導入大腸桿菌細胞中，鋪板獲得單一的克隆，用于比較。表3給出對這些結(jié)果的總結(jié)，GAT活性使得被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞以低于1％的背景被選擇和生長。表明對于足以使轉(zhuǎn)化細胞生長的GAT活性來說，無需IPTG誘導。通過從在存在草甘膦時生長的大腸桿菌細胞中再分離pMAXY2190而驗證了該轉(zhuǎn)化。表3.在大腸桿菌中的pMAXY2190的草甘膦選擇實施例9：轉(zhuǎn)化的植物細胞的選擇農(nóng)桿菌介導的植物細胞的轉(zhuǎn)化的效率低。為了繁殖轉(zhuǎn)化的細胞而抑制非轉(zhuǎn)化細胞的繁殖，需要一種可選擇的標記。對于卡那霉素和潮霉素的抗生素標記，以及解毒除草劑化合物膦絲菌素的除草劑修飾基因bar，都是可用于植物中的可選擇標記的例子(MethodsinMolecularBiology，1995，49：9-18)。在此，本發(fā)明人證明，GAT活性作為一種有效的植物轉(zhuǎn)化的可選擇標記。將進化的GAT基因(0_5B8)SEQIDNO：190克隆到植物啟動子(增強的草莓葉脈條紋病毒)和泛醌終止子之間，導入到如圖12所示的適合于通過根癌農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化植物細胞的二元載體pMAXY3793的T-DNA區(qū)域中。T-DNA中存在可篩選的GUS標記允許確認轉(zhuǎn)化。使用草甘膦作為唯一的選擇試劑來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的煙草幼芽。將L.Xanthi煙草的腋芽亞培養(yǎng)在含有蔗糖(1.5％)和脫乙酰吉蘭糖膠(0.3％)的半強度MS培養(yǎng)基中，在每2-3周在24℃下16h的光照(35-42μEm-2s-1、冷光熒光燈)下。在2-3周亞培養(yǎng)后，從植物上取下嫩葉，剪切成3×3mm的片段。將根癌農(nóng)桿菌EHA105接種到LB培養(yǎng)基中，生長過夜到A600＝1.0的密度。以4,000rpm離心細胞5分鐘，重懸在3×體積的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基(pH5.2)組成，含有2mg/LN6-芐基腺嘌呤(BA)、1％葡萄糖和400μM乙酰丁香酮。然后，將葉子碎片完全浸沒在100×25mmPetri培養(yǎng)皿中的20ml的根癌農(nóng)桿菌中30分鐘。用高壓滅菌的濾紙印跡，然后，放置到固體的共培養(yǎng)基(0.3％脫乙酰吉蘭糖膠)上，如上所述進行培養(yǎng)。在共培養(yǎng)3天后，將20-30個片段轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)的誘導生成幼芽的(BSI)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由含有2mg/LBA、3％蔗糖、0.3％脫乙酰吉蘭糖膠、0-200μM草甘膦和400ug/ml特美汀的MS固體培養(yǎng)基(pH5.7)組成。3周后，無論存在或缺乏GAT基因，放置在無草甘膦的培養(yǎng)基中的外植體上明顯地生成幼芽。對來自再生幼芽的葉片進行GUS組織化學染色，證明兩種構(gòu)建體都轉(zhuǎn)移了T-DNA。超過20uM的草甘膦濃度完全地抑制任何缺乏GAT基因的外植體形成幼芽。用具有GAT構(gòu)建體的根癌農(nóng)桿菌感染的外植體在最高達200uM(最高的檢測濃度)的草甘膦濃度下再生幼芽。通過GUS組織化學染色和用退火到啟動子和3’區(qū)上的引物通過PCR片段擴增GAT基因，來證實轉(zhuǎn)化。結(jié)果總結(jié)在表4中。表4.通過草甘膦選擇再生煙草幼芽實施例10：轉(zhuǎn)化的酵母細胞的草甘膦選擇用于酵母轉(zhuǎn)化的選擇標記通常是營養(yǎng)缺陷性基因，使得轉(zhuǎn)化的細胞可以在缺乏特定氨基酸或核苷酸的培養(yǎng)基中生長。由于釀酒酵母對草甘膦敏感，GAT還可以作為一種可選擇標記。為了證明這一點，進化的GAT基因(0_6D10)，SEQIDNO：196，從T-DNA載體pMAXY3793克隆得到(如實施例9中所示)，作為含有完整編碼區(qū)域的PstI-ClaI片段，連接到如圖13所示的PstI-ClaI消化的p424TEF(Gene，1995，156：119-122)上。該質(zhì)粒含有大腸桿菌復制起點和賦予羧芐青霉素抗性的基因，以及用于酵母轉(zhuǎn)化的色氨酸營養(yǎng)缺陷型的可選擇標記TRP1。將含有GAT的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1Blue(Statagene)中，鋪展在LB羧芐青霉素(50ug/ml)瓊脂培養(yǎng)基上。制備質(zhì)粒DNA，使用轉(zhuǎn)化試劑盒(Biol01)，轉(zhuǎn)化酵母菌株YPH499(Stratagene)。將等量的轉(zhuǎn)化細胞鋪展到缺乏所有的芳香氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)而添加了草甘膦的CSM-YNB-葡萄糖培養(yǎng)基(Biol01)上。為了比較，也將缺乏GAT基因的p424TEF導入到Y(jié)PH499在，如上所述進行鋪展。該結(jié)果證明，GAT活性將可作為一種有效的可選擇標記。通過再分離質(zhì)粒和限制性消化分析，確認在草甘膦選擇克隆中存在含有GAT的載體。實施例11.表達GAT的煙草植物中的除草劑噴灑檢測將如實施例9中所述而生成的煙草幼芽從外植體上切除，轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)誘導生根(BRI)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由半強度的Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基，pH5.7，含有1.5％蔗糖、0.3％脫乙酰吉蘭糖膠、0-200uM草甘膦和400ug/ml特美汀。通過切斷莖桿并轉(zhuǎn)移到鮮新的BRI培養(yǎng)基中，直到獲得期望數(shù)量的克隆，無性繁殖生根的植物和腋窩幼芽。小心地從固體培養(yǎng)基中將生根的植物移出。在將植物種植到小罐土壤中之前，洗滌根部以去除任何殘留的脫乙酰吉蘭糖膠。將保護性的塑料蓋保留在植物上至少一周，直到植物已經(jīng)被充分固定。為了確定表達GAT的煙草植物是否能夠耐受模擬的田間速度的草甘膦噴灑，對各種GAT變體的多個事件的無性系進行檢測。典型的檢測按照如下進行：對來自各個事件的一個克隆噴灑1ml的草甘膦的異丙胺鹽(SigmaP5671)和0.125％TritonX-100的溶液，pH6.8，使得所噴灑的活性成分的含量等于商業(yè)草甘膦產(chǎn)品中的含量。例如，為了獲得32盎司/英畝(1X)的含有40％活性成分(″ai″)的除草劑，將2.4ul的40％ai制劑稀釋到1ml水中，噴灑到4英寸的正方形罐(16平方英寸)中的植物上。還包括僅使用表面活性劑的模擬應(yīng)用(OX)。在有些情形下，在1-4周后，進行第二次噴灑。將植物保持在控制的生長房中，在25℃下、70％濕度、16小時光照下。在本實施例中，10個事件證實GAT0_6D10(SEQIDNO：196)的陽性、10個證實GAT0_5D3(SEQIDNO：193)的陽性、8個事件證實rGAT0_5B8SEQIDNO：190)的陽性，對僅僅用載體(無GAT)轉(zhuǎn)化的植物進行無性繁殖，轉(zhuǎn)移到土壤中，在植物平均具有5片葉子時進行噴灑。也對種子生長的野生型植物進行噴灑。2周后，對僅載體轉(zhuǎn)化的植物和種子生長的植物，用0.5×、2×或4×草甘膦進行噴灑，這些植物停止生長、枯萎和凋零。每一個轉(zhuǎn)基因GAT植物在噴灑過程中都存活了，未出現(xiàn)草甘膦損傷的跡象，例如萎黃病、葉片伸長、矮小或者變棕色(browning)。所有的OX植物都是健康的，包括無GAT的對照植物。3周后，以8×劑量來噴灑所有的存活植物。OX對照植物在兩周內(nèi)死亡。而所有的GAT植物都存活。用GAT轉(zhuǎn)化的并且在草甘膦上選擇的煙草植物都是能夠繁育的。開花和結(jié)實組與野生型植物無可檢測的差別。實施例12.GAT基因和草甘膦耐受表型的孟德爾遺傳學用轉(zhuǎn)化的擬南芥來證實GAT基因和草甘膦耐受表型的孟德爾遺傳學。種植哥倫比亞型擬南芥植物，并且用被稱作為嵌合體(SEQIDNO：16)的GAT變體的構(gòu)建體，通過浸漬法(Clough，SJ和Bent，AF，(1998)PlantJ.16(6)：735-43)轉(zhuǎn)化。收集大量種子，用特異于T-DNA中的插入物的引物，通過PCR驗證GAT植物。將來自各個事件的T1代種子播種在土壤中，每2英寸的正方形罐中種植10-30粒種子。當出現(xiàn)第一組真葉時，給罐噴灑等于0.5×和1×商業(yè)產(chǎn)品的草甘膦(如實施例11中所計算)。如表5中所示，兩周后，轉(zhuǎn)基因和耐受的表型之間的分離是明顯的。表5.0.5×和1×草甘膦耐受的T1擬南芥的分離數(shù)據(jù)的總結(jié)嵌合體事件(SEQIDNO：16)#存活#死亡分離比率18111∶1.436221∶3.7526213∶1131091∶16546192.4∶1僅載體022-野生型029-接近3∶1的比率指示一個單一的分離結(jié)構(gòu)域事件。超過3∶1的比率可能是由于小的樣本大小的影響、不完全的優(yōu)勢或者位置作用，所引起的表達太低而不足以賦予除草劑耐受性。與對照相比，很明顯，GAT基因被傳遞給T1代，并且賦予草甘膦耐受性。實施例13：生成表達GAT轉(zhuǎn)基因的草甘膦抗性玉米用在美國專利5,981,849中描述的方法，生產(chǎn)表達GAT變體轉(zhuǎn)基因的玉米植物，本專利在此引入作為參考。特別地，按照本領(lǐng)域知曉的方法，構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌載體。各個載體含有具有泛素啟動子和內(nèi)含子、GAT變體和PinII終止子的插入物。切除未成熟的玉米胚胎，用含有感興趣的GAT變體的根癌農(nóng)桿菌載體感染。感染后，轉(zhuǎn)移胚胎，并且培養(yǎng)在共培養(yǎng)基中。共培養(yǎng)后，將被感染的未成熟胚胎轉(zhuǎn)移到含有1.0mM草甘膦(RoundupULTRAMAXTM)的培養(yǎng)基中。持續(xù)該選擇，直到鑒定到活躍生長的推定的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。取樣推定的轉(zhuǎn)基因愈傷組織，用于PCR和Western分析(數(shù)據(jù)未顯示)，證實存在GAT基因。將推定的轉(zhuǎn)基因愈傷組織維持在1.0mM草甘膦選擇培養(yǎng)基中，以在植物再生前進一步培養(yǎng)和選擇。再生時，將被證實為轉(zhuǎn)基因的愈傷組織被轉(zhuǎn)移到含有0.1mM草甘膦的成熟培養(yǎng)基中，培養(yǎng)以使體細胞胚成熟。然后，將成熟胚轉(zhuǎn)移到含有0.1mM草甘膦的再生培養(yǎng)基中，以形成幼芽和根。在出現(xiàn)幼芽和根后，將各個小植物轉(zhuǎn)移到具有生根培養(yǎng)基的試管中，該培養(yǎng)基含有0.1mM草甘膦。將具有生成的幼芽和根的小植物移植到溫室內(nèi)的罐中，以進一步生長，產(chǎn)生T0代的噴灑數(shù)據(jù)和T1代種子。為了評價表達GAT變體轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因玉米植物的草甘膦抗性水平，對溫室內(nèi)的T0代植物噴灑草甘膦(RoundupULTRAMAXTM)。通過植物變色分值和植物高度的測量值，評價植物抗性水平。按照如下標準，評價植物的變色和植物的高度：在噴灑草甘膦后第1、2、3和4周時的變色分值9＝無葉/莖變色7＝較小的葉/莖變色5＝更壞的葉/莖變色3＝嚴重脫色的植物或者變干的植物1＝死亡的植物植物高度的測量值在噴灑草甘膦之前噴灑草甘膦之后的第1、2、3和4周時成熟的植物(抽穗)將來自表6所列的各個事件(獨立的轉(zhuǎn)基因的愈傷組織)的兩株植物送到溫室中。植物1被保留來生產(chǎn)種子，不噴灑草甘膦。植物2在移植后第14天被噴灑4×草甘膦(1×草甘膦＝26盎司/英畝)。在第7和14天以4×噴灑的T0代植物的變色分值顯示在表6和7中。抽穗時的高度數(shù)據(jù)顯示在表14中。進行其他試驗，其中對T0代植物噴灑6×草甘膦，在噴灑后10天的數(shù)據(jù)顯示在表8中。表6.在用4×草甘膦處理后7天時的抗性分值構(gòu)建體#用4×測試的事件分值為9的事件％分值為7的事件％分值＜7的事件％18534(SEQIDNO：196)16930％(50)59％(101)11％(18)18537(SEQIDNO：193)7240％(29)54％(39)6％(4)18540(SEQIDNO：190)11132％(36)61％(67)7％(8)總計35233％(115)59％(207)8％(30)表7.在用4×草甘膦處理后14天時的抗性分值構(gòu)建體#用4×測試的事件分值為9的事件％18534(SEQIDNO：196)16929％(49)18537(SEQIDNO：193)7250％(36)18540(SEQIDNO：190)11129％(32)總計35233％(117)表8.在用6×草甘膦處理后10天時的抗性分值構(gòu)建體#用6×測試的事件％在用草甘膦處理后未受損的事件(分值＝9)19286(SEQIDNO：814)31251％(160)19288(SEQIDNO：549)31052％(163)19900(SEQIDNO：738)23156％(129)19902(SEQIDNO：638)23042％(96)21895(SEQIDNO：848)5530％(17)21896(SEQIDNO：912)6161％(37)21905(SEQIDNO：906)3270％(25)總計123151％(627)實施例14：GAT還是一種?；D(zhuǎn)移酶在含有5mM草甘膦或者無草甘膦的反應(yīng)混合物中，測試GAT變體(B6(SEQIDNO：7)、0_6D10(SEQIDNO：448)、17-15H3(SEQIDNO：601)和20-8H12c(SEQIDNO：817))將丙酰基團從丙酰CoA轉(zhuǎn)移到草甘膦的能力。丙酰CoA以1mM的濃度存在。30分鐘后，終止反應(yīng)，通過添加DTNB來確定游離丙酰CoA的存在。所有的變體表現(xiàn)出草甘膦依賴性的對丙酰CoA的水解。這些結(jié)果表明，GAT還可以作為一種?；D(zhuǎn)移酶。實施例15：表達GAT轉(zhuǎn)基因的草甘膦抗性的玉米的T1代研究使用實施例13中描述的方法，制備表達GAT變體轉(zhuǎn)基因18-28D9b(SEQIDNO：814)和17-15H3(SEQIDNO：549)的玉米植物。使用T1代植物來生產(chǎn)草甘膦田間耐受數(shù)據(jù)。對于各個事件，將T1代植物在田間用四種不同的草甘膦噴灑處理(OX、4×、8×和4×+4×)進行處理。以V3和V8對植物進行噴灑。在處理后10天，如實施例13中所描述，對植物的葉片變色和植物高度比較進行評分。T1代的田間噴灑數(shù)據(jù)與實施例13中報道的先前在溫室中獲得的結(jié)果密切相關(guān)。收集T2代種子，用于進一步研究。實施例16：GAT多肽的熱穩(wěn)定性A.溫度變化對表達GAT轉(zhuǎn)基因的草甘膦抗性植物的草甘膦耐受性的影響用實施例13中所述的方法，制備表達GAT變體轉(zhuǎn)基因10_4F2(SEQIDNO：203)、17-15H3(SEQIDNO：549)和18-28D9b(SEQIDNO：814)的玉米植物。在T1代植物中，評價溫度對草甘膦耐受性的影響。將T1代植物種植在涼爽/寒冷(白天14℃，夜晚8℃)、溫暖(白天28℃，夜晚20℃)和炎熱(白天37℃，夜晚20℃)的條件下。用四種不同草甘膦噴灑處理(OX、×、6×和8×)，在V2下對T1代植物進行噴灑。在處理后的第5天和14天，如實施例13中所述，對植物的葉片變色和植物高度比較進行評分。視覺觀察表明，草甘膦耐受性并不總是受到所測試的溫度范圍的負面影響。B.在體外溫度變化對GAT活性的影響按照如下方法，對多種GAT多肽(DS3(對應(yīng)于SEQIDNO：8的天然GAT多肽)、6_6D5(SEQIDNO：410)、17-15H3(SEQIDNO：601)、20-8H12(SEQIDNO：739)、22-13B12(SEQIDNO：781)和401(對應(yīng)于SEQIDNO：6的天然GAT多肽))的體外熱穩(wěn)定性進行評價。將酶分散到200μl條帶PCR試管(VWR，圣弗朗西斯科，加利福尼亞州)中，如圖17所示，在30℃到60℃之間的各種溫度下，在梯度熱循環(huán)儀器(MLResearch，Watertown，MA)中溫育15分鐘。通過離心去除沉淀的蛋白質(zhì)，如實施例7中所述，通過連續(xù)的分光光度分析，在22℃下，測量剩余的可溶蛋白的仍存在的酶活性。使用飽和濃度的草甘膦(DS3(SEQIDNO：8)、401(SEQIDNO：6和6_6D5(SEQIDNO：410)為10mM；17-15H3(SEQIDNO：601)、20-8H12(SEQIDNO：739)和22-13B12(SEQIDNO：781)為5mM)和AcCoA(167μM)。在圖17中描述了數(shù)據(jù)。在最高約42-約44℃的溫度下，天然(即野生型)的GAT多肽DS3(SEQIDNO：8)和401(SEQIDNO：6)的活性是穩(wěn)定的。對于任何生物體來說非天然的GAT多肽(即非野生型的)在范圍約47-約54℃的溫度下是穩(wěn)定的。按照如下操作，在37.5℃下測量多種GAT多肽的半衰期。將GAT多肽401(SEQIDNO：6)、17-15H3(SEQIDNO：601)、20-8H12(SEQIDNO：739)、22-13B12(SEQIDNO：781)、22-15B4(SEQIDNO：946)和22-18C5(SEQIDNO：795)溫育在25mMHepes，pH7.2，10mMKCl和10％甲醇的基質(zhì)(“HKM”)中。在各個時間點，取出等分試樣，用飽和濃度的草甘膦(401為20mM，剩下的為5mM)和AcCoA(167uM)，如實施例7所述，用連續(xù)分光光度分析，在22℃下重復分析3次。各個時間點上的標準方差平均為約2.9％。將GAT活性作為溫育時間的函數(shù)繪圖，將數(shù)據(jù)與指數(shù)衰減(y＝e-x)的曲線擬合，其中y是酶活性，而x是以小時計算的時間，由此計算出半衰期。數(shù)據(jù)被顯示在下面的表9中。表9.37.5℃下的GAT多肽的半衰期酶半衰期，小時401(SEQIDNO：6)1417-15H3(SEQIDNO：601)4520-8H12(SEQIDNO：739)5422-13B12(SEQIDNO：781)6722-15B4(SEQIDNO：946)2622-18C5(SEQIDNO：795)43實施例17：生產(chǎn)表達GAT轉(zhuǎn)基因的草甘膦抗性大豆用DuPontBiolisticPDS1000/He儀器，采用粒子槍轟擊法(參見Klein等人(1987)Nature327：70-73)，生產(chǎn)表達GAT變體轉(zhuǎn)基因的大豆植物。在轉(zhuǎn)化方法中所用的選擇試劑為潮霉素。在轉(zhuǎn)基因事件中潮霉素可選擇的標記基因保留下來，或者通過本領(lǐng)域知曉的方法切除潮霉素基因。用合成的組成型啟動子、GAT變體和PinII終止子來制備DNA片段。如上所述，將可選擇的標記基因，包括35SCaMV啟動子、HPT基因和NOS終止子與GAT基因變體一起共轟擊。在缺乏選擇試劑時，將轟擊的大豆胚胎形成懸浮組織培養(yǎng)一周。將胚胎形成懸浮組織在液體選擇培養(yǎng)基中放置6周。對推定的轉(zhuǎn)基因懸浮組織取樣，用于PCR分析，確定GAT基因的存在。將假定的轉(zhuǎn)基因懸浮培養(yǎng)組織在選擇培養(yǎng)基中維持3周，以獲得足以用于植物再生的組織。用標準操作，使懸浮組織成熟4周；使成熟的體細胞胚胎干燥4-7天，然后在萌發(fā)培養(yǎng)基中放置2-4周。將發(fā)芽的植物轉(zhuǎn)移到單元包裝盤(cellpacktray)的土壤中3周，以適應(yīng)環(huán)境。將植物栽到溫室內(nèi)的10英寸罐中，評價草甘膦抗性。為了確定表達GAT變體轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因大豆的草甘膦抗性水平，在溫室中，對T0代的植物噴灑草甘膦(RoundupULTRAMAXTM)。通過植物變色分值和植物高度測量值，評價植物抗性水平。噴灑草甘膦后2周時的變色分值9＝無葉子/莖變色7＝較小的葉/莖變色5＝更壞的葉/莖變色3＝嚴重脫色的植物或者變干的植物1＝死亡植物對于各個獨立的轉(zhuǎn)基因事件，將1-4棵植物送到溫室中。將每個事件的另外的1-2棵植物種植在控制環(huán)境的生長腔室中，用于種子生產(chǎn)，被噴灑草甘膦。在轉(zhuǎn)移到土壤后的3-4周，對溫室植物噴灑1×、2×或者4×草甘膦(1×草甘膦＝26盎司/英畝的RoundUpULTRAMAXTM)。具有2×和4×噴灑速度的T0代的植物的變色分值分別顯示在表10和表11中。這些結(jié)果表明，如PCR分析所證明，用GAT基因變體有效地轉(zhuǎn)化了大豆。表達GAT基因變體的轉(zhuǎn)基因大豆抵抗具有2×和4×噴灑速度的草甘膦。在4×草甘膦噴灑速度中存活的事件的確表現(xiàn)出某種程度的較小的葉子變色，但是，在2周的噴灑檢測中，植物恢復，并且顯示出正常的葉片形態(tài)。表10.用2×草甘膦處理后的第10天的抗性分值#用2×測試的事件分值為7-8的事件％分值為3-6的事件％SEQIDNO：1932715％(4)11％(3)SEQIDNO：824388％(3)74％(23)表11.用4×草甘膦處理后的第10天的抗性分值#用4×測試的事件分值為7-8的事件％分值為3-6的事件％SEQIDNO：824238％(2)43％(10)實施例18：鹽對GAT動力學的影響為了更好地接近本發(fā)明的GAT酶將被使用的生理學條件(例如植物細胞)，在存在所添加的鹽時，再次評價一些本發(fā)明的GAT酶的活性。對于天然的GAT酶GAT401(SEQIDNO：6)、B6(SEQIDNO：7)和DS3(SEQIDNO：8)和進化的GAT酶06D10(SEQIDNO：448)、104F2(SEQIDNO：454)、18-28D9(SEQIDNO：618)、17-15H3(SEQIDNO：601)、17-10B3(SEQIDNO：592)、20-8H12(SEQIDNO：739)、20-16A3(SEQIDNO：639)和20-30C6(SEQIDNO：683)，圖15A和15B分別提供了關(guān)于動力學參數(shù)Km和k催化/Km的比較，在缺乏所添加的KCl(無陰影欄)或者存在20mMKCl(陰影欄)下進行分析。用實施例7中所述的Bradford分析，確定蛋白質(zhì)濃度。由于缺乏KCl時，這些蛋白質(zhì)對草甘膦的Km極其低，用實施例3中所述的質(zhì)譜分析，確定缺乏KCl時進化GAT酶06D10、18-28D9和20-8H12的動力學參數(shù)，而其他動力學參數(shù)(無論KCl存在與否)用實施例7中所述的連續(xù)分光光度分析來確定。當可獲得時，誤差欄表示多個分析的標準偏差。圖15A顯示，將鹽(20mMKCl)加入到分析緩沖液時，顯著地提高對草甘膦的Km值。k催化值仍然相對未改變或者略微升高，最終結(jié)果為，存在20mMKCl時所觀察到的對于GAT酶的k催化/Km值低于缺乏所添加的KCl時的k催化/Km值(圖15B)。實施例19：進一步進化的編碼具有非常高活性的GAT酶的GAT基因額外重復定向的分子進化而獲得了進一步進化的GAT基因，其編碼具有非常高的GAT活性的GAT酶，例如具有一種或多種改進的特性，如與先前描述的GAT酶相比，降低的對于草甘膦的Km、升高的k催化或者升高的k催化/Km。首先選擇進一步進化的gat基因，用于如實施例8所述將大腸桿菌培養(yǎng)在最小M9培養(yǎng)基中，選擇時使用5mM而不是1mM的草甘膦。如上面的實施例6所描述，純化蛋白質(zhì)。在205nm下，通過UV吸光率來確定蛋白質(zhì)濃度。通過Scopes(1994；ProteinPurification，PrinciplesandPractice，Springer，紐約)描述的方法，根據(jù)公式E(mgml-1cm-1)＝27+120(A280/A205)＝30.5，來確定消光系數(shù)。在通過UV吸光率進行量化之前，使用NAP-5柱(Amersham-PharmaciaBiotech)，通過緩沖液將蛋白質(zhì)溶液交換到50mMNa2SO4中。示例性的進一步進化的gat編碼序列包括在此被確定為SEQIDNO：832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928和930的核酸序列，其分別編碼包括在此被鑒定為SEQIDNO：833、835、837、839、841、843、845、847、849、851、853、855、857、859、861、863、865、867、869、871、873、875、877、879、881、883、885、887、889、891、893、895、897、899、901、903、905、907、909、911、913、915、917、919、921、923、925、927、929和931的氨基酸序列的進一步進化的GAT酶。一些這種進一步進化的GAT酶具有非常高的GAT活性，其中其具有一種或多種改進的特性，例如與相同條件下分析的先前描述的GAT酶相比，降低的對于草甘膦的Km、升高的k催化或者升高的k催化/Km。圖16A、16B和16C分別提供了數(shù)種先前描述的GAT酶(無陰影欄)的動力學參數(shù)Km和k催化/Km與一些本發(fā)明的進一步進化的GAT酶(陰影欄)的動力學參數(shù)的比較，如上所述，存在20mMKCl時用連續(xù)分光光度分析和通過UV吸光率量化蛋白質(zhì)來進行分析。當可獲得時，誤差欄代表多個分析的標準偏差。在這些分析條件下，天然的GAT酶GAT401(SEQIDNO：6)對于草甘膦的Km為約4mM、k催化為約5.4min-1和k催化/Km為約1.35mM-1min-1。當在這些條件下進行分析時，一些本發(fā)明的進一步進化的GAT酶(陰影欄)對于草甘膦的Km范圍小于約0.4mM(例如在約0.4mM和0.1mM之間)，k催化值至少為約1000min-1(例如，在約1000min-1和約2500min-1之間)，k催化/Km值為至少約4800mM-1min-1(例如，在約4800mM-1min-1和約8000mM-1min-1之間)。例如，在這些分析條件下，一些本發(fā)明的進一步進化的GAT酶具有高于天然GAT酶GAT401至少約7000倍的k催化/Km值。一些本發(fā)明的進一步進化的GAT酶包含一個或多個未見于先前描述的GAT多肽和GAT酶上的氨基酸殘基，例如在位置27上，存在B1、Z1或A氨基酸殘基；在位置33上，存在N或G氨基酸殘基；在位置46上，存在B2、Z4或H氨基酸殘基；在位置93上，存在R氨基酸殘基；其中B1為選自由A、I、L、M、F、W、Y和V組成的組的氨基酸；而B2是選自由R、N、D、C、Q、E、G、H、K、P、S和T組成的組的氨基酸；Z1是選自由A、I、L、M和V組成的組的氨基酸殘基；Z4是選自由R、H和K組成的組的氨基酸。例如，一些本發(fā)明的進一步進化的GAT酶包含一個或多個：位置27上的Ala(即Ala27)；位置33上的Asn或Gly(即Asn33或Gly33)；位置46上的His(即His46)；和位置93上的Arg(即Arg93)，序列編號按照如SEQIDNO：907的編號。進行序列/活性分析，確定與高k催化/Km正向相關(guān)的氨基酸殘基(通過高k催化和低Km或者兩者來證明)?？此婆c高k催化/Km正向相關(guān)的氨基酸殘基包括Glul4、Asp32、Asn33、Gly38和Thr62(對應(yīng)于SEQIDNO：907的序列編號)?？梢詫⒁粋€或多個這種殘基的密碼子替代到模板GAT多肽的編碼序列的適當位置上，來構(gòu)建其他的GAT酶。例如，將編碼位置14的Glu、位置32的Asp、位置33的Asn、位置38的Gly和位置62的Thr的密碼子的一個或多個取代到編碼模板多肽的核酸序列上，來產(chǎn)生其他GAT酶，模板肽如上述具有非常高活性的進一步進化的GAT酶中的兩種，GAT24-5H5(SEQIDNO：845)或GAT25-8H7(SEQIDNO：907)。以這種方式產(chǎn)生的示例性的進一步進化的GAT酶，在此被鑒定為R12G1(SEQIDNO：917)、R12G2(SEQIDNO：919)、R12G3(SEQIDNO：921)、R12G4(SEQIDNO：923)、R12G5(SEQIDNO：925)、R12G6(SEQIDNO：927)、R12G7(SEQIDNO：929)和R12G8(SEQIDNO：931)，分別由被鑒定為SEQIDNO：916、918、920、922、924、926、928和930的核酸編碼，與模板多肽相比，具有非常高的GAT活性。實施例20：與高GAT活性相關(guān)的氨基酸氨基酸天冬氨酸(Asp，D)、組氨酸(His，H)和半胱氨酸(Cys，C)與各種乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性位點相關(guān)是已知的。為了確定任何這些殘基是否在GAT活性中起作用，將GAT20-30C6(SEQIDNO：683)的所有D、C和H殘基分別地突變?yōu)楸彼?Ala，A)，分析突變酶對N-乙酰草甘膦的活性。含有取代D34A和H41A的變體僅保留未被修飾的酶的活性的約2％-3％，而含有取代H138A的變體基本上無可檢測的GAT活性。另外，含有取代H138R和H138S的變體的GAT活性低，但是可檢測到(特別是在高于6.8的pH下)，表明位置138上的His(通常為Arg和Ser)可能作為活性位點的基礎(chǔ)。表12實施例21：改進植物中GAT的表達植物、動物和微生物具有特定的密碼子偏好是已知的，在基因轉(zhuǎn)錄本的翻譯過程中，影響氨基酸結(jié)合的效率。稀有密碼子會給翻譯過程中的tRNA恢復帶來麻煩，然后會導致較低的所編碼蛋白的積累。原始的親本gat基因來自細菌如地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，如此，可能不具有在植物中表達的優(yōu)化密碼子分布。本發(fā)明的進化的gat基因已經(jīng)成功地在植物中表達(參見上面的實施例9、11、13和17)，但是仍然存在通過提高在植物中的翻譯效率來改進蛋白質(zhì)生產(chǎn)的可能。實現(xiàn)該目的的一條途徑是，將gat編碼序列中的一個和多個在植物中很少被使用的密碼子替代為在植物中更常用的同一氨基酸的密碼子，從而在gat編碼序列中產(chǎn)生沉默突變，而不改變所編碼蛋白的序列。比較顯示了玉米、棉花和大豆中的密碼子使用頻率的表格(可從日本千葉的KazusaDNAResearchInstitute管理的網(wǎng)站上獲得)，產(chǎn)生如下表格(表13)，顯示通常在單子葉或雙子葉植物中更經(jīng)?；蜉^少使用的密碼子。表13用于提高微生物基因在植物中的表達的第二條途徑是，增加接近起始甲硫氨酸殘基處的G+C含量。植物中天然存在的編碼序列趨向于在緊鄰ATG起始密碼子的下游含有2個或3個G和/或C殘基(Joshi等人(1997)PlantMol.Biol.35：993-1001)。往gat編碼序列中的緊鄰ATG起始密碼子的下游處導入一個或多個富含CG的密碼子，可以產(chǎn)生更加植物樣的編碼序列，并且因而可能增加其在植物中的表達。將第二個密碼子(異亮氨酸，ATA)替代為丙氨酸密碼子(GCG)，生成與未被修飾的酶相比k催化降低的Ile2Ala變體。另一個方面，將丙氨酸密碼子(GCG或GCT)插入到密碼子位置1的Met和位置2的Ile密碼子之間，生成編碼含有插入在位置1的Met和位置2的Ile之間的Ala殘基的GAT酶的gat編碼序列。含有兩個插入在Met1和Ile2之間的丙氨酸的示例性GAT酶變體，鑒定為2-15B4M1MAA(表示在緊接位置1的Met后插入兩個Ala殘基)，具有蛋白質(zhì)序列SEQIDNO：948；與未被修飾的酶22-15B4(SEQIDNO：789)相比，其k催化下降了。含有插入在Met1和Ile2之間的丙氨酸的示例性GAT酶被稱作22-15B4MIMA(表示在緊接位置1的Met后插入一個Ala殘基)，具有蛋白質(zhì)序列SEQIDNO：946；與未被修飾的酶22-15B4(SEQIDNO：789)相比，其動力學基本上未改變。開發(fā)了用于改進GAT在植物中的表達的一般策略。例如，根據(jù)上述表格，通過將較少在植物中使用的密碼子替換為較常在植物中使用的密碼子，來改變進化的gat編碼序列。較少在植物中使用的密碼子(例如，根據(jù)上述表格)通常被去除。采取這種方式，gat編碼序列中至少一個密碼子(例如，至少3個密碼子、至少5個密碼子或者至少10個密碼子)被改變，由植物中較少使用的密碼子改變?yōu)橹参镏休^常使用的密碼子。被替換的密碼子可以在gat編碼序列的編碼序列的5′端(例如，前10個密碼子內(nèi)、前20個密碼子內(nèi)、前50個密碼子內(nèi)或者前100個密碼子內(nèi))。此外，被替換的密碼子可以在整條的gat編碼序列上。而且，選擇較常使用的密碼子，以避免在編碼序列中超過約5-10次(例如，超過5次、超過6次、超過7次、超過8次、超過9次、超過10次)的連續(xù)出現(xiàn)G+C或A+T。還可以改變編碼序列，如在緊鄰gat編碼序列的下游或者鄰近其起始Met密碼子處插入一個Ala密碼子(例如經(jīng)常使用的Ala密碼子)，以在緊鄰ATG起始密碼子的下游含有一個或多個富含CG的密碼子。表14提供了如上所述改變的示例性gat編碼序列原始gat編碼序列改變的gat編碼序列進行的密碼子改變所編碼的蛋白質(zhì)GAT20-8H12/4604(SEQIDNO：738)GAT4604SR(SEQIDNO：932)Ser62TCG-＞TCTArg111CGG-＞AGG20-8H12(SEQIDNO：739)GAT22-18C5/4609(SEQIDNO：794)GAT4609SR(SEQIDNO：933)Ser62TCG-＞TCTArg111CGG-＞AGG22-18C5(SEQIDNO：795)GAT22-16D8/4610(SEQIDNO：792)GAT4610R(SEQIDNO：934)Arg111CGG-＞AGG22-16D8(SEQIDNO：793)GAT22-15B4/4611(SEQIDNO：788)GAT4611R(SEQIDNO：935)Arg111CGG-＞AGG22-15B4(SEQIDNO：789)GAT24-5H5/4614(SEQIDNO：848)GAT4614SR(SEQIDNO：936)Ser62TCG-＞TCTArg111CGG-＞AGG24-5H5(SEQIDNO：849)GAT24-5H5/4614(SEQIDNO：848)GAT4614VSR(SEQIDNO：937)Val4GTG-＞GTASer62TCG-＞TCTArg111CGG-＞AGG24-5H5(SEQIDNO：849)GAT23-2H11/4615(SEQIDNO：836)GAT4615R(SEQIDNO：938)Arg111CGG-＞AGG23-2H11(SEQIDNO：837)GAT24-15C3/4616(SEQIDNO：862)GAT4616R(SEQIDNO：939)Arg111CGG-＞AGG24-15C3(SEQIDNO：863)GAT23-6H10/4617(SEQIDNO：844)GAT4617R(SEQIDNO：940)Arg111CGG-＞AGG24-6H10(SEQIDNO：845)GAT25-8H7/4618(SEQIDNO：906)GAT4618SR(SEQIDNO：941)Ser62TCG-＞TCTArg111CGG-＞AGG25-8H7(SEQIDNO：907，957)GAT25-8H7/4618(SEQIDNO：906)GAT4618VSR(SEQIDNO：942)Val4GTG-＞GTASer62TCG-＞TCTArg111CGG-＞AGG25-8H7(SEQIDNO：907)GAT25-19C8/4619(SEQIDNO：912)GAT4619SR(SEQIDNO：943)Ser62TCG-＞TCTArg111CGG-＞AGG25-19C8(SEQIDNO：913)表14(續(xù))GAT25-19C8/4619(SEQIDNO：912)GAT4619VSR(SEQIDNO：944)Val4GTG-＞GTASer62TCG-＞TCTArg111CGG-＞AGG25-19C8(SEQIDNO：913)GAT22-15B4/4611(SEQIDNO：788)GAT4611A(SEQIDNO：945)插入在Met1和Met2之間的Ala22-15B4M1MA(SEQIDNO：946)GAT22-15B4/4611(SEQIDNO：788)GAT4611AA(SEQIDNO：947)兩個插入在Met1和Met2之間的Ala22-15B4M1MAA(SEQIDNO：948)GAT25-8H7/4618(SEQIDNO：906)GAT4618A(SEQIDNO：949)插入在Met1和Met2之間的Ala25-8H7M1MA(SEQIDNO：950)GAT25-8H7/4618(SEQIDNO：906)GAT4620(SEQIDNO：951)插入在Met1和Met2之間的Ala和前7個較常使用的密碼子；加上Ser62TCG-＞TCTArg111CGG-＞AGG25-8H7M1MA(SEQIDNO：950)GAT25-8H7/4618(SEQIDNO：906)GAT4621(SEQIDNO：952)插入在Met1和Met2之間的Ala和較常使用的密碼子25-8H7M1MA(SEQIDNO：950)通過電穿孔，將在T-DNA中具有dMMV-gat-UBQ3表達盒的雙元載體轉(zhuǎn)化到活性根癌農(nóng)桿菌菌株C58細胞中(McCormac等人，MolBiotechnol.9：155-159，1998)。在28℃下在LB+40ug/ml卡那霉素的平板中生長2天后，將菌落接種到LB+40ug/ml卡那霉素液體培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u床培養(yǎng)過夜。以4000g離心10分鐘，收集農(nóng)桿菌細胞，然后重懸在與起始培養(yǎng)體積相當?shù)?0mMMgSO4中。用1ml塑料注射器(無針頭)給細菌懸浮液加壓，將其“滲透”到煙草葉片的細胞間隙中。將200-300μl的細菌懸浮液滲透到各個斑點上(通常滲透面積為3-4cm2)，在仍然附著在植物上的單個葉片上分布4個或更多個斑點。在某些情形下，在進行滲透之前，用第二種缺乏gat的農(nóng)桿菌菌株，以5∶1或10∶1稀釋含有g(shù)at的農(nóng)桿菌菌株。該稀釋步驟具有減少在植物細胞中過度表達gat基因的作用，從而防止飽和，使得更加容易可視化變體和構(gòu)建體之間的表達差異。3天后，研磨葉片材料，在水溶性緩沖液中進行提取，并離心。上清液含有可溶的蛋白質(zhì)，進行SDS-PAGE，用抗GAT的多克隆抗體對凝膠進行印跡和探查。將滲透了GAT4620基因的煙草葉片中積累的GAT蛋白含量與用未被修飾的GAT25-gH7/4618基因轉(zhuǎn)化的葉片中積累的蛋白質(zhì)的含量進行比較。另一個方面，與表達未被修飾GAT25-8H7/4618基因的葉片相比，具有GAT4621基因的煙草葉片在總蛋白百分含量上具有高兩倍的GAT蛋白積累。實施例22：表達GAT轉(zhuǎn)基因的草甘膦抗性大豆的T1代試驗用實施例17所述方法，制備表達GAT轉(zhuǎn)基因18-28D9c(SEQIDN0：824)的大豆植物。從噴灑草甘膦的T0代植物收集T1代種子。在溫室條件下，T1代種子在從Scotts，Marysville，OH購買的RediEarthR360培養(yǎng)基中萌發(fā)，用實施例17所述方法，在V2-V3階段，噴灑2×或者4×草甘膦(RoundUpULTRAMAXTM，從密蘇里州州圣路易斯的孟山都公司購買)。T1代的溫室噴灑數(shù)據(jù)與先前的T0代植物的溫室結(jié)果十分相關(guān)。收集T2代種子，用于進一步研究。實施例23：生產(chǎn)表達GAT和HRA轉(zhuǎn)基因的草甘膦和磺胺抗性的大豆用實施例17的方法，制備表達GAT&HRA的大豆植物，hRA是乙酰乳酸合酶的高抗性等位基因(美國專利5,605,011、5,378,824、5,141,870和5,013,659)。HRA基因用作轉(zhuǎn)化的可選擇標記基因。選擇試劑為濃度為100ng/ml的氯磺隆?？蛇x擇標記基因由來自大豆(Glycinemax)的S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)啟動子(U.S.2003/226166)、來自大豆的HRA編碼序列和來自大豆的乙酰乳酸合酶終止子組成?？蛇x擇的標記基因被連接到GAT構(gòu)建體上，或者與該構(gòu)建體共轟擊，該構(gòu)建體由合成的組成型啟動子(美國專利6,072,050和6,555,673)或者玉米組蛋白2B啟動子(美國專利6,177,611)、GAT變體(18-28D9c(SEQIDNO：824))和PinII終止子(Gyheungan等人，PlantCell1：115：122(1989))組成。如實施例17所述，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。如實施例17所述，在2×或4×草甘膦應(yīng)用速度后，用植物變色分值確定草甘膦抗性水平。顯示在表15中的結(jié)果證明，不同的組成型啟動子驅(qū)動GAT變體(18-28D9c(SEQIDNO：824))，在T0植物中賦予草甘膦抗性。表15.用4×草甘膦處理后10天的抗性分值事件用4×檢測的#事件7-8分值的事件％3-6分值的事件％PHP20163a(45)(SEQIDNO：824)(SCP1啟動子)5815.5％(9)77.6％(45)PHP20558a(11)(SEQIDNO：824)(H2B啟動子)2634.6％(9)42.3％(11)實施例24：表達GAT和HAR轉(zhuǎn)基因的大豆的T1代出土前試驗將從如實施例17所述的試驗中產(chǎn)生的T1種子種植在溫室內(nèi)的一盆TamaSiltloam中。以70gms活性成分/公頃的速度，立即對盆噴灑出土前施用的氯嘧磺隆(chlorimuron)、玉嘧磺隆(rimsulfuron)或者苯磺隆(tribenuron)。在噴灑施用后的第10天，按照實施例17所述的植物變色分值，對萌發(fā)的植物進行評價。所有的HAR和GAT事件以9級(未受損)，在所有的出土前噴灑應(yīng)用中存活。這些結(jié)果證明，大豆中具有對磺胺的出土前抗性。實施例25：表達GAT和HAR轉(zhuǎn)基因的大豆的T1代出土后試驗在溫室內(nèi)，從如實施例17所述的試驗中產(chǎn)生的T1種子在RediEarthR360培養(yǎng)基中萌發(fā)。在V2-V3階段(種植后14天)，對植物噴灑噻磺隆(thifensulfuron)、豆磺隆、玉嘧磺隆或苯磺隆(分別為70、70、35、35gma.i./公頃)。在噴灑施用后的第10天，按照實施例17所述的植物變色分值，對植物進行評價。結(jié)果示于表16中。表16.用磺胺進行出土后處理后第10天的抗性分值GAT(SEQIDNO：824)/SAMS啟動子-HRA事件的平均抗性分值未噴灑的對照9氯嘧磺隆(70gm活性成分/公頃)7.75玉嘧磺隆(35gm活性成分/公頃)2.21苯磺隆(35gm活性成分/公頃)3.83噻磺隆(70gm活性成分/公頃)7.81如實施例17所述的各種方法，10天后，對用噻磺隆噴灑后具有7級或8級的植物變色的事件噴灑2×或4×的草甘膦用量。按照實施例17所述的變色分值，對事件進行評價。所有的噻磺隆耐受事件以7級或8級在草甘膦噴灑中存活(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果證明，在溫室條件下，分別由HRA和GAT基因賦予的噻磺隆耐受性和草甘膦耐受性是100％相關(guān)，分別耐受70gm活性組分/公頃噻磺隆和2×草甘膦。實施例26：表達GAT轉(zhuǎn)基因的草甘膦抗性玉米植物的T3代試驗采用實施例13中描述的方法，制備表達GAT轉(zhuǎn)基因20-H812(SEQIDNO：738)和20-16A3(SEQIDNO：638)的草甘膦抗性玉米植物。10天后對植物評分，并如實施例13所述確定葉片變色分值。特別地，在V4葉片階段對植物進行噴灑。在進行噴灑處理后，在等間距內(nèi)的植物變得稀少，豎立的數(shù)量也變少。購買得到的NK603(孟山都，圣路易斯，密蘇里州州)作為對照?？剐苑种碉@示在表18中。處理后第10天，進行植物高度的測量，結(jié)果顯示在表18中。表18.用草甘膦處理后第10天的抗性分值表19.用草甘膦處理后第10天的植物高度(英寸)實施例27：表達GAT轉(zhuǎn)基因的草甘膦抗性玉米的T3代的產(chǎn)量試驗用從實施例15獲得的T3代種子生產(chǎn)T3代植物，用于產(chǎn)生關(guān)于雜合體的草甘膦田間耐受性數(shù)據(jù)。該試驗在智利的Viluco進行，采用裂區(qū)(split-plot)設(shè)計，四個(4)重復。特別地，包括3個試驗對象(entries)。這些試驗對象中的兩個包括表達GAT變體轉(zhuǎn)基因17-15H3(SEQIDNO：549)的玉米植物。草甘膦抗性對照NK603可以從孟山都購買得到，作為第三個試驗對象。對于每個事件，將所有的試驗對象在田間用四種不同的草甘膦噴灑處理(OX、在V4階段以4×，在V4階段以8×，和在V4階段以4×和在V8階段以4×)進行處理。處理后第10天，如實施例13所述對植物的高度比較進行評分。T3代田間噴灑數(shù)據(jù)與實施例15中報道的先前在田間獲得的結(jié)果十分相關(guān)。特別地，所有以1×和4×草甘膦噴灑的試驗對象在高度上與未噴灑的對照相似。在較高的V4以4×和V8以4×噴灑速度時，GAT對象的高度暫時地下降了12-17％，而NK603下降了6％；但是在季節(jié)(在繁殖器官成熟過程中)，用草甘膦處理的對象的高度與未噴灑的對象的高度相同。而且，草甘膦處理的對象的產(chǎn)量在數(shù)量上和統(tǒng)計學上并不低于未被噴灑的對象(LSD0.05＝11.8bu./英畝，每個對象的平均產(chǎn)量＝243bu./英畝)。種植在Johnston，IA和York，NE的初步試驗田中的相同事件的T2植物，也獲得類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例28：表達GAT轉(zhuǎn)基因的草甘膦抗性玉米的T2代試驗對GAT陽性和GAT陰性的不同品系進行試驗。采用實施例17所述的方法，制備表達GAT轉(zhuǎn)基因18-28D9b(SEQIDNO：814)、17-15H3(SEQIDNO：549)、20-8H12(SEQIDNO：738)、20-16A3(SEQIDNO：638)的玉米植物。對T2代植物進行檢查。在V4階段，以1×(26盎司/AUltraMaxTM)噴灑GAT陽性的T2代植物。在V4階段，對GAT陰性的T2代植物進行PCR取樣。從每一行中去除GAT陽性植物。不對GAT陰性植物應(yīng)用草甘膦。抽取植物，使得每一行中植物間的間距相等。進行4個(4)重復。對從每一行的中央收獲的5條(5)穗上獲得的谷物進行干燥和稱重。如表20中所示，在任何構(gòu)建體中，都未檢測到產(chǎn)量下降。表20.產(chǎn)量數(shù)據(jù)構(gòu)建體#事件產(chǎn)量在V階段，噴灑1×(26盎司/英畝)ULTRAMAXTM的GAT陽性產(chǎn)量未施用草甘膦的GAT陰性的PHP19286(SEQIDNO：814)401.65lbs/5穗1.57lbs/5穗PHP19288(SEQIDNO：549)401.64lbs/5穗1.60lbs/5穗PHP19900(SEQIDNO：738)61.20lbs/5穗1.23lbs/5穗PHP19902(SEQIDNO：638)41.19lbs/5穗1.21lbs/5穗實施例29：GAT多肽的氨基酸底物用許多氨基酸底物，對數(shù)種本發(fā)明的GAT多肽的GAT活性進行評價。將GAT多肽、AcCoA和氨基酸底物溫育在96孔聚苯乙烯平板的孔中的25mMHepes，pH6.8，10％乙二醇中。30分鐘后，加入30μl溶于500mMTris，pH7.5中的10mM5，5′-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)來終止反應(yīng)。2分鐘后，在412nm下，在SpectramaxPlus平板閱讀器(MolecularDevices，Sunnyvale，加利福尼亞州)讀取吸光率。除了草甘膦，天然的GAT多肽401(SEQIDNO：6)(或者在為膦絲菌素的情形下為B6(SEQIDNO：7))對于12種氨基酸具有可檢測的活性。天然的GAT多肽對L-天冬酰胺的活性約與草甘膦一樣，而對L-絲氨酸的活性比草甘膦約高4.7倍，對磷酰-L-絲氨酸的活性比草甘膦約高2倍。當與天然的GAT多肽比較時，非天然的GAT多肽17-15H3(SEQIDNO：601)和25-8H7(SEQIDNO：907)對天冬酰胺的活性高40倍，但是對絲氨酸和膦絲菌素的活性失去了。除了天冬酰胺和絲氨酸外，對于如下的L-氨基酸，天然GAT多肽的活性為對1mM濃度存在的草甘膦的活性的3％或更高：組氨酸(10％)、酪氨酸(18％)、色氨酸(250％)、纈氨酸(12％)、谷氨酸酰胺(51％)、天冬酰胺(27％)、谷氨酸(32％)、丙氨酸(33％)、甘氨酸(21％)和半胱氨酸(50％)。對其他蛋白質(zhì)氨基酸的活性不可檢測或者低于對作為底物的草甘膦的GAT活性的3％。對于L-天冬酰胺(2mM)、L-丙氨酸(10mM)和甘氨酸的N-甲基衍生物(即肌氨酸，10mM)，天然的GAT多肽未觀察到可檢測的活性。該百分率是相對于GAT多肽對于底物草甘膦的活性的活性百分數(shù)。一些數(shù)據(jù)顯示在表21中。表21.對于草甘膦、天冬酰胺和絲氨酸的GAT活性GAT變體底物K催化±SEmin-1KM±SEmMK催化/KMmin-1mM-1K催化/KM401草甘膦5.35±0.0431.27±0.01444.21改善的倍數(shù)17-15H31150±27.60.251±0.00414573108625-8H71480±65.40.05296007031％草甘膦401天冬酰胺24.16.73.685.517-15H3435±11.32.95±0.1621483.2425-8H7702±12.44.56±0.1121540.520401絲氨酸8544319.847117-15E3242±15.860.1±1.684.040.088225-8H7388±18.5154±10.72.530.00855實施例30：pH對GAT活性的影響用實施例7中所述的分光光度分析方法，除了分析用的緩沖液為滴定到一定的pH值范圍的50mMHepes和10％乙二醇外，確定對于野生型酶B6(SEQIDNO：7)和GAT多肽17-15H3(SEQIDNO：601)的k催化和KM的pH最佳值。通過實施例19中描述的UV吸光率分析方法，確定蛋白質(zhì)濃度。對于克隆B6(SEQIDNO：7)和GAT多肽17-15H3(SEQIDNO：601)，pH對k催化和KM的影響顯示在圖18中。雖然出于清楚和理解的目的，前述的發(fā)明已經(jīng)被略微詳細地描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當清楚，通過閱讀本公開，可以從形式上和詳細地進行各種改變，而不脫離本發(fā)明的實際保護范圍。例如，上述的所有技術(shù)、方法、組合物、設(shè)備和系統(tǒng)可以各種組合來使用。本發(fā)明旨在包括所有在此描述的方法和試劑，以及所有的多核苷酸、多肽、細胞、生物體、植物、農(nóng)作物等，它們是這些新方法和試劑的產(chǎn)物。所有的出版物、專利、專利申請或者其他在本申請中引用的文件處于所有目的被完全引入作為參考，與每個單獨的出版物、專利、專利申請或者其他文件出于各種目的被個別地說明引入作為參考的程度相同。序列表<110>Castle，LindaA.Siehl，DanielGiver，LorraineMinshull，JeremyIvy，ChristinaChen，YongHongPatten，PhillipGordon，RebeccaDuck，NicholasB.McCutchen，BillyFredKemble，Roger<120>新的草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT)基因<130>035718/277848<140><141>2004-04-29<150>US10/427,692<151>2003-04-30<150>CL863-2003<151>2003-04-29<160>972<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>441<212>DNA<213>地衣芽胞桿菌<220><223>ST401gat<400>1atgattgaagtcaaaccaataaacgcggaagatacgtatgagatcaggcaccgcattctc60cggccgaatcagccgcttgaagcatgtatgtatgaaaccgatttgctcgggggtgcgttt120cacctcggtggatattaccggggcaagctgateagcatcgcttcctttcataaagccgaa180cattcagagcttgaaggcgaagaacagtatcagctgagagggatggcgacgcttgaagga240taccgtgagcaaaaagcgggaagcacgctcatccgccatgccgaagagcttcttcggaaa300aagggggcagaccttttatggtgcaatgccaggacatctgtgagcggctactatgaaaag360ctcggcttcagcgaacagggcgaagtctacgacataccgccgatcggacctcatattttg420atgtataagaaattgacgtaa441<210>2<211>441<212>DNA<213>未知的<220><223>從土壤樣品得到的未鑒定的微生物<220><223>B6gat<400>2atgattgaagtcaaacctataaacgcggaagatacgtatgagatcaggcaccgcattctc60cggccgaatcagccgctggaagcatgcaagtatgaaaccgatttgctcgggggcacgttt120cacctcggcggatattatcgggacaggctgatcagcatcgcctcctttcatcaagccgaa180cattcagagcttgaaggccaaaaacagtatcagctgagagggatggcgacacttgaaggg240taccgcgagcaaaaagcgggcagtacgcttatccgccatgccgaagagcttcttcggaaa300aaaggcgcagaccttttatggtgcaacgccaggacatctgtgagcgggtactata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210>280<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>10_4H7<400>280MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuValSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspIleProProThrGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>281<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>10_6D11<400>281MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrLeuHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuValSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspIleProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>282<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>10_8C6<400>282MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGly115120125ValTyrAspIleProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>283<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>11C3<400>283MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrGlnGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerValSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGly115120125ValTyrAspIleProProIleGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>284<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>11G3<400>284MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrGlnGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrGluLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGly115120125ValTyrAspIleProProIleGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuAla145<210>285<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>11H3<400>285MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrGlnGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisLysAlaGluHisSerGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerValArgGlyTyrTyrGluLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGly115120125ValTyrAspIleProProIleGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>286<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>12_1F9<400>286MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValHisAspIleProProThrGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>287<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>12_2G9<400>287MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuValSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>288<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>12_3F1<400>288MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnL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合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>12G7<400>297MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrGlnGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisLysAlaGluHisSerGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerValSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspIleProProIleGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>298<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>1_2H6<400>298MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGly115120125ValTyrAspIleProProIleGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>299<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>13_12G12<400>299MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheAsnGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGlu65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspIleProProValGlyProHisIleLeuMetHisLysLys130135140LeuThr145<210>300<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>13_6D10<400>300MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspSerLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheAsnGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>301<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>13_7A7<400>301MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgSerAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGlu65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>302<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>13_7B12<400>302MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlySerThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspIleProProThrGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>303<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>13_7C1<400>303MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaArgGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspIleProProThrGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>304<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>13_8G6<400>304MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspSerLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheAsnGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGly115120125ValTyrAspIleProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>305<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>13_9F6<400>305MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGlu65707580Ty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400>314MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuValSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluAla859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGly115120125ValTyrAspIleProProAlaGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>315<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>14_4H8<400>315MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlySerThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>316<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>14_6A8<400>316MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuValSerIleAlaSerPheAsnGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspThrProProValGlyProHisValLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>317<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>14_6B10<400>317MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGly115120125ValTyrAspMetProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>318<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>14_6D4<400>318MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheAsnGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluAla859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>319<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>14_7A11<400>319MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuValSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyLeuLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspThrProProThrGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>320<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>14_7A1<400>320MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuValSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGlu65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspThrProProAlaGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>32l<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>14_7A9<400>321MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuValSerIleAlaSerPheHisGlnAlaLysHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>322<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>14_7G1<400>322MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheAsnGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGlu65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuI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<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>9_15H3<400>425MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspMetLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGlu65707580TyrHisGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAsnThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>426<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>9_18H2<400>426MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560ValGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspIleProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>427<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>9_20F12<400>427MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgValLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045GluLeuValSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGly115120125ValTyrAspIleProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>428<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>9_21C8<400>428MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerAspGlnGlyGlu115120125ValTyrAspIleProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>429<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>9_22B1<400>429MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuValSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspLeuProProThrGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>430<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>9_23A10<400>430MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrLeuHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuValSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGlyGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGly115120125ValTyrAspIleProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>431<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>9_24F6<400>431MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluAla859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspIleProProThrGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>432<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>9_4H10<400>432MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysLysTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrLeuHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuIleTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValTyrAspIleProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysLys130135140LeuThr145<210>433<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>9_4H8<400>433MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluIleArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuGlyGlyThrPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheAsnGlnAlaGluHisProGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLe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序列<220><223>0_5B8<400>442MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisLysIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetTyrGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerAspLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuIleArgHisAlaGluGln859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140LeuThr145<210>443<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>0_5C4<400>443MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisLysIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGlyLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerSerIleIleLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>444<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>0_5D11<400>444MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetTyrGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerAspLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGln859095LeuLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysArgLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValPheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140LeuThr145<210>445<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>0_5D3<400>445MetLeuGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetTyrGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerSerLeuIleLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>446<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>0_5D7<400>446MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluGluThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuIleArgHisAlaGluGln859095LeuLeuArgLysLysGlyAlaAsnMetLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110ThrAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>447<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>0_6B4<400>447MetLeuGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetTyrGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaLeuHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerAspLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580PheArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuIleArgHisAlaGluGln859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyLys115120125ValPheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>448<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>0_6D10<400>448MetLeuGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisLysIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluValCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerAspLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuIleArgHisAlaGluGln859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspMetLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValPheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140LeuThr145<210>449<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>0_6D11<400>449MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetTyrGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerAspLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580PheArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuIleArgHisAlaGluGln859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValPheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>450<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>0_6F2<400>450MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetTyrGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580PheArgGluGlnLysAlaGl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><223>11_3B1<400>459MetLeuGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerAspLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580PheArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysArgLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140LeuThr145<210>460<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>11_3B5<400>460MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuIleArgHisAlaGluGln859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspMetLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValPheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>461<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>11_3C12<400>461MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluValCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrGlyGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisProAspLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuIleArgHisAlaGluGln859095LeuLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>462<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>11_3C3<400>462MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisLysIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetTyrGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaLeuHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerSerLeuIleLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValPheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>463<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>11_3C6<400>463MetLeuGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisLysIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrGlyGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerAspLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerThrLeuIleArgHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>464<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>11_3D6<400>464MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluValCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerAspLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerSerLeuIleLysHisAlaGluGln859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValPheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140LeuThr145<210>465<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>1_1G12<400>465MetLeuGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluValCysMetTyrGlu202530ThrAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrGlyGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuIleLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValPheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140LeuThr145<210>466<21l>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>1_1H1<400>466MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluGluThrTyrGluLeuArg151015HisLysIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetTyrGlu202530SerAspLeuLeuArgGlySerPheHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045GlnLeuIleSerIleAlaSerPheHisLysAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580PheArgGluGlnLysAlaGlySerSerLeuIleArgHisAlaGluGlu859095IleLeuArgAsnLysGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110ThrAlaSerGlyTyrTyrLysArgLeuGlyPheSerGluHisGlyGlu115120125ValPheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>467<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>1_1H2<400>467MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProLeuGluAlaCysMetTyrGlu202530SerAspLeuLeuArgGlySerPheHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580PheArgGluGlnLysAlaGly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PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>D_S00260743_17-15B10<400>599MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisLysIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrGlyGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisLeuAspLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerSerLeuIleLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140LeuThr145<210>600<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>D_S00260793_17-15G12<400>600MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerValAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuValLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerG1yTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140LeuThr145<210>601<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>D_S00260796_17-15H3<400>601MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrGlyGIy354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnLysGInTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerSerLeuIleLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValPheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>602<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>17-16A10<400>602MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerSerLeuValLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspMetLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheAspThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>603<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>D_S00260847_17-16D6<400>603MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerValAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuValLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140LeuThr145<210>604<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>D_S00260855_17-16F2<400>604MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisLysIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyPheTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerAspLeu505560GluGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerSerLeuIleLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspMetLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>605<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>D_S00260862_17-16F9<400>605MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerGluLeu505560GlnGlyGlnGluGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgAspGlnLysAlaGlySerSerLeuValLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125ValPheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>606<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>D_S00260904_17-17B3<400>606MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisLysIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaLeuHisLeuGlyGlyTyrTyrArgGly354045LysLeuIleSerIleAlaSerPheHisGlnAlaGluHisSerAspLeu505560GlnGlyGlnLysGlnTyrGlnLeuArgGlyMetAlaThrLeuGluGly65707580TyrArgGluGlnLysAlaGlySerSerLeuValLysHisAlaGluGlu859095IleLeuArgLysArgGlyAlaAspLeuLeuTrpCysAsnAlaArgThr100105110SerAlaSerGlyTyrTyrLysLysLeuGlyPheSerGluGlnGlyGlu115120125IlePheGluThrProProValGlyProHisIleLeuMetTyrLysArg130135140IleThr145<210>607<211>146<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的蛋白質(zhì)序列<220><223>D_S00260929_17-17D4<400>607MetIleGluValLysProIleAsnAlaGluAspThrTyrGluLeuArg151015HisArgIleLeuArgProAsnGlnProIleGluAlaCysMetPheGlu202530SerAspLeuLeuArgGlyAlaPheHisLeuGlyGlyT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