抗人γδTCR單克隆抗體的重組單鏈抗體G5-4ScFv及其編碼基因與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于單克隆抗體及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及抗人γδTCR單克隆抗體的重組單鏈抗體G5-4ScFv(文中也簡稱“G5-4ScFv”)及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：
T細(xì)胞可依據(jù)表面受體(TCR)的不同表達(dá)而分成兩類：TCRαβ細(xì)胞和TCRγδ細(xì)胞。γδT細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞庫中一個(gè)數(shù)量較小的亞群，約占正常人外周血T淋巴細(xì)胞總數(shù)的1％-5％，但在表皮及粘膜等上皮組織中相對(duì)富集。在腫瘤免疫中γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別不具M(jìn)HC限制性及不需特異的抗原呈遞作用，且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具細(xì)胞毒活性，從而具有用于腫瘤過繼免疫治療的潛能?？贵w固相化體外擴(kuò)增是獲得γδT細(xì)胞的一個(gè)重要手段，但是由于目前的抗γδTCR單克隆抗體為鼠源性，會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)，因而在臨床治療上受到較大限制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種抗人γδTCR單克隆抗體的重組單鏈抗體。本發(fā)明所提供的抗人γδTCR單克隆抗體的重組單鏈抗體，命名為G5-4ScFv，來源于小鼠屬小鼠(Musmusculus)，G5-4ScFv的重鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQIDNo：1的氨基酸殘基序列，輕鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQIDNo：2的氨基酸殘基序列。序列表中的SEQIDNo：1由120個(gè)氨基酸殘基組成，序列表中的SEQIDNo：2由108個(gè)氨基酸殘基組成。編碼重組單鏈抗體G5-4ScFv的基因(G5-4ScFv)，其重鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中SEQIDNo：3的DNA序列或編碼序列表中SEQIDNo：1的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNo：3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列，其輕鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中SEQIDNo：4的DNA序列或編碼序列表中SEQIDNo：2的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNo：4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQIDNo：3由360個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNo：1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，序列表中的SEQIDNo：4由324個(gè)堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNo：2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。所述重組單鏈抗體G5-4ScFv的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可通過柔性連接肽連接，所述柔性連接肽的氨基酸殘基序列的通式為(Gly4Ser)n，n為1-5的整數(shù)，優(yōu)選為3，其中n為3時(shí)的重組單鏈抗體G5-4ScFv的氨基酸殘基序列如序列表中序列5所示。序列表中的SEQIDNo：5由249個(gè)氨基酸殘基組成。編碼上述具有(Gly4Ser)3柔性連接肽的重組單鏈抗體G5-4ScFv的基因的核苷酸序列可如序列表中SEQIDNo：6所示。序列表中的SEQIDNo：6由750個(gè)堿基組成。含有本發(fā)明基因G5-4ScFv的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增G5-4ScFv中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)抗人γδTCR單克隆抗體重組單鏈抗體G5-4ScFv的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)重組單鏈抗體G5-4ScFv的方法，是將編碼重組單鏈抗體的重組基因G5-4ScFv插入表達(dá)載體中，再將構(gòu)建的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，經(jīng)表達(dá)、純化得到高活性的重組單鏈抗體G5-4ScFv。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。所述大腸桿菌具體可為E.coliBL2l(DE3)、E.coliBL2l(DE3，plysS)、E.coliJM109、E.coliHB101或E.coliTopl0等，優(yōu)選為E.coliBL2l(DE3)。當(dāng)所述宿主為大腸桿菌時(shí)，用于構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體可為現(xiàn)有的在上述大腸桿菌中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體具體可為將重組基因G5-4ScFv插入pET-22b(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組表達(dá)載體G5-4ScFv-PET22b(+)-sp和G5-4ScFv-PET22b(+)。具體來講，轉(zhuǎn)化有G5-4ScFv-PET22b(+)-sp或G5-4ScFv-PET22b(+)的重組大腸桿菌分別為G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB或G5-4SCFV-PET22b(+)-transB。其中G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB已于2011年6月24日在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCCNo.4983，G5-4SCFV-PET22b(+)-transB已于2011年6月24日在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCCNo.4984。這些菌株也屬于本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容。上述重組表達(dá)載體和工程菌均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。培養(yǎng)含有本發(fā)明抗人γδTCR單克隆抗體的重組單鏈抗體G5-4ScFv基因編碼序列的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。在大腸桿菌宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)時(shí)需加入IPTG誘導(dǎo)劑，所加入IPTG的濃度優(yōu)選為200μmol/L，誘導(dǎo)溫度為16-37℃，優(yōu)選為20℃。本發(fā)明還提供了所述的抗人γδTCR單克隆抗體的重組單鏈抗體在制備擴(kuò)增γδT細(xì)胞制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種刺激γδT細(xì)胞增殖的方法。是用5μg/mL的本發(fā)明中的重組單鏈抗體G5-4ScFv包被培養(yǎng)板，加入2×106個(gè)新鮮分離的人PBMC，用含IL-2(200U/mL)的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2周，得到γδT細(xì)胞。該刺激γδT細(xì)胞增殖的方法可用于體外或體內(nèi)。本發(fā)明中，可以按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備的抗人γδTCR單克隆抗體(如參見以下文獻(xiàn)中記載的方法制備：KohlerandMilrtein，Nature256：495-96，1975；HarlowandLane，Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，1988)。必要時(shí)，也可以按照美國專利5,585,089中所述的方法制備相應(yīng)的人源化形式的抗人γδTCR單克隆抗體。具體來講，本發(fā)明抗人γδTCR單克隆抗體的制備方法，可包括以下步驟：1)用γ9δ2(OT3)-Fc(《昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白及其生物學(xué)功能的初步鑒定》《基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床》Dec.2009.Vol.29No.12)作為免疫原免疫動(dòng)物；2)分離免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞；3)篩選并培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞；4)從細(xì)胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細(xì)胞的動(dòng)物的腹水液中分離并純化出抗人γδTCR單克隆抗體。在上述抗人γδTCR單克隆抗體的制備方法中，步驟1)中的免疫原應(yīng)選擇具有強(qiáng)免疫原性的生物學(xué)材料如細(xì)胞，并且希望該細(xì)胞所表達(dá)的抗原分子的空間構(gòu)型能以自然狀態(tài)暴露于細(xì)胞膜表面，從而可更有效地激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。步驟1)中用于制備單克隆抗體的免疫動(dòng)物可為小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豬、驢、馬等哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為小鼠。步驟2)中當(dāng)被免疫動(dòng)物的血清抗體水平達(dá)到峰值時(shí)，可分離動(dòng)物的脾細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液。必要時(shí)，可使用免疫吸附方法篩選脾細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)娜诤蟿?如聚乙二醇)的誘導(dǎo)下與骨髓瘤細(xì)胞(優(yōu)選為小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0)融合以形成雜交瘤。步驟3)中可以在選擇性培養(yǎng)基(如HAT培養(yǎng)基)中培養(yǎng)以篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)一步可使用流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡法、免疫沉淀法等方法鑒定所需的陽性抗性細(xì)胞株。步驟4)中可于體外(如在組織培養(yǎng)瓶或多孔纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠腹水)培養(yǎng)所選擇的分泌抗人γδTCR單克隆抗體的雜交瘤，并從細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水液中收集和純化出抗人γδTCR單克隆抗體。本發(fā)明提供了抗人γδTCR單克隆抗體的重組單鏈抗體G5-4ScFv及其編碼基因。本發(fā)明制備了分泌能刺激γδT細(xì)胞增殖的抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并獲得相應(yīng)抗體的可變區(qū)序列，構(gòu)建了含重組單鏈抗體基因的重組質(zhì)粒，并在工程菌中進(jìn)行表達(dá)，得到重組單鏈抗體G5-4ScFv。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組單鏈抗體G5-4ScFv能與γδTCR特異結(jié)合；固相化能刺激人PBMC中γδT細(xì)胞增殖，2周時(shí)其純度可達(dá)90％；擴(kuò)增得到的γδT細(xì)胞在刺激時(shí)能有效分泌IFN-γ和TGF-α，并能有效殺傷腫瘤細(xì)胞系daudi細(xì)胞，說明其具有較好的細(xì)胞毒作用，可以用于臨床上腫瘤的過繼免疫治療。此外，重組單鏈抗體G5-4ScFv在應(yīng)用上有以下優(yōu)勢(shì)：1、降低免疫原性，提高了臨床應(yīng)用的安全性(鼠源完整單抗與重組單鏈抗體的區(qū)別：臨床上鼠單抗用于患者的治療有很多限制。一方面其做為異源物質(zhì)，會(huì)使患者產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)，這部分反應(yīng)主要是針對(duì)鼠抗體恒定區(qū)的免疫原性產(chǎn)生的；另一方面鼠源完整抗體一般是通過小鼠腹水制備的，可能混有鼠源病毒，在腫瘤的細(xì)胞過繼免疫治療中需要不斷檢測(cè)是否含有鼠源病毒等。而本發(fā)明的重組單鏈抗體只包括具有抗原識(shí)別功能的可變區(qū)部分，分子量小，無恒定區(qū)，大大減少HAMA反應(yīng)的產(chǎn)生。另一方面，重組單鏈抗體是用原核表達(dá)體系表達(dá)的，可以大規(guī)模表達(dá)，降低成本，保證產(chǎn)品的一致性，而且不存在攜帶鼠源病毒的可能性。這樣在腫瘤的細(xì)胞過繼治療應(yīng)用更具有優(yōu)勢(shì)。)；2、分子量小，穿透力強(qiáng)，容易進(jìn)入實(shí)體瘤周圍的微環(huán)境；3、可大批量生產(chǎn)，提高了產(chǎn)量，降低了成本。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是γδT細(xì)胞的增殖及腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。生物材料說明：本發(fā)明中用到的的重組大腸桿菌分別為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)名稱為G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB或G5-4SCFV-PET22b(+)-transB。其中G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB已于2011年6月24日保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.4983；G5-4SCFV-PET22b(+)-transB已于2011年6月24日保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.4984。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。附圖說明圖1為致敏小鼠血清抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果圖2為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株G5-4分泌的單克隆抗體與γδT細(xì)胞的結(jié)合及與IMMU510競爭抑制的結(jié)果圖3為雜交瘤細(xì)胞株G5-4分泌的單克隆抗體固相化刺激γδT細(xì)胞增殖的細(xì)胞純度檢測(cè)結(jié)果圖4A和圖4B為PCR擴(kuò)增抗人γδTCR單克隆抗體G5-4輕、重鏈可變區(qū)編碼序列的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖5為搭橋PCR擴(kuò)增的重組單鏈抗體G5-4ScFv基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖6為重組表達(dá)載體G5-4ScFv-PET22b(+)-sp和G5-4ScFv-PET22b(+)的雙酶切鑒定結(jié)果圖7為不同濃度的IPTG誘導(dǎo)重組單鏈抗體G5-4ScFv的表達(dá)情況檢測(cè)結(jié)果圖8為G5-4ScFv的表達(dá)形式檢測(cè)結(jié)果圖9為G5-4ScFv蛋白分子量的質(zhì)譜分析結(jié)果圖10為G5-4ScFv的SDS-PAGE和Westernblot鑒定結(jié)果圖11為G5-4ScFv與γδT細(xì)胞結(jié)合情況的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖12為G5-4ScFv和IMMU510與γδT細(xì)胞競爭結(jié)合情況的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖13為G5-4ScFv刺激PBMC中γδT細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果圖14為G5-4ScFv擴(kuò)增的γδT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能的檢測(cè)結(jié)果圖15為G5-4ScFv擴(kuò)增的γδT細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞毒功能檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、抗人γδTCR單克隆抗體的重組單鏈抗體G5-4ScFv及其編碼基因的獲得(一)抗人γδTCR單克隆抗體的獲得可以按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備本發(fā)明的抗人γδTCR單克隆抗體(如參見以下文獻(xiàn)中記載的方法制備：KohlerandMilrtein，Nature256：495-96，1975；HarlowandLane，Aatibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，1988)；也可以按照美國專利5,585,089中所述的方法制備相應(yīng)的人源化形式的抗人γδTCR單克隆抗體。以下描述只為公開目的給出一種具體操作，不作為對(duì)本發(fā)明的限制。一、動(dòng)物免疫1、初次免疫100μg重組γ9δ2(OT3)-Fc(《昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白及其生物學(xué)功能的初步鑒定》《基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床》Dec.2009.Vol.29No.12)與等體積完全弗氏佐劑(CFA)混合，于1.5mL離心管內(nèi)充分?jǐn)嚢柚敝脸蔀榘咨橐?，腹部皮下多點(diǎn)注射免疫4-6周雌性BalB/C小鼠。2、加強(qiáng)免疫于初次免疫后第15、29、44天分別用50μg重組γ9δ2(OT3)-Fc與等體積不完全弗氏佐劑(IFA)按上述方法充分混勻，皮下多點(diǎn)注射免疫小鼠。第四次加強(qiáng)免疫后一周，小鼠斷尾取血，離心取血清，以γ9δ2(OT3)-Fc為一抗，以EnzymelabeledGoatAnti-MouseIgG(FabSpecific)(購自Sigma公司)為二抗，用ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)。致敏小鼠血清抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(1為正常對(duì)照；2、3、4為致敏小鼠)，致敏小鼠1、2和3產(chǎn)生的抗體滴度均超過1∶15000，均可用于后續(xù)沖擊免疫。3、沖擊免疫挑選產(chǎn)生最高抗體效價(jià)的致敏小鼠，尾靜脈注射100μg重組γ9δ2(OT3)-Fc。二、細(xì)胞融合與接種1、骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備復(fù)蘇HGPRT缺陷的SP2/0細(xì)胞，用含10％FCS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，收集細(xì)胞，離心并計(jì)數(shù)，備細(xì)胞融合用。2、致敏小鼠脾細(xì)胞懸液的制備沖擊免疫后3天，將免疫小鼠摘眼球取血，分離血清，留作陽性對(duì)照；然后，小鼠頸椎脫臼處死，置于0.2％新潔爾滅溶液中浸泡5-10分鐘，無菌操作取脾臟，無血清IMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)清洗，剪碎并輕微研磨，100目細(xì)胞篩過濾，1000r/min離心5分鐘，棄上清，IMEM培養(yǎng)基懸浮，制備脾細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，備細(xì)胞融合用。3、細(xì)胞融合將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(1-2×107)與免疫小鼠脾細(xì)胞(1×108)混合，1000r/min離心5分鐘，吸盡上清，輕彈管底，制成團(tuán)松散呈糊狀的細(xì)胞混合液，置于37℃水浴中。用吸管吸取1mL50％PEG(MW4000)緩慢加入細(xì)胞混合液中，邊加邊攪拌，于1分鐘內(nèi)加完，再靜置1分鐘。然后加IMDM培養(yǎng)基，前2分鐘內(nèi)緩慢加入2mL，后2分鐘內(nèi)再加入8mL。800r/min離心5分鐘，混勻，離心后棄上清，加入HAT選擇性培養(yǎng)基(購自Sigma公司)15mL重懸細(xì)胞沉淀，再加入2％甲基纖維素半固體培養(yǎng)基(購自Sigma公司)25mL，充分混勻。4、融合細(xì)胞培養(yǎng)將混勻的細(xì)胞倒入直徑35mm平皿中，每皿約2mL，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7-10天后，肉眼可見培養(yǎng)基中有許多白色雜交細(xì)胞形成的克隆，直徑約0.5-1mm，可供克隆挑選。三、雜交瘤細(xì)胞克隆的挑選，轉(zhuǎn)移及亞克隆：取96孔培養(yǎng)板，每孔中加入含15％胎牛血清、106個(gè)/mL胸腺細(xì)胞和HT的DMEM200ul。在鏡下，用加樣器小心吸取細(xì)胞克隆，移入96孔板中再培養(yǎng)，每孔僅移入一個(gè)細(xì)胞克隆，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。四、陽性克隆篩選雜交瘤細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)兩天后，吸取細(xì)胞生長旺盛的培養(yǎng)孔的上清，以重組δ2單鏈蛋白(將δ2胞外段連入表達(dá)載體pAcGP67-A(構(gòu)建方法參見……文獻(xiàn)，請(qǐng)?zhí)峁┵徺I處或構(gòu)建方法或記載有構(gòu)建方法的參考文獻(xiàn)的出處，不能為饋贈(zèng)的)中，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，經(jīng)鑒定有目的蛋白表達(dá)，用GEHisTrapHP鎳柱親和層析法純化得到的目的蛋白，其氨基酸殘基序列如序列表中序列8所示)為檢測(cè)抗原(一抗)，以EnzymelabeledGoatAnti-MouseIgG(FabSpecific)(購自Sigma公司)為二抗，用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的抗體，連續(xù)測(cè)5-7天，將陽性克隆移至24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各上清是否含有能與γδT細(xì)胞結(jié)合的抗體，保留穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆并編號(hào)。同時(shí)，用穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清包板刺激新鮮分離的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC，2×106個(gè))，用含IL-2(200U/mL)的RP1640完全培養(yǎng)基(購自Invitrogen公司)培養(yǎng)2周后檢測(cè)γδT細(xì)胞純度，選擇具有刺激γδT細(xì)胞增殖作用的雜交瘤細(xì)胞克隆，凍存。五、擴(kuò)增與凍存陽性雜交瘤細(xì)胞克隆將步驟四篩選的陽性雜交瘤細(xì)胞克隆在24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞大量擴(kuò)增后，離心收集細(xì)胞，加入約1mL凍存液(10％DMSO、90％小牛血清)，凍存于-196℃液氮中，每個(gè)陽性克隆凍存5管。六、抗體性質(zhì)分析大規(guī)模培養(yǎng)能分泌刺激γδT細(xì)胞增殖的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株G5-4，收集上清，用ProteinG親和層析柱(購自GE公司)進(jìn)行抗體純化，將純化的單克隆抗體命名為G5-4，繼而用下述方法對(duì)純化的單克隆抗體的特性進(jìn)行檢測(cè)。1、抗體的類型及亞類分析用Sigma公司的MouseMonoclonalAntibodyIsotypingReagents(鼠單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑盒)并按其說明書檢測(cè)單克隆抗體類型及亞型。檢測(cè)結(jié)果表明上述雜交瘤細(xì)胞株G5-4分泌的單克隆抗體為IgG2a亞型，κ亞類。2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株G5-4分泌的單克隆抗體與γδT細(xì)胞的結(jié)合及與IMMU510競爭抑制作用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G5-4與γδT細(xì)胞的結(jié)合情況及其與IMMU510競爭抑制的情況，結(jié)果如圖2所示(A、IsotypeControl(mouseIgG2aIsotype，同型對(duì)照，購自Biolegend公司)；B、IMMU510(購自Immunotech公司)；C、G5-4；D、G5-4+IMMU510-FITC)，與陽性對(duì)照(B)相比，雜交瘤細(xì)胞株G5-4分泌的單克隆抗體與γδT細(xì)胞的結(jié)合率幾近一致，而且，雜交瘤細(xì)胞株G5-4分泌的單克隆抗體可完全抑制市售抗體IMMU510與γδT細(xì)胞的結(jié)合，提示雜交瘤細(xì)胞株G5-4分泌的單克隆抗體識(shí)別的表位與IMMU510識(shí)別的表位相近或相同，是特異識(shí)別γδTCR的抗體。3、抗體固相化刺激γδT細(xì)胞增殖抗體固相化刺激γδT細(xì)胞增殖，具體方法為：用濃度為5ug/mL的雜交瘤細(xì)胞G5-4分泌的單克隆抗體包板刺激新鮮分離的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC，2×106個(gè))，以IMMU510為對(duì)照，以鼠IgG2a(購自Biolegend公司)為同型對(duì)照，用含IL-2(200U/mL)的RP1640完全培養(yǎng)基(購自Invitrogen公司)培養(yǎng)2周后檢測(cè)γδT細(xì)胞純度。結(jié)果如圖3所示(A、IsotypeControl(同型對(duì)照)組；B、IMMU510組；C、G5-4組)，同型對(duì)照不能刺激PBMC中γδT細(xì)胞增殖，而雜交瘤細(xì)胞G5-4分泌的單克隆抗體與IMMU510均能有效刺激γδT細(xì)胞增殖，2周時(shí)純度能達(dá)80％以上，提示雜交瘤細(xì)胞G5-4分泌的單克隆抗體是一種功能性抗γδTCR抗體。(二)重組單鏈抗體G5-4ScFv的編碼基因G5-4ScFv的獲得一、復(fù)蘇G5-4雜交瘤細(xì)胞克隆用含10％FCS的DMEM培養(yǎng)G5-4雜交瘤細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，收集細(xì)胞。用RNeasyMiniKit(QIGEN)并按試劑盒說明書提供的方法提取RNA。取提取的RNA樣品12μl加入Oligo(dT)15(500μg/mL)1μl，70℃加熱變性5分鐘，取出后立即置于冰上，待冷卻后依次加入5×Buffer5μl、dNTP(10mmol/L)5μl、RNA酶抑制劑1μl，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，總體積為25μl，42℃孵育60分鐘，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。二、PCR擴(kuò)增抗γδTCR單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)互補(bǔ)配對(duì)的原則設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增抗人γδTCR單克隆抗體G5-4輕、重鏈可變區(qū)編碼序列的上、下游引物，引物序列見表1和表2。表1PCR擴(kuò)增抗人γδTCR單克隆抗體G5-4輕鏈可變區(qū)編碼序列的上、下游引物MKV1ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGMKV2ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTGMKV3ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTGMKV4ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTGMKV5ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTCMKV6ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGGMKV7ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGGMKV8ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATGMKV9ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTGMKV10ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCTMKV11ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCMKCACTGGATGGTGGGAAGATGG表2PCR擴(kuò)增抗人γδTCR單克隆抗體G5-4重鏈可變區(qū)編碼序列的上、下游引物MHV1ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTCMHV2ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTTMHV3ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTTMHV4ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTTMHV5ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTTMHV6ATGGCTTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGCMHV7ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTTMHV8ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTGMHV9ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTGMHV10ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTGMHV11ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTGMHV12ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTGMHC2ACAGTGGATAGACCGATGGGGC2、PCR擴(kuò)增抗人γδTCR單克隆抗體G5-4的輕、重鏈可變區(qū)編碼序列以步驟一所得的cDNA為模板，分別在表1和表2所列引物對(duì)MKV(1-11)與MKC、MHV(1-12)與MHC2A，經(jīng)PCR擴(kuò)增出抗人γδTCR單克隆抗體G5-4的輕鏈可變區(qū)DNA片斷G5-4VL和重鏈可變區(qū)DNA片斷G5-4VH。PCR反應(yīng)條件為：先94℃預(yù)變性5分鐘，然后94℃變性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。產(chǎn)物于4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4A(G5-4VH：1、Marker；2-13、MHV1-12與MHC2A分別配對(duì)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；14、陰性對(duì)照)和圖4B(G5-4VL：1、Marker；2-11、MKV1-11與MKC分別配對(duì)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；13、陰性對(duì)照)所示，經(jīng)擴(kuò)增獲得了350bp左右的G5-4ScFv輕鏈可變區(qū)DNA片段和330bp左右的G5-4ScFv重鏈可變區(qū)DNA片段，其大小與預(yù)期相符?；厥詹⒓兓疨CR擴(kuò)增的G5-4輕鏈可變區(qū)片段G5-4VL和重鏈可變區(qū)片段G5-4VH，將兩個(gè)DNA片段分別插入克隆載體pEASY-Bluntsimple(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明G5-4重鏈可變區(qū)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：3所示，由360個(gè)堿基組成，編碼序列表中SEQIDNo：1所示的氨基酸殘基序列，G5-4輕鏈可變區(qū)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：4所示，由324個(gè)堿基組成，編碼序列表中SEQIDNo：2所示的氨基酸殘基序列。經(jīng)blast比對(duì)，確認(rèn)為有意義的抗體可變區(qū)序列。3、重組單鏈抗體G5-4ScFv基因G5-4ScFv的獲得通過搭橋PCR(OverlapPCR)，將步驟2中PCR擴(kuò)增的G5-4輕鏈可變區(qū)DNA片段G5-4VL和重鏈可變區(qū)DNA片段G5-4VH用柔性連接肽(Gly4Ser)3(編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：7所示，柔性連接肽的結(jié)構(gòu)通式為(Gly4Ser)n，n為1-5的整數(shù)，優(yōu)選為3，連接起來得到重組單鏈抗體G5-4ScFv的編碼基因G5-4ScFv，具體方法為(引物序列見表3)：先通過PCR，分別在G5-4VL3’端和G5-4VH5’端連入搭橋片段獲得G5-4VL-linker和G5-4VH-linker，G5-4VH-linker的PCR反應(yīng)體系為：G5-4VH模板1μl，G5-4BamHIupforVH或G5-4NdeIupforVH(重鏈可變區(qū)上游引物)1μl，G5-4VH-linkerback(重鏈可變區(qū)搭橋引物)1μl，dNTP5μl，10×Buffer5μl，pfu高保真酶1μl，去離子水36μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。G5-4VL-linker的PCR反應(yīng)體系為：G5-4VL模板1μl，G5-4VL-linkerfor(輕鏈可變區(qū)搭橋引物)1μl，G5-4EcoRIbackforVL(輕鏈可變區(qū)下游引物)1μl，dNTP5μl，10×Buffer5μl，pfu高保真酶1μl，去離子水36μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，可見大小為350-400bp左右的片段，即G5-4VH-linker和G5-4VL-linker，切膠回收。再將G5-4VH-linker和G5-4VL-linker通過OverlapPCR的方法連接起來，OverlapPCR反應(yīng)體系為：G5-4BamHIupforVH或G5-4NdeIupforVH(重鏈可變區(qū)上游引物)1μl，G5-4EcoRIbackforVL(輕鏈可變區(qū)下游引物)1μl，G5-4VH-linker1μl，G5-4VL-linker1μl，dNTP5μl，10×Buffer5μl，pfu高保真酶1μl，去離子水35μl。OverlapPCR(搭橋PCR)反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示[1、Marker；2、G5-4VL-linker；3、G5-4VH-linker(BamHI)；4、G5-4VH-linker(NdeI)；5、Marker；6、G5-4VH-linker-VL(BamHI)；7、G5-4VH-linker-VL(NdeI)]，經(jīng)擴(kuò)增獲得了380bp的G5-4VL-linker、399bp的G5-4VH-linker和750bp的G5-4VH-linker-VL，與預(yù)期結(jié)果相符。將G5-4VH-linker-VL的DNA片段插入克隆載體pEASY-Bluntsimple(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明750bp的G5-4VH-linker-VL即為編碼重組單鏈抗體G5-4ScFv的重組G5-4ScFv基因。重組基因G5-4ScFv的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：6所示，由750個(gè)堿基組成，編碼序列表中SEQIDNo：5所示的氨基酸殘基序列。產(chǎn)物于4℃保存。表3搭橋PCR擴(kuò)增G5-4ScFv基因的引物序列G5-4BamHIupforVHCGCGGATCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTG5-4NdeIupforVHGGAATTCCATATGATGGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCG5-4VH-linkerbackAGAGCCACCGCCACCGCTACCGCCACCGCCGGCTGAGGAGACGGTGACG5-4VL-linkerforCGGTGGCGGTGGCTCTGGTGGTGGTGGCAGCGACATCCAGATGAACCAGG5-4EcoRIbackforVLGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCGTTTGATTTCCAGCT實(shí)施例2、重組單鏈抗體G5-4ScFv的表達(dá)及純化一、重組單鏈抗體G5-4ScFv的表達(dá)載體及工程菌的構(gòu)建取實(shí)施例1構(gòu)建的插入重組基因G5-4ScFv片段且序列正確的重組質(zhì)粒，分別用BamHI/EcoRI或NdeI/EcoRI進(jìn)行雙酶切，回收750bp的雙酶切產(chǎn)物，將回收片段分別與經(jīng)BamHI/EcoRI或NdeI/EcoRI雙酶切的pET22b(+)載體連接，得到重組單鏈抗體G5-4ScFv的表達(dá)載體，分別命名為G5-4ScFv-PET22b(+)-sp和G5-4ScFv-PET22b(+)，雙酶切鑒定結(jié)果如圖6所示(1、Marker；2、BamHI/EcoRI雙酶切前；3、BamHI/EcoRI雙酶切后；4、NdeI/EcoRI雙酶切后；5、NdeI/EcoRI雙酶切前)，經(jīng)酶切獲得750bp和約4000bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，再經(jīng)測(cè)序無誤后，轉(zhuǎn)化TransB(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，得到的陽性克隆即為重組單鏈抗體G5-4ScFv的表達(dá)工程菌，命名為G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB(已于2011年6月24日在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCCNo.4983)和G5-4SCFV-PET22b(+)-transB(已于2011年6月24日在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCCNo.4984)(其中G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB保留載體信號(hào)肽，表達(dá)量高，為包涵體形式表達(dá)；G5-4SCFV-PET22b(+)-transB去除載體信號(hào)肽表達(dá)量低，部分以可溶性形式表達(dá))。二、重組單鏈抗體G5-4ScFv的表達(dá)和純化1.G5-4ScFv的誘導(dǎo)表達(dá)1.1G5-4ScFv的小量誘導(dǎo)表達(dá)挑取單克隆工程菌G5-4SCFV-PET22b(+)-transB或G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB菌落，分別接種于5mL含有氨芐青霉素Amp(濃度為1000mg/L)的LB培養(yǎng)基，37℃搖菌約8h至OD600值達(dá)0.4-0.6時(shí)，按1∶100的比例接種到另4支含新鮮5mL含有氨芐青霉素Amp(濃度為1000mg/L)的LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3h至OD600值達(dá)到0.4-0.6時(shí)，加入不同濃度(200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、1mmol/L)的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，20℃繼續(xù)培養(yǎng)16h。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，菌體總蛋白、菌裂解上清和沉淀分別進(jìn)行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳，確定目的蛋白是否表達(dá)，表達(dá)形式及最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。不同濃度IPTG誘導(dǎo)G5-4ScFv的表達(dá)情況如圖7(1、Marker；2、誘導(dǎo)前；3、200μmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；4、400μmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；5、600μmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；6、1mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物)所示，菌體總蛋白、菌裂解上清和沉淀的檢測(cè)結(jié)果如圖8(1、Marker；2、未誘導(dǎo)菌；3、菌液總蛋白；4、超聲上清；5、超聲沉淀)所示，200μmol/LIPTG即可有效誘導(dǎo)重組單鏈抗體G5-4ScFv表達(dá)，主要存在于細(xì)菌裂解物的沉淀中，裂解上清只能檢出少量重組單鏈抗體G5-4ScFv，提示其主要以包涵體形式表達(dá)，少量以可溶性形式表達(dá)。1.2重組單鏈抗體G5-4ScFv的制備挑取單克隆工程菌G5-4SCFV-PET22b(+)-transB或G5-4SCFV-PET22b(+)-sp-transB，分別接種于5mL含有氨芐青霉素Amp(濃度為1000mg/L)的LB培養(yǎng)基，37℃搖菌8h，然后將培養(yǎng)物按1∶100的比例接種至500mL含有氨芐青霉素Amp(濃度為1000mg/L)的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃搖菌至OD600值達(dá)到0.4-0.6時(shí)，加入200μmol/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)20℃培養(yǎng)16h，然后離心收集菌體。2.重組單鏈抗體G5-4ScFv的純化2.1菌體的超聲破碎工程菌誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體，重懸于10倍體積的超聲緩沖液中，加入蛋白酶抑制劑(購自Merck公司)，冰浴條件下超聲破碎，工作5秒，間隔10秒，工作99次。菌體裂解物于4℃、12,000g離心20min，分別取上清和沉淀200μl，備后續(xù)進(jìn)行鑒定，其余用于純化。2.2包涵體的洗滌重懸上述沉淀于10倍體積的包涵體洗滌液A[50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，5mmol/LEDTA(pH8.0)，100mmol/LNaCl，0.5％TritonX-100]中，冰浴下攪拌30min后，于4℃、12,000g離心20min，取沉淀。重懸于10倍體積的包涵體洗滌液B(500mmol/LNaCl，10mmol/LNaH2PO4，10mmol/LNa2HPO4，2mol/L尿素，pH7.4)，冰浴下攪拌30min后，于4℃、12,000g離心20min，取沉淀。洗滌后的包涵體用溶液C(500mmol/LNaCl，10mmol/LNaH2PO4，10mmol/L，Na2HPO4，8mol/L尿素，pH7.4)溶解過夜，于4℃、12,000g離心20min，收集上清。SDS-PAGE分析包涵體純度。2.3重組單鏈抗體G5-4ScFv的親和柱層析純化上述超聲后上清或者包涵體溶解液分別進(jìn)行GEHisTrapHP鎳柱層析純化，具體方法包括以下步驟：2.3.1GEHisTrapHP鎳柱親和層析：GEHisTrapHP鎳柱(購自GE公司)，柱床體積為1mL。2.3.2超聲上清純化：用10mL蒸餾水清洗柱子；用10mL結(jié)合緩沖液(pH7.2的20mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl，含20mM咪唑)平衡柱子，流速為1mL/min；將包涵體溶解液緩慢上樣，流速為0.3mL/min；用10-15mL洗滌緩沖液(pH7.2的20mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl，含40mM咪唑)洗柱子，流速為1mL/min；用10mL洗脫緩沖液(pH7.2的20mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl，含500mM咪唑)洗脫，流速為0.3mL/min，收集洗脫液，4℃保存。2.3.3層析完成后，用5mL結(jié)合緩沖液洗柱子；然后用10mL蒸餾水清洗柱子；再用5mL20％的乙醇清洗柱子，并將層析柱兩端封閉，于4℃保存。2.3.4包涵體溶解液純化：步驟與上述超聲上清純化相同，但各緩沖液中均含8mol/L尿素。2.4透析復(fù)性上清組：透析法置換緩沖體系。經(jīng)親和純化得到的重組蛋白中含有500mM咪唑，將其裝入截留分子量為3500的透析袋中，置于PBS中，4℃攪拌透析24h，其間換液4次。包涵體組：經(jīng)親和純化得到的重組蛋白中含有8mol/L的尿素，將其裝入截留分子量為3500的透析袋中，置于含6mol/L尿素的2L透析液(50mMNaCl，50mMTris，0.5mMEDTA，10％甘油，pH7.2)中，4℃攪拌透析復(fù)性。每隔2h降低復(fù)性液中的尿素濃度降低1mol/L，直至透析液中的尿素濃度低于2mol/L時(shí)，加入含終濃度為1μmol/L的GSH(谷胱甘肽)和0.2μmol/L的GSSG(還原型谷胱甘肽)的透析液，繼續(xù)4℃攪拌透析，每隔2h尿素濃度降0.5mol/L，尿素濃度低至0.2mol/L以下時(shí)，換成不含尿素的透析液，4℃攪拌透析24h。最終復(fù)性率為50％-80％。透析完畢后，用截流分子量為3000的超濾管將重組蛋白超濾濃縮，用BCA法測(cè)蛋白濃度，分裝保存于-80℃。實(shí)施例3、重組單鏈抗體G5-4ScFv的鑒定針對(duì)實(shí)施例2得到的重組單鏈抗體G5-4ScFv進(jìn)行鑒定。一、理化性質(zhì)質(zhì)譜分析重組單鏈抗體G5-4ScFv的分子量，質(zhì)譜圖如圖9所示，重組單鏈抗體G5-4ScFv的分子量為29840.9kD。二、SDS-PAGE和Westernblot鑒定對(duì)實(shí)施例2獲得重組單鏈抗體G5-4ScFv進(jìn)行10％SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖10中的A幅(A：聚丙烯凝膠電泳圖。1、Marker；2、G5-4ScFv)所示，表明獲得了純度較高的30kD左右的重組單鏈抗體G5-4ScFv，與預(yù)期結(jié)果相符。然后，分別用anti-HistagAb(His標(biāo)簽抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)和Goatanti-mouseIgGAb(山羊抗鼠IgG多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行Westernblot鑒定，結(jié)果如圖10中B幅(B：Western-blot鑒定(anti-HistagAb)。1、Marker；2、G5-4ScFv)和C幅(C：Western-blot鑒定(Goatanti-mouseIgGAb)。1、Marker；2、G5-4ScFv)所示，鑒定結(jié)果表明所純化的蛋白大小為30KD左右，帶His標(biāo)簽，即得到了目的蛋白。三、重組單鏈抗體G5-4ScFv生物學(xué)性質(zhì)的鑒定1.重組單鏈抗體G5-4ScFv的結(jié)合特性1.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G5-4ScFv與γδT細(xì)胞的結(jié)合情況，具體方法：取抗體擴(kuò)增培養(yǎng)兩周得到的γδT細(xì)胞1×106個(gè)，用含1％BSA的PBS洗3遍，分別加入IsotypeControl、IMMU510、G5-4ScFv、D5-3ScFv及S1-9，終濃度為3μg/ml，4℃孵育30分鐘；用含1％BSA的PBS洗3遍，加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG多克隆抗體，4℃孵育30分鐘；用含1％BSA的PBS洗3遍，加入300μl4％多聚甲醛溶液固定。用流式儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖11所示，圖示A：IsotypeControl(mouseIgG2aIsotype，同型對(duì)照，購自Biolegend)；B：IMMU510(購自immunotech公司)，為市售的pan-γδTCR單克隆抗體；C：G5-4ScFv；D：D5-3ScFv，來源于同時(shí)獲得的另一株分泌pan-γδTCR抗體的雜交瘤，此蛋白分子量為26K左右，但不能與γδT細(xì)胞結(jié)合，為本實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照；E：S1-9為本組表達(dá)的帶有HIS標(biāo)簽的35K左右的無關(guān)蛋白。檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明的G5-4ScFv能與γδT細(xì)胞特異性結(jié)合。1.2重組單鏈抗體G5-4ScFv的競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)G5-4ScFv和IMMU510與γδT細(xì)胞的競爭結(jié)合情況，方法為：分別在1×106個(gè)純度大于90％的γδT細(xì)胞中加入3μg同型對(duì)照(mouseIgG2aIsotype，同型對(duì)照，購自Biolegend)(A)、G5-4ScFv(B)、D5-3ScFv(C)于4℃孵育30分鐘，洗三遍后加入FITC標(biāo)記的IMMU510(陽性對(duì)照IMMU510(D)進(jìn)行常規(guī)間標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)染色檢測(cè)。結(jié)果如圖12所示，與同型對(duì)照和陰性對(duì)照D5-3ScFv相比，G5-4ScFv能有效抑制IMMU510與γδT細(xì)胞的結(jié)合，提示二者結(jié)合位點(diǎn)相近或者相同。2.重組單鏈抗體G5-4ScFv刺激γδT細(xì)胞增殖2.1重組單鏈抗體G5-4ScFv有效刺激PBMC中γδT細(xì)胞增殖分別用5μg/mL的IMMU510、G5-4ScFv或D5-3ScFv包被培養(yǎng)板，加入2×106個(gè)新鮮分離的人PBMC，用含IL-2(200U/mL)的RP1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后檢測(cè)γδT細(xì)胞純度。結(jié)果如圖13所示(D5-3ScFv(A)、IMMU510(B)和G5-4ScFv(C))，培養(yǎng)PBMC2周時(shí)，G5-4ScFv與陽性對(duì)照IMMU510均可使其中γδT細(xì)胞增殖，純度達(dá)90％左右，而陰性對(duì)照D5-3ScFv組僅為13.6％。2.2重組單鏈抗體G5-4ScFv擴(kuò)增的γδT細(xì)胞能有效分泌細(xì)胞因子取分別用固相化G5-4Scfv及IMMU510擴(kuò)增的純度大于90％的γδT細(xì)胞，在下述條件下A：只加BFA(10μg/mL)、B：PMA(25μg/mL)+離子霉素(1μg/mL)+BFA(10μg/mL)，培養(yǎng)6小時(shí)，而后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)流式染色，檢測(cè)IFN-γ和TGF-α的分泌情況的變化。結(jié)果如圖14所示，非刺激條件下(A)G5-4ScFv擴(kuò)增的γδT細(xì)胞與IMMU510擴(kuò)增的γδT細(xì)胞均不分泌IFN-γ和TGF-α；在PMA(25μg/mL)聯(lián)合離子霉素(1μg/mL)刺激下(B)，G5-4ScFv擴(kuò)增的γδT細(xì)胞分泌IFN-γ的比例是70.3％，分泌TGF-α的比例是98％；IMMU510擴(kuò)增的γδT細(xì)胞分泌IFN-γ和TGF-α的比例分別是67.1％和97.1％。檢測(cè)結(jié)果表明G5-4ScFv擴(kuò)增的γδT細(xì)胞能夠在刺激條件下有效分泌細(xì)胞因子IFN-γ和TGF-α。3.重組單鏈抗體G5-4ScFv擴(kuò)增的γδT細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞毒功能通過對(duì)人B淋巴細(xì)胞瘤(daudi)細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)G5-4ScFv擴(kuò)增的γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒功能，方法為：分別用G5-4ScFv(斜紋)和IMMU510(灰色)擴(kuò)增的純度大于90％的γδT細(xì)胞做為效應(yīng)細(xì)胞，檢測(cè)其不同效靶比時(shí)對(duì)daudi細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果如圖15所示，G5-4ScFv擴(kuò)增的γδT細(xì)胞能有效殺傷daudi細(xì)胞，效靶比為5∶1時(shí)殺傷效率大于85％，比IMMU510擴(kuò)增的γδT細(xì)胞的殺傷效率稍高。綜上所述，重組單鏈抗體G5-4ScFv能與γδTCR特異結(jié)合；固相化能刺激人PBMC中γδT細(xì)胞增殖，2周時(shí)其純度可達(dá)90％。擴(kuò)增得到的γδT細(xì)胞在刺激時(shí)能有效分泌IFN-γ和TGF-α，并能有效殺傷腫瘤細(xì)胞系：daudi細(xì)胞，說明其具有較好的細(xì)胞毒作用，可以用于臨床上腫瘤的過繼免疫治療。重組單鏈抗體G5-4ScFv在應(yīng)用上有以下優(yōu)勢(shì)：1、降低免疫原性，提高了臨床應(yīng)用的安全性；2、分子量小，穿透力強(qiáng)，容易進(jìn)入實(shí)體瘤周圍的微環(huán)境；3、可大批量生產(chǎn)，提高了產(chǎn)量，降低成本。