本發(fā)明涉及具有提高性能的突變通道視紫紅質(zhì)、編碼其的核酸構(gòu)建體、攜帶該核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體、包含所述核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的細(xì)胞及其相應(yīng)的用途。
背景技術(shù)：
：光門控的、內(nèi)向整流陽離子通道，通道視紫紅質(zhì)-2(ChR2)已經(jīng)變成用于體外和體內(nèi)的神經(jīng)元靶向光激活的優(yōu)選工具1-4。盡管野生型(WT)ChR2可以用于光誘導(dǎo)的去極化，但正在進(jìn)行找尋用于將來潛在的臨床應(yīng)用的具有提高的光敏感性的ChR2突變體(WO03/084994和5-7)。盡管例如腦組織的透光率低，但較高的效率能夠使遠(yuǎn)離所施加的光源的細(xì)胞層去極化。光敏感性的提高還將解決在連續(xù)照明下由于完全WTChR2激活需要的高藍(lán)光強(qiáng)度(480nm下1018-1019phs-1cm-2)引起的潛在細(xì)胞損傷的問題。具有較高光敏感性的變體對于關(guān)于視力恢復(fù)的研究也是關(guān)鍵的8，9。在蛋白質(zhì)水平上，只能通過延長開放狀態(tài)的時(shí)長和/或通過升高通道的單位電導(dǎo)來獲得較高的光效率，因?yàn)橛捎贑hR2發(fā)色團(tuán)視黃醛的性質(zhì)，光敏感性本身只能略微提高。之前的研究已經(jīng)證明分別在螺旋3和4中的C128和D156位的突變導(dǎo)致顯著減緩的通道動(dòng)力學(xué)，開放時(shí)長長達(dá)30分鐘或更長，從而產(chǎn)生500-倍或甚至更高的光敏感性5，6。這些C128和D156突變體可以通過紅光在可變的開放次數(shù)關(guān)閉。盡管光敏感性較好，它們的緩慢關(guān)閉動(dòng)力學(xué)仍然是其應(yīng)用的限制因素。因此，對呈現(xiàn)出較高光敏感性和較快響應(yīng)動(dòng)力學(xué)的光誘導(dǎo)陽離子通道仍然存在需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明概述因?yàn)橐阎?xì)胞內(nèi)膜表面電位受到Ca++的強(qiáng)烈影響，改變膜下細(xì)胞內(nèi)Ca++水平將導(dǎo)致膜的去極化并且在神經(jīng)元中導(dǎo)致電壓-門控的Na+通道的激活。因此，發(fā)明人假設(shè)可以通過借助Ca++內(nèi)流升高內(nèi)膜表面電位而間接地提高神經(jīng)元的光敏感性。發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了具有增強(qiáng)的Ca++-滲透性的ChR2突變體，在下文中稱為CatCh，即鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通道視紫紅質(zhì)(CalciumtranslocatingChannelrhodopsin)。與WTChR2相比較，在海馬神經(jīng)元中表達(dá)時(shí)，CatCh具有高四倍的Ca++-滲透性，高70倍的光敏感性和更快的響應(yīng)動(dòng)力學(xué)。增強(qiáng)的光敏感性和快的動(dòng)力學(xué)顯示出源于相對高的光-門控Ca++內(nèi)流，這升高了內(nèi)膜表面電位并且激活了Ca++-激活的大電導(dǎo)鉀(BK)通道。[Ca++]i的增加升高了內(nèi)部表面電位，有助于電壓-門控的Na+-通道的激活并且間接地提高光敏感性。通過Ca++-依賴性BK-通道激活顯著加速了光刺激后的復(fù)極化。CatCh例證了一種新的原理，通過該原理可以將光-門控通道工程化以提高神經(jīng)元刺激的光敏感性。它的特征，如引發(fā)精確和快速的動(dòng)作電位而同時(shí)只需要低光強(qiáng)度來激活，為光-門控通道在臨床應(yīng)用中的使用打開了道路。因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種光誘導(dǎo)離子通道，其中光誘導(dǎo)離子通道包含與SEQIDNO：1(CHOP-2)的1-309位所示的氨基酸序列具有至少70％同源性并且在對應(yīng)于SEQIDNO：1的L132的位置包含突變的氨基酸序列。在相似的第二個(gè)方面中，本發(fā)明還涉及一種通道視紫紅質(zhì)，其包含根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道和視黃醛或視黃醛衍生物。此外，在第三個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建體，其包含編碼根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道的核苷酸序列。在再另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含編碼根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道的核苷酸序列或根據(jù)第三個(gè)方面的核酸構(gòu)建體。此外，提供了一種細(xì)胞，其包含根據(jù)第二個(gè)方面的通道視紫紅質(zhì)、根據(jù)第三個(gè)方面的核酸構(gòu)建體或根據(jù)第四個(gè)方面的表達(dá)載體。此外，本發(fā)明涉及根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道、第二個(gè)方面的通道視紫紅質(zhì)、根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體和根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞作為藥物的用途。特別地，涉及根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體在基因治療中的用途。更具體地，涉及根據(jù)本發(fā)明的光誘導(dǎo)離子通道、通道視紫紅質(zhì)、核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體或細(xì)胞在失明或視力下降的治療中的用途。在再另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道(其另外在對應(yīng)于SEQIDNO：1的128位的位置具有蘇氨酸、絲氨酸或丙氨酸和/或在對應(yīng)于SEQIDNO：1的156位的位置具有丙氨酸)在癌細(xì)胞消融中的用途。在最后的一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道或根據(jù)第二個(gè)方面的通道視紫紅質(zhì)或根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞在高通量篩選中的用途。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種光誘導(dǎo)離子通道，其中該光誘導(dǎo)離子通道包含與SEQIDNO：1(CHOP-2)的1-309位所示的氨基酸序列，更優(yōu)選與SEQIDNO：1的1-315位所示的氨基酸序列，或甚至與SEQIDNO：1的1-737位所示的氨基酸序列具有至少70％同一性并且在對應(yīng)于SEQIDNO：1中的L132位的位置包含突變的氨基酸序列。野生型CHOP2具有以下氨基酸序列：MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAGAVNKGTGKYASRESFLVMRDKMKEKGIDVRASLDNSKEVEQEQAARAAMMMMNGNGMGMGMGMNGMNGMGGMNGMAGGAKPGLELTPQLQPGRVILAVPDISMVDFFREQFAQLSVTYELVPALGADNTLALVTQAQNLGGVDFVLIHPEFLRDRSSTSILSRLRGAGQRVAAFGWAQLGPMRDLIESANLDGWLEGPSFGQGILPAHIVALVAKMQQMRKMQQMQQIGMMTGGMNGMGGGMGGGMNGMGGGNGMNNMGNGMGGGMGNGMGGNGMNGMGGGNGMNNMGGNGMAGNGMGGGMGGNGMGGSMNGMSSGVVANVTPSAAGGMGGMMNGGMAAPQSPGMNGGRLGTNPLFNAAPSPLSSQLGAEAGMGSMGGMGGMSGMGGMGGMGGMGGAGAATTQAAGGNAEAEMLQNLMNEINRLKRELGE(SEQIDNO：1)本發(fā)明的光誘導(dǎo)離子通道是具有至少5個(gè)跨膜螺旋的膜蛋白，其能夠結(jié)合光敏性多烯。優(yōu)選的是具有6或7個(gè)跨膜螺旋的跨膜蛋白。然而，本發(fā)明也涵蓋具有超過7個(gè)螺旋，例如，8、9或10個(gè)跨膜螺旋的跨膜蛋白。此外，本發(fā)明涵蓋除了跨膜部分以外還包括C-和/或N-末端序列的跨膜蛋白，其中C-末端序列可以延伸至被膜包圍的腔的內(nèi)部，例如，細(xì)胞的胞質(zhì)或脂質(zhì)體的內(nèi)部，或者也可以排列在膜外表面上。這同樣適用于任選存在的N-末端序列，其同樣可以排列在腔內(nèi)以及在膜的外表面上。C-和/或N-末端序列的長度原則上沒有限制；然而，優(yōu)選的是具有1至1000個(gè)氨基酸，優(yōu)選1至500個(gè)，尤其優(yōu)選5至50個(gè)氨基酸的未包埋在膜內(nèi)的C-末端序列的光誘導(dǎo)離子通道。與C-末端序列的長度無關(guān)，未包埋在膜內(nèi)的位于N-末端的序列優(yōu)選包含1至500個(gè)氨基酸，尤其優(yōu)選5至50個(gè)氨基酸。跨膜螺旋的概念是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些通常是α-螺旋蛋白結(jié)構(gòu)，其通常包含20至25個(gè)氨基酸。然而，取決于膜的性質(zhì)(其可以是天然膜，例如細(xì)胞膜或質(zhì)膜，或也可以是合成的膜)，跨膜片段也可以更短或更長。例如，人造膜中的跨膜片段可以包含多達(dá)30個(gè)氨基酸，但另一方面，也可以只有少許氨基酸，例如12至16個(gè)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，光誘導(dǎo)離子通道包含與SEQIDNO：1的1-309位所示的氨基酸序列具有至少70％同一性，優(yōu)選至少75％同一性，更優(yōu)選至少80％同一性，甚至更優(yōu)選至少85％同一性，如至少90％同一性，并且最優(yōu)選至少95％同一性的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，光誘導(dǎo)離子通道包含與SEQIDNO：1的1-315位所示的氨基酸序列具有至少70％同一性，優(yōu)選至少75％同一性，更優(yōu)選至少80％同一性，甚至更優(yōu)選至少85％同一性，如至少90％同一性，并且最優(yōu)選至少95％同一性的氨基酸序列。通常，當(dāng)一些氨基酸序列與所比對序列之間的序列同一性是至少x％時(shí)，氨基酸序列與另一個(gè)氨基酸序列或上述的SEQIDNO：1具有“至少x％的同一性”?？梢允褂美绻娍色@得的計(jì)算機(jī)同源性程序，如在NCBI主頁http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi上提供的“BLAST”程序，使用其中提供的缺省設(shè)置來進(jìn)行這樣的比對。計(jì)算核酸序列組的序列同一性百分比的更多方法是本領(lǐng)域已知的。這樣的包含與SEQIDNO：1的1-309或1-315位所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的光誘導(dǎo)離子通道的實(shí)例是來自萊茵衣藻(C.reinhardii)的CHOP1(gi：15811379)、來自強(qiáng)壯團(tuán)藻(Volvoxcarteri)的CHOP2(gi：167650748)和CHOP1(gi：167650744)，或CHOP2或CHOP1的任何其他直系同源物(ortholog)或等位基因變異體。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，光誘導(dǎo)離子通道包含SEQIDNO：1(CHOP-2)的1-309位所示的氨基酸序列，優(yōu)選由SEQIDNO：1(CHOP-2)的1-309位所示的氨基酸序列組成，除了L132位的突變。在另一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，光誘導(dǎo)離子通道包含SEQIDNO：1(CHOP-2)的1-315位所示的氨基酸序列，優(yōu)選由SEQIDNO：1(CHOP-2)的1-315位所示的氨基酸序列組成，除了L132位的突變。在SEQIDNO：1中的L132位或在對應(yīng)于L132的位置處的突變可以是置換、添加和/或缺失。然而，優(yōu)選地，所述突變是置換，更優(yōu)選地選自L132C、L132S、L132E、L132D和L132T，最優(yōu)選其中所述置換是L312C。盡管實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)限于L132C，但設(shè)想置換L132S、L132E、L132D和L132T將呈現(xiàn)出相似特性，因?yàn)樗羞@些置換將提高通道的極性。此外，光誘導(dǎo)離子通道包含進(jìn)一步的(半)保守性置換。保守性置換是側(cè)鏈和化學(xué)性質(zhì)相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的那些置換。這樣的家族的實(shí)例是具有堿性側(cè)鏈、具有酸性側(cè)鏈、具有非極性脂肪族側(cè)鏈、具有非極性芳香側(cè)鏈、具有不帶電的極性側(cè)鏈、具有小的側(cè)鏈、具有大的側(cè)鏈等的氨基酸。典型的半保守性和保守性置換是：此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到空間結(jié)構(gòu)所需要的位置上的甘氨酸不應(yīng)當(dāng)被置換，并且脯氨酸不應(yīng)當(dāng)被引入具有α-螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)部分中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，光誘導(dǎo)離子通道包含共有基序L(I)DxxxKxxW(F，Y)。括號內(nèi)給出的氨基酸在各種情況下可以替代其前面的氨基酸。這種共有序列是圍繞視黃醛結(jié)合氨基酸賴氨酸的基序。用天然存在的光強(qiáng)度激活CatCh而同時(shí)維持高的時(shí)間精確性的可能性使得其成為獨(dú)特的候選物，特別是對于基因治療的視力恢復(fù)嘗試以及其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。由于降低的光需求，甚至可以通過遠(yuǎn)離其474nm的光譜最大值的激發(fā)來產(chǎn)生CatCh尖峰，例如，使用綠光(532nm-參見圖4d)。由于降低的光需求，在作用光譜的外側(cè)發(fā)揮作用是可行的，并且有助于組織滲透。因此，如與海馬神經(jīng)元中的WTCHOP-2相比，本發(fā)明的突變光誘導(dǎo)離子通道的光敏感性優(yōu)選提高超過5倍，優(yōu)選超過10倍，更優(yōu)選超過20倍，如30倍，甚至更優(yōu)選超過40倍，如50倍，并且最優(yōu)選超過60倍，或甚至超過70倍。此外，如通過海馬神經(jīng)元中的完整細(xì)胞電生理學(xué)記錄測定的，與WTCHOP-2相比，本發(fā)明的突變光誘導(dǎo)離子通道呈現(xiàn)出提高至少1.5倍，更優(yōu)選2倍，或甚至更優(yōu)選2.5倍的刺激頻率。如實(shí)施例中所示，WT-Chop2在海馬神經(jīng)元中呈現(xiàn)出約10Hz至高達(dá)約20Hz的刺激頻率，其中20Hz下的信號發(fā)生已經(jīng)是不準(zhǔn)確的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到固有的峰電位頻率(spikefrequency)還取決于細(xì)胞類型。例如，聽細(xì)胞具有高達(dá)500Hz的固有峰電位頻率。此外，已經(jīng)在體外進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，即在環(huán)境溫度下。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將預(yù)期刺激頻率在溫血?jiǎng)游?如哺乳動(dòng)物)中甚至更高，因?yàn)閯?dòng)力學(xué)也是溫度依賴性的。因此，取決于細(xì)胞類型和溫度，如通過完整細(xì)胞電生理學(xué)記錄所測定的，預(yù)期與WTCHOP-2比較，本發(fā)明的突變光誘導(dǎo)離子通道還呈現(xiàn)出提高至少5倍的刺激頻率，優(yōu)選至少10倍，如至少20倍，或至少30倍，或更優(yōu)選至少40倍，至少50倍，如至少60倍，或至少70倍，甚至更優(yōu)選至少80倍，至少90倍，或至少100倍，最優(yōu)選至少125倍，如至少150倍，或至少175倍，并且甚至最優(yōu)選至少200倍的刺激頻率。以下實(shí)施例中舉例說明了海馬神經(jīng)元培養(yǎng)和來自海馬神經(jīng)元的電生理學(xué)記錄。簡而言之，從新生的P1Sprague-Dawley大鼠(Jackson實(shí)驗(yàn)室)分離海馬，并用木瓜蛋白酶(20Uml-1)在37℃下處理20min。用補(bǔ)充了10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen/Gibco，高葡萄糖)洗滌海馬，并在少量的這種溶液中研磨。將～75,000細(xì)胞涂布于24-孔平板中的聚-D-賴氨酸/層粘連蛋白涂覆的玻璃蓋玻片上。3小時(shí)后，用培養(yǎng)培養(yǎng)基(含有2％B-27補(bǔ)充劑，2mMGlutamax-I和100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的NeurobasalA)替換涂布培養(yǎng)基。涂布后5-10天，使用lipofectamine2000試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染突變體ChR2(L132C)-YFP和ChR2(WT)-YFP。或者，涂布后4-9天，可以將2-5×109GC/ml的病毒(AAV2/7-CAG-ChR2(L132C)-2A-EGFP-WPRE-bGH)加入各個(gè)孔中。以下實(shí)施例中詳細(xì)描述了腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建體的典型構(gòu)建。轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天表達(dá)變得可見。對于任一個(gè)實(shí)驗(yàn)，沒有全-反式視黃醛添加到培養(yǎng)培養(yǎng)基或記錄培養(yǎng)基中。對于在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中的完整細(xì)胞記錄，將具有5-10MΩ電阻的膜片移液器填充滴定至pH7.2的129mM葡萄糖酸鉀、10mMHEPES、10mMKCl、4mMMgATP和0.3mMNa3GTP。將Tyrode’s溶液用作細(xì)胞外溶液(125mMNaCl，2mMKCl，2mMCaCl2，1mMMgCl2，30mM葡萄糖和25mMHEPES，滴定至pH7.4)。名義上無Ca++-細(xì)胞外溶液包含這一相同的溶液，除了其具有0mMCa++和3mMMg++。在興奮性突觸傳導(dǎo)阻滯劑1，2，3，4-四氫-6-硝基-2，3-二氧代-苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺(NBQX，10μM，Sigma)和D(-)-2-氨基-5-膦?；焖?AP-5，50μM，Sigma)的存在下進(jìn)行記錄。對于電壓鉗記錄，將1μM河豚毒素加入細(xì)胞外溶液中。為了抑制BK-通道活性，加入1mMTEA。在裝備有熒光燈的倒置ZeissAxiovert25顯微鏡上進(jìn)行記錄。通過EGFP-或YFP-介導(dǎo)的熒光證明了成功的蛋白質(zhì)表達(dá)。神經(jīng)元接入電阻為15-40MΩ并且監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的穩(wěn)定性。使用Axopatch200A放大器(AxonInstruments，UnionCity，CA)放大電生理信號，在10kHz下過濾，用AxonDigidata1600(50Hz)數(shù)字化并使用pClamp9軟件(AxonInstruments)獲取和分析。使用來自二極管-泵浦固態(tài)激光器(PuschOptoTechGmbH；λ1＝473nm，P1＝100mW，λ2＝532nm，P2＝50mW)的各種長度的光脈沖或來自受激準(zhǔn)分子泵浦染料激光器(Coumarin2，λ＝450nm)的10ns閃光來引起光電流。比光強(qiáng)度是在離細(xì)胞～500μm距離處的400μm直徑石英光纖(STE-F100/400-Y-VIS/NIR；Laser2000，Wessling，德國)末端的強(qiáng)度。從表達(dá)ChR2(L132C)-YFP和ChR2(L132C)-2A-EGFP的神經(jīng)元測得的電流是相同的。此外，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，如通過HEK293細(xì)胞上的Fura-2-成像所測定的，與WTCHOP-2相比，本發(fā)明的突變光誘導(dǎo)離子通道的鈣傳導(dǎo)性提高至少兩倍，優(yōu)選至少三倍，更優(yōu)選至少四倍。為了測定鈣傳導(dǎo)性，將Fura-2AM(5mM；Invitrogen)在室溫下加載30min至1小時(shí)。加載后，將細(xì)胞在不含Ca++的140mMNaCl溶液(140mMNaCl，7mMEGTA，2mMMgCl2和10mMHEPES)中回收。通過使用460/40nm濾鏡(VisitronSystems，Puchheim，德國)的500ms曝光來激發(fā)黃色熒光蛋白以從其YFP-熒光估算各細(xì)胞的表達(dá)水平。然后將溶液替換成由90mMCaCl2、7mMEGTA、2mMMgCl2和10mMHEPES組成的細(xì)胞外Ca++-溶液。在黑暗中15min后，用藍(lán)光(460/40nm)刺激光門控通道10s。用340nm(340/20)和380nm(380/20)激發(fā)Fura-2，并且用CCD相機(jī)檢測發(fā)射的光(540/80nm)(所有濾鏡都來自VisitronSytems，Puchheim，德國)。如上所示，突變光誘導(dǎo)離子通道可以另外包含進(jìn)一步的突變，優(yōu)選置換。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，光誘導(dǎo)離子通道可以另外包含至少一個(gè)以下的氨基酸殘基：對應(yīng)于SEQIDNO：1的253位的位置的天冬氨酸；對應(yīng)于SEQIDNO：1的257位的位置的賴氨酸；對應(yīng)于SEQIDNO：1的260位的位置的色氨酸；對應(yīng)于SEQIDNO：1的123位的位置的谷氨酸；對應(yīng)于SEQIDNO：1的134位的位置的組氨酸或精氨酸，優(yōu)選精氨酸；對應(yīng)于SEQIDNO：1的128位的位置的蘇氨酸、絲氨酸或丙氨酸；和/或?qū)?yīng)于SEQIDNO：1的156位的位置的丙氨酸。因此，突變光誘導(dǎo)離子通道可以包含以下在指定位置處的氨基酸殘基的組合中的一個(gè)，所述位置對應(yīng)于SEQIDNO：1：Cys132+Asp253；Cys132+Lys257；Cys132+Trp260；Cys132+Glu123；Cys132+His134；Cys132+Arg134；Cys132+Thr128；Cys132+Ser128；Cys132+Ala128；Cys132+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257；Cys132+Asp253+Trp260；Cys132+Asp253+Glu123；Cys132+Asp253+His134；Cys132+Asp253+Arg134；Cys132+Asp253+Thr128；Cys132+Asp253+Ser128；Cys132+Asp253+Ala128；Cys132+Asp253+Ala156；Cys132+Lys257+Trp260；Cys132+Lys257+Glu123；Cys132+Lys257+His134；Cys132+Lys257+Arg134；Cys132+Lys257+Thr128；Cys132+Lys257+Ser128；Cys132+Lys257+Ala128；Cys132+Lys257+Ala156；Cys132+Trp260+Glu123；Cys132+Trp260+His134；Cys132+Trp260+Arg134；Cys132+Trp260+Thr128；Cys132+Trp260+Ser128；Cys132+Trp260+Ala128；Cys132+Trp260+Ala156；Cys132+Glu123+His134；Cys132+Glu123+His134；Cys132+Glu123+Arg134；Cys132+Glu123+Thr128；Cys132+Glu123+Ser128；Cys132+Glu123+Ala128；Cys132+Glu123+Ala156；Cys132+His134+Thr128；Cys132+His134+Ser128；Cys132+His134+Ala128；Cys132+His134+Ala156；Cys132+Arg134+Thr128；Cys132+Arg134+Ser128；Cys132+Arg134+Ala128；Cys132+Arg134+Ala156；Cys132+Thr128+Ala156；Cys132+Ser128+Ala156；Cys132+Ala128+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260；Cys132+Asp253+Lys257+Glu123；Cys132+Asp253+Lys257+His134；Cys132+Asp253+Lys257+Arg134；Cys132+Asp253+Lys257+Thr128；Cys132+Asp253+Lys257+Ser128；Cys132+Asp253+Lys257+Ala128；Cys132+Asp253+Lys257+Ala156；Cys132+Lys157+Trp260+Glu123；Cys132+Lys157+Trp260+His134；Cys132+Lys157+Trp260+Arg134；Cys132+Lys157+Trp260+Thr128；Cys132+Lys157+Trp260+Ser128；Cys132+Lys157+Trp260+Ala128；Cys132+Lys157+Trp260+Ala156；Cys132+Trp260+Glu123+His134；Cys132+Trp260+Glu123+Arg134；Cys132+Trp260+Glu123+Thr128；Cys132+Trp260+Glu123+Ser128；Cys132+Trp260+Glu123+Ala128；Cys132+Trp260+Glu123+Ala156；Cys132+Glu123+His134+Thr128；Cys132+Glu123+His134+Ser128；Cys132+Glu123+His134+Ala128；Cys132+Glu123+His134+Ala156；Cys132+Glu123+Arg134+Thr128；Cys132+Glu123+Arg134+Ser128；Cys132+Glu123+Arg134+Ala128；Cys132+Glu123+Arg134+Ala156；Cys132+His134+Thr128+Ala156；Cys132+His134+Ser128+Ala156；Cys132+His134+Ala128+Ala156；Cys132+Arg134+Thr128+Ala156；Cys132+Arg134+Ser128+Ala156；Cys132+Arg134+Ala128+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+His134；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Arg134；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Thr128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Ser128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Ala128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Ala156；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+His134；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Thr128；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Ser128；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Ala128；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Ala156；Cys132+Trp260+Glu123+His134+Thr128；Cys132+Trp260+Glu123+His134+Ser128；Cys132+Trp260+Glu123+His134+Ala128；Cys132+Trp260+Glu123+His134+Ala156；Cys132+Trp260+Glu123+Arg134+Thr128；Cys132+Trp260+Glu123+Arg134+Ser128；Cys132+Trp260+Glu123+Arg134+Ala128；Cys132+Trp260+Glu123+Arg134+Ala156；Cys132+Glu123+Arg134+Thr128+Ala156；Cys132+Glu123+Arg134+Ser128+Ala156；Cys132+Glu123+Arg134+Ala128+Ala156；Cys132+Glu123+His134+Thr128+Ala156；Cys132+Glu123+His134+Ser128+Ala156；Cys132+Glu123+His134+Ala128+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+His134；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Thr128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Ser128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Ala128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Ala156；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Thr128；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Ser128；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Ala128；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Ala156；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Thr128；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Ser128；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Ala128；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Ala156；Cys132+Trp260+Glu123+Arg134+Thr128+Ala156；Cys132+Trp260+Glu123+Arg134+Ser128+Ala156；Cys132+Trp260+Glu123+Arg134+Ala128+Ala156；Cys132+Trp260+Glu123+His134+Thr128+Ala156；Cys132+Trp260+Glu123+His134+Ser128+Ala156；Cys132+Trp260+Glu123+His134+Ala128+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Thr128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Ser128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Ala128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Thr128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Ser128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Ala128；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Ala156；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Thr128+Ala156；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Ser128+Ala156；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Ala128+Ala156；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Thr128+Ala156；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Ser128+Ala156；Cys132+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Ala128+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Thr128+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Ser128+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+His134+Ala128+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Thr128+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Ser128+Ala156；Cys132+Asp253+Lys257+Trp260+Glu123+Arg134+Ala128+Ala156。然而，在以上列表中，Cys132也可以被Ser132、Glu132、Asp132或Thr132置換。通常，通過待用所述離子通道轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生光誘導(dǎo)離子通道功能化所需的視黃醛或視黃醛衍生物。根據(jù)其構(gòu)型，視黃醛可以是全-反式視黃醛、11-順式-視黃醛、13-順式-視黃醛或9-順式-視黃醛。然而，還考慮了本發(fā)明的突變光誘導(dǎo)離子通道可以整合到載體、脂質(zhì)體或其他人造細(xì)胞膜中。因此，在第二個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種通道視紫紅質(zhì)，其包含根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道和視黃醛或視黃醛衍生物。優(yōu)選地，視黃醛衍生物選自3，4-脫氫視黃醛、13-乙基視黃醛、9-dm-視黃醛、3-羥基視黃醛、4-羥基視黃醛、萘基視黃醛、3，7，11-三甲基-十二烷-2，4，6，8，10-五烯醛、3，7-二甲基-癸烷-2，4，6，8-四烯醛、3，7-二甲基-辛烷-2，4，6-三烯醛和6-7阻旋(rotation-blocked)視黃醛、8-9阻旋視黃醛和10-11阻旋視黃醛。此外，第一個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案對應(yīng)于第二個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案。在第三個(gè)方面中，本發(fā)明還涉及一種核酸構(gòu)建體，其包含編碼根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道的核苷酸序列。為了確保最佳表達(dá)，還可以對編碼DNA進(jìn)行適當(dāng)?shù)匦揎?，例如，通過添加合適的調(diào)控序列和/或靶向序列和/或通過將編碼DNA序列與選定宿主的優(yōu)選密碼子使用進(jìn)行匹配。靶向序列可以編碼將光誘導(dǎo)離子通道靶向于細(xì)胞內(nèi)的特定位點(diǎn)或區(qū)室的C-端延伸序列，如靶向于突觸或突觸后位點(diǎn)、靶向于軸突-丘或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。核酸可以結(jié)合另外的元件，例如，啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄起始和終止信號以及翻譯起始和終止信號以及聚腺苷酸化信號，以用于本發(fā)明蛋白質(zhì)序列的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的或組成型的、通用的或細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子。細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的實(shí)例是對于雙極細(xì)胞特異性的mGlu6-啟動(dòng)子。啟動(dòng)子、載體和其他元件的選擇是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員技能水平內(nèi)的常規(guī)設(shè)計(jì)事件。文獻(xiàn)中描述了許多這樣的元件，并且是可通過商業(yè)供應(yīng)商獲得的。因此，在第四個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含編碼根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道的核苷酸序列或根據(jù)第三個(gè)方面的核酸構(gòu)建體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體適用于基因治療，特別是其中載體適用于病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。術(shù)語“適用于病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移”在此意思是所述載體可以包裝在病毒中，并且因此遞送至目標(biāo)位點(diǎn)或細(xì)胞。適用于基因治療的病毒的實(shí)例是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、痘病毒、α病毒、狂犬病病毒、semliki森林病毒和皰疹病毒。這些病毒的差異在于它們多好地將基因轉(zhuǎn)移至它們識別并能夠感染的細(xì)胞中，以及它們是否永久或臨時(shí)地改變細(xì)胞的DNA。然而，基因治療還包括非病毒方法，如應(yīng)用裸DNA、lipoplex和陽離子多聚物(polyplex)以及樹狀聚合物(dendrimer)。如上所述，可以將所得到的核酸序列引入細(xì)胞中，例如，使用病毒作為載體或通過轉(zhuǎn)染，包括例如通過化學(xué)轉(zhuǎn)染劑(如，Lipofectamine，F(xiàn)ugene等)、電穿孔、磷酸鈣共沉淀和DNA的直接擴(kuò)散。實(shí)施例中詳細(xì)描述了用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法并且適用于相應(yīng)的受體細(xì)胞。使用DNA的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了穩(wěn)定的細(xì)胞或細(xì)胞系(如果轉(zhuǎn)染的DNA整合至基因組中)或是不穩(wěn)定(瞬時(shí))的細(xì)胞或細(xì)胞系(其中轉(zhuǎn)染的DNA以染色體外形式存在)。此外，通過使用游離型復(fù)制質(zhì)粒可以獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系，這意味著染色體外質(zhì)粒的遺傳受到整合至細(xì)胞基因組中的控制元件的控制。通常，合適載體或質(zhì)粒的選擇取決于預(yù)定的宿主細(xì)胞。因此，在第五個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞，其包含根據(jù)第二個(gè)方面的通道視紫紅質(zhì)、根據(jù)第三個(gè)方面的核酸構(gòu)建體或根據(jù)第四個(gè)方面的表達(dá)載體。如將在以下進(jìn)行描述的，根據(jù)本發(fā)明的突變光誘導(dǎo)離子通道的一個(gè)應(yīng)用是失明受試者(如，人或動(dòng)物)的治療。存在著其中天然視細(xì)胞不再起作用但所有神經(jīng)連接能夠持續(xù)運(yùn)作的多種疾病。目前，已經(jīng)在各個(gè)研究中心中進(jìn)行了嘗試以在視網(wǎng)膜上植入具有人造陶瓷光細(xì)胞的薄膜。這些光細(xì)胞意圖用來使視網(wǎng)膜的次生但仍然完整的細(xì)胞去極化，并且由此引發(fā)神經(jīng)脈沖(仿生眼)。根據(jù)本發(fā)明的光控離子通道在這些神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、無長突細(xì)胞或雙極細(xì)胞中的有意表達(dá)將是極好的解決方案并且能夠獲得更高的三維目視分辨率。例如，可以簡單地實(shí)現(xiàn)突變光誘導(dǎo)離子通道結(jié)合至本來不表達(dá)相應(yīng)通道的細(xì)胞的膜中，其包括使用已知的重組DNA技術(shù)的程序首先將編碼該離子通道的DNA結(jié)合至合適的表達(dá)載體中，例如質(zhì)粒、粘粒或病毒，然后用其轉(zhuǎn)化目標(biāo)細(xì)胞，并且在這一宿主中表達(dá)蛋白質(zhì)。接著，以合適的方式處理細(xì)胞，例如，用視黃醛，以使得能夠在蛋白質(zhì)和視黃醛之間形成席夫氏堿連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這發(fā)生在各種酵母中，如對于視紫紅質(zhì)(如，細(xì)菌視紫紅質(zhì)和/或牛視紫紅質(zhì))已經(jīng)成功進(jìn)行的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)或畢赤酵母(Pichiapastoris)。還可以在特定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)或昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。用游離型載體來實(shí)現(xiàn)作為瞬時(shí)表達(dá)的表達(dá)，優(yōu)選在黑素瘤細(xì)胞(例如，BLM細(xì)胞系)、COS細(xì)胞(通過“非洲綠猴腎CV1”細(xì)胞的感染產(chǎn)生)或HEK細(xì)胞(“人胚胎腎細(xì)胞”，例如，HEK293細(xì)胞)，或BHK細(xì)胞(“幼倉鼠腎細(xì)胞”)中，或者在CHO細(xì)胞(“中國倉鼠卵巢細(xì)胞”)、骨髓瘤細(xì)胞或MDCK細(xì)胞(“Madine-Darby犬腎細(xì)胞”)中或在用桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細(xì)胞中以穩(wěn)定表達(dá)的形式來實(shí)現(xiàn)表達(dá)。因此，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或MDCK細(xì)胞。在恢復(fù)視力的情況中，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是感光細(xì)胞、視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極神經(jīng)元、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、假單極神經(jīng)元、多極神經(jīng)元、錐體神經(jīng)元、浦肯野細(xì)胞或顆粒細(xì)胞。神經(jīng)元是通過電和化學(xué)信號發(fā)生來處理和傳遞信息的電興奮細(xì)胞，其中通過突觸(與其他細(xì)胞的專門化連接)發(fā)生化學(xué)信號發(fā)生。存在多種專門類型的神經(jīng)元，如對觸覺、聲音、光和各種影響感覺器官的細(xì)胞的其他刺激作為響應(yīng)的感覺神經(jīng)元、接收來自大腦和脊髓的信號并引起肌肉收縮和影響腺體的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，以及將神經(jīng)元連接大腦或脊髓的相同區(qū)域內(nèi)的其他神經(jīng)元的中間神經(jīng)元。通常，神經(jīng)元具有細(xì)胞體、樹突和軸突。樹突是源于細(xì)胞體的絲狀體，通常延伸數(shù)百微米并且多次分支。軸突是在稱為軸突丘的部位從細(xì)胞體產(chǎn)生的特殊細(xì)胞絲。神經(jīng)元的細(xì)胞體常常產(chǎn)生多個(gè)樹突，但從不產(chǎn)生超過一個(gè)軸突，盡管軸突在終止前可以分支數(shù)百次。在大部分的突觸處，信號從一個(gè)神經(jīng)元的軸突發(fā)送至另一個(gè)的樹突。然而，存在這些規(guī)則的許多例外情況：缺少樹突的神經(jīng)元、沒有軸突的神經(jīng)元、將一個(gè)軸突連接另一個(gè)軸突或?qū)渫贿B接另一個(gè)樹突的突觸，等等。大多數(shù)神經(jīng)元在解剖學(xué)上可以進(jìn)一步表征為單極或假單極(樹突和軸突來自相同的突起)、雙極(軸突和單個(gè)樹突在細(xì)胞體的相對末端)、多極(具有超過兩個(gè)樹突并且可以進(jìn)一步分類為(i)具有長投射的軸性突起的GolgiI神經(jīng)元，如錐體細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞和前角細(xì)胞，和(ii)GolgiII：其軸性突起局部投射的神經(jīng)元，如顆粒細(xì)胞。感光細(xì)胞，是在視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)的能夠進(jìn)行光傳導(dǎo)的專門神經(jīng)元。兩種經(jīng)典的感光器是視桿和視錐，其各自產(chǎn)生由視覺細(xì)胞所用的信息。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是位于眼睛視網(wǎng)膜內(nèi)表面附近的神經(jīng)元類型。這些細(xì)胞具有樹突和投射至前頂蓋(pretectum)(中腦)、下丘腦中的視交叉上核和側(cè)膝體(丘腦)的長軸突。小部分幾乎對視覺很少或沒有任何作用，但自身是光敏感性的。它們的軸突形成視網(wǎng)膜下丘腦束并且作用于晝夜節(jié)律和瞳孔光反射，瞳孔的恢復(fù)尺寸。它們通過兩種中間神經(jīng)元類型：雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞，從光感受器接收視覺信息。無長突細(xì)胞是視網(wǎng)膜中的中間神經(jīng)元，并且負(fù)責(zé)70％的對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的輸入。雙極細(xì)胞，其負(fù)責(zé)另外30％的對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的輸入，通過無長突細(xì)胞來調(diào)控。作為視網(wǎng)膜的一部分，雙極細(xì)胞存在于光感受器(視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間。它們直接或間接地起作用以將來自光感受器的信號傳遞至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。細(xì)胞可以進(jìn)行分離(和遺傳修飾)、維持并在合適的溫度和氣體混合物中(通常，37℃，5％CO2)培養(yǎng)，任選在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞孵育器中，并且在實(shí)施例中對特定細(xì)胞系或細(xì)胞類型進(jìn)行了舉例說明。各種細(xì)胞類型的培養(yǎng)條件可能發(fā)生變化，并且對于特定細(xì)胞類型的條件的變化可能導(dǎo)致不同的表型。除了溫度和氣體混合物以外，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中最常見的變化因素是生長培養(yǎng)基。用于生長培養(yǎng)基的配方可以特別地在pH、葡萄糖濃度、生長因子和其他營養(yǎng)素成分的存在方面發(fā)生變化。生長培養(yǎng)基可以是商購得到的，或可以根據(jù)組成來制備，所述組成可以獲自美國典型微生物保藏中心(ATCC)。用于補(bǔ)充培養(yǎng)基的生長因子常常源自動(dòng)物血，如小牛血清。此外，可以將抗生素加入生長培養(yǎng)基中。培養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行的常規(guī)操作包括更換培養(yǎng)基以及細(xì)胞傳代。對于CatCh，存在其他潛在的應(yīng)用領(lǐng)域。因?yàn)镃a++是重要的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑，CatCh打開了對細(xì)胞的精細(xì)調(diào)節(jié)的Ca++內(nèi)平衡進(jìn)行光學(xué)干預(yù)的途徑，從而調(diào)節(jié)其狀態(tài)和活性。在基礎(chǔ)研究中，CatCh可以用于光學(xué)地控制Ca++-依賴性胞吐作用而作為螯合Ca++(cagedCa++)的替代26(例如，突觸處的遞質(zhì)釋放)、通過鈣激活的激酶和磷酸酶光學(xué)地激活下游細(xì)胞內(nèi)過程或通過將CatCh靶向于細(xì)胞內(nèi)區(qū)室(如Golgi器或內(nèi)質(zhì)網(wǎng))而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步方面是根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道或根據(jù)第二個(gè)方面的通道視紫紅質(zhì)或根據(jù)第三個(gè)方面的核酸構(gòu)建體或根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞作為藥物的用途。特別地，本發(fā)明的表達(dá)載體可以用于基因治療中。更具體地，根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道、根據(jù)第二個(gè)方面的通道視紫紅質(zhì)、根據(jù)第三個(gè)方面的核酸構(gòu)建體或根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可以用于失明或視力下降的治療。然而，由于高達(dá)300Hz的快速峰電位啟動(dòng)的作用和加速的復(fù)極化，還設(shè)想光誘導(dǎo)離子通道在聽力的重建或耳聾的治療中的用途。此外，根據(jù)第一個(gè)方面的突變光誘導(dǎo)離子通道可以包含另外的置換(因此稱為SFO，或慢突變體，參見表1)，其導(dǎo)致持久的光誘導(dǎo)鈣內(nèi)流，其隨后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，設(shè)想了另外在對應(yīng)于SEQIDNO：1的128位的位置具有蘇氨酸、絲氨酸或丙氨酸的根據(jù)本發(fā)明的光誘導(dǎo)離子通道在癌細(xì)胞消融中的用途。例如，可以通過經(jīng)由癌細(xì)胞表面標(biāo)志物的病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移來使根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體靶向于癌細(xì)胞。此外，應(yīng)該注意到，特別地逆轉(zhuǎn)錄病毒優(yōu)先整合至快速分裂的細(xì)胞中，如癌細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明的光誘導(dǎo)離子通道主要表達(dá)并且整合至癌細(xì)胞的細(xì)胞膜中。在通過光進(jìn)行刺激時(shí)，這些離子通道將開放并且誘導(dǎo)持久的鈣內(nèi)流，因此導(dǎo)致癌細(xì)胞的死亡。這樣的用途在自然暴露于光的癌細(xì)胞的消融中特別有利，如黑素瘤癌細(xì)胞。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌是黑素瘤癌。在最后一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及根據(jù)第一個(gè)方面的光誘導(dǎo)離子通道，或根據(jù)第二個(gè)方面的通道視紫紅質(zhì)或根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞在高通量篩選中的用途。高通量篩選(HTS)是一種用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)中的方法，尤其是用于藥物發(fā)現(xiàn)中，并且涉及生物和化學(xué)領(lǐng)域。HTS允許研究者在短時(shí)期內(nèi)高效地進(jìn)行數(shù)百萬次生物化學(xué)、遺傳或藥理學(xué)測試，通常是通過現(xiàn)代機(jī)器人技術(shù)、數(shù)據(jù)加工和控制軟件、液體操作裝置和靈敏的檢測器的組合。通過這種方法，可以快速地鑒別出調(diào)節(jié)特定生物分子途徑的活性劑；特別是改變離子通道的物質(zhì)，如根據(jù)本發(fā)明的光誘導(dǎo)離子通道、Ca++-誘導(dǎo)鉀通道或BK通道。例如，可以在宿主細(xì)胞中共表達(dá)Ca++-誘導(dǎo)鉀通道和光誘導(dǎo)離子通道。在通過光進(jìn)行刺激時(shí)，光誘導(dǎo)通道將開放并且細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度將增加，由此激活鉀通道。因此，將接收到膜電位的變化，其可以通過電位敏感性染料來監(jiān)測，如RH421(N-(4-硫代丁基)-4-(4-(4-(二戊基氨基)苯基)丁二烯基)吡啶，內(nèi)鹽)。因此這樣的HTS可以包括以下步驟：(i)將表達(dá)Ca++誘導(dǎo)(鉀)通道和根據(jù)本發(fā)明的光誘導(dǎo)離子通道的細(xì)胞接觸針對Ca++-離子通道的候選試劑，(ii)施加光刺激以誘導(dǎo)光誘導(dǎo)通道，(iii)測定膜電位的改變(混合信號)，和(iv)將步驟(iii)中測定的信號與經(jīng)歷步驟(ii)的只表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的光誘導(dǎo)離子通道的細(xì)胞中測定的信號(單一信號)相比較。膜電位變化的降低表示有發(fā)展前景的Ca++-誘導(dǎo)(鉀)通道的調(diào)節(jié)劑。推想這樣的方法產(chǎn)生了大約5∶1的信噪比，這與在只表達(dá)Ca++-誘導(dǎo)通道的細(xì)胞上進(jìn)行的直接測量相比改善了很多。由于改善的信噪比，所述方法，特別是通過使用光誘導(dǎo)離子通道，可能特別適用于HTS。本質(zhì)上，HTS使用一種途徑在相對短的時(shí)間內(nèi)收集大量關(guān)于許多物質(zhì)對特定靶標(biāo)的效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在這種情況下，篩選是具有單一目標(biāo)(通常測試科學(xué)假設(shè))的較大的實(shí)驗(yàn)，隨后所有這一數(shù)據(jù)可以應(yīng)用于這一目標(biāo)。對于HTS，可以將根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞接種于組織平板中，如多孔平板，例如，96-孔平板。然后，使平板中的細(xì)胞接觸測試物質(zhì)足以與目標(biāo)離子通道相互作用的時(shí)間。平板中孔與孔之間的測試物質(zhì)可以不同。在經(jīng)過孵育時(shí)間后，對平板上的所有孔進(jìn)行測量，人工地或通過機(jī)器測量，并且任選地與沒有接觸測試物質(zhì)的細(xì)胞的測量值進(jìn)行比較。當(dāng)研究者使用膜片鉗時(shí)，人工測量可能是必需的，從而尋找自動(dòng)化途徑中尚未實(shí)施的效應(yīng)。另外，專門的自動(dòng)分析儀器可以在孔上運(yùn)行多種實(shí)驗(yàn)(如，分析特定頻率的光或高通量膜片鉗測量)。在這種情況下，儀器輸出各個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，例如作為數(shù)值網(wǎng)格，其中各數(shù)字對應(yīng)于獲自單個(gè)孔的值。取決于這個(gè)第一分析的結(jié)果，通過在新的分析平板中使用與鑒定為活性(即，改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸水平的)物質(zhì)的相似的那些物質(zhì)，研究者可以在同一篩選中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并且隨后重新運(yùn)行該實(shí)驗(yàn)以收集進(jìn)一步的數(shù)據(jù)，優(yōu)化化學(xué)試劑的結(jié)構(gòu)以提高試劑對細(xì)胞的效應(yīng)。自動(dòng)化是HTS實(shí)用性中的重要因素。專門的機(jī)器人通常負(fù)責(zé)單一分析平板從形成至最終分析的整個(gè)使用期間內(nèi)的眾多過程。HTS機(jī)器人通?？梢酝瑫r(shí)制備和分析許多平板，因而進(jìn)一步加快數(shù)據(jù)收集過程。適用于根據(jù)本發(fā)明的HTS的裝置的實(shí)例包括FluorometricImagingPlateReader(FLIPRTM；MolecularDevices)、FLEXstationTM(MolecularDevices)、VoltageIonProbeReader(VIPR，AuroraBiosciences)、Ratio(ATTO)。在下文中，通過不是意圖限制本發(fā)明范圍的附圖和實(shí)施例來舉例說明本發(fā)明。附圖說明圖1.基于光感視紫紅質(zhì)2結(jié)構(gòu)的ChR2同源性模型(PDB編碼1H2S)。用于半胱氨酸掃描的目標(biāo)區(qū)域(R115至T139)位于跨膜螺旋3(TM3)中并且用紅色突出顯示。插圖分別顯示突變的L132C、氫鍵合的C128和D156(其連接TM3和TM4，如通過虛線表示的)以及用于質(zhì)子供體(H134)和質(zhì)子受體(E123)的同源殘基的推定位置。通過由席夫氏堿共價(jià)連接的全反式視黃醛(ATR)和K257形成了發(fā)色團(tuán)。將通過除去亮氨酸的甲基形成的空腔描繪為球，并且覆蓋在半胱氨酸殘基的突變的巰基(黃色球)上。用VMD30繪制該圖。圖2.HEK293細(xì)胞和非洲爪蟾(Xenopus)卵母細(xì)胞中CatCh的生物物理表征。(a)左圖，在-60mV下表達(dá)CatCh(黑色)和WTChR2(紅色)的HEK293細(xì)胞中測量的響應(yīng)于500ms藍(lán)光脈沖的穩(wěn)態(tài)電流幅度的總結(jié)，顯示為平均值±s.d.(n＝6)。右圖，相對于穩(wěn)態(tài)電流標(biāo)準(zhǔn)化的光電流的關(guān)斷動(dòng)力學(xué)(off-kinetics)的比較。(b)左圖，響應(yīng)于1-s藍(lán)色473-nm光脈沖的實(shí)際光電流。將描記線相對于峰值光電流幅度標(biāo)準(zhǔn)化以說明與WT(紅色)相比CatCh(黑色)穩(wěn)態(tài)-峰值電流比例的提高。右圖，相對于峰值電流標(biāo)準(zhǔn)化的光電流開通動(dòng)力學(xué)(on-kinetics)的比較。(c)在-120mV下80mM細(xì)胞外Ca++(pH9)中表達(dá)CatCh和WTChR2的非洲爪蟾卵母細(xì)胞的473-nm光響應(yīng)(連續(xù)的下方描記線)。注射Ca++螯合劑BAPTA至1mM最終胞質(zhì)濃度消除了內(nèi)在Ca++-激活的氯離子通道的疊加電流，同時(shí)保持了殘留的通道視紫紅質(zhì)Ca++-電流(虛的上方描記線)。將電流相對于WTChR2峰值電流標(biāo)準(zhǔn)化，并且作為六個(gè)其他實(shí)驗(yàn)的典型電流。注意到BATPA注射之前和之后CatCh的較大光電流幅度差異，其表明與WTChR2相比提高的Ca++滲透性。(d)在-80mV下HEK293細(xì)胞中CatCh的離子流特征(n＝6，參見方法)。(e)與140mMNaCl(-●-，WTChR2和CatCh疊加的)相比，90mMCaCl2中WTChR2(-■-)和CatCh(-▲-)的電流-電壓關(guān)系。將電流相對于-100mV下的WTChR2電流標(biāo)準(zhǔn)化。CaCl2中CatCh的逆轉(zhuǎn)電位轉(zhuǎn)變成正電位，其表明提高的Ca++-滲透性(平均值±S.d.，n＝5)。(f)在90mM細(xì)胞外Ca++存在下，在表達(dá)WTChR2(●)和CatCh(■)的HEK293細(xì)胞中對10s460nm光(藍(lán)條)的Ca++-內(nèi)流的Fura-2測量(n＝10)，其顯示出在CatCh中細(xì)胞內(nèi)Ca++的增加四倍的升高(對照為未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，▲)。圖3.在海馬培養(yǎng)神經(jīng)元中的CatCh表達(dá)。(a)在CAG啟動(dòng)子下表達(dá)ChR2(L132C)-2A-EGFP的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的共焦圖像。比例尺20μm。(b)通過473-nm藍(lán)光的600ms脈沖(J473nm1×1019光子s-1cm-2)引起的CatCh(黑色)和WT(紅色)典型光電流的比較。(c)穩(wěn)態(tài)電流幅度的總結(jié)(-60mV，n-6)。圖4.快速和高靈敏度神經(jīng)光刺激。(a-d)來自響應(yīng)于2-s光脈沖的表達(dá)CatCh的海馬神經(jīng)元的典型完整細(xì)胞電流-鉗記錄。(a)WT所需要的473-nm光強(qiáng)度誘導(dǎo)了去極化阻斷(J473nm1×1017光子s-1cm-2)。(b)降低的光強(qiáng)度重新建立了激活(firing)(J473nm1×1016光子s-1cm-2)。(c)峰電位-激活(spike-firing)的典型光-調(diào)諧曲線(Jmax9.7×1016光子s-1em-2，平均值±s.d.，2輪)。(d)中度的綠色532-nm照射也引發(fā)了動(dòng)作電位串(train)(J532nm2.5×1017光子s-1cm-2)。(e)由25個(gè)1-ms473-nm光脈沖(J473nm3×1018光子s-1cm-2，平均值±s.d.，[振動(dòng)])組成的整個(gè)光脈沖串中的光脈沖-峰電位潛伏期，在2mM細(xì)胞外Ca++(■)中和作為5Hz下的對照，在3mM細(xì)胞外Mg++中(■)，其將潛伏期增加至與WTChR2相似的值。(f)以50Hz速率響應(yīng)1-ms473-nm脈沖的峰電位激活(J473nm2.8×1019光子s-1cm-2)和(g)在10Hz下響應(yīng)于10ns473-nm光脈沖(J473nm1×1025光子s-1cm-2)。(h)由于BK通道被1mMTEA的抑制導(dǎo)致的不完整的膜復(fù)極化(雙頭箭頭)。脈沖串的第3峰電位(黑色)、TEA應(yīng)用后的第1峰電位(紅色)和第3峰電位(藍(lán)色)的重疊(J473nm1.8×1018光子s-1cm-2)。(i)細(xì)胞外溶液中Ca++被Mg++取代減緩了峰復(fù)極化并且引起延長的去極化(5Hz，左圖)和較高頻率的多個(gè)峰電位的形成(20Hz，右圖)(J473nm8.3×1018光子s-1em-2)。圖5.CatCh的光譜表征。光激發(fā)后，CatCh(黑色描記線)突變體動(dòng)力學(xué)中與WT(紅色描記線)相當(dāng)?shù)夭⒃诠庵虚g體的存在下進(jìn)入光循環(huán)。該圖描繪了450nm激發(fā)后的光譜變化，具有去質(zhì)子化席夫氏堿的特征性波長，P390(381nm，上圖)，對于P520，主要處于開放狀態(tài)(541nm，第二幅圖)，和基態(tài)(440nm，第三幅圖)。第一紅移的中間體，推測為P500，沒有分解，并且只檢測為偏移。席夫氏堿以微秒的時(shí)程(τ＝50μs)去質(zhì)子化，這是由于在381nm處的低幅度而難以觀察到的一個(gè)事件，伴隨541nm處的上升。P520中間體的上升發(fā)生在之后的過程中(t＝1.5ms)，在其衰變之前(t＝9ms)，由此增加第二持久的物質(zhì)(P480)?；鶓B(tài)(D470)在以下過程(t＝10s)中回復(fù)。光循環(huán)中的轉(zhuǎn)變類似WT中觀察到的那些。至于電流測量中的開通和關(guān)斷動(dòng)力學(xué)，突變沒有引起功能狀態(tài)的總體變化。開放狀態(tài)主要是通過P520中間體確定的。與WT中較低的P520相比，在P390幅度的情況中發(fā)現(xiàn)了主要的差異。因此，L132C突變沒有影響發(fā)色團(tuán)位點(diǎn)處的光反應(yīng)。注意到光循環(huán)的光譜動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)在50mMCa++的存在下沒有改變。圖6.在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中通過兩個(gè)電極-電壓-鉗測定了CatCh的作用譜。在不存在Ca++的情況下，在不同波長(λ)下測量電流幅度(如實(shí)施例中所示)，相對于光子流量標(biāo)準(zhǔn)化(n＝6)?；鶓B(tài)(-)和作用譜(■)的比較。圖7.通過Ca++誘導(dǎo)的表面電位變化。已知跨膜的電壓降取決于所施加的電位差(Ψ’)并且通過表面電位(Φ0)來改變。通常Φ0取決于負(fù)表面電荷密度，其可以通過用反離子屏蔽來改變。因此，可以通過膜的外側(cè)或內(nèi)側(cè)上的表面電荷的改變來影響電壓門控的鈉通道(和其他電壓敏感性通道)的激活18。在我們的情況中，通過CatCh傳導(dǎo)的Ca++中和了神經(jīng)元內(nèi)膜面上的負(fù)表面電荷。通過這一作用，誘導(dǎo)了對膜電位的去極化效應(yīng)，從而導(dǎo)致在較低光強(qiáng)度下動(dòng)作電位的誘導(dǎo)。在a-c中描繪了這種機(jī)制的示意圖(按照Hille2001)。(a)在黑暗中，CatCh通道關(guān)閉，膜上的電位差異，EM(施加的外部電位)，等同于靜息膜電位(在此設(shè)定為-60mV)。為了簡單起見，將Φ0設(shè)定為Φ0’。(b)在CatCh的光激發(fā)時(shí)，發(fā)生了常見的膜去極化Na+內(nèi)流。然而，進(jìn)入神經(jīng)元的另外的Ca++提高了內(nèi)膜面上的表面電位(Φ0”)。Ca++內(nèi)流越高，Φ0”越為正性(通過雙頭箭頭表示)，并且跨膜的電壓降越小。這有助于電壓門控的鈉通道的激活。(c)通過用Mg++取代細(xì)胞外Ca++(Mg++不滲透通過CatCH并且早已存在于細(xì)胞溶質(zhì)中達(dá)到～4mM)，只發(fā)生較小的去極化作用。這是由于與Ca++相比，Mg++與細(xì)胞外膜側(cè)的結(jié)合較弱，這略微降低了細(xì)胞外表面電位Φ0’。注意到表面電位的去極化效應(yīng)隨著跨膜電壓降的斜率降低而提高。具體實(shí)施方式實(shí)施例CatCh的構(gòu)建和生物物理表征與之前的方法相反，本發(fā)明人的目的在于鑒定在WTChR2內(nèi)其突變改變了陽離子滲透性的殘基。發(fā)明人著重于第三跨膜結(jié)構(gòu)域，因?yàn)樵摻Y(jié)構(gòu)域內(nèi)的幾個(gè)突變的殘基已經(jīng)顯示出改變通道的光循環(huán)和門控(圖1)5-7，12。將從Arg115至Thr139的各殘基單獨(dú)地用半胱氨酸置換并在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中篩選其功能變化。光譜學(xué)。按照之前所述的5，13，在畢赤酵母中表達(dá)并從其純化CatCh。進(jìn)行了閃光光解研究并且在從受激準(zhǔn)分子泵浦染料激光器(450nm，2-3mJ)的10ns激光閃光激發(fā)后測量吸光率變化13。L132C(CatCh)突變在電流描記線的振幅和形狀上都呈現(xiàn)出顯著變化。HEK293細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)。在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染C-末端截短的ChR2(L132C)-YFP(載體：pcDNA(-)-chop2-309-(L132C)-EYFP)，并且在所有時(shí)間保持在G418選擇下(0.6mg/ml；PAAGermany，德國)。對于野生型WTChR2，按照所述的13，將C-末端截短的ChR2-YFP(載體：pcDNA4TO-chop2-309-EYFP)穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染至HEK293-Trex細(xì)胞中(Invitrogen)，培養(yǎng)并誘導(dǎo)。在從測量前24小時(shí)用人密碼子優(yōu)化的pcDNA3.1(-)-ChR2-YFP構(gòu)建體(WT，H134R或L132C)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞(Effectene，QIAGEN)測定峰-穩(wěn)態(tài)關(guān)系。HEK293細(xì)胞上的電生理學(xué)記錄。在水平DMZ-Universal牽拉器(系列號No.5318904120B，Zeitz-Instruments，Augsburg，德國)上從薄壁硼硅玻璃(GB150-8P，ScienceProducts，Hofheim，德國)制得具有2-4Ω電阻的膜片電極(patchpipette)。光電流用完整細(xì)胞膜片鉗方法記錄并且通過來自二極管-泵浦固態(tài)激光器(PuschOptoTechGmbH，BadenBaden，德國；λ＝473nm)的聚焦至400μm光纖中的光脈沖來激活。通過快速的計(jì)算機(jī)控制的光閘(UniblitzLS6ZM2，VincentAssociates)來施加光脈沖。在光波導(dǎo)末端測量給出的所有光強(qiáng)度。為了獲得對于不同陽離子的滲透率的估計(jì)值，我們測量了光電流-電壓關(guān)系并確定了逆轉(zhuǎn)電位。細(xì)胞內(nèi)溶液含有140mMNaCl、7mMEGTA、2mMMgCl2和10mMTris(pH＝9)，而細(xì)胞外溶液含有140mMNaCl、2mMMgCl2和10mMTris(pH＝9)。對于陽離子滲透性，外部的140mMNaCl分別替換為140mMKCl、90mMCaCl2或90mMMgCl2。當(dāng)pH從9降至7.4(6)時(shí)，從電流-電壓關(guān)系的逆轉(zhuǎn)電位偏移確定質(zhì)子滲透性。根據(jù)Goldman-Hodgkin-Katz(GHK)公式計(jì)算滲透率比例，包括Na+、K+、H+和Ca++項(xiàng)。在HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后24h，與WTChR2相比，藍(lán)光誘導(dǎo)的CatCh的穩(wěn)態(tài)電流具有～2.5倍高的幅度(CatCh：25.0±8.8pA/pF；WT：10.1±4.1pA/pF；平均值±s.d.，n＝6，-60mV，圖2a)。穩(wěn)態(tài)-峰電流之比也從WT的0.37±0.18增加至CatCh的0.71±0.16(圖2b)。在重復(fù)的藍(lán)光刺激過程中，CatCh峰電流消失。當(dāng)沒有通過黃光過早地誘導(dǎo)恢復(fù)時(shí)，在黑暗中數(shù)分鐘內(nèi)恢復(fù)。相反，在相同條件下，WTChR2峰電流的完全恢復(fù)花了20秒鐘13。與WTChR2(τon＝214±2s，τoff＝10±1ms，n＝9，pH7.4，-60mV；平均值±s.d.；圖2a、b，圖5下圖，表1)相比，CatCh的激活和失活時(shí)間常數(shù)(τon＝590±3s，τoff＝15±2ms，n＝9，pH7.4，-60mV，平均值±s.d.)略長。接著，發(fā)明人將所描述的對通道性能的效應(yīng)與光循環(huán)中的光譜變化進(jìn)行了比較。純化CatCh上的閃光光解實(shí)驗(yàn)揭示只有與WTChR2光譜的小偏離13(參見圖5)。1.早期P390中間體，其代表去質(zhì)子化的席夫氏堿，幾乎不能檢測出。2.中間體P520，其代表通道的開放狀態(tài)，顯示出9ms略微延長的存在時(shí)間，與通過電生理學(xué)測定的τoff值相當(dāng)。對于突變體H134R獲得了相似的開放存在時(shí)間值，其顯示出在未改變的單位電導(dǎo)下加倍的活性2，14。因此，還是在CatCh的情況中，開放狀態(tài)的減速的動(dòng)力學(xué)可能造成了HEK293細(xì)胞中測得的2.5倍增加的穩(wěn)態(tài)電流，由此單位電導(dǎo)保持未變。按照之前所描述的14，這一點(diǎn)使用穩(wěn)態(tài)噪音分析通過測量CatCh的單通道電導(dǎo)進(jìn)行了證實(shí)。噪音分析。按照之前所描述的14，在HEK293細(xì)胞上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并且在室溫(23℃)下進(jìn)行。電極液含有1mM胍-HCl、199mMNMG-Cl(N-甲基葡糖胺)、10mMEGTA、2mMMgCl2和20mMHepes(pH7.4)，電解液(bathsolution)含有200mM胍-HCl、2mMMgCl2、2mMCaCl2和20mMHepes(pH7.4)。在飽和光條件下并且再在其中-60mV的電流應(yīng)答為最大電流的一半(I0.5；2kHz低通Bessel濾波器；取樣速率：100kHz；細(xì)胞直徑：15μm)的光條件下，在使用電壓步進(jìn)方案的情況下記錄響應(yīng)于藍(lán)光刺激的電流。將-60mV保持電位下延長照明(2min)過程中穩(wěn)態(tài)I0.5的記錄用于估算單通道的電導(dǎo)(2kHz低通Bessel濾波器；取樣速率：20kHz)。收集未用照明(對照，3次記錄)和使用照明(2次記錄，在光刺激開始后30秒)的交替記錄，進(jìn)行傅立葉變換，并用Lorentzian函數(shù)從近似值估算單通道電導(dǎo)(對于詳細(xì)內(nèi)容，參見14)。選擇較低的光強(qiáng)度，以獲得光門控通道的開放和關(guān)閉的最大波動(dòng)。與WTChR2和H134R噪音分析實(shí)驗(yàn)一致，將胍用作傳導(dǎo)離子。注意到通道的動(dòng)力學(xué)特性與滲透陽離子無關(guān)14。對于200mM胍，在室溫下(23℃)，不同功率譜的評價(jià)產(chǎn)生了140±5fS的單通道電導(dǎo)γ(n＝6，-60mV)，這與外推的150fB的室溫WTChR2單通道電導(dǎo)相似14。與H134R相比，從噪音分析測定的CatCh的開放概率未變(P?！?.6)。因此，增加的開放通道時(shí)間可以容易地說明所觀察到的光電流的2.5倍增加，然而，可能不能排除略微增強(qiáng)的CatCh副本的表達(dá)。非洲爪蟾卵母細(xì)胞制備和分子生物學(xué)。將沒有細(xì)胞外暴露的半胱氨酸殘基的C-末端截短的ChR2變體(殘基1-315)(含有突變C34A和C36A)亞克隆至載體pTLN中27。通過QuickChange定點(diǎn)誘變(Stratagene)引入單一半胱氨酸突變，并且通過測序進(jìn)行驗(yàn)證。使用SP6mMessagemMachine試劑盒(Ambion，Austin，TX)制備mRNA。將50nlcRNA(其包括30ng的WTChR2/CatChmRNA)注入各個(gè)非洲爪蟾卵母細(xì)胞中。在部分卵巢切除術(shù)后通過膠原酶處理獲得卵母細(xì)胞。cRNA注射后，在全反式視黃醛(1μM，來自1mM的乙醇原液)中孵育卵母細(xì)胞并且在18℃下在含有1mg/ml慶大霉素的ORI緩沖液(90mMNaCl、2mMKCl、2mMCaCl2和5mMMops，pH7.4)中保持兩至四天。非洲爪蟾卵母細(xì)胞上的雙電極-電壓鉗。用75-W氙弧燈和450±25nm帶通濾波器激活光電流，將帶通濾波器的光耦合至具有～1018光子s-1cm-2輸出的1-mm光導(dǎo)中。對于各個(gè)波長，使用窄帶寬濾波器(398-645nm；±10nm；K-系列Balzer)記錄作用光譜，并結(jié)合中性密度濾光器來獲得～1.4×1017光子s-1cm-2的輸出。為了產(chǎn)生作用光譜，將ORI溶液中的Ca++替換為Ba++以抑制CaCC電流。將各個(gè)波長下的電流幅度標(biāo)準(zhǔn)化以表示相等的光子暴露量。然后將通過光譜學(xué)測定的基礎(chǔ)光譜與平均化的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行擬合。為了抑制鈣激活的氯離子通道(CaCC)的激活，將50nl的快速Ca2+-螯合劑1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)的20mM溶液注入各卵母細(xì)胞中(在卵母細(xì)胞中～1mM的終濃度)。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，用不同波長激發(fā)CatCh揭示了幾乎相同的作用光譜，幾乎與WTChR2光譜相同在474nm處具有最大激發(fā)波長(圖6)。在細(xì)胞外Ca++存在下并且在負(fù)的保持電位下，由于與鈣激活的氯離子通道(CaCC)相似的疊加外向電流，CatCh電流在照明過程中顯示出劇烈的幅度增大15，16(圖2c)。在表達(dá)WTChR2的卵母細(xì)胞中，也觀察到了CaCC電流，但它們顯著小于CatCh誘導(dǎo)的那些電流(圖2c)。對于WTChR2和CatCh兩者，在80mM細(xì)胞外Ca++下，將快速Ca++螯合劑BAPTA(1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸)注入細(xì)胞中消除了CaCC電流，而保留了殘余的Ca++電流(圖2c)1。在注射BAPTA之前和之后CatCh的較大光電流差異支持了CatCh激活后Ca++內(nèi)流增加的假設(shè)。CatCh的提高的鈣滲透性。為了獲得CatCh離子滲透性的估算值，在HEK293細(xì)胞中測定了光電流-電壓關(guān)系和不同陽離子的逆轉(zhuǎn)電位。這些實(shí)驗(yàn)揭示了鈉、鉀和鎂的滲透性對于WTChR2是相當(dāng)?shù)?圖2d)1。與WTChR2(pH/pNa＝2.5*106)相比，CatCh的質(zhì)子滲透性(pH/pNa＝4*106)略有提高。在將細(xì)胞外溶液的140mMNa+替換為90mMCa++時(shí)，通過逆轉(zhuǎn)電位偏移測定了Ca++-滲透性(pca/pNa)。CatCh的相對Ca++-滲透性從WTChR2的0.15提高至0.24，如從-30.7±2.7mV(WTChR2，平均值±s.d.，n＝5)至-21.6±3.8mV(CatCh，平均值±s.d.，n＝5；圖2e)的逆轉(zhuǎn)電位偏移所證明的。為了進(jìn)一步量化CatCh的提高的Ca++滲透性，我們在表達(dá)CatCh的HEK293細(xì)胞上進(jìn)行了Fura-2鈣成像，并且將測得的340/380比例與表達(dá)WTChR2的細(xì)胞中測得的比例進(jìn)行了比較。HEK293細(xì)胞上的Fura-2成像。將Fura-2AM(5mM；Invitrogen)在室溫下加載30min至1小時(shí)。加載后，將細(xì)胞在不含Ca++的140mMNaCl溶液(140mMNaCl，7mMEGTA，2mMMgCl2和10mMHEPES)中回收。使用460/40nm濾波器(VisitronSystems，Puchheim，德國)，通過500ms曝光來激發(fā)黃色熒光蛋白，以從其YFP-熒光估算各個(gè)細(xì)胞的表達(dá)水平。然后將溶液替換為細(xì)胞外Ca++溶液，其由90mMCaCl2、7mMEGTA、2mMMgCl2和10mMHEPES組成。在黑暗中15min后，用藍(lán)光(460/40nm)將光門控的通道刺激10s。用340nm(340/20)和380nm(380/20)激發(fā)Fura-2，并且用CCD相機(jī)檢測發(fā)射的光(540/80nm)(所有濾波器來自VisitronSystems，Puchheim，德國)。為了排除不同的蛋白質(zhì)表達(dá)水平對鈣攝取的影響，將測得的340/380比例對于各單個(gè)細(xì)胞的YFP-熒光值標(biāo)準(zhǔn)化。圖2f顯示了在飽和的90mMCa++溶液中10-s藍(lán)光(470nm)光刺激時(shí)，表達(dá)CatCh的細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca++增加比表達(dá)WT細(xì)胞中的高約4倍。應(yīng)用于海馬神經(jīng)元為了測試CatCh對神經(jīng)元應(yīng)用的適用性，在培養(yǎng)的海馬錐體細(xì)胞中表達(dá)構(gòu)建體。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。從新生的P1Sprague-Dawley大鼠(Jackson實(shí)驗(yàn)室)分離海馬，并且在37℃下用木瓜蛋白酶(20Uml-1)處理20min。用補(bǔ)充了10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen/Gibco，高葡萄糖)洗滌海馬并且在少量的該溶液中研磨。將～75,000個(gè)細(xì)胞涂布于24孔平板中聚-D-賴氨酸/層粘連蛋白涂覆的玻璃蓋玻片上。3小時(shí)后，用培養(yǎng)培養(yǎng)基(含有2％B-27補(bǔ)充劑，2mMGlutamax-I和100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的NeurobasalA)替換涂板培養(yǎng)基。涂板后5-10天，突變體ChR2(L132C)-YFP和ChR2(WT)-YFP使用lipofectamine2000試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染?；蛘?，涂板后4-9天，將2-5×109GC/ml病毒(AAV2/7-CAG-ChR2(L132C)-2A-EGFP-WPRE-bGH)加入各個(gè)孔中。轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天表達(dá)變得可見。在培養(yǎng)物生存期間(～5周)，沒有觀察到神經(jīng)毒性。對于在此所描述的任一個(gè)實(shí)驗(yàn)，沒有將全-反式視黃醛添加到培養(yǎng)培養(yǎng)基或記錄培養(yǎng)基中。腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建。將細(xì)胞巨化病毒早期增強(qiáng)子/雞β-肌動(dòng)蛋白(CAG)啟動(dòng)子進(jìn)行PCR擴(kuò)增并且插入pAA2-Rho-EGFP(由自AlbertoAuricchio惠贈(zèng)28)中，以獲得pAAV2-CAG-EGFP。pAAV2-CAG-EGFP病毒表達(dá)質(zhì)粒另外含有旱獺轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)和牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化序列。通過接頭PCR構(gòu)建了ChR2(L132C)-2A-EGFP(來自Volker的饋贈(zèng)-2A自切割肽/CHYSEL29)并且使用Clontech’s融合試劑盒通過EGFP的換位亞克隆至pAAV2-CAG-EGFP中。將病毒載體(pAAV2-CAG-ChR2(L132C)-2A-EGFP-WPRE-bGH)封裝(血清型7)并且在賓夕法尼亞大學(xué)的基因治療項(xiàng)目下進(jìn)行親和性純化，具有2.26x1011基因組拷貝/ml的最終感染性病毒滴度。來自海馬神經(jīng)元的電生理學(xué)記錄。對于培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中的完整細(xì)胞記錄，將具有5-10MΩ電阻的膜片電極填充129mM葡萄糖酸鉀、10mMHEPES、10mMKCl、4mMMgATP和0.3mMNa3GTP，滴定至pH7.2。將Tyrode’s溶液用作細(xì)胞外溶液(125mMNaCl、2mMKCl、2mMCaCl2、1mMMgCl2、30mM葡萄糖和25mMHEPES，滴定至pH7.4)。名義上無Ca++細(xì)胞外溶液含有這一相同的溶液，除了其具有0mMCa++和3mMMg++。在興奮性突觸傳導(dǎo)阻滯劑1，2，3，4-四氫-6-硝基-2，3-二氧代-苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺(NBQX，10μM，Sigma)和D(-)-2-氨基-5-膦?；焖?AP-5，50μM，Sigma)的存在下進(jìn)行記錄。對于電壓鉗記錄，將1μM河豚毒素加入細(xì)胞外溶液中。為了抑制BK-通道活性，加入1mMTEA。在裝備有熒光燈的倒置ZeissAxiovert25顯微鏡上進(jìn)行記錄。通過EGFP-或YFP-介導(dǎo)的熒光證明了成功的蛋白質(zhì)表達(dá)。神經(jīng)元接入電阻為15-40MΩ并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測穩(wěn)定性。使用Axopatch200A放大器(AxonInstruments，UnionCity，CA)放大電生理信號，以10kHz過濾，用AxonDigidata1600(50Hz)數(shù)字化，并且使用pClamp9軟件(AxonInstruments)獲取和分析。使用來自二極管-泵浦固態(tài)激光器(PuschOptoTechGmbH；λ1＝473nm，P1＝100mW，λ2＝532nm，P2＝50mW)的各種長度的光脈沖或來自受激準(zhǔn)分子泵浦染料激光器(Coumarin2，λ＝450nm)的10ns閃光來引起光電流。在附圖圖例和文字中標(biāo)示了特定的光強(qiáng)度，并且其是在離細(xì)胞～500μm距離處的400μm直徑石英光纖(STE-F100/400-Y-VIS/NIR；Laser2000，Wessling，德國)的末端處的強(qiáng)度。從表達(dá)ChR2(L132C)-YFP和ChR2(L132C)-2A-EGFP的神經(jīng)元測得的電流是相同的。共焦成像。為了成像，將具有海馬神經(jīng)元的蓋玻片在含有2％蔗糖的PBS緩沖液中的4％仲甲醛中4℃下固定10min。隨后將細(xì)胞在兔α-GFPIgG(Invitrogen，A11122)中孵育1.5小時(shí)，接著在AlexaFluor488驢-α-兔IgG(Invitrogen，A21206)中孵育45min。在ZeissLSM510共焦顯微鏡(Zeiss，Plan-Neofluar40×/0.75)上對安置好的蓋玻片的免疫熒光進(jìn)行拍照。CatCh突變體在海馬培養(yǎng)物(圖3a)中強(qiáng)烈地表達(dá)數(shù)周而沒有神經(jīng)毒性的信號，并且與在HEK293細(xì)胞中一樣，在完整細(xì)胞記錄中呈現(xiàn)出較高的穩(wěn)態(tài)-峰比例，并且響應(yīng)于473-nm藍(lán)光，與具有164±39pA(-60mV，n＝6，平均值±s.d.)的WT相比，644±31pA(-60mV，n＝6，平均值±s.d.)的電流幅度提高了約四倍(圖3b)。在電流鉗模式中，通常用于激活WT的人工高光強(qiáng)度(1018-1019光子s-1cm-2)驅(qū)使表達(dá)CatCh的錐體細(xì)胞進(jìn)入去極化段(圖4a)。為了誘導(dǎo)可靠的峰電位串，將光強(qiáng)降低2個(gè)對數(shù)單位(5*1016-2*1017光子s-1cm-2)以達(dá)到視錐光感受器驅(qū)動(dòng)的亮視覺的天然范圍內(nèi)的光強(qiáng)度(圖4b)17。圖4c顯示出錐體細(xì)胞的光強(qiáng)度依賴性激活速率的代表性調(diào)諧曲線。平均化的最大激活速率位于8.2×1016±2.5×1016光子s-1cm-2(平均值±s.d.，n＝5)。表達(dá)CatCh的神經(jīng)元的較高光效能有助于使用遠(yuǎn)離峰值靈敏度的波長來激活，如在圖4d中用綠光(532nm)舉例說明的。就使用穿透較深的綠光的更高效組織募集而言，這可以提供益處。我們將表達(dá)CatCh的神經(jīng)元顯著增強(qiáng)的光敏感性歸因于增強(qiáng)的Ca++滲透性，由此短暫地提高了胞質(zhì)膜表面的表面電位10，11，18，19(對于Ca++對表面電位的作用的解釋參見圖7)。在光激發(fā)過程中，CatCh作為膜結(jié)合的快速Ca++-源，其通過暫時(shí)地提高局部的細(xì)胞內(nèi)表面Ca++濃度，由此中和負(fù)的表面電荷(圖7)。已知這引起了內(nèi)部表面電位向更正的值偏移，因而將膜去極化(圖7)17，18。結(jié)果是在更負(fù)的膜電位下激活電壓門控的Na+-通道18。在短的光脈沖后或在關(guān)閉固定光后，Ca++在胞質(zhì)內(nèi)快速(微秒)達(dá)到平衡，導(dǎo)致快速恢復(fù)和動(dòng)作電位的立即消失。因此，對于CatCh，與WTChR2相比，需要較低的光電流并且因之需要較少的光用于峰電位啟動(dòng)。在相似的光強(qiáng)度(2.8×1018光子s-1cm-2)下，CatCh的光脈沖-峰電位潛伏期(～5-6ms；圖4e)(具有較小的抖動(dòng))比WTChR2的潛伏期(～10ms)短3。發(fā)明人進(jìn)一步測試了CatCh在高頻率光刺激下誘導(dǎo)單動(dòng)作電位的能力。一串1-ms長的藍(lán)色473-nm光脈沖(2.8×1019光子s-1cm-2)驅(qū)動(dòng)了高達(dá)50Hz頻率的100％可靠的峰電位串(n＝8；圖4f-大部分錐體細(xì)胞在超過50Hz時(shí)甚至使用直接電流注入也沒有良好地效應(yīng))。另一方面，WT需要至少2-ms光脈沖來可靠地誘導(dǎo)峰電位并且這僅在高達(dá)20Hz的頻率下完成12。我們通過10ns藍(lán)光脈沖(1.1×1025光子s-1cm-2)(脈沖長度足夠短以致在各CatCh蛋白中只能誘導(dǎo)單次翻轉(zhuǎn))進(jìn)一步使得CatCh的短激活時(shí)間變得更短并引發(fā)了高達(dá)10Hz頻率的單動(dòng)作電位(圖4g)。然而，快速刺激頻率還需要細(xì)胞在各峰電位之后的快速復(fù)極化。盡管CatCh與WT相比具有減低的τoff，但在CatCh激活過程中～4倍的Ca++-內(nèi)流的增加(參見Fura-2測量，圖2f)表現(xiàn)為足以激活足夠的Ca++激活大電導(dǎo)鉀通道(BK通道)20，從而有效地在各個(gè)動(dòng)作電位后在微秒范圍內(nèi)將細(xì)胞復(fù)極化至其初始靜息電位。為了證明通過BK通道介導(dǎo)了快速復(fù)極化，我們將100μM鉀通道抑制劑四乙銨(TEA)加入細(xì)胞外溶液中并且觀察到通常在WTChR2的脈沖刺激方案中看到的不完全膜復(fù)極化以及平臺電位的產(chǎn)生3(圖4h)?？傊?，與表達(dá)WT的細(xì)胞相比，表達(dá)CatCh的神經(jīng)元呈現(xiàn)出較快的峰電位開始、較快的復(fù)極化和提高的光敏感性(對于比較，參見表1)。在不存在外部Ca++但存在3mMMg++(其對表面電位具有不太明顯的作用11，18(圖7)并且不是通過WTChR2或CatCh傳導(dǎo)的)的情況下的對照實(shí)驗(yàn)支持了上述解釋：1)光脈沖-峰電位潛伏期增加至WTChR2值(圖4e)，2)與在Ca++存在下觀察到的快速峰復(fù)極化不同，觀察到與WTChR2實(shí)驗(yàn)中看到的相似的延長人工去極化(圖4i，左圖)，3)在Ca++不存在的情況下，在其他方面相同的實(shí)驗(yàn)條件下相同的光強(qiáng)度由～10mV導(dǎo)致了降低的去極化和4)在Ca++不存在的情況下，如從延長的CatCh開放時(shí)間預(yù)期的，重新產(chǎn)生了多尖峰形成(圖4i，右圖)。因此，本發(fā)明人已經(jīng)證明了CatCh(具有升高的Ca++滲透性的通道視紫紅質(zhì))同時(shí)具有提高的光敏感性和快速動(dòng)力學(xué)，并且因此勝過WTChR2以及公開的慢速和快速突變體(對于不同ChR2變體的性能的比較，參見表1)。討論在最初看到CatCh(WTChR2的L132C突變體)時(shí)，與WTChR2相比較顯示出相當(dāng)不引人注意的結(jié)果：1)開放狀態(tài)的期間增加兩倍，2)P520中間體在光循環(huán)動(dòng)力學(xué)中的衰減減速，3)單通道電導(dǎo)未改變，和4)輕微紅移的吸收最大值(4nm)。通過測得的參數(shù)可以容易地解釋2.5倍的光電流增加而沒有表達(dá)水平的相關(guān)增加。然而，再次考慮時(shí)，從表達(dá)CatCh的非洲爪蟾卵母細(xì)胞獲得的電壓鉗數(shù)據(jù)的更進(jìn)一步檢查給出了針對升高的Ca++滲透性的第一個(gè)暗示，這然后通過測定逆轉(zhuǎn)電位和HEK293細(xì)胞上的鈣成像實(shí)驗(yàn)得到了證實(shí)。著眼于圖1中的模型，通過形成更柔性的結(jié)構(gòu)并且因此形成空腔可能有助于Ca++-滲透性的提高，如對于光驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泵細(xì)菌視紫紅質(zhì)的L94A突變所示的(比較圖1)21。該空腔位于作為保守跨膜螺旋三(TM3)的部分(僅離開C128的螺旋轉(zhuǎn)角)的疏水性補(bǔ)片上。操控C128(TM3)和D156(TM4)之間的相互作用顯著地減緩了ChR2的反應(yīng)循環(huán)5，6，這是在細(xì)菌視紫紅質(zhì)突變體L93A(即，L94的相鄰殘基)中也觀察到的效應(yīng)22，23。在ChR2中，TM3和TM4的相互作用似乎影響了門控和選擇性兩者，指向作為光反應(yīng)至離子孔的變換器的結(jié)構(gòu)元件24。較小的并且更疏水的半胱氨酸的插入可能增加螺旋片段的靈活性，從而有助于Ca++的進(jìn)入。當(dāng)呈現(xiàn)到海馬錐體細(xì)胞時(shí)，與WTChR2相比，CatCh呈現(xiàn)出～70倍的光敏感性提高。通常，通過強(qiáng)烈延長的開放通道時(shí)間來實(shí)現(xiàn)這種增加的光效能2，6，13。而對于CatCh不是這種情況。所觀察到的光敏感性明顯不同于迄今為止對于其他通道視紫紅質(zhì)所觀察到的。如以下所解釋的，通過CatCh的Ca++內(nèi)流誘導(dǎo)了對神經(jīng)元興奮性的次生效應(yīng)。盡管與WT相比具有較慢的關(guān)斷動(dòng)力學(xué)，但CatCh在高頻率光刺激過程中顯示出提高的峰電位可靠性和精確性，從而減少了額外的峰電位并消除了在高于20Hz刺激頻率下表達(dá)WT的細(xì)胞中通常觀察到的人工平臺電位3，7，12。在室溫下傳送的1-ms光脈沖在表達(dá)CatCh的錐體細(xì)胞中誘導(dǎo)了高達(dá)50Hz的可靠的峰電位串(它們的天然尖峰形成的自然極限；圖4f)。在更快形成尖峰的細(xì)胞上(如皮層小白蛋白(paravalbumin)中間神經(jīng)元)的較高頻率的CatCh介導(dǎo)峰電位誘導(dǎo)仍有待測試12。由于通道視紫紅質(zhì)動(dòng)力學(xué)是溫度依賴性的，具有～2.3的Q1014，發(fā)明人預(yù)期在37℃的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有3.2倍加速的CatCh動(dòng)力學(xué)而不損失光敏感性。這使得CatCh介導(dǎo)的峰電位刺激可以高達(dá)至少300Hz。提高的光敏感性結(jié)合快速動(dòng)力學(xué)和高時(shí)間精確性使得我們能夠用短至10ns的光脈沖激活CatCh，其在各CatCh分子中激活單次翻轉(zhuǎn)，接著是單一峰電位。通過在照明過程中增加的神經(jīng)元中的Ca++內(nèi)流最好地解釋了可激發(fā)細(xì)胞中的觀察結(jié)果。注意到由提高的滲透性引起的Ca++對驅(qū)動(dòng)力的作用可以忽略。然而，我們可以將CatCh認(rèn)為是光門控的膜結(jié)合Ca++源(“膜結(jié)合的螯合Ca++”)，其瞬時(shí)地將Ca++遞送至細(xì)胞膜的胞質(zhì)表面，只要CatCh通道開放。這暫時(shí)地中和了內(nèi)膜表面上的負(fù)電荷，由此提高了表面電位，這等同于膜的去極化11(圖7)。如所預(yù)期的，當(dāng)細(xì)胞外Ca++被非滲透的Mg++替換時(shí)，所有觀察到的Ca++對動(dòng)作電位的效應(yīng)消失，恢復(fù)了WTChR2的表型。這證明了所觀察到的Ca++效應(yīng)是由于細(xì)胞外Ca++的內(nèi)流引起的，而不是由通過CatCh在細(xì)胞器(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中的潛在表達(dá)導(dǎo)致的[Ca++]i升高引起的。這種經(jīng)由表面電位發(fā)生的快速初始去極化將WTChR2表達(dá)細(xì)胞中的～10ms的光脈沖-峰電位潛伏期3減半至CatCh表達(dá)細(xì)胞中的～5ms。與WTChR2相比，CatCh的峰值-穩(wěn)定電流比降低很多(參見表1)。因此，在CatCh的持續(xù)照明過程中，細(xì)胞的去極化水平幾乎保持穩(wěn)定。在持久照明過程中連續(xù)的Ca++內(nèi)流可以激活鈣激活非選擇性陽離子通道，這進(jìn)一步支持了穩(wěn)定去極化水平的維持。另一方面，成功的高頻脈沖刺激的先決條件是各次動(dòng)作電位后細(xì)胞的快速復(fù)極化。與WT相比略有增加的CatCh開放狀態(tài)的時(shí)間會(huì)限制其最大刺激頻率。然而，增強(qiáng)的Ca++滲透性通過有效地激活大電導(dǎo)鈣門控鉀通道(BK通道)克服了這種限制。這在各次動(dòng)作電位后的微秒范圍內(nèi)重新建立了神經(jīng)元的靜息膜電位。通過用開放通道阻滯劑TEA抑制BK通道證實(shí)了這一理論，TEA導(dǎo)致在脈沖刺激方案的長度內(nèi)神經(jīng)元的持久去極化。與已經(jīng)可得的光遺傳學(xué)工具相比，CatCh具有提高的光敏感性，這與慢突變體13或SFO6相似，但由于其提高的Ca++-滲透性以及對神經(jīng)元興奮性的效果而具有快得多的響應(yīng)動(dòng)力學(xué)。這使得CatCh優(yōu)于可用的ChR2變體，其必須以快速動(dòng)力學(xué)為代價(jià)來建立高光敏感性，而反過來對于快速通道視紫紅質(zhì)也是一樣7，12(對于綜述，參見表1)。關(guān)于光遺傳學(xué)應(yīng)用，我們注意到在各個(gè)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備中對于確認(rèn)最佳光脈沖參數(shù)是重要的，如刺激長度和強(qiáng)度，因?yàn)樘囟ǖ捻憫?yīng)最終將受到神經(jīng)元固有的生物物理特性和CatCh表達(dá)水平的控制。參考文獻(xiàn)列表WO03/0849941.Nagel，G.等Channelrhodopsin-2，adirectlylight-gatedcation-selectivemembranechannel.ProcNatlAcadSciUSA100，13940-13945(2003).2.Nagel，G.等Lightactivationofchannelrhodopsin-2inexcitablecellsofCaenorhabditiseleganstriggersrapidbehavioralresponses.CurrBiol15，2279-2284(2005).3.Boyden，E.，Zhang，F(xiàn).，Bamberg，E.，Nagel，G.&Deisseroth，K.Millisecond-timescale，geneticallytargetedopticalcontrolofneuralactivity.NatNeurosci8，1263-1268(2005).4.Zhang，F(xiàn).等Multimodalfastopticalinterrogationofneuralcircuitry.Nature446，633-639(2007).5.Bamann，C.，Gueta，R.，Kleinlogel，S.，Nagel，G.&Bamberg，E.Structuralguidanceofthephotocycleofchannelrhodopsin-2byaninterhelicalhydrogenbond.Biochemistry49，267-278(2010).6.Bemdt，A.，Yizhar，O.，Gunaydin，L.，Hegemann，P.&Deisseroth，K.Bi-stableneuralstateswitches.NatNeurosci12，229-234(2009).7.Lin，J.，Lin，M.，Steinbach，P.&Tsien，R.Characterizationofengineeredchannelrhodopsinvariantswithimprovedpropertiesandkinetics.BiophysJ96，1803-1814(2009).8.Lagali，P.等Light-activatedchannelstargetedtoONbipolarcellsrestoreVisualfunctioninretinaldegenerationNatNeurosci11，667-675(2008).9.Bi，A.等Ectopicexpressionofamicrobial-typerhodopsinrestoresvisualresponsesinmicewithphotoreceptordegeneration.Neuron50，23-33(2006).10.B.&Hodgkin，A.Theactionofcalciumontheelectricalpropertiesofsquidaxons.JPhysiol(Lond)137，218-244(1957).11.Hille，B.649-662(SinauerAssociates，SunderlandMassachusettsUSA，2001).12.Gunaydin，L.等Ultrafastoptogeneticcontrol.NatNeurosci13，387-392(2010).13.Bamann，C.，Kirsch，T.，Nagel，G.&Bamberg，E.Spectralcharacteristicsofthephotocycleofchannelrhodopsin-2anditsimplicationforchannelfunction.JMolBiol375，686-694(2008).14.Feldbauer，K.等Channelrhodopsin-2isaleakyprotonpump.ProcNatlAcadSciUSA(2009).15.Caldwell，J.等Increasesinintracellularcalciumtriggeredbychannelrhodopsin-2potentiatetheresponseofmetabotropicglutamatereceptormGluR7.JBiolChemistry283，2430024307(2008).16.Weber，W.-M.IoncurrentsinXenopuslaevisoocytes：stateoftheart.BiochimBiophysActa1421，213-233(1999).17.Thyagarajan，S.等Visualfunctioninmicewithphotoreceptordegenerationandtransgenicexpressionofchannelrhodopsin2inganglioncells.JNeurosci30，8745-8758(2010).18.Hille，B.，Woodhull，B.&Shapiro，B.Negativesurfacechargenearsodiumchannelsofnerve：divalentions，monovalentions，andpH.PhilosTransRSocLondBBiolSci270，301-318(1975).19.Muller，R.&Finkelstein，A.Theeffectofsurfacechargeonthevoltage-dependentconductanceinducedinthinlipidmembranesbymonazomycin.JGeneralPhysiol60，285-306(1972).20.Faber，E.&Sah，P.Calcium-activateedpotassium-channels：multiplecontributionstoneuronalfunction.Neuroscientist9，181-194(2003).21.Joh，N.，Oberai，A.，Yang，D.，Whitelegge，J.&Bowie，J.Similarenergeticcontributionsofpackinginthecoreofmembraneandwater-solubleproteins.JAmChemSoc131，10846-10847(2009).22.Subramaniam，S.，F(xiàn)aruqi，A.，Oesterhelt，D.&Henderson，R.Electrondiffractionstudiesoflight-inducedconformationalchangesintheLeu-93→Alabacteriorhodopsinmutant.ProcNatAcadSciUSA941767-1772(1997).23.Subramaniam，S.，Greenhalgh，D.，Rath，P.，Rothschild，K.&Khorana，H.Replacementofleucine-93byalanineorthreonineslowsdownthedecayoftheNandOintermediatesinthephotocycleofbacteriorhodopsin：implicationsforprotonuptakeand13-cis-retinalall-trans-r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