立足點引物雙鏈體的組合物及其使用方法相關申請本申請依據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2010年10月27日提交的美國臨時申請序列號61/407,291的優(yōu)先權，該案的完整內(nèi)容通過引用結合在此。發(fā)明領域在此描述的實施例涉及部分雙鏈的核酸引物以及它們在例如核酸合成方法中的用途。發(fā)明背景核酸是生物學中的重要信息載體，并且核酸的檢測、擴增和鑒別已經(jīng)形成了一個龐大的生物技術產(chǎn)業(yè)的基礎。具體地說，全世界已經(jīng)使用如聚合酶鏈反應（PCR）（佐伯（Saiki）等人.科學（Science）239,487-491（1988））等方法作為擴增DNA的一種可靠手段，同時反轉錄酶法已經(jīng)被用于探測轉錄組。DNA聚合酶、RNA聚合酶和反轉錄酶的操作典型地使用一個稱為引物的短寡核苷酸片段來引導一個長標靶的部分被復制或轉錄。盡管核酸雜交的特異性常常足以引導針對大多數(shù)標靶序列的酶促活性，但是具有重復序列、二級結構以及高G/C含量的標靶很難以高產(chǎn)率進行擴增。另外，其他核酸的高背景常常會導致不正確的擴增，如在單拷貝人類基因組擴增的情況下。最后，由于必須同時發(fā)生的大量正交擴增反應，多重化擴增（如由一個DNA芯片池）可能很難實現(xiàn)。轉錄和反轉錄存在類似的問題。技術實現(xiàn)要素：核酸的雜交在單個核苷酸水平上是具特異性的。舉例來說，胞嘧啶優(yōu)先地結合于鳥嘌呤，并且腺嘌呤優(yōu)先地結合于胸腺嘧啶或尿嘧啶。然而，對于由許多核苷酸構成的核酸分子來說，雜交的特異性降低，并且具有接近互補的序列的核酸將幾乎與完美互補的序列一樣強地結合。鑒于感興趣的標靶核酸（“標靶”）和具有與該標靶有例如一個核苷酸不同的序列的核酸（“假標靶”）的異質混合物，與該標靶互補的相當大部分的引物將改與假標靶雜交。由于正確的標靶以略微更高的親和力結合于一種具有互補序列的引物，故在足夠的時間下，正確的標靶最終將在結合于一種互補引物方面替代假標靶。不過，這一過程非常緩慢，并且在許多實驗系統(tǒng)典型的納摩爾濃度下將要用去數(shù)個月。為了減小互補引物結合于假標靶的傾向，通常有必要在接近引物/標靶復合物的熔融溫度下運行基于核酸引物的實驗系統(tǒng)。由于這一熔融溫度一般比大多數(shù)生物系統(tǒng)自然地運作時所處的溫度要高得多，故此高溫要求阻礙了該實驗系統(tǒng)在正常生物條件下操作。另外，由于該熔融溫度將隨不同的標靶而變化，故這類實驗系統(tǒng)必需的窄溫度范圍限制了同時使用多種引物來檢測多種標靶。在此提供了引物（例如，引物雙鏈體和發(fā)夾引物雙鏈體），這些引物在多個實施例中能夠在一個較寬的溫度范圍內(nèi)以高特異性迅速地結合于核酸標靶。這些引物可以用于例如核酸合成反應（例如PCR）、微陣列分析、成像法以及單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析中。這些引物還可以用于核酸檢測檢驗中，其中它們主要用作“探針”。因此，不管應用如何，本發(fā)明的引物在此可以與“探針”互換地提到。不管應用（或使用方法）如何，本發(fā)明的引物克服了在假標靶的存在下需要特異性雜交時，并且更具體地說在這些假標靶過量存在時通常遇到的問題。在此提供的引物具有若干獨特的特性，這些特性有助于它們與對核酸起作用的酶組合使用。第一，這些引物以熱力學方式設計成以高特異性僅僅結合于它們所希望的標靶，并且它們針對甚至單個核苷酸變化也顯示出高辨別力。第二，這些引物的特異性使得傳統(tǒng)上困難的標靶（如具有顯著序列重復、二級結構和/或高G/C含量的那些）能夠進行PCR、轉錄和反轉錄。用這些引物可以達到的高特異性程度進一步使得甚至在高核酸背景（如單拷貝人類基因組擴增）下也能夠進行精確的加工。第三，這些引物的部分雙鏈的性質意味著它們不太可能彼此相互作用，并且因此它們能夠進行高度多重化的復制、轉錄和/或反轉錄反應。最后，這些引物與標靶的雜交對于溫度和鹽度相對穩(wěn)固，并且因此，這些引物可以具有比標準引物顯著更長的長度，而這種長度又提供進一步增強的特異性和引物設計靈活性。在一些實施例中，在此論述的核酸引物經(jīng)過合理地設計，以使得特定的標靶核酸分子與該引物之間的雜交的標準自由能（例如，理論的標準自由能）接近于零，而一種假標靶（即使是與特定的（實際的）標靶具有少至單個核苷酸不同的假標靶）與該引物之間的雜交的標準自由能足夠高到以使得其結合相比之下不利。諸位發(fā)明人通過設計出一種引物來實現(xiàn)這一目的，該引物具有(a)一個“立足點（toehold）”單鏈的標靶特異性區(qū)、(b)一個“分支移位”雙鏈的標靶特異性區(qū)以及(c)一個“平衡”雙鏈的標靶非特異性區(qū)。在一些實施例中，該引物可以包含一個單鏈，該單鏈自身雜交形成雙鏈區(qū)。在一些實施例中，該引物可以包含兩條鏈。作為后一實施例的一個實例，這些引物包含一個第一或補體鏈及一個第二或保護子鏈。該補體鏈正如其名稱所暗示的，與感興趣的標靶部分互補并且將與該標靶雜交。另一方面，該保護子鏈被設計成不與該標靶雜交，而是與該標靶（或假標靶）競爭著結合該補體。該“立足點”區(qū)存在于該補體鏈中，與標靶序列互補并且不與保護子區(qū)互補。該補體鏈中的“平衡區(qū)”（即，補體平衡區(qū)）與該保護子的一部分（即，與保護子平衡區(qū)）互補并且不與標靶序列互補。立足點跟標靶的雜交能與補體平衡區(qū)跟保護子平衡區(qū)的雜交能相配或幾乎相配（針對不同的其他熱力學考慮因素進行調(diào)整）。該平衡區(qū)的序列被合理地設計成在所希望的溫度和引物濃度條件下達到這一相配。因此，實際標靶與引物的平衡迅速地接近50%的標靶:引物::保護子:引物（或任何所希望的比率），而假標靶與引物的平衡非常有利于保護子:引物。在特定標靶存在下，豐富的游離引物有助于其高敏感性和特異性的檢測。在一些實施例中，在此論述的核酸引物經(jīng)過設計，以使得特定標靶核酸分子與該引物之間的雜交的經(jīng)濃度調(diào)整的自由能接近于零，而一種假標靶與該引物之間的雜交的經(jīng)濃度調(diào)整的標準自由能足夠高以使得其結合相比之下不利。如在此所使用，“經(jīng)濃度調(diào)整的自由能”是指ΔG°+(Δn)RTln(c)，其中R是普適氣體常數(shù)，T是以開爾文為單位的溫度，c是該引物的濃度，并且Δn是在該反應過程中分子數(shù)量的變化（對于標準雜交來說，Δn=-1；對于兩條鏈的引物雜交來說，Δn=0）。因此，本發(fā)明的多個方面提供了包含這些引物的引物組合物、包含該補體和保護子鏈的組合物（例如在試劑盒中）、制備這些引物的方法，以及在包括（不限于）核酸合成和/或檢測檢驗或反應在內(nèi)的檢驗或反應中使用這些引物的方法。因此，在一個方面，本發(fā)明提供一種部分雙鏈的引物，它包含(a)第一核酸鏈（在此也稱為補體鏈）和第二核酸鏈（在此也稱為保護子鏈），其中該第一和該第二鏈當彼此雜交時被安排成(1)一個雙鏈的標靶非特異性（平衡）區(qū)；(2)一個雙鏈的標靶特異性（分支移位）區(qū)；以及(3)由該第一核酸鏈貢獻的一個單鏈的標靶特異性（立足點）區(qū)，其中該雙鏈的標靶非特異性區(qū)具有的標準自由能大致地等于與一種標靶核酸結合的單鏈的標靶特異性區(qū)的標準自由能。該部分雙鏈的引物可以包含一個或多個雙鏈的標靶非特異性區(qū)、一個或多個雙鏈的標靶特異性區(qū)和/或一個或多個單鏈的標靶特異性區(qū)。在一些實施例中，該部分雙鏈的引物可以包含一個或兩個雙鏈的標靶非特異性（平衡）區(qū)、一個或多個雙鏈的標靶特異性（分支移位）區(qū)和/或一個或多個單鏈的標靶特異性（立足點）區(qū)。在一些實施例中，該第二核酸鏈在其3’端處包含一個不可延伸的核苷酸，和/或該第一核酸鏈在其標靶非特異性區(qū)的3’端處或3’端附近包含一個非天然核苷酸。在一些實施例中，該不可延伸的核苷酸是一個非天然核苷酸或一個雙脫氧核苷酸。在一些實施例中，該非天然核苷酸是異-C、異-G或脫氧尿苷。這些實例意圖為非限制性的。在一些實施例中，該雙鏈的標靶非特異性區(qū)為約4-20個核苷酸的長度。該雙鏈的標靶非特異性區(qū)可以長于20個核苷酸，如（例如）4-21個核苷酸的長度。在一些實施例中，它可以為約12-192個核苷酸的長度。在一些實施例中，該單鏈的標靶特異性區(qū)為約4-20個核苷酸的長度。該單鏈的標靶特異性區(qū)可以長于20個核苷酸，如（例如）4-21個核苷酸的長度。在一些實施例中，它可以為約12-192個核苷酸的長度。在一些實施例中，該雙鏈的標靶非特異性區(qū)和該單鏈的標靶特異性區(qū)具有類似或相同的A/T核苷酸比例（以及典型地類似或相同的G/C核苷酸比例）。在一些實施例中，該第一和第二核酸鏈包含DNA或RNA，或其組合。在另一方面，本發(fā)明提供一種單鏈引物，該引物部分地自身雜交形成(1)一個雙鏈的標靶非特異性區(qū)、(2)一個雙鏈的標靶特異性區(qū)、(3)單鏈的標靶特異性區(qū)及(4)一個發(fā)夾環(huán)區(qū)，其中這一個或多個雙鏈的標靶非特異性區(qū)的經(jīng)濃度調(diào)整的標準自由能大致地等于與一種標靶核酸結合的一個或多個單鏈的標靶特異性區(qū)的經(jīng)濃度調(diào)整的標準自由能。在另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，該組合物包含前文提到的任何引物。該組合物可以進一步包含一種載體，如一種緩沖液，任選地包含一種防腐劑、一種或多種鹽等。該組合物還可以包含過量的多個單鏈的保護子鏈，其中每個保護子鏈包含一個保護子平衡區(qū)和一個保護子分支移位區(qū)。這些單鏈的保護子鏈各自可以優(yōu)選地在其3’端處包含一個不可延伸和/或非天然存在的核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含一種核酸標靶、一種聚合酶及任何前述引物。在一些實施例中，該引物是一種部分雙鏈的引物，它包含一個第一和一個第二核酸鏈，這些核酸鏈被安排成(1)一個雙鏈的標靶非特異性區(qū)、(2)一個雙鏈的標靶特異性區(qū)以及(3)由該第一核酸鏈貢獻的一個單鏈的標靶特異性區(qū)。在一些實施例中，該核酸標靶是單鏈的。在一些實施例中，該核酸標靶是DNA或RNA。在一些實施例中，該核酸標靶包含重復序列、二級結構和/或高GC含量。在一些實施例中，該核酸標靶存在于多種不同的核酸中。在一些實施例中，該核酸標靶是作為一個單拷貝或以低拷貝（例如，低于0.001%、低于0.01%、低于0.1%或低于1%）存在于多種不同的核酸中。在一些實施例中，該系統(tǒng)包含多種任何前述引物，如多種不同的部分雙鏈的引物。在一些實施例中，該系統(tǒng)包含至少兩種前述引物，如至少兩種部分雙鏈的引物，這些引物一起可以用于擴增該核酸標靶的一個區(qū)域。在另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，該組合物包含前文提到的任何系統(tǒng)。該組合物可以進一步包含一種載體，如一種緩沖液，任選地包含一種防腐劑、一種或多種鹽、一種或多種酶（如聚合酶）、適于核酸合成的多種核苷酸等。該組合物還可以包含過量的多個單鏈的保護子鏈，其中每個保護子鏈包含一個保護子平衡區(qū)和一個保護子分支移位區(qū)。這些單鏈的保護子鏈各自可以優(yōu)選地在其3’端處包含一個不可延伸和/或非天然存在的核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括使任何前述引物（包括任何前述的部分雙鏈的引物）與一個樣品接觸，并且檢測該引物與該樣品中的一種標靶的雜交。在一些實施例中，該引物（如部分雙鏈的引物）標記有一個可檢測部分。在一些實施例中，該可檢測部分包含一種熒光團或一種放射性同位素。該標靶將典型地為一種核酸。在一些實施例中，該標靶是一種單鏈核酸。在一些實施例中，該標靶是DNA或RNA。在一些實施例中，該標靶是一種包含重復序列、二級結構和/或高GC含量的核酸。在一些實施例中，該標靶存在于多種不同的核酸中。在一些實施例中，該標靶是作為一個單拷貝或以低拷貝（例如，低于0.001%、低于0.01%、低于0.1%或低于1%）存在于多種不同的核酸中。在一些實施例中，在此描述的這一和其他方法是在低于補體鏈-標靶復合物的熔融溫度的溫度下進行。在一些實施例中，在此描述的這一和其他方法是在介于（并且包括）室溫直到（并且包括）50°C，或直到（并且包括）40°C，或直到（并且包括）30°C之間的溫度下進行。在一些實施例中，在此描述的這一和其他方法是在約37°C下進行的。在一些實施例中，在此描述的這一和其他方法是以過量的保護子鏈進行，該保護子鏈包含一個保護子平衡區(qū)和一個保護子分支移位區(qū)，并且與該部分雙鏈的引物中的保護子鏈相同。在此描述的這一和其他方法中，該引物可以是任何前述引物，包括部分雙鏈的引物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括使任何前述的部分雙鏈的引物的一個第一（補體）鏈的一個單鏈的標靶特異性（立足點）區(qū)與一種核酸標靶雜交，從而使該引物的第一鏈與該引物的第二（保護子）鏈解離，并且在一種聚合酶的存在下，以一種標靶互補的方式使該第一鏈在其3’端處延伸。在另一方面，本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括在一種核酸標靶、一種聚合酶以及一種或多種前述的部分雙鏈的引物的存在下進行一種核酸合成反應。在一些實施例中，該核酸合成反應是一種核酸擴增反應。在一些實施例中，該核酸擴增反應是聚合酶鏈反應（PCR）。在一些實施例中，該核酸合成反應是一種轉錄反應。在一些實施例中，該轉錄反應是一種反轉錄反應。在一些實施例中，使用了兩種部分雙鏈的引物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種進行多重化核酸擴增反應的方法，該方法包括使用任何前述引物（包括該部分雙鏈的引物）對多個獨特的核酸分子進行擴增。在另一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，它包含一種或多種（包括多種）任何前述的部分雙鏈的引物，和一種或多種核酸合成試劑，如酶、核苷酸、鹽、EDTA、緩沖液等。在一些實施例中，這一種或多種核酸合成試劑是選自下組，該組由一種緩沖液、多種核苷酸以及一種聚合酶組成。在一些實施例中，該試劑盒進一步包含過量的保護子鏈，該保護子鏈與該引物中所包含的保護子鏈相同。在一些實施例中，該試劑盒進一步包含使用說明書。在另一方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，它包含在一個第一容器中的一種第一單鏈（補體）核酸，和在一個第二容器中的與該第一單鏈核酸的一個區(qū)域互補的一種第二單鏈（保護子）核酸，其中，當該第一與第二單鏈核酸彼此雜交時，形成一種部分雙鏈的核酸，該核酸包含(1)一個雙鏈的標靶非特異性區(qū)、(2)一個雙鏈的標靶特異性區(qū)以及(3)由該第一核酸貢獻的一個單鏈的標靶特異性區(qū)，其中該第一單鏈核酸包含一個非天然核苷酸和/或該第二單鏈核酸在其3’端處包含一個不可延伸的核苷酸。在一些實施例中，該試劑盒進一步包含使用說明書。在一些實施例中，該試劑盒進一步包含一種或多種核酸合成試劑，如上文列舉的那些。在一些實施例中，這一種或多種核酸合成試劑是選自下組，該組由一種緩沖液、多種核苷酸以及一種聚合酶組成。在一些實施例中，該保護子鏈是以一定量（例如摩爾量）提供于該試劑盒中，該量大于該試劑盒中補體鏈的量（例如摩爾量）。在前述方面和發(fā)明的一些實施例，特別是涉及兩條鏈的引物的那些實施例中，該引物的核苷酸序列經(jīng)過選擇，這樣使得：其中：是保護子平衡區(qū)與補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是保護子平衡區(qū)與在第一方向上緊鄰標靶核酸序列的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是立足點區(qū)與第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；并且是3.5kcal/mol。在一個方面，在此提供了一種引物雙鏈體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含一個補體鏈和一個保護子鏈，其中該保護子鏈包含一種核酸，該核酸具有：一個保護子分支移位區(qū)，它具有一個第一端、一個第二端以及對應于具有一個第一端和一個第二端的一個第一標靶核酸序列的一個序列，其中該保護子分支移位區(qū)的第一端和該第一標靶核酸序列的第一端都在5′或者都在3′；和緊鄰該保護子分支移位區(qū)的第一端的一個保護子平衡區(qū)，它具有不對應于緊鄰該第一標靶核酸序列的第一端的序列（如果有的話）的一個序列；并且該補體引物包含一種核酸，該核酸具有：一個補體分支移位區(qū)，它具有一個第一端和一個第二端，以及與該保護子分支移位區(qū)互補的一個序列，其中該補體分支移位區(qū)的第一端和該第一標靶核酸序列的第一端都在5′或者都在3′；一個立足點區(qū)，它：緊鄰該補體分支移位區(qū)的第一端；并且與緊鄰該第一標靶核酸序列的第二端的一個第二標靶核酸序列互補；以及一個補體平衡區(qū)，它：緊鄰該補體分支移位區(qū)的第二端；與該保護子平衡區(qū)互補；并且具有這樣一種序列，該序列使得：其中：是該保護子平衡區(qū)與該補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該保護子平衡區(qū)與在第一方向上緊鄰該標靶核酸序列的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；并且是3.5kcal/mol。在另一方面，在此提供了一種引物雙鏈體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含一種核酸，該核酸具有一個保護子鏈、一個發(fā)夾區(qū)及一個補體鏈，其中：該保護子鏈包含一個保護子分支移位區(qū)和一個保護子平衡區(qū)，其中：該保護子分支移位區(qū)具有：一個第一端；一個第二端；以及對應于具有一個第一端和一個第二端的一個第一標靶核酸序列的一個序列，其中該保護子分支移位區(qū)的第一端和該第一標靶核酸序列的第一端都在5′或者都在3′；并且該保護子平衡區(qū)具有：一個第一端；緊鄰該保護子分支移位區(qū)的第一端的一個第二端；以及不對應于緊鄰該第一標靶核酸序列的第一端的序列（如果有的話）的一個序列；該發(fā)夾區(qū)包含：一個第一端；和緊鄰該保護子平衡區(qū)的第一端的一個第二端；并且該補體鏈包含一個補體平衡區(qū)、一個補體分支移位區(qū)及一個立足點區(qū)，其中：該補體平衡區(qū)具有：一個第一端；緊鄰該發(fā)夾區(qū)的第一端的一個第二端；以及與該保護子平衡區(qū)互補的一個序列；該補體分支移位區(qū)具有：一個第一端；緊鄰該補體平衡區(qū)的第一端的一個第二端；以及與該保護子分支移位區(qū)互補的一個序列，其中該補體分支移位區(qū)的第一端和該第一標靶核酸序列的第一端都在5′或者都在3′；該立足點區(qū)：緊鄰該補體分支移位區(qū)的第一端；并與緊鄰該第一標靶核酸序列的第二端的一個第二標靶核酸序列互補；并且該補體平衡區(qū)具有這樣一種序列，該序列使得：其中：是該保護子平衡區(qū)與該補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該保護子平衡區(qū)與在第一方向上緊鄰該標靶核酸序列的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；并且是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；是該發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能；R是理想氣體常數(shù)；T是擬使用該引物雙鏈體系統(tǒng)的溫度；c是擬使用該引物雙鏈體系統(tǒng)的濃度；并且是3.5kcal/mol。在又一方面，在此提供了一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有（按3′到5′的順序）一個第一保護子鏈、一個第一發(fā)夾區(qū)、一個補體鏈、一個第二發(fā)夾區(qū)及一個第二保護子鏈，其中：該第一保護子鏈包含：一個第一保護子分支移位區(qū)，它具有對應于一個第一標靶核酸序列的一個序列；和一個第一保護子平衡區(qū)，它：緊鄰該第一保護子分支移位區(qū)的5′；并且具有不對應于緊鄰該第一標靶核酸序列的5′的序列（如果有的話）的一個序列；該第一發(fā)夾區(qū)緊鄰該第一保護子平衡區(qū)的5′；該補體鏈包含：一個第一補體平衡區(qū)，它：緊鄰該第一發(fā)夾區(qū)的5′；并且具有與該第一保護子平衡區(qū)的序列互補的一個序列；一個第一補體分支移位區(qū)，它：緊鄰該第一補體平衡區(qū)的5′；并且具有與一個第一保護子分支移位區(qū)互補的序列；一個立足點區(qū)，它：緊鄰該第一補體分支移位區(qū)的5′；并且具有與緊鄰該第一標靶核酸序列的3′的一個第二標靶核酸序列互補的一個序列；一個第二補體分支移位區(qū)，它：緊鄰該立足點區(qū)的5′；并且具有與緊鄰該第二標靶核酸序列的3′的一個第三標靶核酸序列互補的一個序列；一個第二補體平衡區(qū)，它：緊鄰該第二補體分支移位區(qū)的5′；具有不與緊鄰該第三標靶核酸序列的3′的序列（如果有的話）互補的一個序列；該第二發(fā)夾區(qū)緊鄰該第二補體平衡區(qū)的5′；并且該第二保護子鏈包含：一個第二保護子平衡區(qū)，它：緊鄰該第二發(fā)夾區(qū)的5′；并且具有與該第二補體平衡區(qū)互補的一個序列；以及一個第二保護子分支移位區(qū)，它：緊鄰該第二保護子平衡區(qū)的5′；并且具有與該第二補體分支移位區(qū)互補的一個序列；其中該第一補體平衡區(qū)和該第二補體平衡區(qū)具有這樣的序列，這些序列使得：其中：是該第一保護子平衡區(qū)與該第一補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第一補體平衡區(qū)與緊鄰該第一標靶核酸序列的5′的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該第二保護子平衡區(qū)與該第二補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第二補體平衡區(qū)與緊鄰該第三標靶核酸序列的3′的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；是該第一發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能；是該第二發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能；R是理想氣體常數(shù)；T是擬使用該引物雙鏈體系統(tǒng)的溫度；c是擬使用該引物雙鏈體系統(tǒng)的濃度；并且是3.5kcal/mol。在又另一方面，在此提供了一種引物雙鏈體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含一個發(fā)夾引物和一個保護子鏈，其中：該發(fā)夾引物包含一種核酸，該核酸具有：一個第一保護子鏈，該鏈具有：一個第一保護子分支移位區(qū)，它具有對應于一個第一標靶核酸序列的一個序列；和一個第一保護子平衡區(qū)，它：緊鄰該第一保護子分支移位區(qū)的5′；并且具有不對應于緊鄰該第一標靶核酸序列的5′的序列（如果有的話）的一個序列；一個緊鄰該第一保護子平衡區(qū)的5′的發(fā)夾區(qū)；一個補體鏈，該鏈具有：一個第一補體平衡區(qū)，它：緊鄰該第一發(fā)夾區(qū)的5′；并且具有與該第一保護子平衡區(qū)的序列互補的一個序列；一個第一補體分支移位區(qū)，它：緊鄰該第一補體平衡區(qū)的5′；并且具有與一個第一保護子分支移位區(qū)互補的一個序列；一個立足點區(qū)，它：緊鄰該第一補體分支移位區(qū)的5′；并且具有與緊鄰該第一標靶核酸序列的3′的一個第二標靶核酸序列互補的一個序列；一個第二補體分支移位區(qū)，它：緊鄰該立足點區(qū)的5′；并且具有與緊鄰該第二標靶核酸序列的3′的一個第三標靶核酸序列互補的一個序列；一個第二補體平衡區(qū)，它：緊鄰該第二補體分支移位區(qū)的5′；具有不與緊鄰該第三標靶核酸序列的3′的序列（如果有的話）互補的一個序列；并且該保護子包含一種核酸，該核酸具有：一個第二保護子鏈，該鏈具有：一個第二保護子平衡區(qū)，它具有與該第二補體平衡區(qū)互補的一個序列；和一個第二保護子分支移位區(qū)，它：緊鄰該第二保護子平衡區(qū)的5′；并且具有與該第二補體分支移位區(qū)互補的一個序列；其中該第一補體平衡區(qū)和該第二補體平衡區(qū)具有這樣的序列，這些序列使得：其中：是該第一保護子平衡區(qū)與該第一補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第一補體平衡區(qū)與緊鄰該第一標靶核酸序列的5′的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該第二保護子平衡區(qū)與該第二補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第二補體平衡區(qū)與緊鄰該第三標靶核酸序列的3′的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；是該發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能；并且是3.5kcal/mol。在又一方面，在此提供了一種引物雙鏈體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含一個保護子鏈和一個發(fā)夾引物，其中：該保護子鏈包含一種核酸，該核酸具有：一個第一保護子鏈，該鏈具有：一個第一保護子分支移位區(qū)，它具有對應于一個第一標靶核酸序列的一個序列；和一個第一保護子平衡區(qū)，它：緊鄰該第一保護子分支移位區(qū)的5′；并且具有不對應于緊鄰該第一標靶核酸序列的5′的序列（如果有的話）的一個序列；該發(fā)夾引物包含一種核酸，該核酸具有：一個補體鏈，該鏈具有：一個第一補體平衡區(qū)，它具有與該第一保護子平衡區(qū)的序列互補的一個序列；一個第一補體分支移位區(qū)，它：緊鄰該第一補體平衡區(qū)的5′；并且具有與一個第一保護子分支移位區(qū)互補的一個序列；一個立足點區(qū)，它：緊鄰該第一補體分支移位區(qū)的5′；并且具有與緊鄰該第一標靶核酸序列的3′的一個第二標靶核酸序列互補的一個序列；一個第二補體分支移位區(qū)，它：緊鄰該立足點區(qū)的5′；并且具有與緊鄰該第二標靶核酸序列的3′的一個第三標靶核酸序列互補的一個序列；一個第二補體平衡區(qū)，它：緊鄰該第二補體分支移位區(qū)的5′；具有不與緊鄰該第三標靶核酸序列的3′的序列（如果有的話）互補的一個序列；一個緊鄰該第二補體平衡區(qū)的5′的發(fā)夾區(qū)；以及一個第二保護子鏈，該鏈具有：一個第二保護子平衡區(qū)，它：緊鄰該第二發(fā)夾區(qū)的5′；并且具有與該第二補體平衡區(qū)互補的一個序列；和一個第二保護子分支移位區(qū)，它：緊鄰該第二保護子平衡區(qū)的5′；并且具有與該第二補體分支移位區(qū)互補的一個序列；其中該第一補體平衡區(qū)和該第二補體平衡區(qū)具有這樣的序列，這些序列使得：其中：是該第一保護子平衡區(qū)與該第一補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第一補體平衡區(qū)與緊鄰該第一標靶核酸序列的5′的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該第二保護子平衡區(qū)與該第二補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第二補體平衡區(qū)與緊鄰該第三標靶核酸序列的3′的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；是該發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能；并且是3.5kcal/mol。在另一方面，在此提供了一種引物雙鏈體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含一個第一保護子鏈、一個補體鏈及一個第二保護子鏈，其中：該第一保護子鏈包含一種核酸，該核酸具有：一個第一保護子分支移位區(qū)，它具有對應于一個第一標靶核酸序列的一個序列；和一個第一保護子平衡區(qū)，它：緊鄰該第一保護子分支移位區(qū)的5′；并且具有不對應于緊鄰該第一標靶核酸序列的5′的序列（如果有的話）的一個序列；該補體鏈包含一種核酸，該核酸具有：一個第一補體平衡區(qū)，它：緊鄰該第一發(fā)夾區(qū)的5′；并且具有與該第一保護子平衡區(qū)的序列互補的一個序列；一個第一補體分支移位區(qū)，它：緊鄰該第一補體平衡區(qū)的5′；并且具有與一個第一保護子分支移位區(qū)互補的一個序列；一個立足點區(qū)，它：緊鄰該第一補體分支移位區(qū)的5′；并且具有與緊鄰該第一標靶核酸序列的3′的一個第二標靶核酸序列互補的一個序列；一個第二補體分支移位區(qū)，它：緊鄰該立足點區(qū)的5′；并且具有與緊鄰該第二標靶核酸序列的3′的一個第三標靶核酸序列互補的一個序列；一個第二補體平衡區(qū)，它：緊鄰該第二補體分支移位區(qū)的5′；具有不與緊鄰該第三標靶核酸序列的3′的序列（如果有的話）互補的一個序列；并且該第二保護子鏈包含：一個第二保護子平衡區(qū)，它具有與該第二補體平衡區(qū)互補的一個序列；和一個第二保護子分支移位區(qū)，它：緊鄰該第二保護子平衡區(qū)的5′；并且具有與該第二補體分支移位區(qū)互補的一個序列；其中該第一補體平衡區(qū)和該第二補體平衡區(qū)具有這樣的序列，這些序列使得：其中：是該第一保護子平衡區(qū)與該第一補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第一補體平衡區(qū)與緊鄰該第一標靶核酸序列的5′的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該第二保護子平衡區(qū)與該第二補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第二補體平衡區(qū)與緊鄰該第三標靶核酸序列的3′的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；并且是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；R是理想氣體常數(shù)；T是擬使用該引物雙鏈體系統(tǒng)的溫度；c是擬使用該引物雙鏈體系統(tǒng)的濃度；并且是3.5kcal/mol。在又另一方面，在此提供了一種引物雙鏈體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含（按3′到5′的順序）一個第一保護子鏈、一個第一發(fā)夾區(qū)、一個補體鏈、一個第二發(fā)夾區(qū)及一個第二保護子鏈，其中：該第一保護子鏈具有對應于一個第一標靶核酸序列的一個序列；該第一發(fā)夾區(qū)緊鄰該第一保護子鏈的5′；該補體鏈包含：一個第一補體分支移位區(qū)，它：緊鄰該第一發(fā)夾區(qū)的5′；并且具有與該第一保護子鏈的序列互補的一個序列；一個立足點區(qū)，它：緊鄰該第一補體分支移位區(qū)的5′；并且具有與緊鄰該第一標靶核酸序列的3′的一個第二標靶核酸序列互補的一個序列；以及一個第二補體分支移位區(qū)，它：緊鄰該立足點區(qū)的5′；并且具有與緊鄰該第二核酸序列的3′的一個第三標靶核酸序列互補的一個序列；該第二發(fā)夾區(qū)緊鄰該第二補體分支移位區(qū)的5′；并且該第二保護子鏈具有與該第二補體分支移位區(qū)的序列互補的一個序列。在前述方面的任一項中，可以為2.0kcal/mol、1.0kcal/mol或0.5kcal/mol；和/或可以為約10nM；和/或T可以為約293K或約338K；和/或該立足點區(qū)可以為介于4個與20個核苷酸之間的長度、介于約4個與15個核苷酸之間的長度，或介于約4個與10個核苷酸之間的長度；和/或該保護子分支移位區(qū)的第一端可以為5′或3′；和/或該引物雙鏈體系統(tǒng)可以進一步包含一種官能化的熒光基團或染料；和/或該引物雙鏈體系統(tǒng)可以被固定在一個固體支撐物上；和/或該發(fā)夾區(qū)可以為不超過20個核苷酸的長度或不超過10個核苷酸的長度；和/或該發(fā)夾區(qū)的序列可以選自下組，該組由以下各項組成：聚腺苷序列、聚脫氧腺苷序列、聚5′-甲基尿苷序列、聚胸苷序列、聚鳥苷序列、聚脫氧鳥苷序列、聚胞苷序列、聚脫氧胞苷序列、聚尿苷序列及聚脫氧尿苷序列；和/或該第一標靶核酸序列和/或該第二標靶核酸序列可以是在一種生物體或一種病毒中天然存在的序列；和/或該第一標靶核酸序列和/或該第二標靶核酸序列可以是在一種微RNA中天然存在的序列。在一個方面，在此提供了一種檢測樣品中的標靶核酸的方法，該方法包括：使一種標靶核酸與在此描述的任一實施例的引物雙鏈體系統(tǒng)接觸；并且檢測該標靶核酸與該引物雙鏈體系統(tǒng)的至少一部分之間的復合物的形成。在一些實施例中，該引物雙鏈體系統(tǒng)進一步包含一種官能化的熒光基團或染料。在一些實施例中，該引物雙鏈體系統(tǒng)被固定在一個固體支撐物上。在一些實施例中，該接觸在一個細胞中發(fā)生。在一些實施例中，該標靶核酸是在一種生物體或一種病毒中天然存在的一種核酸。在一些實施例中，該標靶核酸是一種微RNA。在另一方面，在此提供了一種擴增標靶核酸內(nèi)所含的序列的方法，該方法包括：形成一種溶液，該溶液包含：一種標靶核酸；在此描述的任一實施例的一種引物雙鏈體系統(tǒng)；以及用于進行一種擴增反應的多種試劑；并且在使得該標靶核酸內(nèi)所含的一個序列被擴增的條件下孵育該溶液。在一些實施例中，該標靶核酸是在一種生物體或一種病毒中天然存在的一種核酸。本發(fā)明的這些和其他方面和實施例將在此更詳細地解釋。附圖簡要說明圖1A、1B、2A、2B、3A、3B、4-8、9A及9B描繪了示例性的核酸探針系統(tǒng)。圖10、11、12A、12B、13及14描繪了使用核酸探針系統(tǒng)的示例性方法。圖15A和15B描繪了使用在此提供的引物雙鏈體進行的高特異性聚合酶鏈反應（PCR）。圖16A-16D示出了具有單個核苷酸辨別力的引物雜交的實驗論證。圖17A-17D示出了有關引物雙鏈體的單堿基辨別能力的另外的實驗結果和統(tǒng)計學。圖18A-18B示出了使用雙鏈體引物改良一種準重復標靶的PCR產(chǎn)率的實驗結果。發(fā)明的詳細說明基于探針的核酸檢驗中的一個重大挑戰(zhàn)是序列類似于標靶序列的核酸將以較強的熱力學和快速的動力學與該標靶的補體雜交。然而，如在此所描述，鏈置換反應的動力學和熱力學可以部分地解耦，使得在熱力學方面只是略微有利或甚至不利的反應仍然可以具有與兩個互補鏈的雜交一樣快的動力學。在此描述的組合物和方法利用了這一解耦機制來提供特異性和動力學改良的核酸探針系統(tǒng)。在此提供了高特異性核酸探針系統(tǒng)和使用這些探針系統(tǒng)的方法。在某些實施例中，在此描述的這些核酸探針系統(tǒng)包含多個補體探針，這些探針具有與標靶序列互補的區(qū)域，這些區(qū)域被與這些補體探針的一部分互補的保護子區(qū)保護從而不與假標靶雜交。該標靶與受保護的探針之間的結合反應的自由能是通過一個或多個平衡區(qū)的經(jīng)合理地設計的堿基進行精細控制，這一個或多個平衡區(qū)的序列不對應于該標靶核酸序列或其補體。在某些實施例中，一個保護子和一個補體探針在單個核酸分子上形成多個區(qū)域，并且通過一個或多個核酸發(fā)夾彼此分開。在此描述的方法和組合物具有若干獨特的特性，這些特性有助于它們用于雜交檢驗中。第一，在此描述的核酸探針系統(tǒng)可靠地將標靶與假標靶之間的較小序列差異轉變成該標靶對比假標靶與探針的雜交之間的結合親和力和反應速率的較大差異。第二，在此描述的核酸探針系統(tǒng)可以設計成在較寬溫度和鹽濃度范圍內(nèi)的任一種下操作，并且因此可以在許多不同的實驗條件下可靠地起作用。第三，使用在此描述的核酸探針系統(tǒng)可以使得雜交反應即使在室溫下也為動力學上快速的，這有助于進行快速并且高通量的核酸分析。第四，在此描述的核酸探針系統(tǒng)經(jīng)過了合理地設計，并且因此不太可能不利地或以出于意料的方式與其他生物分子相互作用。因此，在此提供了引物組合物、制備這些組合物的方法及其使用方法。在此描述的實施例部分地以下述發(fā)現(xiàn)為前提：呈部分雙鏈并且部分單鏈的引物（例如，一對部分雜交的引物或單個自身雜交的引物）當例如用于一種核酸合成反應中時，能夠辨別完全互補的標靶與具有一個或多個錯配的那些（即，假標靶）。如在此所論證，在此描述的引物雙鏈體在例如使用假標靶（如具有準重復序列的那些）的PCR反應中優(yōu)于標準引物。在此的引物雙鏈體包含一個在此稱為“立足點”的單鏈區(qū)，該引物雙鏈體從該單鏈區(qū)起始與一種標靶的結合；一個雙鏈的“平衡區(qū)”，它自發(fā)地解離，使得單個引物鏈無法競爭與該標靶的雜交（沿該引物的全長）；以及在該立足點區(qū)與平衡區(qū)中間的一個雙鏈的分支移位區(qū)，它與標靶核酸序列完全互補。機械地，認為與一種標靶的雜交在該立足點開始，并且沿該補體鏈的長度繼續(xù)，直到該引物不再是“雙鏈的”。這也假定了該標靶與分支區(qū)之間的互補性。如在此所使用，核酸“區(qū)”或“結構域”是任何長度的核苷酸的連續(xù)伸長。當在“標靶”與補體鏈之間存在核苷酸錯配時，第二鏈（即，保護子鏈）的置換在熱力學上是不利的，并且該補體鏈與該“標靶”之間的締合被逆轉。應了解的是，在這后一描述中，該“標靶”實際上是一個假標靶，因為它包含與該補體鏈的核苷酸差異或錯配。由于標準自由能有利于該核酸的標靶序列與該引物的分支移位區(qū)加立足點區(qū)之間的完整匹配（完全互補）而非錯配（例如，單個核苷酸變化），故該引物的第一（補體）鏈在錯配不存在的情況下而不是在錯配的存在下將穩(wěn)定地結合于標靶。如果在該引物的第一（補體）鏈與該標靶之間存在一個錯配，那么該引物雙鏈體傾向于通過新暴露出來的單鏈平衡區(qū)重新形成。以此方式，在一個標靶中（或在一個樣品中，就那點來說）的一個不正確位置處開始核酸合成反應的頻率降低。這一辨別類型使用現(xiàn)有技術的標準單鏈引物典型地是不可能的，因為在那些反應中，不存在將傾向于結合于一個錯配的引物鏈的競爭性核酸鏈（如保護子鏈）。在一些實施例中，在此描述的這些引物可以比常規(guī)引物（例如，用于聚合酶鏈反應（PCR）擴增的那些）顯著更長，因為本發(fā)明的引物依賴于一個競爭性保護子鏈的存在（對于特異性來說）而非依賴于熔融溫度來辨別互補序列與錯配序列。因此，本發(fā)明的引物可以按不依賴于溫度的方式進行選擇并且使用。因此，在此描述的引物雙鏈體改良了例如核酸合成反應的特異性，并且在一些實施例中，允許更高程度的引物多重化。初步實驗（其結果在此提供）顯示，如與標準引物相比較，準重復標靶的PCR產(chǎn)率可以使用在此提供的引物雙鏈體顯著地改良（例如75%對比30%）。在此描述的引物雙鏈體還提供了一個異質核酸群中特定核酸的檢測和擴增，如（例如）對包含人類DNA的一個樣品中的細菌DNA進行檢測并擴增，此法在如生物戰(zhàn)用劑等罕見生物體的檢測中具有廣泛的適用性。引物雙鏈體如在此所使用，本發(fā)明的引物可以稱為“引物雙鏈體”，表示它們可以呈它們包含雙鏈區(qū)的一種構象提供和/或存在。因此，術語“引物”和“引物雙鏈體”可以互換地使用。這些引物雙鏈體提供了相對于現(xiàn)有引物改良的特異性和動力學。在此的“引物雙鏈體”是指這樣一種引物，它包含一個第一鏈（在此稱為“補體鏈”）及與該第一鏈部分互補的一個第二鏈（在此稱為“保護子鏈”）。在一些實施例中，該補體鏈和該保護子鏈是分開的單鏈核酸分子（圖1A和1B）。在其他實施例中，該補體鏈和該保護子鏈彼此連接，并且通過一個發(fā)夾區(qū)分開以形成單個核酸分子的多個鄰接的區(qū)域（圖2A和2B）。如在此所使用，“發(fā)夾區(qū)”是連接一個核酸的兩個雙鏈區(qū)的由多個核苷酸構成的一個單鏈環(huán)。示例性引物雙鏈體的總體結構于圖式中圖示并描述于此。應了解的是，在大多數(shù)情況下，當提到補體區(qū)或保護子區(qū)（或反之亦然）時，每個區(qū)域典型地在單個“引物雙鏈體”（或單個引物系統(tǒng)）內(nèi)。舉例來說，本發(fā)明的引物中的補體平衡區(qū)與同一引物中的保護子平衡區(qū)互補，這樣使得本發(fā)明的一個引物的補體平衡區(qū)不會與物理上分開的不同引物的保護子平衡區(qū)雜交。在本發(fā)明的引物只由單個鏈組成的實施例中，補體“鏈”可以稱為補體區(qū)，并且保護子“鏈”可以稱為保護子區(qū)。在某些實施例中，該補體鏈（或區(qū)）包含一個立足點區(qū)、一個補體分支移位區(qū)及一個補體平衡區(qū)，而該保護子鏈（或區(qū)）包含一個保護子分支移位區(qū)和一個保護子平衡區(qū)。如在此所使用，核酸“區(qū)”是任何長度的核苷酸的連續(xù)伸長段。立足點區(qū)和分支移位區(qū)各自被設計成與標靶核酸中的相鄰區(qū)域互補，并且因此與標靶核酸中的相鄰區(qū)域“堿基配對”（例如雜交）。補體鏈中與標靶核酸中的一個區(qū)域堿基配對的一個區(qū)域稱為“標靶特異性”區(qū)。平衡區(qū)被設計成不與標靶核酸互補并且因此不與標靶核酸堿基配對。因此，平衡區(qū)稱為“標靶非特異性”區(qū)。在某些方面，當該補體鏈（或區(qū)）與該保護子鏈（或區(qū)）彼此雜交（為雙鏈的）時，形成一個引物雙鏈體。因此，在一些方面，一個引物雙鏈體包含一個標靶特異性的單鏈立足點區(qū)、一個標靶特異性的雙鏈分支移位區(qū)及一個標靶非特異性的雙鏈平衡區(qū)（圖1A和1B）。在一些情況下，該引物雙鏈體還可以包含一個發(fā)夾環(huán)，如下文更詳細地描述。在此描述的這些引物雙鏈體可以被設計成特異性地與標靶核酸雜交。引物（例如）在一種核酸擴增反應中的功效取決于該引物的特異性、效率以及保真度。典型的核酸引物通常以與同一引物結合于其期望的特定標靶核酸相當?shù)臒崃W和動力學特征結合于假標靶，差異在于錯配的雙鏈體與完美雜交的雙鏈體的熔融溫度。因此，錯配的雙鏈體和完美的雙鏈體可以通過其熔融溫度來區(qū)別。相比之下，本發(fā)明的引物以一種相對不依賴于溫度的方式來區(qū)別假標靶與真標靶。在此“假標靶”是指在與補體鏈雜交的區(qū)域內(nèi)有至少一個核苷酸與標靶核酸分子不同的一種核酸分子。舉例來說，如果標靶是TCGAAGGG，那么TCGACGGGG是假標靶。在某些實施例中，假標靶包含相對于該標靶至少2個、至少3個、至少4個或更多個核苷酸變化。結合于假標靶的引物降低了例如核酸擴增的保真度（精確度）。在此呈現(xiàn)的引物雙鏈體被設計成改變了用假標靶進行鏈置換的標準自由能，從而容許對正確的標靶與假標靶（包括只有一個核苷酸不同于正確的標靶的假標靶）進行辨別。如在此所描述，保護子鏈負責改變標準自由能，以允許補體鏈對正確的標靶與假標靶進行辨別。在此描述的引物被合理地設計成有助于以精細調(diào)諧的動力學和熱力學進行鏈置換反應，這樣使得鏈置換反應的動力學和熱力學部分地解耦。作為此解耦的結果，在熱力學方面只是略微有利或甚至不利的反應仍然可以具有與兩個互補鏈的雜交一樣快的動力學。舉例來說，在37°C和1MNa+下，一個引物與一個完美互補（正確或特定）的標靶（即，100%的核苷酸匹配）的雜交的經(jīng)濃度調(diào)整的標準自由能比同一引物與一個假標靶的雜交的經(jīng)濃度調(diào)整的標準自由能更有利，對于該假標靶與該期望標靶不同的每個核苷酸而言該有利的差別介于1.9kcal/mol與6.6kcal/mol之間。在某些實施例中，本發(fā)明的引物雙鏈體使用了立足點交換鏈置換反應來將經(jīng)濃度調(diào)整的標準自由能的這個1.9到6.6kcal/mol的差異轉換成對該標靶與假標靶之間的最佳辨別。引物雙鏈體結合于標靶核酸的熱力學/動力學的一個實例如下參照圖3A和3B所描述。出于此實例的目的，該標靶核酸具有至少兩個區(qū)，(1)和(2)。在某些實施例中，區(qū)域(1)可以為約10到約200個（包括14-200個或20-200個）核苷酸的長度，而區(qū)域2可以更小，例如為約4到約20個核苷酸的長度。如在此所使用，術語“核苷酸”與“堿基”可互換地使用。保護子鏈包括鄰近一個保護子平衡區(qū)(3)的一個保護子分支移位區(qū)。該保護子分支移位區(qū)對應于標靶區(qū)1，而該保護子平衡區(qū)(3)不對應于區(qū)域(1)或區(qū)域(2)，或者緊鄰這些標靶區(qū)的5’的任何區(qū)域。如果一個核酸序列、結構域或區(qū)域與另一序列是同一核酸分子的部分并且如果沒有堿基分開這兩個序列，那么這兩個序列“緊鄰”、“緊鄰5′”或“緊鄰3′”。補體鏈包括一個補體平衡區(qū)(3)、一個補體分支移位區(qū)(1)以及一個立足點區(qū)(2)。該補體平衡區(qū)(3)與該保護子平衡區(qū)(3)互補，該補體分支移位區(qū)(1)與該保護子分支移位區(qū)和標靶區(qū)(1)互補（即，該保護子分支移位區(qū)與該標靶區(qū)(1)的序列是相同的并且這兩者都結合于該補體分支移位區(qū)(1)，并且該立足點區(qū)(2)與標靶區(qū)(2)互補。在某些實施例中，該平衡區(qū)被設計成使得其經(jīng)濃度調(diào)整的標準自由能與結合于標靶區(qū)(2)的該立足點區(qū)的經(jīng)濃度調(diào)整的標準自由能相同或大致相同。在一些情況下，對于在37°C下進行的反應中所使用的10納摩爾濃度（nM）的引物來說，和（豎線表示絕對值）應當各自小于約11.3kcal/mol以確保完整保護子鏈與該標靶解離。在一些實施例中，當引物雙鏈體與一個特定（正確）的標靶核酸分子相互作用（圖3A）時，(3):(3)的解離與(2):(2)的締合彼此平衡，并且(1):(1)雜交的熱力學對于該標靶核酸和對于與補體鏈相互作用的保護子鏈是相同的。兩種狀態(tài)之間總自由能的變化相對較?。ɡ鐬榧s1kcal/mol），并且反應迅速地（例如不到一分鐘）達到約50:50的平衡。在某些實施例中，該平衡區(qū)可以被設計成具有與結合于標靶區(qū)2的立足點區(qū)的標準自由能非常接近的標準自由能，以使得該平衡在例如60:40或70:30下達到平衡。在一些實施例中，該平衡區(qū)的設計還可以考慮該反應期間自由能變化的其他誘因，如保護子平衡區(qū)與上游標靶序列之間的雜交（這在一些情況下是可忽略的）、發(fā)夾（如果存在的話）的限制、期望的使用溫度及期望的引物濃度。在一些實施例中，當引物雙鏈體改為與一個假標靶核酸分子相互作用（圖3B）時，由于假標靶區(qū)(2m)與立足點區(qū)不完全互補，故(3):(3)的解離和(2m):(2)的締合不平衡。該平衡因此移到該引物雙鏈體不結合該假標靶的狀態(tài)。換種方式來說，在一些情況下，結合于該保護子鏈的該補體鏈的自由能是（忽略由任選的發(fā)夾區(qū)和其他考慮因素造成的影響），這平衡了結合于特定標靶的補體鏈的自由能，在此實例中，這是因為引物雙鏈體的平衡區(qū)(3)已經(jīng)被設計成具有等于（或大致等于）標靶區(qū)(2)的經(jīng)濃度調(diào)整的標準自由能。當該引物雙鏈體與在標靶區(qū)(2m)中具有單個核苷酸（堿基）變化的假標靶相互作用時，該系統(tǒng)的自由能的負值小于該引物雙鏈體的負值，并且因此不利于平衡。如在此所使用，在提到標準自由能時的術語“大致等于”意思是指，第一個提到的自由能在第二個提到的自由能的加減10%范圍內(nèi)。在一些實施例中，大致等于第二自由能的第一自由能是在該第二自由能的約+3kcal/mol到約-3kcal/mol的范圍內(nèi)。應了解的是，在一些實施例中，該第一與該第二真能量之間的差異可以小于或為約1kcal/mol、小于或為約2kcal/mol、小于或為約3kcal/mol、小于或為約3.5kcal/mol，或者更高。盡管圖3B圖示了對應于一個標靶核酸分子的區(qū)域(2)/(2m)的單個核苷酸變化，但本發(fā)明的引物雙鏈體也可以對特定標靶與在區(qū)域(1)中具有一個核苷酸變化的假標靶進行辨別。當該假標靶在標靶區(qū)1中具有單堿基變化時，那么該引物雙鏈體的標準自由能在結合后變?yōu)槠渲惺墙Y合于該引物雙鏈體的補體區(qū)(1)的錯配標靶區(qū)(1)的標準自由能。由于這單堿基變化，該引物雙鏈體的自由能的負值小于（結合于保護子的補體引物的自由能），因此平衡移到該引物雙鏈體不結合該假標靶區(qū)的狀態(tài)。標準自由能可以基于本領域中的知識和在此提供的傳授內(nèi)容在理論上進行計算。補體和保護子鏈、區(qū)域或結構域在此描述的核酸探針系統(tǒng)的補體結構域各自包括多個區(qū)域，這些區(qū)域包括一個立足點區(qū)和一個或多個補體標靶區(qū)。該立足點區(qū)和該一個或多個補體標靶區(qū)都具有與標靶核酸的核酸序列互補的核酸序列。當使核酸探針系統(tǒng)與標靶核酸在適當?shù)碾s交條件下接觸時，該立足點區(qū)和該補體標靶區(qū)因此能夠與標靶核酸的序列進行堿基配對并且因此與它形成一種復合物。補體結構域還可以包括一個或多個補體平衡區(qū)。這一個或多個補體平衡區(qū)經(jīng)合理地設計。因此，這一個或多個補體平衡區(qū)的序列不被設計成與一個標靶核酸序列互補。立足點區(qū)與該標靶核酸分子中的一個序列互補（并因此雜交）；然而，立足點區(qū)不與保護子鏈雜交。因此，當該補體鏈與該標靶核酸分子雜交時，該立足點區(qū)也與該標靶核酸分子雜交，但當該補體鏈與該保護子鏈雜交時，該立足點區(qū)保持單鏈的。立足點區(qū)可以定位于該補體鏈的3’端或5’端處（例如，作為該補體鏈的3’端或5’端的延伸）。在某些實施例中，立足點區(qū)為約4個核苷酸到約20個核苷酸的長度、約4個核苷酸到約15個核苷酸的長度或約4個核苷酸到約10個核苷酸的長度。在一些實施例中，立足點區(qū)為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸的長度。在一些實施例中，該立足點區(qū)大于20個核苷酸的長度，包括例如小于或為約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個核苷酸。補體分支移位區(qū)與該標靶核酸分子中的一個序列并且與保護子分支移位區(qū)互補。因此，當該補體鏈與一個標靶核酸分子雜交時，該補體分支移位區(qū)與該標靶核酸雜交。當該補體鏈與其保護子鏈雜交時，該補體分支移位區(qū)與該保護子分支移位區(qū)雜交。在某些實施例中，分支移位區(qū)是不超過200、100、75、50、40、30、25或20個核苷酸的長度。在一些實施例中，分支移位區(qū)為約10個核苷酸到約200個核苷酸的長度。在某些實施例中，分支移位區(qū)為約10個核苷酸到約150個核苷酸的長度、約10個核苷酸到約100個核苷酸的長度或約10個核苷酸到約50個核苷酸的長度。在多個特定的實施例中，分支移位區(qū)為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200個核苷酸的長度。在多個特定的實施例中，取決于感興趣的標靶核酸分子，分支移位區(qū)可以超過200個核苷酸的長度。一個補體鏈與一個保護子鏈的平衡區(qū)彼此互補（即，形成雙鏈核酸），但與感興趣的標靶不互補（即，不與該標靶形成雙鏈核酸）。因此，當一個補體鏈與一個標靶核酸分子雜交時，該補體平衡區(qū)不與該標靶核酸分子雜交。當該補體鏈與其保護子鏈雜交時，該補體平衡區(qū)與該保護子平衡區(qū)雜交。該平衡區(qū)的設計是取決于該立足點區(qū)的設計。在一些實施例中，該平衡區(qū)被設計成使得該平衡區(qū)的熱力學特征與該立足點區(qū)的熱力學特征相當。在一些實施例中，該熱力學特征是基于使用例如在RPI生物信息網(wǎng)站得到的Mfold軟件的一個理論模型。一個平衡區(qū)內(nèi)核苷酸的數(shù)量和/或性質與該立足點區(qū)的核苷酸數(shù)量和/或性質相當。舉例來說，如果一個立足點區(qū)包含40%的A和T核苷酸以及60%的G和C核苷酸，那么該平衡區(qū)也應當包含40%的A和T核苷酸以及60%的G和C核苷酸。在多個實施例中，該平衡區(qū)被設計成使得不超過三個連續(xù)的核苷酸與該標靶核酸上的一個序列互補，以避免該平衡區(qū)結合于該標靶核酸。在一些實施例中，平衡區(qū)的長度足夠短以使得該補體與該保護子彼此自發(fā)地解離。在一些實施例中，平衡區(qū)為約4個核苷酸到約20個核苷酸的長度、約4個核苷酸到約15個核苷酸的長度或約4個核苷酸到約10個核苷酸的長度。在一些實施例中，平衡區(qū)為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸的長度。在一些實施例中，平衡區(qū)大于20個核苷酸的長度，包括例如小于約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多個核苷酸。在一些實施例中，與該標靶核酸內(nèi)的一個核苷酸序列互補的連續(xù)核苷酸的數(shù)量可以大于三個，其條件是該平衡區(qū)不結合于該標靶核酸。在一些實施例，例如該引物雙鏈體含有兩個分開的核酸鏈的那些實施例中，平衡區(qū)的設計不取決于該引物雙鏈體的濃度或形成/使用該引物雙鏈體時的溫度。在一些實施例中，平衡區(qū)被設計成使得保護子鏈被該標靶核酸分子從補體鏈中置換的反應的標準自由能接近零千卡/摩爾。如在此所使用，“接近零”意思是指該反應的標準自由能是在0kcal/mol加減3.5kcal/mol的范圍內(nèi)。在某些實施例中，此置換反應的標準自由能在零千卡/摩爾加減3.5、3.0、2.5、2.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1kcal/mol的范圍內(nèi)。在其他實施例，例如該引物雙鏈體是由單個核酸分子（例如，發(fā)夾區(qū)分開補體鏈（或區(qū)或結構域）與保護子鏈（或區(qū)或結構域））形成的那些實施例中，平衡區(qū)的設計將取決于該引物雙鏈體的濃度以及反應溫度。在這些實施例中，平衡區(qū)被設計成使得保護子鏈被該標靶核酸從補體鏈中置換的反應的標準自由能加上RTln(c)接近零千卡/摩爾，其中R是普適氣體常數(shù)（0.0019858775(34)kcal/mol·K），T是使用該引物雙鏈體時的溫度，并且c是使用引物雙鏈體的濃度。在一些實施例中，使用這些引物雙鏈體時的溫度為約273K（0°C）、277K、283K、288K、293K、298K、303K、308K、313K、318K、323K、328K、333K、338K、343K、348K、353K、358K或363K（90°C）。在一些實施例中，使用這些引物雙鏈體的濃度（c）為約1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、100nM、125nM、150nM、175nM、200nM、225nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或1μM。在某些實施例中，此置換反應的標準自由能加上RTln(c)在零千卡/摩爾加減3.5、3.0、2.5、2.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1kcal/mol的范圍內(nèi)。在一些實施例中，引物雙鏈體可以包括一個或多個發(fā)夾區(qū)，這些區(qū)域將補體鏈連接到保護子鏈。在某些實施例中，一個引物雙鏈體的發(fā)夾區(qū)可以為任何長度。在一些實施例中，該發(fā)夾區(qū)是超過30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3個核苷酸的長度。在一些實施例中，該發(fā)夾的序列不與該標靶核酸分子的一個序列互補。在某些實施例中，該發(fā)夾區(qū)具有聚單核苷酸序列，如聚腺苷序列、聚脫氧腺苷序列、聚5′-甲基尿苷序列、聚胸苷序列、聚鳥苷序列、聚脫氧鳥苷序列、聚胞苷序列、聚脫氧胞苷序列、聚尿苷序列及聚脫氧尿苷序列。在此描述的引物雙鏈體可以是至少兩種定向中的一種。舉例來說，在一種定向中，立足點區(qū)位于5’端處，緊鄰補體分支移位區(qū)（即，在兩個區(qū)域之間沒有插入的核苷酸），并且補體平衡區(qū)位于3’端處，緊鄰該補體分支移位區(qū)。在這一定向中，保護子平衡區(qū)在保護子鏈的5’端處，緊鄰保護子分支移位區(qū)（圖1A）。在另一種定向中，該立足點區(qū)位于3’端處，緊鄰該補體分支移位區(qū)，并且該補體平衡區(qū)位于5’端處，緊鄰該補體分支移位區(qū)。在這一定向中，該保護子平衡區(qū)在該保護子鏈的3’端處，緊鄰該保護子分支移位區(qū)（圖1B）。不管定向如何，該補體平衡區(qū)的序列使得：其中：是該保護子平衡區(qū)與該補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該保護子平衡區(qū)與在第一方向上緊鄰該標靶核酸序列的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；并且是3.5kcal/mol。在一些實施例中，引物雙鏈體包含一個比保護子更長的補體鏈，長度的差異取決于該補體鏈的立足點區(qū)的長度。這些引物的長度被設計成使得該補體與感興趣的標靶的雜交具有接近零的標準自由能（ΔG°）。保護子鏈（從該引物雙鏈體）的釋放確保了此雜交反應關于熵是中性的并且對濃度是穩(wěn)固的。因此，在一些實施例中，對于許多條件，在室溫（例如約25°C或約298K）下進行的此反應比得上在接近熔融溫度下達到的雜交的特異性。如在此所期望的，ΔG°（標準自由能的變化）“接近零”是指絕對值（量）小于或為約1kcal/mol、小于或為約2kcal/mol、小于或為約3kcal/mol，或者小于或為約3.5kcal/mol。在一些實施例中，平衡區(qū)或立足點區(qū)的標準自由能>-1kcal/mol到<1kcal/mol、>-3kcal/mol到<3kcal/mol或>-3.5kcal/mol到<3.5kcal/mol。引物雙鏈體可以按約2:1到約5:1的保護子鏈與補體鏈的比率制備。在一些實施例中，保護子鏈與補體鏈的比率為約2:1、約3:1、約4:1或為約5:1。在一些實施例中，保護子鏈與補體鏈的比率為2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。這些引物雙鏈體也可以與過量的保護子鏈一起用于在此描述的任何檢驗或反應中。該保護子鏈可以相對于該引物大致等于或超過2、5、10、20、50、100或500倍摩爾過量。發(fā)夾引物雙鏈體系統(tǒng)（例如單鏈系統(tǒng)）在某些實施例中，一個引物雙鏈體包括一個單個核酸，該核酸包含一個補體區(qū)或結構域、一個發(fā)夾區(qū)以及一個保護子區(qū)或結構域。在一些實施例中，該補體結構域與該保護子結構域雜交，形成了一個具有插入的發(fā)夾環(huán)區(qū)的引物雙鏈體。與在此披露的其他引物系統(tǒng)相同，這些發(fā)夾引物系統(tǒng)被設計成與一個標靶核酸分子特異性雜交。在此，一個“發(fā)夾引物雙鏈體系統(tǒng)”或一個“發(fā)夾系統(tǒng)”包括一個補體平衡區(qū)、一個補體分支移位區(qū)、一個立足點區(qū)、一個保護子平衡區(qū)及一個保護子分支移位區(qū)。如以上所描述，補體平衡區(qū)與保護子平衡區(qū)互補；補體分支移位區(qū)與保護子分支移位區(qū)和標靶核酸區(qū)互補；并且立足點區(qū)與標靶核酸區(qū)互補。保護子分支移位區(qū)對應于標靶核酸區(qū)并且與補體分支移位區(qū)互補。由于在此描述的發(fā)夾引物雙鏈體系統(tǒng)是由單個核酸分子形成的，故補體平衡區(qū)的設計將取決于擬使用該引物系統(tǒng)的溫度和濃度，如在此所描述。應了解的是，盡管可以使用該標靶核酸分子的序列來描述這些引物系統(tǒng)的特征，但在一些實施例中，該標靶核酸本身可以是或不是該引物系統(tǒng)（例如，兩條鏈或單鏈的系統(tǒng)）的一種組分。對于具有一個發(fā)夾區(qū)的引物雙鏈體來說，當對保護子鏈被該標靶核酸從補體鏈中置換的反應的標準自由能進行測定時，可以考慮該發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能。針對不同大小的發(fā)夾的發(fā)夾限制的標準自由能的近似值提供于表1中（來自圣塔盧西亞（SantaLucia）和?？怂梗℉icks），生物物理學與生物分子結構年評（Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.）,33:414-440,（2004））。發(fā)夾大小發(fā)夾限制的ΔG°3nt3.5kcal/mol4nt3.5kcal/mol5nt3.3kcal/mol6nt4.0kcal/mol7nt4.2kcal/mol8nt4.3kcal/mol9nt4.5kcal/mol10nt4.6kcal/mol12nt5.0kcal/mol14nt5.1kcal/mol16nt5.3kcal/mol18nt5.5kcal/mol20nt5.7kcal/mol25nt6.1kcal/mol30nt6.3kcal/mol具有未提供于表1中的長度（例如，長度n）的發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能可以使用以下方程式估算：ΔGo(環(huán)-n)=ΔGo(環(huán)-x)+2.44RTln(n/x)其中ΔGo(環(huán)-n)是n個核苷酸長度的一個發(fā)夾區(qū)的限制的未知的標準自由能，ΔGo(環(huán)-x)是n個核苷酸長度的一個發(fā)夾區(qū)的限制的已知的標準自由能（例如，如表1所提供），R是理想氣體常數(shù)，并且T是擬使用該引物雙鏈體的溫度。有關發(fā)夾區(qū)限制的標準自由能的計算的另外的信息提供于圣塔盧西亞和?？怂梗ㄍ希┲?，其全文以引用結合于此。在此描述的發(fā)夾引物雙鏈體系統(tǒng)可以是至少兩種定向中的一種。舉例來說，在圖2A中所示的一種定向中，立足點區(qū)位于核酸分子的5’端處。補體分支移位區(qū)的5’端緊鄰該立足點區(qū)的3’端；補體平衡區(qū)的5’端緊鄰該補體分支移位區(qū)的3’端；發(fā)夾區(qū)的5’端緊鄰該補體平衡區(qū)的3’端；保護子平衡區(qū)的5’端緊鄰該發(fā)夾區(qū)的3’端；并且保護子分支移位區(qū)的5’端緊鄰該保護子平衡區(qū)的3’端。在這一定向中，當核酸分子經(jīng)歷容許退火的條件時，該發(fā)夾區(qū)形成一個環(huán)，該環(huán)從該補體平衡區(qū)和該保護子平衡區(qū)延伸。在圖2B中所示的另一種定向中，該立足點區(qū)位于核酸分子的3’端處。補體分支移位區(qū)的3’端緊鄰該立足點區(qū)的5’端；補體平衡區(qū)的3’端緊鄰該補體分支移位區(qū)的5’端；發(fā)夾區(qū)的3’端緊鄰該補體平衡區(qū)的5’端；保護子平衡區(qū)的3’端緊鄰該發(fā)夾區(qū)的5’端；并且保護子分支移位區(qū)的3’端緊鄰該保護子平衡區(qū)的5’端。不管定向如何，該發(fā)夾引物雙鏈體系統(tǒng)的補體平衡區(qū)具有這樣一種序列，該序列使得：其中：是該保護子平衡區(qū)與該補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該保護子平衡區(qū)與在第一方向上緊鄰該標靶核酸序列的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；并且是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；是該發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能；R是理想氣體常數(shù)；T是擬使用該引物系統(tǒng)的溫度；c是擬使用該引物系統(tǒng)的濃度；并且是3.5kcal/mol。其他引物系統(tǒng)另外的引物系統(tǒng)描繪于圖4-7中。這些引物系統(tǒng)各自包括一個補體結構域和兩個保護子結構域。該補體結構域具有一個單個立足點區(qū)，該區(qū)域側接兩個補體分支移位區(qū)和兩個補體平衡區(qū)。這些保護子結構域各自包括一個保護子分支移位區(qū)，它具有與一個補體分支移位區(qū)的序列互補的一個序列；和一個保護子平衡區(qū)，它具有與一個補體平衡區(qū)的序列互補的一個序列。圖4-7的引物系統(tǒng)之間的差異在于發(fā)夾區(qū)的數(shù)量和位置，而這又影響了補體平衡區(qū)的設計。與在此披露的其他引物系統(tǒng)相同，這些引物系統(tǒng)被設計成與一種標靶核酸特異性雜交。盡管使用了該標靶核酸的序列來描述引物系統(tǒng)的特征，但在一些實施例中，該標靶核酸并非引物系統(tǒng)的一種組分。如圖4中所描繪，一個引物系統(tǒng)可以具有（按3′到5′的順序）一個第一保護子結構域、一個第一發(fā)夾區(qū)、一個補體結構域、一個第二發(fā)夾區(qū)及一個第二保護子結構域。在這些實施例中，該第一保護子結構域包括一個第一保護子分支移位區(qū)和一個第一保護子平衡區(qū)。該第一保護子分支移位區(qū)具有對應于一個第一標靶核酸序列的一個序列。該第一保護子平衡區(qū)緊鄰該第一保護子分支移位區(qū)的5′，并且具有不對應于緊鄰該標靶核酸序列上該第一標靶序列的5′的序列（如果有的話）的一個序列。在這一實施例中，該第一發(fā)夾區(qū)緊鄰該第一保護子平衡區(qū)的5′。這些標靶核酸的補體結構域包含一個第一補體平衡區(qū)、一個第一補體分支移位區(qū)、一個立足點區(qū)、一個第二補體分支移位區(qū)及一個第二補體平衡區(qū)。該第一補體平衡區(qū)緊鄰該第一發(fā)夾區(qū)的5′，并且具有與該第一保護子平衡區(qū)的序列互補的一個序列。該第一補體分支移位區(qū)緊鄰該第一補體平衡區(qū)的5′，并且具有與一個第一保護子分支移位區(qū)互補的一個序列。該立足點區(qū)緊鄰該第一補體分支移位區(qū)的5′，并且具有與一個第二標靶核酸序列互補的一個序列，該第二標靶核酸序列緊鄰該標靶核酸上該第一標靶核酸序列的3′。該第二補體分支移位區(qū)緊鄰該立足點區(qū)的5′，并且具有與一個第三標靶核酸序列互補的一個序列，該第三標靶核酸序列緊鄰該標靶核酸上該第二標靶核酸序列的3′。該第二補體平衡區(qū)緊鄰該第二補體分支移位區(qū)的5′，并且具有不與緊鄰該標靶核酸序列上該第三標靶序列的3′的序列（如果有的話）互補的一個序列。在這些實施例中，該第二發(fā)夾區(qū)緊鄰該第二補體平衡區(qū)的5′。在這一實施例中，該第二保護子結構域包括一個第二保護子平衡區(qū)和一個第二保護子分支移位區(qū)。該第二保護子平衡區(qū)緊鄰該第二發(fā)夾區(qū)的5′，并且具有與該第二補體平衡區(qū)互補的一個序列。該第二保護子分支移位區(qū)緊鄰該第二保護子平衡區(qū)的5′，并且具有與該第二補體分支移位區(qū)互補的一個序列。根據(jù)這一實施例，該第一補體平衡區(qū)和該第二補體平衡區(qū)具有這樣的序列，這些序列使得：其中：是該第一保護子平衡區(qū)與該第一補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第一補體平衡區(qū)與緊鄰該第一標靶核酸序列的5’的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該第二保護子平衡區(qū)與該第二補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第二補體平衡區(qū)與緊鄰該第三標靶核酸序列的3’的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；是該第一發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能；是該第二發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能；R是理想氣體常數(shù)；T是擬使用該引物系統(tǒng)的溫度；并且c是擬使用該引物系統(tǒng)的濃度；并且是3.5kcal/mol。如圖5中所描繪，在某些實施例中，一種引物系統(tǒng)可以具有一種發(fā)夾引物和一種保護子，其中該發(fā)夾引物是一種核酸，該核酸包括一個第一保護子結構域、一個第一發(fā)夾區(qū)、一個補體結構域，并且該保護子是包括一個第二保護子結構域的一種核酸。在這些實施例中，該第一保護子結構域包括一個第一保護子分支移位區(qū)和一個第一保護子平衡區(qū)。該第一保護子分支移位區(qū)具有對應于一個第一標靶核酸序列的一個序列。該第一保護子平衡區(qū)緊鄰該第一保護子分支移位區(qū)的5′，并且具有不對應于緊鄰該標靶核酸序列上該第一標靶序列的5′的序列（如果有的話）的一個序列。在這一實施例中，該發(fā)夾區(qū)緊鄰該第一保護子平衡區(qū)的5′。這些標靶核酸的補體結構域包含一個第一補體平衡區(qū)、一個第一補體分支移位區(qū)、一個立足點區(qū)、一個第二補體分支移位區(qū)及一個第二補體平衡區(qū)。該第一補體平衡區(qū)緊鄰該發(fā)夾區(qū)的5′，并且具有與該第一保護子平衡區(qū)的序列互補的一個序列。該第一補體分支移位區(qū)緊鄰該第一補體平衡區(qū)的5′，并且具有與一個第一保護子分支移位區(qū)互補的一個序列。該立足點區(qū)緊鄰該第一補體分支移位區(qū)的5′，并且具有與一個第二標靶核酸序列互補的一個序列，該第二標靶核酸序列緊鄰該標靶核酸上該第一標靶核酸序列的3′。該第二補體分支移位區(qū)緊鄰該立足點區(qū)的5′，并且具有與一個第三標靶核酸序列互補的一個序列，該第三標靶核酸序列緊鄰該標靶核酸上該第二標靶核酸序列的3′。該第二補體平衡區(qū)緊鄰該第二補體分支移位區(qū)的5′，并且具有不與緊鄰該標靶核酸序列上該第三標靶序列的3′的序列（如果有的話）互補的一個序列。在這一實施例中，該第二保護子結構域包括一個第二保護子平衡區(qū)和一個第二保護子分支移位區(qū)。該第二保護子平衡區(qū)具有與該第二補體平衡區(qū)互補的一個序列。該第二保護子分支移位區(qū)緊鄰該第二保護子平衡區(qū)的5′，并且具有與該第二補體分支移位區(qū)互補的一個序列。根據(jù)這一實施例，該第一補體平衡區(qū)和該第二補體平衡區(qū)具有這樣的序列，這些序列使得：其中：是該第一保護子平衡區(qū)與該第一補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第一補體平衡區(qū)與緊鄰該第一標靶核酸序列的5’的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該第二保護子平衡區(qū)與該第二補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第二補體平衡區(qū)與緊鄰該第三標靶核酸序列的3’的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；是該發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能；并且是3.5kcal/mol。如圖6中所描繪，在某些實施例中，一種引物系統(tǒng)可以具有一種保護子和一種發(fā)夾引物，其中該發(fā)夾引物是包括一個第一保護子結構域的一種核酸，并且該發(fā)夾引物是一種核酸，該核酸包括一個補體結構域、發(fā)夾區(qū)及一個第二保護子結構域。在這些實施例中，該第一保護子結構域包括一個第一保護子分支移位區(qū)和一個第一保護子平衡區(qū)。該第一保護子分支移位區(qū)具有對應于一個第一標靶核酸序列的一個序列。該第一保護子平衡區(qū)緊鄰該第一保護子分支移位區(qū)的5′，并且具有不對應于緊鄰該標靶核酸序列上該第一標靶序列的5′的序列（如果有的話）的一個序列。這些標靶核酸的補體結構域包含一個第一補體平衡區(qū)、一個第一補體分支移位區(qū)、一個立足點區(qū)、一個第二補體分支移位區(qū)及一個第二補體平衡區(qū)。該第一補體平衡區(qū)具有與該第一保護子平衡區(qū)的序列互補的一個序列。該第一補體分支移位區(qū)緊鄰該第一補體平衡區(qū)的5′，并且具有與一個第一保護子分支移位區(qū)互補的一個序列。該立足點區(qū)緊鄰該第一補體分支移位區(qū)的5′，并且具有與一個第二標靶核酸序列互補的一個序列，該第二標靶核酸序列緊鄰該標靶核酸上該第一標靶核酸序列的3′。該第二補體分支移位區(qū)緊鄰該立足點區(qū)的5′，并且具有與一個第三標靶核酸序列互補的一個序列，該第三標靶核酸序列緊鄰該標靶核酸上該第二標靶核酸序列的3′。該第二補體平衡區(qū)緊鄰該第二補體分支移位區(qū)的5′，并且具有不與緊鄰該標靶核酸序列上該第三標靶序列的3′的序列（如果有的話）互補的一個序列。根據(jù)這些實施例，該發(fā)夾區(qū)緊鄰該第二補體平衡區(qū)的5′。在這一實施例中，該第二保護子結構域包括一個第二保護子平衡區(qū)和一個第二保護子分支移位區(qū)。該第二保護子平衡區(qū)緊鄰該發(fā)夾區(qū)的5′，并且具有與該第二補體平衡區(qū)互補的一個序列。該第二保護子分支移位區(qū)緊鄰該第二保護子平衡區(qū)的5′，并且具有與該第二補體分支移位區(qū)互補的一個序列。根據(jù)這一實施例，該第一補體平衡區(qū)和該第二補體平衡區(qū)具有這樣的序列，這些序列使得：其中：是該第一保護子平衡區(qū)與該第一補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第一補體平衡區(qū)與緊鄰該第一標靶核酸序列的5’的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該第二保護子平衡區(qū)與該第二補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第二補體平衡區(qū)與緊鄰該第三標靶核酸序列的3’的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；并且是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；是該發(fā)夾區(qū)的限制的標準自由能；并且是3.5kcal/mol。如圖7中所描繪，在某些實施例中，一種引物系統(tǒng)可以具有一種第一保護子、一種補體引物及一種第二保護子，其中該第一保護子是包括一個第一保護子結構域的一種核酸，該補體引物是包括一個補體結構域的一種核酸，并且該第二保護子是包括一個第二保護子結構域的一種核酸。在這些實施例中，該第一保護子結構域包括一個第一保護子分支移位區(qū)和一個第一保護子平衡區(qū)。該第一保護子分支移位區(qū)具有對應于一個第一標靶核酸序列的一個序列。該第一保護子平衡區(qū)緊鄰該第一保護子分支移位區(qū)的5′，并且具有不對應于緊鄰該標靶核酸序列上該第一標靶序列的5′的序列（如果有的話）的一個序列。這些標靶核酸的補體結構域包含一個第一補體平衡區(qū)、一個第一補體分支移位區(qū)、一個立足點區(qū)、一個第二補體分支移位區(qū)及一個第二補體平衡區(qū)。該第一補體平衡區(qū)具有與該第一保護子平衡區(qū)的序列互補的一個序列。該第一補體分支移位區(qū)緊鄰該第一補體平衡區(qū)的5′，并且具有與一個第一保護子分支移位區(qū)互補的一個序列。該立足點區(qū)緊鄰該第一補體分支移位區(qū)的5′，并且具有與一個第二標靶核酸序列互補的一個序列，該第二標靶核酸序列緊鄰該標靶核酸上該第一標靶核酸序列的3′。該第二補體分支移位區(qū)緊鄰該立足點區(qū)的5′，并且具有與一個第三標靶核酸序列互補的一個序列，該第三標靶核酸序列緊鄰該標靶核酸上該第二標靶核酸序列的3′。該第二補體平衡區(qū)緊鄰該第二補體分支移位區(qū)的5′，并且具有不與緊鄰該標靶核酸序列上該第三標靶序列的3′的序列（如果有的話）互補的一個序列。在這一實施例中，該第二保護子結構域包括一個第二保護子平衡區(qū)和一個第二保護子分支移位區(qū)。該第二保護子平衡區(qū)具有與該第二補體平衡區(qū)互補的一個序列。該第二保護子分支移位區(qū)緊鄰該第二保護子平衡區(qū)的5′，并且具有與該第二補體分支移位區(qū)互補的一個序列。根據(jù)這一實施例，該第一補體平衡區(qū)和該第二補體平衡區(qū)具有這樣的序列，這些序列使得：其中：是該第一保護子平衡區(qū)與該第一補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第一補體平衡區(qū)與緊鄰該第一標靶核酸序列的5’的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；是該第二保護子平衡區(qū)與該第二補體平衡區(qū)的雜交的標準自由能；是該第二補體平衡區(qū)與緊鄰該第三標靶核酸序列的3’的序列（如果有的話）的雜交的標準自由能；并且是該立足點區(qū)與該第二標靶核酸序列的雜交的標準自由能；R是理想氣體常數(shù)；T是擬使用該引物系統(tǒng)的溫度；c是擬使用該引物系統(tǒng)的濃度；并且是3.5kcal/mol。缺少平衡結構域的引物雙鏈體系統(tǒng)在一些實施例中，引物系統(tǒng)可以缺少平衡結構域。這些核酸在標靶核酸具有與該引物系統(tǒng)的立足點區(qū)的序列互補的一個序列時將以較快的動力學、但在該標靶核酸突變使得它不含與該引物系統(tǒng)的立足點區(qū)互補的一個序列時以較慢的動力學與該標靶核酸雜交。因此，這些引物系統(tǒng)可用于例如使用動力學差別對核酸標靶中的差異和/或突變進行定位。如圖8中所描繪，在某些實施例中，一種引物系統(tǒng)可以包括一種核酸，該核酸具有（按3′到5′的順序）一個第一保護子結構域、一個第一發(fā)夾區(qū)、一個補體結構域、一個第二發(fā)夾區(qū)以及一個第二保護子結構域。這些引物系統(tǒng)的第一保護子結構域具有對應于一個第一標靶核酸序列的一個序列。該第一發(fā)夾區(qū)緊鄰該第一保護子結構域的5′。該補體結構域具有一個第一補體分支移位區(qū)、一個立足點區(qū)及一個第二補體分支移位區(qū)。該第一補體平衡區(qū)緊鄰該第一發(fā)夾區(qū)的5′，并且具有與該第一保護子結構域的分支移位序列互補的一個序列。該立足點區(qū)緊鄰該第一補體分支移位區(qū)的5′，并且具有與一個第二標靶核酸序列互補的一個序列，該第二標靶核酸序列緊鄰該標靶核酸分子上該第一標靶核酸序列的3′。該第二補體分支移位區(qū)緊鄰該立足點區(qū)的5′，并且具有與一個第三標靶核酸序列互補的一個序列，該第三標靶核酸序列緊鄰該第二標靶核酸序列的3′。該第二發(fā)夾區(qū)緊鄰該第二補體分支移位區(qū)的5′。該第二保護子結構域具有與該第二補體分支移位區(qū)的序列互補的一個序列?？傮w的引物修飾在此描述的每一引物都可以包含DNA、RNA或其類似物，和/或其組合。在某些實施例中，一種引物包含一個或多個非天然核苷酸。這些引物中非天然核苷酸的并入可以進一步增大引物雙鏈體的性能。具體地說，保護子鏈盡管不打算用來起始轉錄，但可以恰巧與標靶的其他區(qū)域或者其他背景分子互補，并且可以假性地起始復制/轉錄。為了防止這一情況，在第二保護子鏈的3′端處使用一個非天然核苷酸或一個雙脫氧核苷酸可以用來防止由該鏈引起的不期望的引發(fā)。非天然核苷酸的實例包括但不限于，異-C、異-G、脫氧尿苷（也參看克魯格（Krueger）等人，化學與生物學（ChemBiol.）16:242-48（2009），其中有關非天然核苷酸的傳授內(nèi)容以引用結合于此）。在一些實施例中，例如，在使用了反復引發(fā)的酶促功能的聚合酶鏈反應（PCR）中，延伸的補體鏈可以變?yōu)殡S后的引物雜交的標靶。為了對于隨后數(shù)輪擴增保持引物雜交的特異性，引物的平衡區(qū)不可以被復制。在補體鏈的分支移位區(qū)與平衡區(qū)之間的界面處引入一個非天然核苷酸例如可以防止該平衡區(qū)被復制。在某些實施例中，在此描述的引物用作聚合酶延伸的起點。為了便于對擴增的（核酸）片段進行分析，也可以在PCR反應中使用標記過的引物。標記過的引物是聯(lián)接（或結合）到一個可檢測部分的那些。實例包括熒光染料、放射性標記以及可鑒別的金屬、核酸序列及蛋白質。當用經(jīng)熒光標記的引物進行反應時，可以產(chǎn)生帶有一個熒光標記的擴增子（核酸產(chǎn)物）。在此描述的引物可以通過本領域中已知的任何方法合成（參看例如，奧格威（Ogilvie）等人，美國化學協(xié)會雜志（J.Amer.Chem.Soc.）99(23):7741–7743；瑞茲C.B.（Reese,C.B.）四面體（Tetrahedron）34(21):3143（1978）；艾弗莫夫（Efimov）等人，核酸研究（NucleicAcidsRes.）11(23):8369–8387（1983）；蓋雷格（Garegg）等人，四面體通訊（TetrahedronLett.）27(34):4051（1986）；比尤凱格（Beaucage）等人，四面體，48(12):2223（1992）；艾弗莫夫等人，核苷、核苷酸以及核酸（Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids）26(8–9):1087–93（2007），以引用結合于此）。標靶核酸分子“標靶”可以是一種單鏈（ss）或雙鏈（ss）核酸。標靶核酸可以為例如DNA、RNA或者經(jīng)歷反轉錄的RNA的DNA產(chǎn)物。在一些實施例中，標靶可以為DNA與RNA的混合物（嵌合體）。在其他實施例中，標靶包含人工核酸類似物，例如肽核酸（尼爾森（Nielsen）等人，科學（Science）254(5037):1497-500（1991））或鎖核酸（阿列克塞（Alexei）等人，四面體54(14):3607-30（1998））。在一些實施例中，標靶可以是天然存在的（例如基因組DNA）或者它可以為合成的（例如來自基因組庫）。如在此所使用，“天然存在的”核酸序列是在無人類干預的情況下存在于自然界中的生物體或病毒的核酸分子中所存在的一種序列。在一些實施例中，標靶是基因組DNA、信使RNA、核糖體RNA、微RNA、前體微RNA、原微RNA、病毒DNA、病毒RNA或piwi-RNA。在某些實施例中，標靶核酸是在一種生物體或病毒中天然存在的一種核酸。在一些實施例中，標靶核酸是一種致病性生物體或病毒的核酸。在某些實施例中，一個受試者體內(nèi)標靶核酸的存在或不存在是該受試者患有一種疾病或病癥或者易患一種疾病或病癥的指示。在某些實施例中，一個受試者體內(nèi)標靶核酸的存在或不存在是該受試者將對用以治療一種疾病或病癥的治療（如一種藥物）良好或較差地作出反應的指示。術語“聚核苷酸”、“核酸”與“核酸分子”可互換地使用。它們是指任何長度的核苷酸（脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物）的一種聚合形式。聚核苷酸可以具有任何三維結構，并且可以執(zhí)行任何功能。以下為聚核苷酸的非限制性實例：一個基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)、由連鎖分析界定的基因座（loci/locus）、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA（mRNA）、轉運RNA、核糖體RNA、核糖酶、cDNA、重組聚核苷酸、分支的聚核苷酸、質粒、載體、分離的具有任何序列的DNA、分離的具有任何序列的RNA、核酸探針以及引物。聚核苷酸可以包含經(jīng)過修飾的核苷酸（如甲基化核苷酸）和核苷酸類似物。如果存在的話，可以在該聚合物組裝之前或之后對核苷酸結構進行修飾。聚核苷酸可以進一步如通過與一個標記性組分結合來進行修飾。術語“重組”聚核苷酸意思是指基因組、cDNA、半合成或合成來源的一種聚核苷酸，它不出現(xiàn)在自然界中或以一種非天然的安排與另一種聚核苷酸連接。術語“分離的核酸”是指天然或合成來源的一種聚核苷酸，或其某種組合，該聚核苷酸(1)不與在自然界中發(fā)現(xiàn)該“分離的核酸”的細胞關聯(lián)，和/或(2)可操作地連接到它在自然界中所不連接的一種聚核苷酸。核酸還可以涵蓋單鏈或雙鏈DNA和RNA，以及含有經(jīng)過修飾的堿基、糖以及主鏈的替代性核酸的任何和所有形式。因此，術語“核酸”將被理解為包括但不限于，單鏈或雙鏈DNA或RNA（以及其可以呈部分單鏈或部分雙鏈的形式）、cDNA、適體、肽核酸（“PNA”）、2'-5'DNA（具有一個縮短的主鏈的一種合成物質，它具有一個匹配DNA的A構象的堿基間距；2'-5'DNA正常地將不與呈B形式的DNA雜交，但它將易于與RNA雜交）及鎖核酸（“LNA”）。核酸類似物包括天然核苷酸的已知類似物，這些類似物具有類似或改良的具有堿基配對特性的結合、雜交。嘌呤和嘧啶的“類似”形式在本領域中是眾所周知的，并且包括但不限于氮丙啶基胞嘧啶、4-乙?；奏?、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷（queosine）、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸及2,6-二氨基嘌呤。在此提供的DNA主鏈類似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3'-硫縮醛、亞甲基(甲基亞氨基)、3'-N-氨基甲酸酯、嗎啉基氨基甲酸酯，以及肽核酸（PNA）、甲基膦酸酯鍵或交替的甲基膦酸酯與磷酸二酯鍵（斯特奧斯-索卡普（Strauss-Soukup），1997，生物化學（Biochemistry）36:8692-8698），以及苯甲基膦酸酯鍵，如美國專利號6,664,057中所論述的；還參看，寡核苷酸與類似物、實踐方法（OLIGONUCLEOTIDESANDANALOGUES,APRACTICALAPPROACH），F(xiàn).艾克斯坦（F.Eckstein）編輯，牛津大學出版社的IRL出版社（IRLPressatOxfordUniversityPress）（1991）；反義策略（AntisenseStrategies），紐約科學院年報（AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences），第600卷，貝賽加（Baserga）和登哈特（Denhardt）編輯（NYAS1992）；米利根（Milligan），1993，藥物化學雜志（J.Med.Chem.）36:1923-1937；反義研究與應用（AntisenseResearchandApplications）（1993，CRC出版社）。在此的這些核酸可以從細胞中提取，或根據(jù)本領域的技術人員已知的任何手段以合成方式制備；舉例來說，這些核酸可以按化學方式合成，或由cDNA或mRNA轉錄或反轉錄，以及其他來源。如在此所使用，如果兩個核酸或核酸區(qū)都與同一核酸序列互補，那么它們彼此“對應”。如果兩個核酸或核酸區(qū)彼此堿基配對，形成一個雙鏈核酸分子，那么它們彼此“互補”。在此利用的標靶核酸可以是任何核酸，例如人類核酸、細菌核酸或病毒核酸。標靶核酸樣品可以為例如來自一種或多種細胞、組織或體液的一種核酸樣品。標靶樣品可以源自于任何來源，包括但不限于，真核細胞、植物、動物、脊椎動物、魚、哺乳動物、人類、非人類、細菌、微生物、病毒、生物來源、血清、血漿、血液、尿液、精液、淋巴液、腦脊髓液、羊水、活組織檢查、針吸活組織檢查、癌癥、腫瘤、組織、細胞、細胞溶解產(chǎn)物、粗細胞溶解產(chǎn)物、組織溶解產(chǎn)物、組織培養(yǎng)細胞、口腔拭子、漱口水、糞便、干化組織、法醫(yī)來源、尸體剖檢、考古來源、感染、醫(yī)院感染、生產(chǎn)來源、藥物制劑、生物分子生產(chǎn)、蛋白質制劑、脂質制劑、碳水化合物制劑、無生物、空氣、土壤、樹液、金屬、化石、挖掘物和/或其他地球或地球外的物質和來源。該樣品還可以含有來自一種來源或多種不同來源的物質的混合物。舉例來說，當使用所披露的方法來擴增來自這些受感染的細胞或組織的核酸時，感染性細菌或病毒的核酸可以與人類核酸一起擴增。有用的標靶樣品的類型包括真核樣品、植物樣品、動物樣品、脊椎動物樣品、魚樣品、哺乳動物樣品、人類樣品、非人類樣品、細菌樣品、微生物樣品、病毒樣品、生物樣品、血清樣品、血漿樣品、血液樣品、尿液樣品、精液樣品、淋巴液樣品、腦脊髓液樣品、羊水樣品、活組織檢查樣品、針吸活組織檢查樣品、癌癥樣品、腫瘤樣品、組織樣品、細胞樣品、細胞溶解產(chǎn)物樣品、粗細胞溶解產(chǎn)物樣品、組織溶解產(chǎn)物樣品、組織培養(yǎng)細胞樣品、口腔拭子樣品、漱口水樣品、糞便樣品、干化組織樣品、尸體剖檢樣品、考古樣品、感染樣品、醫(yī)院感染樣品、生產(chǎn)樣品、藥物制劑樣品、生物分子生產(chǎn)樣品、蛋白質制劑樣品、脂質制劑樣品、碳水化合物制劑樣品、無生物樣品、空氣樣品、土壤樣品、樹液樣品、金屬樣品、化石樣品、挖掘物樣品和/或其他地球或地球外的樣品。在一些實施例中，在此利用的標靶核酸包含重復序列、二級結構和/或高G/C含量。在某些實施例中，感興趣的標靶核酸分子為約100到約1,000,000個核苷酸（nt）的長度。在一些實施例中，該標靶為約100到約1000、約1000到約10,000、約10,000到約100,000，或約100,000到約1,000,000個核苷酸的長度。在一些實施例中，該標靶為約100、約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1,000、約2,000、約3,000、約4,000、約5,000、約6,000、約7,000、約8,000、約9000、約10,000、約20,000、約30,000、約40,000、約50,000、約60,000、約70,000、約80,000、約90,000、約100,000、約200,000、約300,000、約400,000、約500,000、約600,000、約700,000、約800,000、約900,000或約1,000,000個核苷酸的長度。應了解的是，該標靶核酸可以提供于一個更長的核酸的環(huán)境中（例如，如在一個染色體或一個染色體片段內(nèi)的一個編碼序列或基因）。在某些實施例中，感興趣的標靶是線性的，而在其他實施例中，標靶是環(huán)狀的（例如質粒DNA、線粒體DNA或質體DNA）。組合的引物-標靶系統(tǒng)在一些實施例中，在此提供了引物-標靶系統(tǒng)。一種引物-標靶系統(tǒng)包含一種或多種核酸標靶、一種聚合酶及一種或多種引物（例如引物雙鏈體和/或發(fā)夾引物雙鏈體）。術語“引物”涵蓋在此描述的引物或引物系統(tǒng)中的任一種（例如，單鏈引物、雙鏈引物雙鏈體以及發(fā)夾引物雙鏈體）。在某些實施例中，在此描述的引物-標靶系統(tǒng)包含多種不同的引物。在一些實施例中，一種引物-標靶系統(tǒng)可以包含至少兩種引物，這些引物可以用于鑒別并且例如擴增標靶核酸分子。標靶核酸分子可以例如作為單拷貝或以低拷貝數(shù)存在于多種非標靶核酸分子之中。在此描述的任一個引物-標靶系統(tǒng)都可以包含與核酸擴增或測序反應中所用的那些類似的條件（例如，類似的試劑、反應溫度等）。使用方法在此描述的引物系統(tǒng)能夠通過一種熱力學機制或通過一種動力學機制辨別特定標靶與假標靶。在使用一種熱力學機制（描述于下）對標靶與假標靶進行區(qū)別時，將鏈置換反應進行到完成并且基于平衡結合親和力的差異對該標靶與假標靶進行區(qū)別。為了使用一種動力學機制（描述于下）對標靶與假標靶進行區(qū)別，在達到平衡之前停止鏈置換反應，并且使用反應完成的速率差異來對這些標靶與假標靶進行區(qū)別。熱力學分離熱力學與動力學機制兩者的總體策略是使用立足點交換鏈置換反應。總體說來，立足點交換涉及用一個不與標靶互補的另外的區(qū)域對標靶的補體進行延伸，并且使一個保護子鏈與這個延伸的補體鏈以及鄰近該延伸的區(qū)域的大量堿基進行預雜交，但不與單鏈立足點區(qū)進行預雜交。圖9描繪了立足點交換的一個實施方案。在這一實施方案中，使用了一種兩條鏈的引物雙鏈體系統(tǒng)（如以上所描述并且描繪于圖1A中）來對標靶核酸與假標靶進行區(qū)別。該補體鏈的補體分支移位區(qū)和立足點區(qū)具有對應地對應于一個第一標靶序列和一個第二標靶序列的序列。補體平衡區(qū)被設計成與該立足點區(qū)呈相同的長度和核苷酸堿基分布。以此方式，圖9A中所示的在正確的標靶與受保護的補體之間的鏈置換反應的標準自由能大約為ΔG°=0kcal/mol。該鏈置換反應可以寫為：標靶+補體/保護子標靶/補體+保護子ΔG°通過以下關系式而與平衡常數(shù)Keq有關：ΔG°=RTln（Keq）。對于ΔG°=0的反應來說，平衡常數(shù)（Keq）為1。該平衡常數(shù)也與該平衡有關；對于這一反應來說，Keq=[TC][P]/[T][PC]=1。對于[PC]和[P]超過[T]的檢驗來說，[TC]/[T]=1，意味著所有標靶分子中有正好一半在平衡時雜交。在圖9A中所示的實例中，ΔG°=+0.1kcal/mol，對應于Keq=0.85，這意味著46%的標靶分子在平衡時雜交。該保護子鏈相應地改變了用假標靶進行的鏈置換反應的標準自由能。在圖9B中所示的實例中，該假標靶與正確的標靶有單個堿基不同，這使得用同一個兩條鏈的核酸引物系統(tǒng)進行的鏈置換反應的ΔG°為+3.7kcal/mol，此對應于Keq=1.9*10-3。平衡時，只有0.19%的假標靶將與補體雜交。因此，圖8中描繪的示例性核酸引物系統(tǒng)優(yōu)先地結合于其標靶，對比只具有單個核苷酸錯配的假標靶超過200倍。圖10是平衡結合親和力作為該反應的標準自由能的函數(shù)的曲線。當該反應的標準自由能的負值極?。ㄈ缭诩冸s交反應的情況下），標靶和假標靶都非常強地結合，并且很難對這兩者進行區(qū)別，從而導致假陽性。另一方面，當該反應的標準自由能的正值很大時，該引物與該標靶非常弱地結合，從而導致假陰性。將一種引物雙鏈體系統(tǒng)設計成具有接近零的標準自由能使得對標靶與假標靶進行最佳的辨別，藉此使假陽性和假陰性最少。動力學分離動力學分離依賴于立足點交換的動力學差異。立足點交換反應的動力學取決于這些立足點區(qū)的結合強度。立足點結合能的每一kcal/mol差異會影響動力學達5.4倍（圖11），因此圖9B中所示的+3.6kcal/mol的錯配將產(chǎn)生434的動力學減速。與熱力學辨別中不同，動力學辨別只在錯配處于該立足點區(qū)中時才發(fā)生。在與補體分支移位區(qū)互補的位置處與正確的標靶不同的假標靶不太可能產(chǎn)生顯著不同的反應動力學。因此，使用動力學機制來對標靶與假標靶進行區(qū)別的方法可作為精確定位標靶/引物錯配的位置的一種手段與熱力學分離一起使用。值得注意的是，缺少補體平衡區(qū)的引物雙鏈體系統(tǒng)，如圖8中所描繪的引物系統(tǒng)，可以用于采用動力學機制來精確定位標靶/引物錯配的位置的方法中。微陣列核酸微陣列通常被用于高通量核酸檢測，但通常不能對密切相關的核酸序列進行區(qū)別。在一些實施例中，在此描述的引物雙鏈體系統(tǒng)可以用于核酸微陣列中，以便例如改良微陣列分析的特異性。在一些情況下，微陣列檢驗可以使用本領域中眾所周知的方法進行，其中例外為，可以使用在此描述的引物雙鏈體系統(tǒng)代替常規(guī)的核酸引物。舉例來說，如圖12A中所描繪，在某些實施例中，發(fā)夾引物雙鏈體系統(tǒng)可以使用標準技術直接合成或固定在微陣列芯片上。在其他實施例中，一種兩條鏈的引物雙鏈體系統(tǒng)可以于核酸微陣列中使用。在一些實施例中，在預定的位置處包括兩個可光裂解的堿基的發(fā)夾結構可以如圖12A中一般合成。隨后曝光使該發(fā)夾裂解，產(chǎn)生官能化到陣列表面的兩條鏈的復合物（圖12B）。也可以使用其他方法，如使用切刻或限制酶，來制備兩條鏈的復合物。核酸合成反應，包括擴增反應在一些實施例中，可以使用在此披露的引物雙鏈體和系統(tǒng)，通過用在此描述的引物雙鏈體系統(tǒng)取代在本領域中已知的基于引物的擴增反應中的核酸引物來改良基于引物的擴增反應（包括聚合酶鏈反應（PCR）、鏈置換擴增或轉錄介導的擴增）的特異性。舉例來說，如圖13中所描繪，通過使用圖4中所描繪的類型的發(fā)夾引物雙鏈體系統(tǒng)作為PCR引物，有可能改良PCR的特異性用于多種（例如生物技術）應用。在此實例中，標靶核酸序列是通過以下方式擴增：形成一種溶液，該溶液包含具有該標靶核酸的一種引物雙鏈體系統(tǒng)和用于進行擴增反應的多種標準試劑；并且在使得擴增反應發(fā)生的條件下孵育該溶液。在某些實施例中，將非天然堿基并入發(fā)夾引物雙鏈體引物系統(tǒng)中，以便防止該發(fā)夾本身復制。在一些實施例中，在此描述的引物雙鏈體可以適用于擴增標靶核酸，這些標靶核酸典型地需要通過以下PCR方法中的任一種或多種進行擴增：等位基因特異性PCR、組裝PCR、不對稱PCR、解螺旋酶依賴性擴增、中間序列特異性PCR（ISSR）、反向PCR、連接介導的PCR、甲基化特異性PCR（MSP）、微小引物PCR、多重PCR、嵌套式PCR、重疊延伸PCR、定量PCR（Q-PCR）、反轉錄PCR（RT-PCR）、固相PCR、熱不對稱交錯PCR（TAIL-PCR）或降落PCR。在一些情況下，在此描述的引物雙鏈體和方法可以用于或適用于任一前述的PCR方法中，或者可以取代（用于替代）任一前述的PCR方法。有關前述每一PCR方法的簡短說明提供于下。等位基因特異性PCR是一種基于單核苷酸多態(tài)性（SNP）（DNA中的單個堿基差異）的診斷或克隆技術。它典型地需要預先知曉DNA序列，包括等位基因之間的差異。組裝PCR或聚合酶循環(huán)組裝（PCA）是通過對具有較短重疊區(qū)段的一個長寡核苷酸池進行PCR的一種人工合成長DNA序列的方法。這些寡核苷酸在有義與反義方向之間交替，并且這些重疊區(qū)段決定了PCR片段的順序，藉此選擇性地產(chǎn)生最終的長DNA產(chǎn)物（斯特姆（Stemmer）等人，基因（Gene）164(1):49-53（1995））。不對稱PCR優(yōu)先地擴增雙鏈DNA標靶中的一條DNA鏈。它可以用于測序和雜交探測中，其中兩條互補鏈中只有一條需要擴增（伊尼斯（Innis）等人，美國國家科學院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）85(24):9436-40（1988））。解螺旋酶依賴性擴增類似于傳統(tǒng)的PCR，但典型地使用一個恒定的溫度而非通過變性和退火/延伸循環(huán)來進行循環(huán)。使用DNA解螺旋酶（一種使DNA展開的酶）代替熱變性（文森特（Vincent）等人，歐洲分子生物學會報告（EMBOReports）5(8):795-800（2004））。中間序列特異性PCR（ISSR）是一種用于DNA指紋圖譜分析的PCR方法，該方法對簡單的序列重復之間的區(qū)域進行擴增，產(chǎn)生了擴增的片段長度的一個獨特的指紋圖譜（澤特凱維茲（Zietkiewicz）等人，基因組學（Genomics）20(2):176–83（1994））。反向PCR常被用于鑒別基因組插入片段周圍的側接序列。它涉及了一系列的DNA消化和自連接，從而在未知序列的任一端產(chǎn)生已知的序列（奧科曼（Ochman）等人，遺傳學（Genetics）120(3):621–623（1988））。連接介導的PCR使用連接到感興趣的DNA的小DNA連接子以及退火到這些DNA連接子的多種引物；它已被用于DNA測序、基因組步移及DNA足跡法（穆勒（Mueller）等人，科學（Science）246(4931):780–786（1988））。甲基化特異性PCR（MSP）被用于檢測基因組DNA中CpG島的甲基化。DNA首先用亞硫酸氫鈉處理，該亞硫酸氫鈉將未甲基化的胞嘧啶堿基轉變成尿嘧啶，尿嘧啶被引物識別為胸腺嘧啶。微小引物PCR使用了一種熱穩(wěn)定性聚合酶（S-Tbr），并且被用于擴增保守的DNA序列，如16S（或真核18S）rRNA基因（艾森伯格（Isenbarger）等人，應用與環(huán)境微生物學（AppliedandEnvironmentalMicrobiology）74(3):840–9.（2008））。多重PCR一次性靶向多個基因，從單一測試運行得到另外的信息，否則將需要若干倍的試劑和更多的時間來進行。嵌套式PCR通過降低因DNA的非特異性擴增引起的背景來增加DNA擴增的特異性。在兩個連續(xù)的PCR中使用兩組引物。在第一個反應中，使用一個引物對來產(chǎn)生DNA產(chǎn)物，除期望的標靶外，這些產(chǎn)物可以仍然由非特異性擴增的DNA片段組成。然后，將這一種或多種產(chǎn)物用于一個用一組引物進行的第二PCR中，該組引物的結合位點完全或部分地不同于第一個反應中所使用的每一引物并位于所述每一引物的3'。重疊延伸PCR或重疊延伸剪接（SOE）是一種遺傳工程技術，該技術被用于將含有互補序列的兩個或兩個以上DNA片段剪接在一起。它被用于對含有基因、調(diào)控序列或突變的DNA段進行連接；該技術能夠產(chǎn)生特異性并且較長的DNA構建體。定量PCR（Q-PCR）被用于測量一種PCR產(chǎn)物的量（常為實時的）。它定量地測量DNA、cDNA或RNA的起始量。Q-PCR常用于確定一個DNA序列是否存在于一個樣品中以及該樣品中它的拷貝數(shù)。反轉錄PCR（RT-PCR）被用于從RNA擴增DNA。反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNA，然后通過PCR進行擴增。RT-PCR被廣泛用于表達譜分析中，用以測定一個基因的表達或鑒別一種RNA轉錄物的序列，包括轉錄起始和終止位點。如果一個基因的基因組DNA序列是已知的，那么可以使用RT-PCR來定位該基因中外顯子和內(nèi)含子的位置。一個基因的5'端（對應于轉錄起始位點）典型地通過RACE-PCR（cDNA末端快速擴增）來鑒別。固相PCR涵蓋多種含義，包括聚合酶克隆擴增（其中PCR克隆是例如源于凝膠基質中）、橋式PCR（引物共價連接到一個固體支撐物的表面）、常規(guī)的固相PCR（其中在帶有引物的固體支撐物的存在下應用不對稱PCR，該引物的序列匹配一種水性引物）及增強的固相PCR（其中常規(guī)的固相PCR可以通過采用高熔融溫度（Tm）和嵌套式固體支撐物引物并且任選地應用一個熱‘步驟’來促成固體支撐物引發(fā)來進行改良）。熱不對稱交錯PCR（TAIL-PCR）被用于對側接一個已知序列的一個未知序列進行分離。在該已知的序列內(nèi)，TAIL-PCR使用一個退火溫度不同的嵌套的引物對；使用一種簡并引物在該未知序列的另一個方向上進行擴增（劉（Liu）等人，基因組學（Genomics）25(3):674–81.（1995））。降落PCR（逐步減低的PCR）是PCR的一種變型，它旨在通過隨著PCR循環(huán)進程，逐漸地降低退火溫度來減小非特異性背景。在初始循環(huán)時的退火溫度經(jīng)常比所用引物的Tm高幾度（3°C-5°C），而在后續(xù)循環(huán)時，它比該引物Tm低幾度（3°C-5°C）。對于引物結合來說，更高的溫度得到更強的特異性，并且更低的溫度容許從初始循環(huán)期間所形成的特定產(chǎn)物進行更高效的擴增。反應溶液的溫度可以在變性狀態(tài)、退火狀態(tài)以及延伸狀態(tài)之間循序地循環(huán)預定數(shù)目的循環(huán)。實際時間和溫度可以取決于酶、引物以及標靶。對于任何給定的反應，變性狀態(tài)在某些實施例中可以在從約75°C到約100°C的范圍內(nèi)。退火溫度和時間會影響引物結合于一種標靶核酸內(nèi)的一個特定基因座的特異性和效率，并且對于特定PCR反應可能很重要。對于任何給定的反應，退火狀態(tài)在某些實施例中可以在從約20°C到約75°C的范圍內(nèi)。在一些實施例中，該退火狀態(tài)可以在約20°C到約25°C、約25°C到約30°C、約30°C到約35°C，或約35°C到約40°C、約40°C到約45°C、約45°C到約50°C下進行。在某些實施例中，該退火狀態(tài)可以在室溫（例如20°C或25°C）下進行。在一些實施例中，該退火狀態(tài)可以在20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、37°C、38°C、39°C、40°C、41°C、42°C、43°C、44°C、45°C、46°C、47°C、48°C、49°C或50°C的溫度下進行。延伸溫度和時間可以影響等位基因產(chǎn)物的產(chǎn)率并且被理解為是所研究的酶的固有特性。對于一種給定的酶，延伸狀態(tài)在某些實施例中可以在從約60°C到約75°C的范圍內(nèi)。在任何前述實施例中，可以利用任何DNA或RNA聚合酶（催化核苷酸聚合成為一條核酸鏈的酶），包括熱穩(wěn)定性聚合酶和反轉錄酶（RTase）。實例包括嗜熱脂肪桿菌聚合酶I、水生棲熱菌（Taq）聚合酶I、強烈熱球菌（Pfu）、沃斯氏熱球菌（Pwo）、黃棲熱菌（Tfl）、嗜熱棲熱菌（Tth）、海濱棲熱菌（Tli）及海棲熱袍菌（Tma）。這些酶、這些酶的修飾型式以及多種酶的組合可從廠家商購得到，包括羅氏公司（Roche）、英杰公司（Invitrogen）、凱杰公司（Qiagen）、斯特塔杰公司（Stratagene）及應用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems）。代表性酶包括（馬薩諸塞州伊普斯維奇的紐英倫生物技術公司（NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA））、HotMasterTaqTM（艾本德公司（Eppendorf））、Mpx（菲尼酶公司（Finnzymes））、（富酶泰斯公司（Fermentas））、KOD（EMD生物科技公司（EMDBiosciences））、Z-Taq（塔卡拉公司（TAKARA））以及CS3AC/LA（密蘇里州大學城的克倫塔公司（KlenTaq,UniversityCity,MO））。鹽及緩沖液包括本領域的普通技術人員所熟悉的那些，包括對應地包含MgCl2和Tris-HCl及KCl的那些。緩沖液可以包含添加劑，如表面活性劑、二甲亞砜（DMSO）、甘油、牛血清白蛋白（BSA）及聚乙二醇（PEG），以及本領域的普通技術人員所熟悉的其他添加劑。核苷酸一般為三磷酸脫氧核糖核苷，如三磷酸脫氧腺苷（dATP）、三磷酸脫氧胞苷（dCTP）、三磷酸脫氧鳥苷（dGTP）以及三磷酸脫氧胸苷（dTTP），并且也適量添加到反應中用于擴增標靶核酸。在此還提供了多種方法，這些方法包括(1)使一種引物雙鏈體的一個補體鏈與一種標靶核酸雜交，藉此將該補體鏈與其保護子鏈解離，并且(2)在一種聚合酶的存在下，以一種標靶互補的方式使該補體鏈在其3’端延伸。在此還提供了多種方法，這些方法包括在一種標靶核酸、一種聚合酶以及一種或多種在此描述的任一實施例的引物雙鏈體的存在下，進行一種核酸合成反應?！昂怂岷铣煞磻笔侵负铣珊怂岬娜魏畏磻?。實例包括核酸擴增反應，如聚合酶鏈反應（PCR）或其變化型式（在此別處描述）、轉錄反應、反轉錄反應、邊合成邊測序或其他引物延伸反應（也參看，里扎迪（Lizardi）等人，自然-遺傳學（Nat.Genet.）19:225-32（1998），以引用結合）。在一些情況下，提供了一種方法，該方法包括(1)合成一條補體鏈，該鏈具有一個標靶非特異性平衡區(qū)、一個標靶特異性分支移位區(qū)以及一個標靶特異性立足點區(qū)；(2)合成一條保護子鏈，該鏈具有一個與該補體鏈互補的平衡區(qū)和一個與該補體鏈互補的分支移位區(qū)；并且(3)使該補體鏈與該保護子鏈雜交以形成一種引物雙鏈體。在一些情況下，提供了一種方法，該方法包括(1)提供一條補體鏈，該鏈具有一個標靶非特異性平衡區(qū)、一個標靶特異性分支移位區(qū)以及一個標靶特異性立足點區(qū)；(2)提供一條保護子鏈，該鏈具有一個與該補體鏈互補的平衡區(qū)和一個與該補體鏈互補的分支移位區(qū)；并且(3)將該補體鏈與該保護子鏈組合以形成一種引物雙鏈體。在一些情況下，提供了一種方法，該方法包括(1)提供多個核酸分子，這些分子包含一種標靶核酸；(2)提供至少一種引物雙鏈體，該雙鏈體具有(i)一個平衡區(qū)、(ii)一個與該標靶核酸互補的分支移位區(qū)及(iii)一個立足點區(qū)；并且(3)在單個反應中，在適于核酸雜交的條件下，將該多個標靶核酸、至少一種引物雙鏈體以及一種聚合酶組合。在此還提供了對至少一種感興趣的標靶核酸進行擴增的方法，包括(1)提供多個核酸分子，這些分子包含至少一種標靶核酸；(2)提供至少一種引物雙鏈體，該雙鏈體具有(i)一個平衡區(qū)、(ii)一個分支移位區(qū)以及(iii)一個立足點區(qū)；并且(3)在單個反應中，在適于該至少一種標靶核酸擴增的條件下，將該多種標靶核酸分子、至少一種引物雙鏈體及一種聚合酶組合。在某些實施例中，在單個反應中或在多個反應中（例如，在一個或多個多重化PCR擴增反應中）對多種獨特的標靶核酸進行擴增。在一些實施例中，對約10到100、約100到約1000、約1000到約10,000，或約10,000到約100,000種核酸標靶進行擴增。一個反應中不同引物雙鏈體的數(shù)目將取決于希望的標靶的數(shù)目。在一些實施例中，在此提供了對相對于一個標靶核酸分子具有一個或多個核苷酸變化的假核酸分子進行辨別的方法，該方法包括(1)提供多個核酸分子，這些分子包含至少一種標靶核酸；(2)提供至少一種引物雙鏈體，該雙鏈體具有(i)一個平衡區(qū)、(ii)一個分支移位區(qū)以及(iii)一個立足點區(qū)；并且(3)在單個反應中，在適于該至少一個標靶核酸分子擴增的條件下，將該多種標靶核酸分子、至少一種引物雙鏈體及一種聚合酶組合。在此描述的任一方法可以進一步包括在單個反應中提供或組合以下一種或多種試劑：緩沖液（例如KCl、MgCl2、Tris-HCl）、dNTP（例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP，濃度為例如約50到約100μM）、聚合酶（例如，濃度為每50μl反應物約0.5-2.0個單位）和/或水。單個反應中一種引物雙鏈體的每條鏈的濃度取決于例如標靶核酸的濃度而變化。在一些實施例中，可以使用約5到約50pg的質?；虿《緲税校蛘呖梢允褂眉s50ng到約500ng的基因組標靶。在這些情況下，每一引物（第一鏈和第二鏈）的濃度可以為例如約0.05μM到約1μM。在多個特定實施例中，每一引物的濃度為約1nM到約1μM。在此描述的任一實施例中，單個反應可以經(jīng)歷循環(huán)的溫度變化，這樣使得一種dsDNA結構經(jīng)受多輪的變性、隨后的引物退火以及基于聚合酶的延伸，例如，類似于標準PCR所用的那些條件。在一些實施例中，變性步驟的溫度范圍是約90°C到約95°C。在某些實施例中，在循環(huán)之前，需要約1到約5分鐘的初始變性步驟，確切的時間量可以取決于感興趣的核酸標靶的GC含量。在某些實施例中，在一個循環(huán)反應期間，該變性步驟為約15到約30秒。在一些實施例中，退火步驟的溫度范圍是約50°C到約60°C。在一些實施例中，該退火步驟為約20°C到約40°C。在多個特定實施例中，該退火步驟是在室溫（約20°C或約25°C）下。在某些實施例中，在一個循環(huán)反應期間，該退火步驟為約15到約30秒。在一些實施例中，延伸步驟的溫度范圍是約70°C到約75°C。在某些實施例中，在一個循環(huán)反應期間，該延伸步驟為約45到約60秒。一個循環(huán)反應的每一步驟的溫度、時間及循環(huán)數(shù)目可以取決于感興趣的核酸標靶的長度以及所使用的聚合酶。更長的標靶可能需要例如更長的延伸時間。對于一種500個核苷酸的標靶來說，循環(huán)條件的一個實例陳述于表2中。表2在此描述的任一實施例中，單個反應（例如核酸擴增）可以在室溫（例如約20°C到約25°C）下進行。在某些實施例中，單個反應在室溫下進行約1小時。在此描述的任一方法中，提供的一種引物雙鏈體的第二保護子鏈可以超過第一互補鏈或超過退火的引物雙鏈體。舉例來說，在一些實施例中，該第二鏈是以約1×到約10×（例如1×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×）該第一鏈濃度，或約1×到約10×（例如1×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×）該退火的雙鏈體濃度的濃度提供。在一些實施例中，該第一鏈是以約0.05μM到約1μM的濃度提供，而該第二鏈是以約0.10μM到約2μM，或約0.15μM到約3μM、約0.2μM到約4μM或約0.25μM到約5μM的濃度提供。在此描述的任一方法可以包含選自以下各項的方法：等位基因特異性PCR、組裝PCR、不對稱PCR、解螺旋酶依賴性擴增、中間序列特異性PCR（ISSR）、反向PCR、連接介導的PCR、甲基化特異性PCR（MSP）、微小引物PCR、多重PCR、嵌套式PCR、重疊延伸PCR、定量PCR（Q-PCR）、反轉錄PCR（RT-PCR）、固相PCR、熱不對稱交錯PCR（TAIL-PCR）以及降落PCR。在此描述的任一方法中，擴增的核酸標靶的產(chǎn)率可以為約30%到約100%。在一些實施例中，該產(chǎn)率為至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或至少100%。在此描述的任一方法中，擴增的核酸產(chǎn)物可以進行純化。核酸純化方法是本領域的普通技術人員眾所周知的，并且包括酚提取、異硫氰酸胍、醇沉淀、DEAE（離子交換）、尺寸排阻色譜（SEC）、氯化銫、從瓊脂糖提取、二氧化硅以及其他基于柱的純化方法。在此描述的任一方法中，經(jīng)過純化的擴增的核酸標靶可以為約30%到約100%純。在一些實施例中，該純度為至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或至少100%純。成像在此描述的引物雙鏈體及系統(tǒng)還可以用于改良原位成像檢驗的特異性。生物RNA與熒光團標記的引物之間的非特異性相互作用常常是背景噪聲的來源。因此，如圖14中所描繪，使用在此描述的熒光團標記的核酸引物系統(tǒng)代替常規(guī)的引物在一些實施例中極大地改良了現(xiàn)有原位成像技術的性能。值得注意的是，通過用熒光團標記補體鏈或結構域并且用淬滅劑標記保護子鏈或結構域，當該引物雙鏈體系統(tǒng)結合于標靶時，它將只產(chǎn)生一個可檢測信號。單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測單核苷酸多態(tài)性（SNP）的位置和身份的精確檢測對于研究和治療目的是特別受關注的。因此，在此描述的動力學辨別方法可用于便利的鑒別SNP。試劑盒在此提供了多種試劑盒，這些試劑盒包括(1)至少一個補體鏈，該鏈具有一個平衡區(qū)、一個分支移位區(qū)以及一個立足點區(qū)；及(2)至少一個保護子鏈，該鏈具有一個平衡區(qū)及一個分支移位區(qū)。在此提供了多種試劑盒，這些試劑盒包括至少一種引物雙鏈體，該雙鏈體包含(1)至少一個補體鏈或區(qū)，它具有一個平衡區(qū)、一個分支移位區(qū)以及一個立足點區(qū)；及(2)至少一個保護子鏈或區(qū)，它具有一個平衡區(qū)及一個分支移位區(qū)。在此描述的任一試劑盒可以進一步包含一種聚合酶。在此提供的任一試劑盒可以進一步包含一種或多種選自以下各項的試劑：緩沖液（例如KCl、MgCl2、Tris-HCl）、dNTP（例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP）以及水。在此提供的任一試劑盒可以包含保護子鏈，其摩爾量超過引物。在此提供的任一試劑盒可以進一步包含說明書或指導，用于獲得有關使用這些試劑盒的組分的說明（例如來自網(wǎng)站）。在此提供的任一試劑盒可以進一步包括至少一個反應管、孔、腔室等。在此描述的任一引物或引物系統(tǒng)可以呈試劑盒的形式提供或包含在一個試劑盒內(nèi)。實例根據(jù)本發(fā)明，PCR、轉錄以及反轉錄的以上局限性可以通過使用高特異性的引物雙鏈體來克服。在此描述的實驗論證了，引物雙鏈體可以對具有單堿基變化的標靶（對于DNA和RNA標靶）（圖16）及引物（圖17）可靠地進行辨別。正確的標靶以大約50%的產(chǎn)率與7/5的引物雜交，但即使是大量過量（200×）的具有單堿基變化的標靶也不足以顯著地雜交。針對多種不同的標靶對引物雙鏈體進行設計并測試，并且每一引物雙鏈體都相對于單核苷酸變化達到了高辨別因子（圖17）。定量地，與具有單核苷酸變化的假標靶的雜交產(chǎn)率的中值辨別力為26。在原理實證的論證中，使用了這些引物雙鏈體進行PCR（圖18A和18B）。設計出一種半重復的標靶核酸，該核酸很難通過傳統(tǒng)的PCR（不使用本發(fā)明的引物雙鏈體的PCR）進行擴增。對標準的21個核苷酸的引物和這些引物雙鏈體的產(chǎn)率進行計算。確定許多不同的熱循環(huán)規(guī)程以便調(diào)查功能的范圍?；谶@些引物雙鏈體的長度和核苷酸含量，標準的PCR條件將預測出這些引物的退火溫度會為55°C。意外的是，作為一個實例，即使在對引物雙鏈體退火最不利的條件（35°C和40°C）下，使用這些引物雙鏈體擴增的正確長度的產(chǎn)物的分數(shù)（50.2%）也高于在其最有利的PCR條件（45°C）下使用標準引物擴增的正確長度的引物的分數(shù)（31.0%）。此外，在這一特定實驗中，這些引物雙鏈體經(jīng)任意地設計（7個核苷酸立足點區(qū)和5個核苷酸平衡區(qū)），并且沒有針對PCR產(chǎn)率性能進行優(yōu)化。因此，可能的情況是，可以通過本發(fā)明的引物雙鏈體的優(yōu)化來達到甚至更高的PCR特異性。圖15示出了使用在此提供的引物雙鏈體進行的高特異性PCR。在圖5A中，引物“PC”包含一個補體鏈“C”和一個保護子鏈“P”。當PC結合于期望的標靶的正確的位置“X”時，單鏈保護子寡核苷酸“P”作為一種惰性廢產(chǎn)物釋放，并且引發(fā)的標靶通過DNA聚合酶而伸長。在圖5B中，當引物PC結合于非期望的標靶或正確的標靶的不正確的位置（在任一情況下，表示為“Y”）時，從補體鏈“C”中置換保護子在熱力學上是不利的，并且在動力學上迅速發(fā)生逆轉。因此，預期脫靶的擴增（例如，Y而非X的擴增）將顯著地減少。圖16示出了具有單個核苷酸辨別力的引物雜交的實驗論證。在圖16A中，短的合成DNA標靶“X”或假標靶“Y”與引物反應。（在保護子鏈“P”上的聚T尾用來將產(chǎn)物與凝膠上的反應物相區(qū)別。）紅色框示出了假標靶Y的單堿基變化的位置。圖16B示出了天然的聚丙酰胺凝膠的結果。引物“PC”是以2:1的保護子P與補體C的比率制備，并且在1μM濃度的PC下退火。添加正確標靶或假標靶以達到200nM的標靶（X或Y）、100nM的PC以及100nM的P的最終濃度。在一些實施例中，反應可以具有過量的保護子（P）引物。舉例來說，在一些實施例中，該保護子鏈是以約1×到約10×（例如1×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×）補體鏈的濃度提供。所有反應都在室溫（25°C）下進行1小時。作為一個實例，標示“7/4”表示一種引物，該引物擁有7個核苷酸的單鏈核苷酸（呈3’突出物形式）來起始與標靶的雜交，并且保護子自發(fā)地解離，釋放出4個核苷酸。圖16C是由圖16B中所示數(shù)據(jù)推斷的雜交產(chǎn)率的曲線圖。作為曲線“X”示出的是引物與正確的標靶X的雜交，而其余“虛線的”曲線示出了與假標靶Y的雜交。7/4、7/5及7/6引物都在其雜交產(chǎn)率（χ）方面對正確標靶與假標靶進行辨別。7/0的標靶則不然。在圖16D中，辨別因子（Q）是對引物特異性的定量的度量，并且是按正確標靶的雜交產(chǎn)率（χ）除以假標靶的雜交產(chǎn)率（χ）來計算。在16E中，7/5引物與假標靶Y存在極少雜交，即使在這種標靶是以大量過量（即200倍）存在時仍然如此。圖17示出了有關引物雙鏈體的單堿基辨別能力的另外的實驗結果和統(tǒng)計學。圖17A示出了對四種另外的標靶和多組引物進行構建并測試：兩種基于天然存在的微RNA序列，兩種被設計成有意地具有顯著的二級結構。圖17B示出了針對每一標靶由7/5引物所達到的辨別因子（Q）的柱狀圖。由于凝膠掃描儀的局限性，不可能可靠地測量超過100的辨別因子，并且這些都分組為“100+”。圖17C示出了RNA標靶和引物。該標靶序列是其序列與人類let7g微RNA相同的一種合成RNA寡核苷酸。圖17D示出了天然PAGE的結果。PC引物是以2:1的保護子P與補體C的比率制備，并且在3μM的濃度下退火。添加正確標靶或假標靶以達到2μM的X或Y、1μM的PC以及1μM的P的最終濃度。該正確標靶成功地結合于引物；帶有單核苷酸錯配的標靶的雜交產(chǎn)率較低。圖18示出了使用雙鏈體引物改良一種準重復標靶的PCR產(chǎn)率的實驗結果。圖18A示出了一種準重復PCR標靶（168nt），傳統(tǒng)的PCR引物難于以高產(chǎn)率對其進行擴增。此處，a*是針對X1的正確標靶。標為a*m1（它為X1-m17G）、a*m2（它為X1-m9T）以及a*m3（它為X1-m11G）的其余位點都不是正確標靶。類似地，b*是針對X2的正確標靶，并且b*m1（它為X2-m3T）、b*m2（它為X2-m11C）以及b*m3（它為X2-m18T）不是正確標靶。因此，最外面的結合位點是引物的完美結合位點，但在這些完美位點之間還存在3個另外的單堿基錯配引物結合位點。這些引物雙鏈體通過7個核苷酸結合于該標靶，并且保護子必須自發(fā)地解離，釋放出5個核苷酸。該引物雙鏈體被設計成使得其3’端無法通過聚合酶延伸。補體鏈的立足點區(qū)被設計在3’端而非先前設計中的5’端。在圖18B中，如與標準引物相比較，引物雙鏈體顯示出顯著更高的正確長度產(chǎn)物的產(chǎn)率。每一泳道都用所用引物以及溫度循環(huán)規(guī)程進行標記（例如，“98-40-72”指示在98°C下變性、在40°C下退火并在72°C下伸長）。最左邊的泳道示出了合成的寡核苷酸參照物。標為“正確%”的下方數(shù)字指示了對應于正確長度產(chǎn)物的譜帶相較于泳道中所有譜帶的積分強度的相對強度。引物雙鏈體PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)為比參照物和標準PCR產(chǎn)物長10個核苷酸，因為每一引物上有5個核苷酸的突出物（立足點區(qū)）。等效物本領域的普通技術人員只使用常規(guī)實驗就將認識到或能夠確定在此描述的具體實施例的許多等效形式。冠詞“一個（種）”（a/an）在此用于指一個（種）或超過一個（種）（即，至少一個（種））的該冠詞的語法賓語。舉例來說，“一個要素”意思指一個要素或超過一個要素。除非作相反指示或另外從上下文明顯可見，否則如果一組中一個、超過一個或所有組內(nèi)成員存在于、用于或以其他方式相關于一種給定的產(chǎn)物或方法，那么認為在該組的一個或多個成員之間包括“或”的權利要求項或描述得到滿足。本發(fā)明包括該組的正好一個成員存在于、用于或以其他方式相關于一種給定的產(chǎn)物或方法的實施例。本發(fā)明包括該組的超過一個或所有成員存在于、用于或者以其他方式相關于一種給定的產(chǎn)物或方法的實施例。另外，應了解的是，本發(fā)明涵蓋將所列的一個或多個權利要求項中的一個或多個限定、要素、條款、說明性術語等引入另一權利要求項中的所有變化、組合以及變更。舉例來說，可以對附屬于另一權利要求項的任一權利要求項加以修改，以使其包括一個或多個在附屬于同一基礎權利要求項的任何其他權利要求項中所見的限定。在要素是以例如馬庫西組（Markushgroup）格式等清單呈現(xiàn)的情況下，應了解的是，也披露了這些要素的各個亞組，并且可以從該組中去除任何要素。應當了解的是，總體來說，在本發(fā)明或本發(fā)明的多個方面提到包含特定要素、特征的情況下，本發(fā)明的某些實施例或本發(fā)明的多個方面由或主要由這些要素和/或特征組成。為簡單起見，那些實施例未在此以文字具體地陳述。還應注意，術語“包含”意圖為開放式的，并且容許包括另外的要素或步驟。當給定范圍時，包括端點在內(nèi)。另外，應了解的是，除非另作指示，或者另外從上下文以及本領域的普通技術人員的理解明顯可見，否則以范圍表示的值在本發(fā)明的不同實施例中可以采用所規(guī)定的范圍內(nèi)的任何特定值或子范圍，除非上下文中另作清楚地指示，否則精確到該范圍下限單位的十分之一。如在此所使用，術語“約”總體上可以指在所敘述的值加減10%范圍內(nèi)的任何值。然而，在一些情況下，“約”可以涵蓋所敘述的值加減20%的范圍。此外，應了解的是，在現(xiàn)有技術內(nèi)的本發(fā)明的任何特定實施例都可以明確地從任一個或多個權利要求項中排除。由于這些實施例被認為是本領域的普通技術人員已知的，故可以將其排除，即使在此未明確地陳述該排除也如此。本發(fā)明方法的任何特定的實施例都可以出于任何原因從任一個或多個權利要求項中排除，無論是否涉及現(xiàn)有技術的存在。本發(fā)明并未將其應用局限于以下說明中所陳述或附圖中所圖示的組分的構建和安排的細節(jié)。本發(fā)明能夠具有其他實施例并且以不同的方式實踐或進行。此外，在此使用的措辭和術語都是出于說明的目的，并不應當被視為限制。在此使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含”、“涉及”及其變化形式打算涵蓋其后所列的多項和其等效形式，以及其他多項。前述專利、專利申請及參考文獻，特別是在此參考的傳授內(nèi)容各自以引用結合于此。[1]皮特森M.（Petersen,M.）和文格爾J.（Wengel,J.），LNA：治療學和基因組學的通用工具（LNA:aversatiletoolfortherapeuticsandgenomics）.生物技術趨勢（TrendsBiotechnol.）21,74-81,（2003）。[2]克魯格A.T.（Krueger,A.T.）和庫爾E.T.（Kool,E.T.），堿基對結構的重新設計：為了新基因組的生物化學與生物功能（RedesigningtheArchitectureoftheBasePair:TowardBiochemicalandBiologicalFunctionofNewGeneticSets）.化學與生物學（ChemBiol.）16,242-248（2009）。[3]里扎迪P.M.（Lizardi,P.M.）等人，使用等溫滾環(huán)擴增進行的突變檢測和單分子計數(shù)（Mutationdetectionandsingle-moleculecountingusingisothermalrolling-circleamplification）.自然-遺傳學（Nat.Genet.）19,225-232（1998）。[4]佐伯R.K.（Saiki,R.K.），蓋爾福德D.H.（Gelfand,D.H.），斯托菲S.（Stoffel,S.），斯查夫S.J.（Scharf,S.J.），通口R.（Higuchi,R.），霍恩G.T.（Horn,G.T.），穆利斯K.B.（Mullis,K.B.）以及艾里奇H.A.（Erlich,H.A.），用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶進行的DNA的引物引導的酶促擴增（Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase）.科學（Science）239,487-491（1988）。[5]張D.Y.（Zhang,D.Y.），陳X.（Chen,X.）以及尹P.（Yin,P.），優(yōu)化核酸雜交特異性（OptimizingNucleicAcidHybridizationSpecificity）.已提交（2011）。當前第1頁1 2 3