本發(fā)明涉及一種半抗原及其制備方法和應用，具體涉及鏈霉素半抗原及其制備方法和應用。

背景技術：
鏈霉素(Streptomycin，SM)是一種重要的氨基糖苷類抗生素，其作為一種抗生素在治療家畜感染性疾病中發(fā)揮著重要作用，但其耐藥性強，毒副作用較大，若動物性食品中有過量的鏈霉素殘留，則可能對人造成嚴重危害。為了保障動物源性食品的安全，農(nóng)業(yè)部第235號文件《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定鏈霉素在牛奶中為200μg/L，在肌肉、脂肪、肝中為600μg/kg，在腎中為1000μg/kg。目前鏈霉素殘留的檢測主要有儀器檢測方法、微生物學檢測法、免疫學法，如高效液相色譜法、熒光檢測法、薄層色譜法、質(zhì)譜法、杯碟法、紙片法、酶聯(lián)免疫法、光學免疫傳感器等，由于儀器較昂貴，操作繁瑣、費用高、不適合進行大規(guī)?，F(xiàn)場檢測等，ELISA法具有靈敏度高、耗時少、成本低、大規(guī)模檢測等優(yōu)點。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種鏈霉素半抗原及其制備方法。本發(fā)明提供的鏈霉素半抗原分子結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明提供的鏈霉素半抗原的制備方法，包括如下步驟：0.58g鏈霉素與0.07g乙二胺在50ml甲醇中的混合液，在室溫下反應5-10小時，蒸除溶劑，定量得到鏈霉素半抗原。本發(fā)明的另一個目的是上述鏈霉素半抗原在免疫檢測中的應用，具體包括由所述鏈霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的鏈霉素抗原，及由所得鏈霉素抗原免疫動物制備得到的鏈霉素抗體，其中所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清白蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原，所述抗體為鏈霉素單克隆抗體。本發(fā)明還提供由上述鏈霉素抗體制備的酶聯(lián)免疫試劑盒，及其在檢測動物源性食品中鏈霉素殘留的應用。本發(fā)明提供的鏈霉素半抗原既最大程度地保留了鏈霉素的化學結(jié)構(gòu)，又通過化學合成改造引入了可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的-NH，合成方法簡單，純度、產(chǎn)率較高；用該半抗原作為原料，制備適于動物免疫的抗原體系免疫動物，所得抗體的效價、特異性、親和力都比較好；所得的抗體用于酶聯(lián)免疫試劑盒，使用方便、檢測成本低、檢測方法高效、準確、快速、可同時檢測大批量的樣本，適于動物源性食品中鏈霉素殘留的現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。本發(fā)明的鏈霉素半抗原在鏈霉素的檢測中發(fā)揮重要作用。附圖說明圖1：鏈霉素半抗原合成路線圖圖2：鏈霉素半抗原核磁共振氫譜圖圖3：鏈霉素ELISA標準曲線具體實施方式下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1：鏈霉素半抗原的合成和鑒定0.58g鏈霉素與0.07g乙二胺在50ml甲醇中的混合液，在室溫下反應5-10小時，蒸除溶劑，定量得到鏈霉素半抗原。取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測定，如圖2所示，圖譜中1.6，2.3及3.4ppm(mg/L)處新增加的峰為氨乙基片斷的信號峰，7.7ppm左右的峰為烯胺雙鍵上的C-H信號峰，說明半抗原合成成功。實施例2：鏈霉素抗原將鏈霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到鏈霉素抗原。一、免疫原制備——鏈霉素半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物合成取鏈霉素半抗原20mg用2ml水溶解得到溶液I；取3％的戊二醛0.5ml逐滴加入到溶液I中，室溫攪拌反應24h，得到溶液II；取牛血清白蛋白(BSA)50mg用4ml水溶解得溶液III；將溶液II緩慢加入到溶液III中，室溫攪拌反應過夜；加入NaBH430mg還原；用0.02M的PBS透析三天，每天更換透析液三次，得鏈霉素免疫原。二、包被原制備——鏈霉素半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物合成取卵清白蛋白(OVA)50mg用4ml水溶解得到溶液I；取碳化二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)各50mg用2ml水溶解完全后加入溶液I中，室溫攪拌反應30min，得到溶液II；取鏈霉素半抗原25mg用3ml水溶解得到溶液III；將溶液II緩慢加入到溶液III中，室溫攪拌反應24h，得鏈霉素包被原。三、鏈霉素抗原的鑒定將載體蛋白、鏈霉素半抗原、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS調(diào)零，用紫外分光光度計在波長200～800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、鏈霉素半抗原、鏈霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線，并計算其結(jié)合比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明鏈霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。實施例3：鏈霉素單克隆抗體一、鏈霉素單克隆抗體的制備動物免疫：將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150μg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體。細胞融合和克隆化：小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細胞，按8∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復蘇：將鏈霉素的單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成5×107個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的生產(chǎn)與純化：將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射鏈霉素的單克隆雜交瘤細胞株5×105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，-20℃保存。二、單克隆抗體效價的測定用間接競爭ELISA法測定抗體的效價為1∶100000～120000。間接競爭ELISA方法：用鏈霉素半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物包被酶標板，加入鏈霉素標準品溶液和單克隆抗體工作液，37℃反應30min，倒出孔內(nèi)液體，用PBST洗滌液洗滌3～5次，用吸水紙拍干；加入酶標記抗抗體，輕輕振蕩混勻，37℃反應30min，倒出孔內(nèi)液體，用PBST洗滌液洗滌3～5次，用吸水紙拍干；加入底物顯色液，37℃反應15min后，加入終止液終止反應；設定酶標儀于波長450nm處測定每孔吸光度值。三、單克隆抗體的特異性抗體特異性是指它同特異性抗原結(jié)合的能力與同該類抗原類似物結(jié)合能力的比較，常用交叉反應率作為評價標準。交叉反應越小，抗體的特異性則越高。本實驗將鏈霉素、雙氫鏈霉素、硫酸鏈霉素、卡拉霉素、慶大霉素做系列稀釋，分別與單克隆抗體進行間接競爭ELISA，制作標準曲線，分析得到IC50，然后按下式計算交叉反應率：結(jié)果顯示各類似物的交叉反應率為：鏈霉素100％，雙氫鏈霉素105％，硫酸鏈霉素94％、卡拉霉素＜1％、慶大霉素＜1％。本發(fā)明抗體可以同時檢測鏈霉素、雙氫鏈霉素、硫酸鏈霉素。實施例4：由鏈霉素單克隆抗體制備的酶聯(lián)免疫試劑盒一、酶聯(lián)免疫試劑盒的組成(1)包被鏈霉素偶聯(lián)抗原的酶標板；(2)用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體；(3)鏈霉素單克隆抗體工作液；(4)標準溶液：濃度分別為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L；(5)底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化脲，B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液；(6)終止液為2mol/L的硫酸溶液；(7)濃縮洗滌液為含1％吐溫-20的0.1～0.2mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；(8)濃縮復溶液為pH為7.2～7.8，含有5％～8％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。本試劑盒的主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準確度高等特點。二、酶聯(lián)免疫試劑盒檢測實際樣本的應用1.樣本的前處理(1)肌肉前處理方法除去肌肉中的脂肪部分，用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取2g±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8mlPBST緩沖液(稱取5.2g十二水合磷酸氫二鈉、0.88g二水合磷酸二氫鈉、9g氯化鈉和1ml吐溫-20加1升去離子水溶解混勻)用振蕩器振蕩5min，加入正己烷5ml充分上下振蕩混合10min后靜置1h；3000g以上，室溫(20-25℃/68-77°F)離心15min；移取1ml中間層至5ml聚苯乙烯離心管中，加入1ml正己烷，用振蕩器充分振蕩5min，3000g以上，室溫(20-25℃/68-77°F)離心15min；除去上層，取下層清液用復溶工作液(用去離子水將10×濃縮復溶液按1∶9體積比進行稀釋)按1∶9體積比進行稀釋混勻；取50μl用于分析。(2)肝臟前處理方法除去肝臟中的脂肪部分，用均質(zhì)器均質(zhì)肝臟樣本，稱取5.0g±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入20mlPBST緩沖液用振蕩器振蕩30min；3000g以上，室溫(20-25℃/68-77°F)離心10min；移取2ml上層清液至10ml玻璃離心管中，加入3ml正己烷用振蕩器充分振蕩5min；3000g以上，室溫(20-25℃/68-77°F)離心10min；除去上層，取下層清液用復溶工作液按1∶9體積比進行稀釋混勻；取50μl水相進行分析。(3)血清前處理方法用加有肝素鈉(20-30單位/ml血)的離心管采集血清樣本(建議采血注射器也用肝素鈉潤洗)，血清樣本室溫靜置1h，待析出血漿后，3000g以上，15℃離心10min；取制備好的血漿樣本20μl至5ml聚苯乙烯離心管，用復溶工作液按1∶199體積比進行稀釋；取50μl用于分析。(4)牛奶前處理方法取20μl牛奶樣本，加入780μl復溶工作液，混勻；取50μl用于分析。(5)奶粉前處理方法稱取1.0g±0.05g奶粉樣本；加入5ml去離子水，充分振蕩至奶粉全部溶解；取出50μl，加入1950μl復溶工作液，混勻；取50μl用于分析。(6)蜂蜜前處理方法一稱取1.0g±0.05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入10ml提取緩沖液(稱取1.5g十二水合磷酸氫二鈉和1g庚烷-磺酸鈉鹽，加100ml去離子水溶解混勻，加入0.75ml濃磷酸調(diào)pH至2.0)，用振蕩器振蕩10min至蜂蜜全部溶解，3000g以上，室溫(20-25℃/68-77°F)離心10min，直至清亮。用RIDAC18柱(純化提取物)，用2ml甲醇洗柱子，流速為60d/min；用2ml去離子水洗柱子，流速為60d/min；取2ml樣本以流速為15d/min過柱；用3ml去離子水洗柱子，45d/min；用氮氣或空氣吹干柱子；除去柱中水分，用1ml甲醇洗脫樣本，流速為15d/min；在40～50℃，水浴氮氣流下完全蒸發(fā)溶劑；用2ml復溶工作液溶解干燥的殘留物；取50μl進行分析。蜂蜜前處理方法二稱取1.0g±0.05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中；加入5ml復溶工作液，用振蕩器振蕩10min至蜂蜜全部溶解，3000g以上，室溫(20-25℃/68-77°F)離心10min，直至清亮；取200μl清亮上清液，加入600μl復溶工作液中，混勻；取50μl進行分析。(7)蜂王漿前處理方法稱取1.0g±0.05g蜂王漿樣本至50ml聚苯乙烯離心管中；加入4ml去離子水，用振蕩器振蕩混勻；加入2.0g中性氧化鋁，用振蕩器充分振蕩5min后，3000g以上，室溫(20-25℃/68-77°F)離心10min；取100μl清亮上清液，加入900μl復溶工作液，混勻后；取50μl進行分析。2.用試劑盒進行檢測向包被有包被原的酶標板微孔中加入50μl標準品/樣本，再加入50μl單克隆抗體工作液，輕輕振蕩混勻，蓋上蓋板膜，37℃恒溫箱中避光反應30min。倒出孔中的液體，用洗滌工作液(用去離子水將20×濃縮洗滌液按1∶19體積比進行稀釋)250μl/孔充分洗滌4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干以保證完全除去孔中的液體，加入100μl酶標記抗抗體，輕輕振蕩混勻，蓋上蓋板膜，37℃恒溫箱中避光反應30min。倒出孔中的液體，重復洗板步驟，加入底物液A液50μl，再加入底物液B液50μl，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后37℃恒溫箱中避光顯色15min。加入50μl終止液，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處測量每孔的吸光度值。3.檢測結(jié)果分析用所獲得的標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100％，即得到標準品或樣本的百分吸光率。以鏈霉素標準品百分吸光率為縱坐標，以鏈霉素標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖，如圖3所示。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中鏈霉素實際濃度。三、酶聯(lián)免疫試劑盒技術參數(shù)的確定最低檢測限：對20份空白樣本進行檢測，從標準曲線上查出對應于各百分吸光率的濃度，以20份樣本鏈霉素濃度的平均值加上3倍標準差表示檢測限，結(jié)果得該方法對肝臟、肌肉檢測限為2μg/kg，血清檢測限為10μg/kg，牛奶檢測限為4μg/L，奶粉檢測限為20μg/kg，蜂蜜檢測限為(方法一0.5μg/kg，方法二2μg/kg)，蜂王漿檢測限為2μg/kg。準確度和精密度：ELISA測定的準確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)表示。取空白肝臟、肌肉、牛奶、蜂蜜、蜂王漿樣本，以10、20、40μg/kg三個濃度的鏈霉素對其進行添加回收試驗，取空白血清、奶粉樣本，以50、100、200μg/kg三個濃度的鏈霉素對其進行添加回收試驗，結(jié)果得該方法對肌肉、肝臟、血清樣本的回收率為70％±10％，對牛奶、奶粉樣本的回收率為85％±25％，對蜂蜜、蜂王漿樣本的回收率為90％±15％，批內(nèi)變異系數(shù)＜15％，批間變異系數(shù)＜25％。經(jīng)測定本發(fā)明試劑盒在2～8℃至少可以保存12個月。