本發(fā)明關(guān)于一種制備抗體F(ab’)2片段的方法，特別是一種使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行純化，且無(wú)需使用硫酸銨或硫酸鈉沉淀，以獲得高回收率、高純度的抗體F(ab’)2片段的制備方法。

背景技術(shù)：
由于抗體可專(zhuān)一性連結(jié)抗原的特性，目前已有許多抗體應(yīng)用于治療的用途，例如應(yīng)用于對(duì)抗傳染疾?。ɡ纾?xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等感染）、癌癥、藥物或是其他異物的治療。在抗體的結(jié)構(gòu)中，以IgG為例，經(jīng)由胃蛋白酶（Pepsin）的水解作用可將抗體分為F(ab’)2及Fc兩部分，F(xiàn)(ab’)2以雙硫鍵結(jié)合兩個(gè)抗原結(jié)合部位，分子量約為110kDa。由于F(ab’)2片段移除Fc部分，故可免除抗體與細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞）的Fc受體的之間的非專(zhuān)一性結(jié)合且由于其分子較小，更能有效地滲透組織，此外，由于移除Fc部分，做為檢測(cè)時(shí)可不受到抗Fc抗體引起的檢測(cè)干擾，應(yīng)用在檢測(cè)上有更高的靈敏度，因此在安全性及效能上較IgG更好。生產(chǎn)抗體F(ab’)2片段用于治療用途，往往涉及許多目的在保持其有效性的步驟，同時(shí)通過(guò)純化以減少副作用的發(fā)生率和嚴(yán)重性。這些步驟包括硫酸銨或硫酸鈉沉淀、酶消化、熱凝、滲濾，近來(lái)更用到離子交換及親和性管柱層析。其中，較精致的方法為自血清中純化抗體，然后經(jīng)蛋白酶水解產(chǎn)生F(ab’)2片段，再經(jīng)沉淀法及管柱層析法，將F(ab’)2片段與Fc水解物及蛋白酶分離。也有自血清先以蛋白酶水解再以分段的硫酸銨或硫酸鈉沉淀加上層析管柱分析。這些制備的步驟可得到有效及安全的F(ab’)2產(chǎn)品，但制備的成本相當(dāng)高。此外，制備方法中如用到硫酸銨或硫酸鈉沉淀的步驟，將相當(dāng)費(fèi)時(shí)且回收率損失相當(dāng)高，造成制造成本大幅增加。為了達(dá)到避免硫酸銨沉淀步驟的目的，已有相關(guān)研究應(yīng)用Q-Sepharose管柱加上切流過(guò)濾系統(tǒng)（Tangentialflowdiafiltration）來(lái)純化F(ab’)2，可無(wú)需使用硫酸銨沉淀（Jonesetal.,JournalofImmunologicalMethods(2003)275(1-2),239-250）。但此純化方法實(shí)施時(shí)需監(jiān)控水解的狀態(tài)，使抗血清的水解產(chǎn)物除F(ab’)2外，其他的成分都小于13kDa才能達(dá)到純化的目的。此條件除了容易造成過(guò)度水解外，也可能只能在特定血清樣品才能實(shí)施，其報(bào)告中所用的樣品，IgG為其血清蛋白質(zhì)的主要成分，含量大于其他蛋白質(zhì)（含白蛋白）成分的總和。因此，仍需要進(jìn)一步改善制備抗體F(ab’)2片段的方法，以縮短制備時(shí)間、降低制備成本及提高純化回收率，以獲得高純度及質(zhì)量的抗體F(ab’)2片段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供制備與純化抗體F(ab’)2片段的方法，以及使用所述方法所制備的包含抗體F(ab’)2片段的醫(yī)藥組合物。在一方面，本發(fā)明提供一種制備抗體F(ab’)2片段的方法，其包含下列步驟：（1）將抗體以胃蛋白酶（Pepsin）水解以獲得抗體F(ab’)2片段；（2）將抗體F(ab’)2片段以過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮并置換緩沖液，其中緩沖液的置換使抗體F(ab’)2片段帶有正電荷；以及（3）將抗體F(ab’)2片段以陽(yáng)離子交換管柱進(jìn)行純化，并以鹽類(lèi)水溶液置換經(jīng)純化的抗體F(ab’)2片段。其中經(jīng)純化的抗體F(ab’)2片段不含有血清白蛋白、完整抗體分子及抗體Fc片段。較佳地，將經(jīng)純化的抗體F(ab’)2片段可以第二過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮并根據(jù)使用需求置換第二緩沖液。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述過(guò)濾系統(tǒng)可為切向流過(guò)濾系統(tǒng)（TangentialFlowFiltrationSystem）。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述緩沖液的pH值小于所述抗體F(ab’)2片段的等電點(diǎn)（pI）值，例如，所述緩沖液可為pH4.3的醋酸鈉溶液。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述鹽類(lèi)水溶液可為濃度約0.1M至約2M的氯化鈉（NaCl）水溶液。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述第二緩沖液可為生理食鹽水。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述第二過(guò)濾系統(tǒng)可為切向流過(guò)濾系統(tǒng)（TangentialFlowFiltrationSystem）。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述抗體可為免疫球蛋白（immunoglobulin），例如，IgG、IgA或IgM。另一方面，本發(fā)明提供一種包含抗體F(ab’)2片段的組合物，其中所述抗體F(ab’)2片段是由本發(fā)明所述的方法所制得，且所述組合物不含有血清白蛋白、完整抗體分子及抗體Fc片段。又一方面，本發(fā)明還提供一種包含抗體F(ab’)2片段的醫(yī)藥組合物，包含一或多種藥學(xué)上可接受的載劑，其中所述抗體F(ab’)2片段是由本發(fā)明所述的方法所制得，且所述醫(yī)藥組合物不含有血清白蛋白、完整抗體分子及抗體Fc片段。附圖說(shuō)明前文的所述以及實(shí)施方式可通過(guò)說(shuō)明書(shū)附圖達(dá)到更好的說(shuō)明效果。為了加強(qiáng)本發(fā)明的說(shuō)明，將適當(dāng)?shù)膶?shí)施例的附圖列舉于此。圖1顯示以陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行抗體F(ab’)2片段的分離與純化的層析圖，其中標(biāo)示為unbound的波峰代表未與管柱結(jié)合的物質(zhì)，而后分別以0.2M與1.0的NaCl，以及0.1MNaOH沖提管柱。圖2顯示抗體F(ab’)2片段制備過(guò)程中各階段的產(chǎn)物以SDS-PAGE進(jìn)行分析并以考馬斯藍(lán)（commassivebrilliantblue）染色的結(jié)果圖。M：分子量標(biāo)記；1：未經(jīng)水解與純化的含有豬抗CDV抗體的血漿，其中PSA代表豬血清白蛋白，IgG抗體的分子量約為135kDa；2：前述血漿經(jīng)胃蛋白酶水解后的產(chǎn)物；3：前述水解產(chǎn)物經(jīng)50kDa超過(guò)濾膜進(jìn)行透析、置換緩沖液的產(chǎn)物，相較于使用超過(guò)濾膜透析前，蛋白質(zhì)組成分并無(wú)差異，顯示超過(guò)濾膜透析并無(wú)法獲得分離純化的效果；4：陽(yáng)離子交換管柱的過(guò)濾液；5：陽(yáng)離子交換管柱經(jīng)0.2MNaCl沖提管柱的洗出物，可觀察到經(jīng)分離純化的抗體F(ab’)2片段。圖3顯示以西方墨點(diǎn)分析確認(rèn)抗體F(ab’)2片段的存在與純化程度。此處使用兔子抗豬只IgGF(ab’)2片段的抗體（NOVUS）為初級(jí)抗體用以偵測(cè)。1：含有豬抗CDV抗體的血漿經(jīng)胃蛋白酶水解的產(chǎn)物；2：前述經(jīng)水解的血漿以陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化后0.2MNaCl的沖提產(chǎn)物；3：前述經(jīng)水解的血漿以陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化后0.5MNaCl的沖提產(chǎn)物。圖4顯示經(jīng)CDV感染的不同批次豬只的血清樣品分析結(jié)果，將總蛋白質(zhì)含量相等的血清樣品以SDS-PAGE進(jìn)行分析并以考馬斯藍(lán)（commassivebrilliantblue）染色。M：分子量標(biāo)記；1、2、3：不同批次豬只的血清樣品。圖5顯示本發(fā)明的抗體F(ab’)2片段制備方法可適用于高濃度IgG的血清樣品。經(jīng)免疫的豬只血清以及經(jīng)純化的產(chǎn)物以SDS-PAGE進(jìn)行分析并以考馬斯藍(lán)（commassivebrilliantblue）染色。M：分子量標(biāo)記；1：未經(jīng)水解與純化的含有豬抗CDV抗體的血漿，其中PSA代表豬血清白蛋白，IgG抗體的分子量約為135kDa；2：前述血漿經(jīng)胃蛋白酶水解及陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化后的產(chǎn)物。于高濃度IgG血清（血漿）樣品中，抗體F(ab’)2片段的回收率仍可大于90%。具體實(shí)施方式除非另外定義，本文中所用的所有技術(shù)及科學(xué)詞匯具有所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常理解的相同意義。當(dāng)用于此處時(shí)，本文所使用冠詞“一”或“該”意指該冠詞文法上的受詞為一或一以上（亦即至少為一）。舉例而言，“一組件”代表一組件或多于一組件。本文所用的術(shù)語(yǔ)“大約”、“約”、或“近似”一般而言應(yīng)意謂指定數(shù)值或范圍的20%以內(nèi)，較佳者為10%以內(nèi)，且更佳者為5%以內(nèi)。本文所給予的數(shù)量皆為近似值，意謂術(shù)語(yǔ)“大約”、“約”、或“近似”如未明確陳述亦可推論?？贵w，也稱為免疫球蛋白，其存在于個(gè)體的血清中并為免疫系統(tǒng)的一部分，通過(guò)與特定抗原的結(jié)合與中和，并誘導(dǎo)后續(xù)的免疫反應(yīng)以達(dá)到保護(hù)個(gè)體免于外來(lái)物質(zhì)，例如病原體，入侵的功能。由于抗原與抗體之間特異性結(jié)合的特性，目前在產(chǎn)業(yè)上已有各種應(yīng)用，例如，檢驗(yàn)、檢測(cè)、預(yù)防及治療疾病等。在目前已知的抗體中，例如，IgG、IgM、IgA、IgE，以IgG在血液中的含量最高，且由于IgG為成熟免疫反應(yīng)的產(chǎn)物因此應(yīng)用廣泛。當(dāng)以酵素分解IgG時(shí)，依據(jù)使用的酵素可獲得不同的產(chǎn)物，例如，當(dāng)使用木瓜酵素（papain）時(shí)，IgG會(huì)分解成一個(gè)Fc片段（crystallizingfragment）及兩個(gè)Fab片段（antigen-bindingfragment），若使用胃蛋白酶（pepsin）時(shí)，則可獲得一個(gè)F(ab’)2片段及一個(gè)Fc片段。Fab片段及F(ab’)2片段仍保留可特異性結(jié)合抗原的特性，而F(ab’)2片段更具有沉淀抗原的功能。相對(duì)于此，F(xiàn)c片段則扮演信號(hào)標(biāo)記的角色，吸引并活化巨噬細(xì)胞、嗜中性白血球等而辨識(shí)并吞噬抗原抗體復(fù)合物。此外，當(dāng)異種的抗體進(jìn)入個(gè)體中時(shí)，F(xiàn)c片段因其抗原決定部位的特定序列會(huì)被視為外來(lái)物質(zhì)，故誘發(fā)嚴(yán)重免疫反應(yīng)而造成副作用，因此目前在產(chǎn)業(yè)利用上多將抗體以酵素處理以去除Fc片段、保留Fab片段及F(ab’)2片段，且由于Fab片段及F(ab’)2片段的分子較小，更能進(jìn)入有效地滲入組織提高功效。目前產(chǎn)業(yè)上針對(duì)F(ab’)2片段制備方法，大部分是先純化抗體后再以蛋白酶水解將Fc切除，再以親和性管柱或其他特性的層析法將產(chǎn)物分離。此類(lèi)的方法操作的風(fēng)險(xiǎn)較低，但過(guò)程較長(zhǎng)且花費(fèi)驚人，一般只用在研究實(shí)驗(yàn)室的小量制備。而應(yīng)用于大量制備的制程時(shí)，多以胃蛋白酶直水解血清或血漿，再以硫酸銨沉淀將F(ab’)2片段和其他的水解產(chǎn)物做粗分離，但此步驟是個(gè)耗時(shí)的工作，一般沉淀、固液分離及沉淀物的再溶解透析，最少需2個(gè)工作日，再者固液分離在大量操作時(shí)需要的設(shè)備和濾膜耗材也是很大的花費(fèi)。而且硫酸銨沉淀中F(ab’)2片段的純度和回收率是個(gè)兩難的抉擇，工業(yè)上常用的13%硫酸銨可得到較純的F(ab’)2片段但其回收率低于50%，45%硫酸銨可將F(ab’)2片段幾乎都沉淀下來(lái)但無(wú)法與其余蛋白質(zhì)分離。此外，以硫酸銨沉淀做粗分離，仍需要經(jīng)陰離子交換樹(shù)脂做進(jìn)一步的純化。為了克服硫酸銨沉淀的兩難困境，Jones和Landon已報(bào)導(dǎo)將血清或血漿中蛋白質(zhì)水解為小分子勝肽，再以透析的方式分離F(ab’)2片段（Jonesetal.,JournalofImmunologicalMethods(2003)275(1-2),239-250）。然在這個(gè)方法中，需要持續(xù)監(jiān)控胃蛋白酶的水解反應(yīng)，并具有兩個(gè)反應(yīng)終點(diǎn)要觀察，其一為抗體需水解為F(ab’)2，但過(guò)度的水解會(huì)使F(ab’)2產(chǎn)率降低甚至失去活性；另一為需控制血清或血漿中的其他蛋白質(zhì)都水解為小分子勝肽（13kDa），這兩個(gè)反應(yīng)終點(diǎn)很難同時(shí)達(dá)到，因此在產(chǎn)業(yè)上使用仍有其局限性。有鑒于此，本發(fā)明提供一種制備抗體F(ab’)2片段的方法，其包含下列步驟：（1）將抗體以胃蛋白酶（Pepsin）水解以獲得抗體F(ab’)2片段；（2）將抗體F(ab’)2片段以過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮并置換緩沖液，其中緩沖液的置換使抗體F(ab’)2片段帶有正電荷；以及（3）將抗體F(ab’)2片段以陽(yáng)離子交換管柱進(jìn)行純化，并以鹽類(lèi)水溶液置換經(jīng)純化的抗體F(ab’)2片段。其中經(jīng)純化的抗體F(ab’)2片段不含有血清白蛋白、完整抗體分子及抗體Fc片段。較佳地，經(jīng)純化的抗體F(ab’)2片段可以第二過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮并根據(jù)使用需求置換第二緩沖液。如此，通過(guò)上述方法不但可克服硫酸銨沉淀步驟所造成的低回收率或低純度，更可縮短制備時(shí)間、降低制備成本及提高純化回收率，進(jìn)而獲得高純度及品質(zhì)的抗體F(ab’)2片段。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指完整抗體，“抗體片段”是指完整抗體中包含F(xiàn)(ab’)2片段的抗原結(jié)合片段，其仍保有與抗原特異性結(jié)合的功能而可替代完整抗體的功能。在一實(shí)施例中，抗體與抗體片段可由重組DNA技術(shù)制得，在另一實(shí)施例中，抗體與抗體片段可由自然來(lái)源獲得，其中抗體片段亦可由完整抗體經(jīng)化學(xué)或酵素作用而獲得。使抗體水解而獲得F(ab’)2片段的胃蛋白酶有效量可由所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員依所需水解的抗體含量、胃蛋白酶的活性加以決定，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，胃蛋白酶的最終濃度為0.05%（w/v）。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，使抗體F(ab’)2片段帶有正電荷的緩沖液為酸性，例如，具有介于約2.0至6.0的pH值，較佳為介于3.0至5.0，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可理解任何可使抗體F(ab’)2片段帶有正電荷的緩沖系統(tǒng)皆可應(yīng)用，所述緩沖系統(tǒng)包含但不限于，醋酸、檸檬酸、磷酸、2-嗎啉乙烷磺酸（2-morpholinoethanesulfonicacid,MES）。另一方面，本發(fā)明提供一種包含抗體F(ab’)2片段的組合物，其中所述抗體F(ab’)2片段是由本發(fā)明所述的方法所制得，且所述組合物不含有血清白蛋白、完整抗體分子及抗體Fc片段。其中所述組合物還可包含使抗體F(ab’)2片段半衰期延長(zhǎng)的載體，例如但不限于線型高分子聚合物（如，PEG）、支鏈高分子聚合物、脂質(zhì)、膽固醇、醣類(lèi)、寡糖、以及合成或自然生成的蛋白質(zhì)、聚肽、勝肽。又一方面，本發(fā)明還提供一種包含抗體F(ab’)2片段的醫(yī)藥組合物，包含一或多種藥學(xué)上可接受的載劑，其中所述抗體F(ab’)2片段是由本發(fā)明所述的方法所制得，且所述醫(yī)藥組合物不含有血清白蛋白、完整抗體分子及抗體Fc片段。在預(yù)防及治療的應(yīng)用上，本發(fā)明的抗體F(ab’)2片段或其衍生物可與藥學(xué)上可接受的載劑調(diào)配成醫(yī)藥組合物。此處所使用的“藥學(xué)上可接受”意指該載劑是與包含于該組合物中的活性成分兼容，能更好地穩(wěn)定該活性成分而不會(huì)對(duì)投予該醫(yī)藥組合物的對(duì)象產(chǎn)生傷害。所述載劑可為該活性成分的稀釋劑、載體、賦形劑或介質(zhì)。適合載劑的實(shí)例包含生理兼容緩沖液，如漢克氏溶液、林格氏溶液、生理食鹽水緩沖液、乳糖、右旋葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻膠、黃耆膠、明膠、硅酸鈣、微晶型纖維素、聚乙烯咯啶酮、纖維素、無(wú)菌水、糖漿及甲基纖維素。所述醫(yī)藥組合物可額外包含潤(rùn)滑劑，例如，滑石、硬脂酸鎂及礦物油；潤(rùn)濕劑；乳化與懸浮劑；保存劑，例如，甲基-及丙基-羥基苯甲酸鹽；甜味劑；以及調(diào)味劑。根據(jù)本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可為片狀、藥丸、粉末、錠劑、囊袋、藥包、藥酒、懸浮液、乳化液、溶液、糖漿、軟明膠膠囊與硬明膠膠囊、栓劑、無(wú)菌注射溶液及經(jīng)包裝的粉末形式。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可經(jīng)由任何生理可接受途徑傳送。此些途徑包含但不限于非經(jīng)口服投藥、系統(tǒng)性投藥、口服投藥、鼻腔投藥、直腸投藥、腹腔注射、血管注射、皮下注射、經(jīng)皮投藥、吸入投藥及肌肉注射。本發(fā)明是通過(guò)下列范例進(jìn)一步說(shuō)明，此僅提供而用于展現(xiàn)而非限制的目的。由于本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)可理解所公開(kāi)的特定具體實(shí)施例，并對(duì)所述些具體實(shí)施例進(jìn)行諸多修改而獲得相似或類(lèi)似的結(jié)果而仍未脫離本發(fā)明的精神與范疇。實(shí)施例材料及方法抗體的制備以犬瘟熱病毒（Caninedistempervirus，CDV）免疫豬只，并通過(guò)增強(qiáng)（boost）免疫提高豬只血液的中和抗體效價(jià)。采集豬只血液樣品，若需求為血漿，將血液樣品緩慢注入至含3.2%檸檬酸鈉溶液的采血袋至最終體積比為9：1，輕搖數(shù)分鐘使血液與抗凝血?jiǎng)┗旌?。若需求為血清，則將血液樣品注入無(wú)菌試管內(nèi)，傾斜放置10-30分鐘，待血液凝固后收集以免溶血影響后續(xù)分析。將上述樣品經(jīng)離心以分離上清液與固形物，分別獲得的上清液為血漿樣品或血清樣品。F(ab’)2片段的產(chǎn)制胃蛋白酶（pepsin）處理經(jīng)由上述步驟所獲得的含有抗CDV抗體的血清或血漿先于58℃加熱30分鐘以使病毒去活化，接著進(jìn)行胃蛋白酶水解或-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。于進(jìn)行胃蛋白酶水解反應(yīng)前，取1L含有抗CDV抗體的血清或血漿加入等體積的超純水進(jìn)行稀釋?zhuān)又尤腩A(yù)先溶于0.1NHCl的10%胃蛋白酶（SIGMA-ALDRICH）至最終濃度為0.05%（w/v），隨后以5NHCl緩緩注入上述溶液中以調(diào)整pH值至約pH3.2±0.1。將含有胃蛋白酶的豬血清（漿）溶液置于37℃下反應(yīng)2小時(shí)進(jìn)行水解反應(yīng)，而后將溶液移置4℃冰箱中以中止反應(yīng)待后續(xù)透析。濃縮及緩沖液置換經(jīng)胃蛋白酶水解的豬血清（漿）溶液接著以切向流過(guò)濾系統(tǒng)（TangentialFlowFiltrationSystems）進(jìn)行濃縮及緩沖液置換，切向流過(guò)濾系統(tǒng)在此處使用孔徑為50kD，膜面積為0.11m2的膜匣（GEHealthcareLifeSciences；KvickLabCassette-UFELA0050010ST）。豬血清（漿）溶液經(jīng)濃縮至50%體積后，繼續(xù)以10倍體積的50mM醋酸鈉溶液（pH4.3）進(jìn)行透析，持續(xù)監(jiān)控透析后的血清（漿）溶液樣品，至導(dǎo)電度與50mM醋酸鈉溶液相近（低于5ms/cm）后停止。收集的溶液接著以0.22μm濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。以陽(yáng)離子交換管柱純化抗體F(ab’)2片段陽(yáng)離子交換管柱SP-SepharoseFF（50x125mm）先以50mM醋酸鈉溶液（pH4.3）平衡，將前述經(jīng)胃蛋白酶水解并經(jīng)透析以濃縮與置換緩沖液的豬血清（漿）溶液通入管柱，繼續(xù)以50mM醋酸鈉溶液（pH4.3）沖洗管柱以洗出未結(jié)合物，持續(xù)監(jiān)測(cè)洗出液于280nm的吸光值，待接近管柱平衡時(shí)的吸光值作為終止判定。再分別以含0.2MNaCl的50mM醋酸鈉溶液（pH4.3）沖洗出所要的F(ab’)2部分和以含1MNaCl的50mM醋酸鈉溶液（pH4.3）沖洗出雜蛋白，管柱最終以0.1M的NaOH作在位清洗（CIP）以重復(fù)使用。透析置換F(ab’)2劑型緩沖液收集陽(yáng)離子交換管柱0.2MNaCl的洗出溶液，接著以切向流過(guò)濾系統(tǒng)（TangentialFlowFiltrationSystems）進(jìn)行濃縮與置換緩沖液，切向流過(guò)濾系統(tǒng)于此處使用孔徑為50kD，膜面積為0.11m2的膜匣（GEHealthcareLifeSciences；KvickLabCassette-UFELA0050010ST）。0.2MNaCl洗出液經(jīng)濃縮至50%體積后，繼續(xù)以10倍體積的注射用生理食鹽水進(jìn)行透析。收集的溶液接著以0.22μm濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。抗體F(ab’)2片段病毒中和抗體效價(jià)測(cè)試為測(cè)定抗體F(ab’)2片段中和病毒的效價(jià)，以50μl的CDV病毒（約200TCID50）與50μl不同稀釋倍數(shù)的樣品混合反應(yīng)1小時(shí)，再將混合液加入預(yù)先培養(yǎng)的B95-8細(xì)胞株，觀察是否產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE），以不產(chǎn)生細(xì)胞病變的最高稀釋倍數(shù)作為樣品的中和抗體效價(jià)。樣品為血清或血漿時(shí)需先置于56℃反應(yīng)30分鐘使補(bǔ)體去活化后再進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果實(shí)例1：經(jīng)由陽(yáng)離子交換樹(shù)脂可獲得純度極高的抗體F(ab’)2片段將含有豬只抗CDV抗體經(jīng)胃蛋白酶水解以獲得F(ab’)2片段，并經(jīng)切向流過(guò)濾系統(tǒng)透析以濃縮與置換緩沖液后，帶正電的F(ab’)2片段進(jìn)一步以陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離與純化，其分離純化層析圖如圖1所示，其中標(biāo)示為unbound的波峰代表未與管柱結(jié)合的物質(zhì)，而后分別以0.2M與1.0的NaCl沖洗管柱以將結(jié)合管柱的物質(zhì)置換洗出，最后以0.1MNaOH清洗管柱。收集上述各階段的洗出液并以SDS-PAGE進(jìn)行分析。SDS-PAGE經(jīng)考馬斯藍(lán)染色后的結(jié)果如圖2所示，第1道顯示未經(jīng)水解與純化的含有豬抗CDV抗體的血漿，其中PSA代表豬血清白蛋白，IgG抗體的分子量約為135kDa；第2道為前述血漿經(jīng)胃蛋白酶水解后的產(chǎn)物，各蛋白質(zhì)的分子量顯著降低；第3道為前述水解產(chǎn)物經(jīng)50kDa超過(guò)濾膜透析置換緩沖液的結(jié)果，相較于使用超過(guò)濾膜透析前，蛋白質(zhì)組成分布與第2道并無(wú)差異，顯示超過(guò)濾膜透析并無(wú)法獲得分離純化的效果；第4道則為陽(yáng)離子交換管柱的過(guò)濾液；最后則為陽(yáng)離子交換管柱經(jīng)0.2MNaCl沖洗管柱的洗出物，可觀察到經(jīng)純化的抗體F(ab’)2片段，蛋白質(zhì)純化程度顯著增加。接著以西方墨點(diǎn)分析確認(rèn)純化物，此處使用兔子抗豬只IgGF(ab’)2片段的抗體（購(gòu)自NOVUS）偵測(cè)，其結(jié)果如圖3所示，其中第1道為含有豬抗CDV抗體的血漿經(jīng)胃蛋白酶水解的產(chǎn)物，第2道為前述經(jīng)水解的血漿以陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離純化后以0.2MNaCl沖提的產(chǎn)物，第3道則為以陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離純化后以0.5MNaCl沖提的產(chǎn)物。三者均于100kDa處測(cè)得信號(hào)，與預(yù)期IgG抗體F(ab’)2片段的分子量相當(dāng)。進(jìn)一步計(jì)算F(ab’)2片段產(chǎn)物的回收率，于純化前以1000ml、中和效價(jià)為2700倍的血漿為原料，經(jīng)上述F(ab’)2片段產(chǎn)制過(guò)程后，可制得380ml、蛋白質(zhì)濃度7.9mg/ml、中和效價(jià)大于6400倍的F(ab’)2產(chǎn)物，以中和效價(jià)計(jì)算其回收率大于90%。實(shí)例2：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化法適用于不同抗體濃度的樣品豬只因個(gè)體差異及飼養(yǎng)環(huán)境的不同，造成免疫反應(yīng)亦不相同，以CDV感染豬只為例，將3批次免疫血清的樣品以SDS-PAGE進(jìn)行分析并以考馬斯藍(lán)（commassivebrilliantblue）染色，其結(jié)果如圖4所示。其中雖然注入分析的總蛋白質(zhì)含量相等，但可觀察到豬血清白蛋白（PSA）的含量差異不大，但抗體（IgG）的含量則有很大差異。然而，本發(fā)明的制備方法可適用于不同濃度的樣品，如圖5所示，經(jīng)免疫的豬只血清以及經(jīng)本發(fā)明的方法純化的產(chǎn)物以SDS-PAGE進(jìn)行分析并以考馬斯藍(lán)（commassivebrilliantblue）染色，其中第1道所示的IgG含量比例雖然遠(yuǎn)高于第2圖的第1道所示的IgG含量比例，然而于高濃度IgG血清（血漿）樣品中，抗體F(ab’)2片段的回收率仍可大于90%。實(shí)例3：中和抗體效價(jià)測(cè)試F(ab’)2片段產(chǎn)物經(jīng)序列稀釋后進(jìn)行中和抗體效價(jià)測(cè)試，在稀釋6400倍的樣品中觀察不到細(xì)胞病變，而在12800倍稀釋的樣品中觀察到細(xì)胞病變，將此樣品的中和抗體效價(jià)定為6400倍。發(fā)明人相信本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本文的敘述，無(wú)須進(jìn)一步的例示即可將本發(fā)明應(yīng)用至其最廣泛的范圍。因此，應(yīng)當(dāng)了解此處所提供的敘述及權(quán)利要求是供例示目的而非以任何方式限制本發(fā)明的范疇。