本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種預(yù)防和/或治療炎癥反應(yīng)的小分子多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
炎癥（inflammation）是一種具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)。炎癥反應(yīng)使血液中產(chǎn)生大量的促炎性細(xì)胞因子（proinflammatorycytokines），如IL-1，TNF-α，IFN-gamma，IL-6等，刺激內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等活化，合成和分泌蛋白及細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)的各個(gè)階段，如血管擴(kuò)張，血管通透性增高，炎癥細(xì)胞粘附、遷移及趨化，新生血管形成等過程。在此過程中，白細(xì)胞也通過釋放蛋白水解酶、大量炎癥介質(zhì)和氧自由基等促進(jìn)炎癥反應(yīng)，使病情加重，造成組織損傷。眼部的葡萄膜炎是一類可反復(fù)發(fā)作的、臨床常見、治療棘手的嚴(yán)重眼部免疫原性疾病，可破壞血眼屏障，其滲出物和毒素等引起眼內(nèi)組織的增生、變性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜等組織損害、晶體混濁產(chǎn)生白內(nèi)障、繼發(fā)性青光眼等，致盲率高，嚴(yán)重影響患者的視覺質(zhì)量和生活質(zhì)量。在歐美國家，約有35％的葡萄膜炎患者出現(xiàn)不同程度的視力損害；國內(nèi)葡萄膜炎致盲率為18.76％。目前，葡萄膜炎的治療方法主要是使用激素、免疫抑制劑和非甾體類消炎藥。然而，長期、反復(fù)地使用激素，往往導(dǎo)致激素性青光眼等治療棘手的并發(fā)癥發(fā)生。而免疫抑制劑在全身及局部毒副作用大，限制了其應(yīng)用；非甾體類消炎藥則局部刺激性強(qiáng)、藥物分子量大，難以透過血眼屏障從而限制了其在眼組織局部的有效濃度。C型凝集素（C-typelectins）是一類依賴鈣離子的凝集素大家族，包括許多細(xì)胞內(nèi)吞受體、蛋白聚糖、所有的膠原凝集素和選擇蛋白等。其糖識(shí)別域（carbohydrate-recognitiondomains,CRD）結(jié)構(gòu)，即C型凝集素結(jié)構(gòu)域（C-typelectindomain,CTLD）具有高度同源性，由約115-130個(gè)氨基酸組成，是C型凝集素的主要功能區(qū)域，參與介導(dǎo)各種生物學(xué)反應(yīng)，如細(xì)胞間的黏附，凋亡，以及免疫反應(yīng)等，其中免疫反應(yīng)包括炎癥、腫瘤免疫以及病毒感染的細(xì)胞等。研究表明，許多C型凝集素蛋白具有抑制炎癥的作用，如血栓調(diào)節(jié)蛋白（Thrombomodulin,TM）、胰腺炎相關(guān)蛋白（Pancreatitis-associatedprotein，PAP）、甘露糖結(jié)合蛋白（Mannose-bindinglectin,MBL）等。甘露糖結(jié)合凝集素（mannosebindinglectin,MBL）是一種由肝臟合成的C型凝集素，屬于C型凝集素超家族III—膠原凝集素（collectin）亞家族。人類MBL多肽鏈由229個(gè)氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量約為32kDa。MBL通過結(jié)合病原微生物表面的甘露糖等糖基配體，識(shí)別大多數(shù)細(xì)菌、病毒、真菌等，直接介導(dǎo)巨噬細(xì)胞調(diào)理吞噬作用和/或通過凝集素途徑激活補(bǔ)體，在機(jī)體的天然免疫防御中發(fā)揮重要作用。近年來，越來越多的生物制劑通過實(shí)驗(yàn)室或臨床證實(shí)具有抑制眼部炎癥的作用，然而，這些生物制劑分子量大，體外合成方法復(fù)雜，存在制備過程中重組表達(dá)純化工藝繁瑣和內(nèi)毒素殘留等不足；且容易因蛋白構(gòu)象以及修飾改變而導(dǎo)致生物學(xué)活性喪失；由于其分子量大，難以通過血眼屏障，需要經(jīng)過反復(fù)玻璃體腔注射或者轉(zhuǎn)基因等方法發(fā)揮抗炎的作用，存在組織損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。在開發(fā)有效的眼部炎癥抑制劑時(shí)，應(yīng)充分考慮到眼科用藥的特殊性。第一，眼部存在多個(gè)解剖性和功能性的屏障。全身給藥常常由于血-房水屏障和血-視網(wǎng)膜屏障而無法在眼組織局部達(dá)到足夠的藥物濃度；局部給藥，如玻璃體腔注射，大于76.5kDa的大分子在理論上很難穿透視網(wǎng)膜作用于視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管。第二，藥物在親水的淚液、房水、玻璃體液中溶解的程度與其有效性呈正相關(guān)。第三，基于上述主要原因，眼科用藥的生物利用度很低；要使之提高，需加大給藥的濃度。但高濃度藥物的毒副作用較為明顯，全身和局部均無法高劑量給藥。第四，目前雖然已經(jīng)有一系列相對安全的內(nèi)源性炎癥抑制劑被先后證實(shí)，如血栓調(diào)節(jié)蛋白（Thrombomodulin，TM）、胰腺炎相關(guān)蛋白（Pancreatitis-associatedprotein，PAP）、甘露糖結(jié)合蛋白（Mannose-bindingprotein，MBP）等，但由于其分子量較大且空間構(gòu)象復(fù)雜，故在制備過程中存在重組表達(dá)純化工藝繁瑣和內(nèi)毒素殘留等不足。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種適于眼球組織的安全有效的小分子炎癥反應(yīng)抑制劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是提供一種預(yù)防和/或治療炎癥反應(yīng)的小分子多肽及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種下式I表示的多肽，或其藥學(xué)上可接受的鹽[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10]-[Xaa11]-[Xaa12]-[Xaa13]-[Xaa14]-[Xaa15]-[Xaa16]-[Xaa17]-[Xaa18](I)式中，Xaa0是無，或1-3個(gè)氨基酸構(gòu)成肽段；Xaa1是選自下組的氨基酸：Trp，Phe，Tyr，或無；Xaa2是選自下組的氨基酸：Asn，Gln，His，Lys，或Arg；Xaa3是選自下組的氨基酸：Asp，或Glu；Xaa4是選自下組的氨基酸：Val，Ile，Leu，Met，Phe，或Ala；Xaa5是選自下組的氨基酸：Pro，或Ala；Xaa6是選自下組的氨基酸：Cys，或Ser；Xaa7是選自下組的氨基酸：Ser，或Thr；Xaa8是選自下組的氨基酸：Thr，或Ser；Xaa9是選自下組的氨基酸：Ser，或Thr；Xaa10是選自下組的氨基酸：His，Asn，Gln，Lys，或Arg；Xaa11是選自下組的氨基酸：Leu，Ile，Val，Met，Ala，或Phe；Xaa12是選自下組的氨基酸：Ala，Val，Leu，或Ile；Xaa13是選自下組的氨基酸：Val，或Leu；Xaa14是選自下組的氨基酸：Cys，或Ser；Xaa15是選自下組的氨基酸：Glu，或Asp；Xaa16是選自下組的氨基酸：Phe，Leu，Val，Ile，Ala，或Tyr；Xaa17是選自下組的氨基酸：Pro，或Ala；Xaa18是無，或1-3個(gè)氨基酸構(gòu)成肽段；并且所述的多肽具有抑制炎癥的活性，且所述多肽的長度為17-23個(gè)氨基酸。在另一優(yōu)選例中，Xaa18是1-3個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽段。在另一優(yōu)選例中，Xaa0是1-3個(gè)氨基酸構(gòu)成肽段。在另一優(yōu)選例中，所述多肽選自下組：(a)具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDNO:1所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎癥功能的由(a)衍生的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽保留了≥70%的SEQIDNO:1的所示多肽的抑制炎癥免疫反應(yīng)的活性。在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽與SEQIDNO:1的相同性≥80%，較佳地≥90%；更佳地≥95%。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼第一方面所述的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子具有SEQIDNO:2所示的序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有：(a)第一方面所述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物還包括：(c)藥學(xué)上可接受的抗炎藥物。在另一優(yōu)選例中，抗炎藥物選自下組：地塞米松、甲強(qiáng)龍等甾體類抗炎藥；阿司匹林、吲哚美辛、水楊酸鈉等非甾體類抗炎藥；環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等免疫抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑、眼用凝膠或眼藥膏。在本發(fā)明的第四方面，提供了第一方面所述的多肽或藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備抑制炎癥或治療與炎癥相關(guān)疾病的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的與炎癥相關(guān)疾病的選自下組：眼部炎性疾病、胰腺炎、炎癥性腸病、肺部炎癥、接觸性皮炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種抑制哺乳動(dòng)物炎癥的方法，給需要的對象施用本發(fā)明所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的對象是人。在另一優(yōu)選例中，所述的炎癥免疫反應(yīng)是與葡萄膜炎相關(guān)的炎癥反應(yīng)。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1顯示了WP-17多肽的HPLC分析結(jié)果，WP-17多肽洗脫峰位于12.690分鐘，純度為99.61%。圖2顯示了WP-17多肽的質(zhì)譜分析結(jié)果，WP-17多肽分子量為1905，制備純度大于95%。圖3顯示了大鼠EIU臨床觀察結(jié)果；圖3A顯示正常對照組大鼠無明顯炎癥表現(xiàn)；圖3B顯示LPS組大鼠在LPS注射24小時(shí)后出現(xiàn)虹膜血管迂曲擴(kuò)張、前房閃輝、瞳孔區(qū)膜狀物、瞳孔膜閉等炎癥表現(xiàn)；圖3C顯示20μgWP-17干預(yù)組炎癥表現(xiàn)明顯減輕，僅見虹膜血管輕度充血，未見滲出；圖3D顯示大鼠EIU臨床評分結(jié)果。圖4顯示大鼠房水炎性細(xì)胞浸潤定量計(jì)數(shù)結(jié)果：正常對照組（NaCl）大鼠房水無明顯炎性細(xì)胞浸潤；LPS組大鼠房水炎性細(xì)胞對照組相比顯著增多（P<0.01）；1μg、10μg和20μgWP-17干預(yù)組與LPS組相比，炎性細(xì)胞明顯減少（P<0.01）。圖5顯示大鼠房水蛋白定量結(jié)果：正常對照組（NaCl）大鼠房水僅含有少量蛋白；LPS組大鼠房水蛋白濃度與對照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；10μg和20μgWP-17干預(yù)組與LPS組相比，蛋白濃度逐步減少，與LPS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。圖6顯示了大鼠眼球組織病理學(xué)觀察結(jié)果；圖6A顯示正常大鼠眼球組織；圖6B顯示LPS組可見前房大量噬伊紅樣無定形物質(zhì)和炎癥細(xì)胞浸潤，大量白細(xì)胞分布于虹膜、睫狀體基質(zhì)內(nèi)和前、后房；玻璃體腔近視網(wǎng)膜內(nèi)表面有大量炎癥細(xì)胞；視網(wǎng)膜增厚，可見炎癥細(xì)胞浸潤；圖6C顯示20μgWP-17干預(yù)組，虹膜及睫狀體表面、基質(zhì)內(nèi)和玻璃體腔內(nèi)細(xì)胞滲出明顯減少，視網(wǎng)膜僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤。圖7顯示了WP-17對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響結(jié)果；圖7A顯示各處理組RAW264.7細(xì)胞TNF-α濃度測定結(jié)果，空白對照組細(xì)胞上清液中僅含有少量的TNF-α；而LPS組細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度約為空白對照組的190倍；WP-17的干預(yù)（1μM、10μM、50μM）明顯抑制了細(xì)胞上清液中TNF-α的表達(dá)水平，且抑制作用呈劑量依賴性，與LPS相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1<0.05，P2<0.01，P3<0.01）；圖7B顯示各處理組RAW264.7細(xì)胞IL-6濃度測定結(jié)果，空白對照組細(xì)胞上清液中幾乎未測出IL-6；LPS組細(xì)胞上清液中PGE2的水平明顯升高；WP-17的干預(yù)明顯抑制了細(xì)胞上清液中IL-6的表達(dá)水平，且抑制效果呈劑量依賴性，與LPS相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。圖8顯示了WP-17細(xì)胞安全性試驗(yàn)結(jié)果，各濃度組WP-17對細(xì)胞相對增殖率分別為100.52±7.27%，100.90±6.84%，101.02±5.78%，99.07±10.49%和99.87±5.85%，不同濃度組之間兩兩比較顯示：WP-170.1、1、10μM、100μM、1mM組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。圖9顯示了多個(gè)候選序列WP-17、P1、P2抑制炎癥效果；圖9A顯示多個(gè)候選序列WP-17、P1、P2EIU臨床評分結(jié)果；圖9B顯示多個(gè)候選序列WP-17、P1、P2房水炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；圖9C顯示多個(gè)候選序列WP-17、P1、P2房水蛋白定量結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次制備了一種源自C型凝集素的具有抑制炎癥功能的，分子量僅1.905KDa的小分子多肽。具體地，本發(fā)明人應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，基于同源性分析和生物學(xué)特性等分析，選定了數(shù)個(gè)候選序列，采用固相法將其合成后，再經(jīng)內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠葡萄膜炎模型篩選，獲得了一類新型的、具有預(yù)防和治療眼部炎癥功能的小分子多肽，即WP-17。本發(fā)明的小肽WP-17的分子量小，可透過各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度；安全性高，對生物組織毒副作用小；眼局部用藥生物利用度高，可減少劑量，從而減小全身副作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明?；钚远嚯脑诒景l(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明多肽”、“WP-17多肽”、“WP-17小肽”或“肽WP-17”可互換使用，都指具有炎癥抑制活性的肽WP-17氨基酸序列WNDVPCSTSHLAVCEFP(SEQIDNO:1)的蛋白或多肽。此外，所述術(shù)語還包括具有抑制炎癥功能的、SEQIDNO：1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)：1-5個(gè)(通常為1-4個(gè)，較佳地1-3個(gè)，更佳地1-2個(gè)，最佳地1個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為5個(gè)以內(nèi)，較佳地為3個(gè)以內(nèi)，更佳地為2個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。本發(fā)明還包括WP-17蛋白的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持抑制炎癥功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)WP-17多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導(dǎo)序列、分泌序列或6His等標(biāo)簽序列融合而形成的然后蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。一類優(yōu)選的活性衍生物指與式I的氨基酸序列相比，有至多5個(gè)，較佳地至多3個(gè)，更佳地至多2個(gè)，最佳地1個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1本發(fā)明還提供了WP-17多肽的類似物。這些類似物與天然WP-17多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。本發(fā)明多肽還可以以由藥學(xué)上或生理學(xué)可接受的酸或堿衍生的鹽形式使用。這些鹽包括(但不限于)與如下酸形成的鹽：氫氯酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羥乙磺酸。其他鹽包括：與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常規(guī)的“前體藥物”的形式。編碼序列本發(fā)明提供了編碼WP-17多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發(fā)明一種優(yōu)選的編碼序列如SEQIDNO:2所示。它編碼SEQIDNO:1所示的短肽。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO:2所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO:1序列的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO:2中相應(yīng)編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。本發(fā)明的WP-17核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或WP-17蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明還包括對WP-17DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。制備方法本發(fā)明多肽可以是重組多肽或合成多肽。本發(fā)明的多肽可以是化學(xué)合成的，或重組的。相應(yīng)地，本發(fā)明多肽可用常規(guī)方法人工合成，也可用重組方法生產(chǎn)。一種優(yōu)選的方法是使用液相合成技術(shù)或固相合成技術(shù)，如Boc固相法、Fmoc固相法或是兩種方法聯(lián)合使用。固相合成可快速獲得樣品，可根據(jù)目的肽的序列特征選用適當(dāng)?shù)臉渲d體及合成系統(tǒng)。例如，F(xiàn)moc系統(tǒng)中優(yōu)選的固相載體如連接有肽中C端氨基酸的Wang樹脂，Wang樹脂結(jié)構(gòu)為聚苯乙烯，與氨基酸間的手臂是4-烷氧基芐醇；用25%六氫吡啶/甲基甲酰胺室溫處理20分鐘，以除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，并按照給定的氨基酸序列由C端逐個(gè)向N端延伸。合成完成后，用含4%對甲基苯酚的三氟乙酸將合成的胰島素原相關(guān)肽從樹脂上切割下來并除去保護(hù)基，可過濾除樹脂后乙醚沉淀分離得到粗肽。將所得產(chǎn)物的溶液凍干后，用凝膠過濾和反相高壓液相層析法純化所需的肽。當(dāng)使用Boc系統(tǒng)進(jìn)行固相合成時(shí)，優(yōu)選樹脂為連接有肽中C端氨基酸的PAM樹脂，PAM樹脂結(jié)構(gòu)為聚苯乙烯，與氨基酸間的手臂是4-羥甲基苯乙酰胺；在Boc合成系統(tǒng)中，在去保護(hù)、中和、偶聯(lián)的循環(huán)中，用TFA/氯甲烷(DCM)除去保護(hù)基團(tuán)Boc并用二異丙基乙胺(DIEA/氯甲烷中和。肽鏈縮合完成后，用含對甲苯酚(5-10%)的氟化氫(HF),在0℃下處理1小時(shí)，將肽鏈從樹脂上切下，同時(shí)除去保護(hù)基團(tuán)。以50-80%乙酸(含少量巰基乙醇)抽提肽，溶液凍干后進(jìn)一步用分子篩SephadexG10或Tsk-40f分離純化，然后再經(jīng)高壓液相純化得到所需的肽。可以使用肽化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)已知的各種偶聯(lián)劑和偶聯(lián)方法偶聯(lián)各氨基酸殘基，例如可使用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，羥基苯駢三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)進(jìn)行直接偶聯(lián)。對于合成得到的短肽，其純度與結(jié)構(gòu)可用反相高效液相和質(zhì)譜分析進(jìn)行確證。在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明多肽WP-17，按其序列，采用固相合成的方法制備，行高效液相色譜純化，獲得高純度目的肽凍干粉，-20℃貯存。另一種方法是用重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明多肽。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的WP-17多肽。一般來說有以下步驟：(1).用本發(fā)明的編碼WP-17多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。由于本發(fā)明多肽較短，因此可以考慮將多個(gè)多肽串聯(lián)在一起，重組表達(dá)后獲得表達(dá)產(chǎn)物，然后通過酶切等方法形成所需的小肽。藥物組合物和施用方法本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有：(a)安全有效量的本發(fā)明多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還包括(c)：藥學(xué)上可接受的抗炎物。所述的抗炎藥物可以包括但不局限于：地塞米松、甲強(qiáng)龍等甾體類抗炎藥；阿司匹林、吲哚美辛、水楊酸鈉等非甾體類抗炎藥；環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等免疫抑制劑。本發(fā)明多肽的數(shù)量通常為5微克-100毫克/劑，較佳地為100-1000微克/劑。為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個(gè)體約0.01毫克/千克至50毫克/千克，較佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克體重的本發(fā)明多肽。此外，本發(fā)明的多肽可以單用，也可與其他治療劑一起使用(如配制在糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或非甾體類消炎藥等藥物組合物中)。藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體：它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受該組合物的個(gè)體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)：眼內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。待預(yù)防或治療的對象可以是動(dòng)物；尤其是人。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物被用于實(shí)際治療時(shí)，可根據(jù)使用情況而采用各種不同劑型的藥物組合物。較佳地，可以例舉的有眼藥水、針劑、眼用凝膠和眼藥膏。這些藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法通過混合、稀釋或溶解而進(jìn)行配制，并且偶爾添加合適的藥物添加劑，如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、稀釋劑、緩沖劑、等滲劑(isotonicities)、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑和助溶劑，而且該配制過程可根據(jù)劑型用慣常方式進(jìn)行。例如，眼藥水的配制可這樣進(jìn)行：將多肽WP-17或其藥學(xué)上可接受的鹽與基本物質(zhì)一起通過加熱溶解于無菌水(在無菌水中溶解有表面活性劑)中，加入聚乙烯吡咯烷酮，并可任意地加入合適的藥物添加劑如防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑和等滲劑、抗氧化劑和增粘劑，然后使其完全溶解。本發(fā)明的藥物組合物還可以緩釋劑形式給藥。例如，多肽WP-17或其鹽可被摻入以緩釋聚合物為載體的藥丸或微囊中，然后將該藥丸或微囊通過手術(shù)植入待治療的組織。此外，多肽WP-17或其鹽還可通過插入預(yù)先涂有藥物的眼內(nèi)透鏡而得以應(yīng)用。作為緩釋聚合物的例子，可例舉的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羥基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，較佳地可例舉的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物被用于實(shí)際治療時(shí)，作為活性成分的多肽WP-17或其藥學(xué)上可接受的鹽的劑量，可根據(jù)待治療的每個(gè)病人的體重、年齡、性別、癥狀程度而合理地加以確定。例如，當(dāng)局部滴眼時(shí)，通常其濃度約為0.1-10wt%，較佳地1-5wt%，每日可2-6次給藥，每次1-5滴。工業(yè)應(yīng)用性含有本發(fā)明肽或其藥學(xué)上可接受鹽作為活性成分的藥物組合物，對炎癥有顯著的抑制作用。經(jīng)體內(nèi)、體外試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明多肽不僅可以抑制大鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎，而且可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子和蛋白的表達(dá)，且對RAW264.7細(xì)胞無明顯毒副作用。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：(a)本發(fā)明多肽的分子量小，可透過各種眼組織屏障；(b)水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度；(c)安全性高，對生物組織毒副作用??；(d)可通過固相合成的方法制備，純度高，產(chǎn)量大，成本低。因此本發(fā)明多肽有望開發(fā)成藥物，用于治療炎癥性眼病及相關(guān)的炎性疾病，如炎癥性腸病、皮膚炎癥等。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1多肽的合成采用市售的SYMPHONY多肽合成儀合成序列為SEQIDNO:1的WP-17多肽。步驟如下：1.根據(jù)軟件計(jì)算配制所需要的保護(hù)氨基酸溶液，和縮合試劑，切割試劑，在儀器相應(yīng)的瓶里加入足量的DMF、DCM。2.在反應(yīng)器中加入100μmolFMOC-Ala-Wang-Resin。3.在收集切割液的管道上放入15mg的離心管。4.編輯程序，一般樹脂的溶漲時(shí)間是30min，脫保護(hù)時(shí)間是5min、15min兩次、縮合時(shí)間是30分鐘，切割程序是2h。5.開機(jī)按照程序合成。6.最后將切割液用乙醚沉淀，離心，吹干，用HPLC純化。制得120mg多肽WP-17，為白色粉末(水溶性好)，純度：>95%。密封，-20℃保存?zhèn)溆?。?shí)施例2小肽WP-17的鑒定及保存1.取少量成品小肽WP-17，做HPLC分析的純度鑒定和質(zhì)譜鑒定。2.HPLC分析條件：A液為超純水（含0.1%三氟乙酸），B液為乙腈（含0.1%三氟乙酸）。使用Kromasil公司的100-5C18（4.6mm×250mm）進(jìn)行梯度分析：B液10%-50%，流速1ml/min,時(shí)間共18分鐘。質(zhì)譜分析條件：A液為超純水（含0.1%甲酸），B液為乙腈（含0.1%甲酸）。流速0.2ml/min,時(shí)間共1分鐘。3.HPLC結(jié)果：WP-17的洗脫峰位于12.690分鐘，純度為99.61%(圖1)；4.質(zhì)譜分析結(jié)果：WP-17的分子量為1905，純度大于95%（圖2）。5.將白色粉末狀的各小肽，密封包裝，-20℃保存。實(shí)施例3WP-17對EIU模型炎性細(xì)胞浸潤和蛋白滲出的影響1.材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料健康雄性Wistar大鼠，140-180g，8-10周齡，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心；內(nèi)毒素脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS），來源于大腸埃希桿菌，購自美國SIGMA-Aldrich公司；Bradford蛋白定量試劑盒（BradfordProteinAssayKit），購自美國Bio-Rad公司。1.2模型制作及干預(yù)試驗(yàn)將Wistar大鼠隨機(jī)分成4組，依次為LPS組、LPS+1μgWP-17干預(yù)組、LPS+10μgWP-17干預(yù)組、LPS+20μgWP-17干預(yù)組及正常對照組（0.9%NaCl組），每組9-15只。EIU模型通過對每只大鼠右足底皮下注射200μgLPS（2mg/ml，100μl，溶解于無菌生理鹽水）來誘導(dǎo)建立，正常對照組每只大鼠右足底皮下注射100μl無菌生理鹽水。LPS組、LPS+WP-17（1μg、10μg、20μg）干預(yù)組每只大鼠在右足底皮下注射200μgLPS的同時(shí)，玻璃體腔內(nèi)分別注射含有0、1μg、10μg和20μgWP-17的PBS溶液10μl。1.3大鼠EIU臨床表現(xiàn)定性觀察LPS及藥物干預(yù)24小時(shí)后對大鼠進(jìn)行生物顯微鏡觀察，參照Behar-Cohen等的方法由一名獨(dú)立的觀察者對大鼠的臨床表現(xiàn)進(jìn)行評估和計(jì)分。EIU的嚴(yán)重程度用0-4分表示：0：沒有炎癥反應(yīng)；1：結(jié)膜和虹膜血管輕度擴(kuò)張；2：結(jié)膜和虹膜血管中度擴(kuò)張伴有前房閃輝；3：重度虹膜充血伴前房重度閃輝；4：在3分的程度上出現(xiàn)前房纖維素樣滲出、虹膜后黏連、瞳孔縮小和前房積膿。1.4大鼠房水炎性細(xì)胞浸潤定量計(jì)數(shù)LPS及藥物干預(yù)24小時(shí)后對大鼠以過量麻醉處死，在手術(shù)顯微鏡下用30號(hào)微量進(jìn)樣器于大鼠角膜緣內(nèi)1mm處行前房穿刺收集房水（30-40μl/雙眼）。房水樣本用等量臺(tái)酚藍(lán)染液對倍稀釋，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行房水細(xì)胞計(jì)數(shù)，由兩名獨(dú)立的技術(shù)員對每個(gè)區(qū)域（相當(dāng)于0.1μl）的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，四個(gè)區(qū)域細(xì)胞數(shù)量的平均值即為每微升房水中所含的細(xì)胞數(shù)。1.5大鼠房水蛋白定量采用Bradford法測定，按照試劑盒說明，測定大鼠房水蛋白濃度。用牛血清白蛋白配置標(biāo)準(zhǔn)液，以590nm處的吸光度(A)值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出其濃度。1.6大鼠眼球組織病理學(xué)觀察各組大鼠均于LPS及藥物干預(yù)24小時(shí)后摘取眼球，立即置于5%甲醛溶液內(nèi)固定24小時(shí)，石蠟包埋，經(jīng)瞳孔-視乳頭軸作矢狀切面組織切片（5μm），作常規(guī)HE染色。在光學(xué)顯微鏡下對前房、虹膜睫狀體、玻璃體和視網(wǎng)膜行組織病理學(xué)觀察。1.7統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析(one-wayANOVA)分別比較各組大鼠炎性細(xì)胞浸潤和蛋白濃度變化情況。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2.1大鼠EIU臨床表現(xiàn)定性觀察正常對照組大鼠無明顯炎癥表現(xiàn)，EIU臨床評分為0.75±0.50（圖3A、3D）；LPS組大鼠在LPS注射24小時(shí)后出現(xiàn)虹膜血管迂曲擴(kuò)張、前房閃輝、瞳孔區(qū)膜狀物、瞳孔膜閉等炎癥表現(xiàn)，EIU臨床評分為3.80±0.27（圖3B、3D）；20μgWP-17干預(yù)組與LPS組相比，炎癥表現(xiàn)明顯減輕，僅見虹膜血管輕度充血，未見滲出，EIU臨床評分為1.40±0.42（P<0.01）（圖3C、3D）。2.2大鼠房水炎性細(xì)胞浸潤定量計(jì)數(shù)正常對照組大鼠房水無明顯炎性細(xì)胞浸潤；LPS組大鼠房水炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)104.37±4.26×105個(gè)細(xì)胞/ml，與對照組相比顯著增多（P<0.01）；1μg、10μg和20μgWP-17干預(yù)組與LPS組相比，炎性細(xì)胞明顯減少，依次為53.91±2.28×105，47.69±5.23×105個(gè)細(xì)胞/ml和12.59±1.92×105個(gè)細(xì)胞/ml（P<0.01）(圖4)。2.3大鼠房水蛋白定量正常對照組大鼠房水僅含有少量蛋白（2.39±0.93μg/ml）；LPS組大鼠房水蛋白濃度為39.34±2.04μg/ml，與對照組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；1μg、10μg和20μgWP-17干預(yù)組與LPS組相比，蛋白濃度逐步減少，分別為37.19±0.95μg/ml，28.47±1.52μg/ml和12.88±2.37μg/ml。其中10μg和20μgWP-17干預(yù)組蛋白濃度與LPS組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）(圖5)。2.4大鼠眼球組織病理學(xué)觀察LPS組可見前房大量噬伊紅樣無定形物質(zhì)和炎癥細(xì)胞浸潤，大量白細(xì)胞分布于虹膜、睫狀體基質(zhì)內(nèi)和前、后房；玻璃體腔近視網(wǎng)膜內(nèi)表面有大量炎癥細(xì)胞；視網(wǎng)膜增厚，可見炎癥細(xì)胞浸潤。20μgWP-17干預(yù)組，虹膜及睫狀體表面、基質(zhì)內(nèi)和玻璃體腔內(nèi)細(xì)胞滲出明顯減少，視網(wǎng)膜僅見少量炎癥細(xì)胞浸潤(圖6A、6B、6C)。3.小結(jié)通過建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎模型，經(jīng)臨床表現(xiàn)觀察及評分、房水炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白定量，以及大鼠眼球組織病理學(xué)觀察等實(shí)驗(yàn)，證實(shí)WP-17具有抑制炎性細(xì)胞浸潤和蛋白滲出，從而減輕炎癥反應(yīng)、緩解臨床癥狀的作用。實(shí)施例4WP-17對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響1.實(shí)驗(yàn)方法1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株和材料小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株RAW264.7，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM高糖培養(yǎng)基，購自美國GIBCO公司；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒購自美國R&D公司。1.2模型制作及干預(yù)試驗(yàn)RAW264.7細(xì)胞采用含10%胎牛血清（Fetalbovineserum,FBS）、100U/ml青霉素和鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為2.5×105/ml接種于24孔板。待細(xì)胞貼壁良好且生長融合至80-90%時(shí)，更換不含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行血清饑餓培養(yǎng)24小時(shí)。將RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、LPS組、LPS+WP-17組，每組設(shè)六個(gè)復(fù)孔。LPS組和LPS+WP-17組加入不同濃度的WP-17（0、1、10、50μM）和LPS（100ng/ml）500μl，空白對照組加入等體積DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，分別于6、16和24小時(shí)后收集細(xì)胞上清液。1.3TNF-α和IL-6濃度測定細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)處理24小時(shí)后，收集細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明分別測定RAW264.7細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的濃度。以450nm處的吸光度(A)值為縱坐標(biāo)，以試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出其濃度。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析(one-wayANOVA)分別比較各組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的濃度，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2.1TNF-α濃度測定空白對照組細(xì)胞上清液中僅含有少量的TNF-α（1.50±1.72pg/ml）；而LPS組細(xì)胞上清液中TNF-α的濃度約為空白對照組的190倍，為286.64±15.39pg/ml；WP-17的干預(yù)（1、10、50μM）明顯抑制了細(xì)胞上清液中TNF-α的表達(dá)水平，且抑制作用呈劑量依賴性，分別為236.40±15.14pg/ml，157.68±64.63pg/ml和61.76±21.76pg/ml，與LPS相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1<0.05，P2<0.01，P3<0.01）（圖7A）。2.2IL-6濃度測定空白對照組細(xì)胞上清液中幾乎未測出IL-6（1.75±0.78pg/ml）；LPS組細(xì)胞上清液中PGE2的水平明顯升高（188.20±17.75pg/ml）；WP-17的干預(yù)明顯抑制了細(xì)胞上清液中IL-6的表達(dá)水平，且抑制效果呈劑量依賴性，分別為161.60±18.64pg/ml，104.70±9.39pg/ml和51.38±4.79pg/ml，與LPS相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖7B）。3.小結(jié)巨噬細(xì)胞在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，本實(shí)驗(yàn)通過LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株RAW264.7建立炎癥細(xì)胞模型，用不同濃度的WP-17多肽進(jìn)行干預(yù)，通過分析細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的濃度，證實(shí)WP-17能夠抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，且作用存在劑量依賴性。實(shí)施例4WP-17細(xì)胞安全性試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)方法1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株和材料小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株RAW264.7，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM高糖培養(yǎng)基，購自美國GIBCO公司；MTS購自Promega公司，用PBS(pH6.0)配成300mmol/L，于-20℃避光保存。1.2模型制作及干預(yù)試驗(yàn)RAW264.7細(xì)胞采用含10%胎牛血清（Fetalbovineserum,FBS）、100U/ml青霉素和鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105/ml接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁良好且生長融合至80-90%時(shí)，更換不含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行血清饑餓培養(yǎng)24小時(shí)。1.3細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTS比色法）細(xì)胞經(jīng)血清饑餓培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入不同濃度的WP-17（0.1、1、10μM、100μM、1mM）100μl，每個(gè)濃度平行做6孔，空白對照組加入等體積DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)，每孔加入20μlMTS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，在酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm處測量各孔的吸光值，并計(jì)算細(xì)胞相對增殖率(RelativeGrowthRate，RGR)。公式：RGR=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對照組A值×100%。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析(one-wayANOVA)分別比較各組細(xì)胞相對增殖率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果各濃度組細(xì)胞相對增殖率分別為100.52±7.27%，100.90±6.84%，101.02±5.78%，99.07±10.49%和99.87±5.85%。不同濃度組之間兩兩比較顯示：WP-170.1、1、10μM、100μM、1mM組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖8）。3.小結(jié)通過檢測不同濃度WP-17對細(xì)胞相對增殖率的影響，可見在0.1-1mM濃度范圍內(nèi)WP-17對細(xì)胞無明顯毒性作用，實(shí)驗(yàn)中所使用的藥物濃度（0.1-10μM）在安全濃度范圍內(nèi)。實(shí)施例5多個(gè)候選序列效果比較應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，在MBP的CTLD結(jié)構(gòu)域中選定了另兩個(gè)候選序列，重復(fù)實(shí)施例1，進(jìn)行生物固相合成，并將合成的小肽命名為P1和P2（見表2）；重復(fù)實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)方法，將大鼠隨機(jī)分為5組，依次為正常對照組、LPS組、LPS+20μgP1組、LPS+20μgP2組和LPS+20μgWP-17組，通過內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎模型，對WP-17與兩個(gè)小肽抑制炎癥的效果進(jìn)行比較。表2對EIU大鼠分別行三種小肽玻璃體腔注射治療，24小時(shí)后進(jìn)行EIU臨床評分，房水炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)以及房水蛋白定量檢測，對三個(gè)小肽抑制炎癥的效果進(jìn)行比較。表3表3.各組EIU大鼠臨床評分、房水炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)以及房水蛋白定量值（n=6，##p<0.01vs正常對照組，**p<0.01vsLPS組，$p<0.01vsLPS+20μgWP-17組）結(jié)果表明：WP-17具有明顯抑制炎癥的作用，與LPS相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；P1、P2無明顯抑制炎癥的作用，各檢測數(shù)據(jù)與LPS相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且與WP-17相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖9）。小結(jié)通過內(nèi)毒素誘導(dǎo)葡萄膜炎模型進(jìn)行多個(gè)小肽的篩選和抗炎作用的比較，證實(shí)WP-17抑制炎癥的作用最顯著，由此提示了WP-17所處的區(qū)域可能為CTLD發(fā)揮抗炎作用的核心區(qū)域。實(shí)施例6眼藥水的制備利用常規(guī)技術(shù)，混合以下組分，制得1%眼藥水，其配方如下：WP-17肽10mg羥丙基甲基纖維素0.03g雙蒸水加至10ml調(diào)節(jié)滲透壓至300Osm，酸堿度(pH)至6.8-7.1。經(jīng)3位志愿者試用一周，每日2次，每次2滴/眼。結(jié)果表明該眼藥水可抑制眼部的炎癥。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。