針對(duì)內(nèi)體/溶酶體酶的抑制劑發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種多功能蛋白酶抑制劑，所述蛋白酶抑制劑可以與多種分子綴合。本發(fā)明還涉及所述蛋白酶抑制劑及其綴合物的應(yīng)用。發(fā)明背景蛋白酶抑制劑已經(jīng)作為一種強(qiáng)力的藥物種類出現(xiàn)1。其包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制劑、HIV蛋白酶的抑制劑和蛋白酶體抑制劑，諸如用來(lái)治療多發(fā)性骨髓瘤（multiplemyeloma）的硼替佐米（Bortezomib）(Velcade(萬(wàn)珂))2。由于其在寬泛種類的生物學(xué)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起重要作用，內(nèi)體-溶酶體途徑的蛋白酶常常被提議為治療靶標(biāo)3。例如，溶酶體半胱氨酸和天冬氨酰蛋白酶在一些錐蟲(chóng)物種中是驗(yàn)證的藥物靶標(biāo)4，并且某些內(nèi)體蛋白酶的上調(diào)與增加的惡性腫瘤（malignancy）相關(guān)5。天冬酰胺酰內(nèi)肽酶（AEP或legumain）也已經(jīng)參與了惡性黑素瘤（melanoma）的進(jìn)展6，參與對(duì)治療性藥物l-天冬酰胺酶的破壞和參與神經(jīng)興奮毒性（neuroexitotoxity）7。作為天然的半胱氨酸蛋白酶抑制劑的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)的下調(diào)可以導(dǎo)致增加的惡性腫瘤8和不完善的免疫應(yīng)答9。非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’slymphoma）中的組織蛋白酶D(CatD)的高表達(dá)也已經(jīng)與增加的惡性腫瘤相關(guān)10，并且還與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)11。由于最近的一些研究表明抗原呈遞細(xì)胞的內(nèi)體中的蛋白水解活性可能太高，導(dǎo)致抗原破壞和對(duì)T細(xì)胞的不充分的呈遞，所以，內(nèi)體蛋白酶抑制劑的另一種潛在的治療應(yīng)用可能是免疫調(diào)節(jié)。因此，蛋白酶抗性抗原通常引起更穩(wěn)健的免疫應(yīng)答12,13。綜合上述，似乎內(nèi)體/溶酶體蛋白酶活性的有效下調(diào)物可能是對(duì)治療“武器”的有價(jià)值的補(bǔ)充。然而，由于存在多個(gè)具有廣泛的功能冗余性的內(nèi)體蛋白酶家族14，因此，迄今為止，內(nèi)體/溶酶體蛋白酶功能的調(diào)控仍然是具有挑戰(zhàn)性的。還有另外一個(gè)問(wèn)題，在參考文獻(xiàn)中存在證據(jù)表明特定蛋白酶的敲低/抑制導(dǎo)致其他蛋白酶的上調(diào)3,15。大部分內(nèi)體蛋白酶屬于3個(gè)獨(dú)特的家族：存在一些木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶(PLCPs)，其包括組織蛋白酶L,S,B,C和幾種其他的蛋白酶16。除了這些以外存在與胃蛋白酶相關(guān)的天冬氨酰蛋白酶；組織蛋白酶D和E。最后，存在稱作天冬酰胺酰內(nèi)肽酶（AEP）或legumain的另一種半胱氨酸蛋白酶，其與半胱天冬酶(caspase)更加緊密相關(guān)17。這三種種類中的每一種都可以被不同的且不重疊的小分子抑制劑抑制18，但是，這些蛋白酶的體內(nèi)抑制或敲除通常表現(xiàn)出有限的表型或沒(méi)有表型，這最可能是由于功能冗余性引起。因此，我們認(rèn)為以內(nèi)體特異性方式抑制所有三個(gè)內(nèi)體蛋白酶家族將提供調(diào)節(jié)內(nèi)體/溶酶體功能的有效工具。PLCPs和AEP被天然存在的14kDa蛋白，即，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C有效抑制。所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑是一個(gè)小蛋白家族，其以納摩爾之下（sub-nanomolar）的親和力抑制PLCPs19。其存在于血流中，并且相信其在生理反應(yīng)和病理反應(yīng)過(guò)程中釋放的蛋白酶的清除過(guò)程中起作用。重要的是，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，以及一些家族成員，通過(guò)獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)以0.20nM的Ki抑制AEP20（圖1）。因此，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C代表用于合成泛內(nèi)體（pan-endosomal）蛋白酶抑制劑的一種極佳的構(gòu)架。組織蛋白酶D和E（內(nèi)體天冬氨酰蛋白酶）被胃蛋白酶抑制劑A以0.1nM的Ki抑制21，胃蛋白酶抑制劑A是一種首次從放線菌屬（Actinomyces）分離的異構(gòu)肽。其主要缺點(diǎn)在于其在水性介質(zhì)中的實(shí)質(zhì)不溶解性21。然而，由于不容易得到更可溶的備選物，因此，其仍然廣泛地使用，甚至用在基于細(xì)胞的測(cè)定中。已經(jīng)進(jìn)行了一些嘗試來(lái)解決這一問(wèn)題，諸如將胃蛋白酶抑制劑A綴合到去唾液酸糖蛋白(ASGP)上22，或者綴合到聚（乙二醇）上23，或者最近直接使其甘露糖基化，或者將其綴合到甘露糖基化的牛血清白蛋白上24。胃蛋白酶抑制劑的PEG化降低其抑制潛力400倍，并且綴合到甘露糖基化的BSA上降低Ki10倍，而綴合到ASGP上使得胃蛋白酶抑制劑沒(méi)有活性，直至蛋白骨架被消化。胃蛋白酶抑制劑與肽或熒光結(jié)構(gòu)部分的綴合沒(méi)有顯著改變其抑制潛力25。發(fā)明概述本發(fā)明部分是基于提供半胱氨酸蛋白酶抑制劑/天冬氨酰蛋白酶抑制劑綴合物，所述綴合物表現(xiàn)出多功能蛋白酶抑制活性。因此，在第一方面，提供包含半胱氨酸蛋白酶抑制劑/胃蛋白酶抑制劑A綴合物的多功能蛋白酶抑制劑。本發(fā)明人已經(jīng)觀察到，可以通過(guò)將胃蛋白酶抑制劑A（其本身是非常難溶的）綴合到半胱氨酸蛋白酶抑制劑上，諸如半胱氨酸蛋白酶抑制劑C上來(lái)形成高度水溶性的分子。此外，這樣的綴合物表現(xiàn)出針對(duì)下述蛋白酶種類中的至少兩種的抑制活性：半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酰蛋白酶；和/或天冬酰胺酰內(nèi)肽酶(AEP)。應(yīng)該理解，本文所述的綴合物的各種生理學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酰胺或其其他的生理學(xué)功能性衍生物也可以是適宜的，并且熟練的技術(shù)人員明白可以怎樣制備此類分子。因此，術(shù)語(yǔ)多功能應(yīng)該理解為意指本發(fā)明的綴合物具有針對(duì)至少兩種酶學(xué)上不同的蛋白酶的抑制活性，諸如一種半胱氨酸蛋白酶，和一種天冬氨酰蛋白酶和/或天冬酰胺酰內(nèi)肽酶，其抑制常數(shù)小于10μM。半胱氨酸蛋白酶抑制劑已經(jīng)進(jìn)展為抑制多種半胱氨酸蛋白酶，因此，盡管在任何一次僅可能接合一種蛋白酶分子（和一種AEP），但是其廣泛地抑制這一類型的蛋白酶。有利地，本發(fā)明人已經(jīng)能夠提供這樣的綴合物，所述綴合物在水溶液中顯著可溶，其在pH范圍為3-10、諸如4-8的水性緩沖液中，或在水本身中的溶解度大于50nM，但是典型地大于500nM，諸如在1μM的量級(jí)。這可以通過(guò)在半胱氨酸蛋白酶抑制劑分子和胃蛋白酶抑制劑A之間結(jié)合肽結(jié)構(gòu)部分而實(shí)現(xiàn)。典型地，任意增溶的肽的長(zhǎng)度可以為2-30個(gè)氨基酸，并且應(yīng)該是足夠親水的從而使疏水的抑制劑組分溶解。除了促進(jìn)溶解之外，該肽還可以允許所述綴合物靶向所需的組織、細(xì)胞等。以這種方式，所述肽本身可以便利地為本領(lǐng)域已知的靶向肽，或者所述肽可以通過(guò)進(jìn)一步修飾而能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)靶向結(jié)構(gòu)部分。典型地，所述肽結(jié)構(gòu)部分長(zhǎng)度大于4個(gè)氨基酸殘基，并且包含至少兩個(gè)具有在中性pH下帶電荷的側(cè)鏈、和/或具有親水性和/或極性側(cè)鏈的氨基酸。優(yōu)選地，所述肽可以包含一個(gè)或多個(gè)不影響所述綴合物抑制蛋白酶的能力的氨基酸殘基，例如，在中性pH下帶負(fù)電荷的氨基酸，或者具有羥基或羧酸側(cè)鏈的那些氨基酸?？梢允褂梅翘烊话被?，例如，在其側(cè)鏈攜帶疊氮基或炔烴官能性的那些氨基酸，諸如可以通過(guò)另外的化學(xué)或酶促反應(yīng)而被進(jìn)一步修飾的那些氨基酸，例如通過(guò)銅催化的Huisgen環(huán)化加成反應(yīng)或使用分選酶26。肽上的反應(yīng)性側(cè)鏈和/或修飾的殘基可以促進(jìn)抑制劑與另一結(jié)構(gòu)部分（諸如靶向蛋白）的共綴合，由此促使向特定細(xì)胞類型和組織的遞送（例如，進(jìn)一步的詳細(xì)描述參見(jiàn)正文和圖8）。增溶標(biāo)簽的一個(gè)具體實(shí)例是FLAG-標(biāo)簽27，但是可以使用其他的肽。典型地，半胱氨酸蛋白酶抑制劑與胃蛋白酶抑制劑A的綴合可以通過(guò)在半胱氨酸蛋白酶抑制劑分子上存在的半胱氨酸，或者半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以通過(guò)熟練的技術(shù)人員已知的誘變技術(shù)進(jìn)行修飾，以引入能夠促進(jìn)與胃蛋白酶抑制劑A的綴合的半胱氨酸結(jié)構(gòu)部分，任選地經(jīng)由增溶肽。通過(guò)賴氨酸的修飾，或通過(guò)由熟練技術(shù)人員已知的方法引入的非天然氨基酸的修飾，也是可能的28。熟練的技術(shù)人員能夠通過(guò)生物化學(xué)方式，或通過(guò)比較與已知的半胱氨酸蛋白酶抑制劑的序列類似性，或通過(guò)在蛋白質(zhì)X射線晶體結(jié)構(gòu)中確定抑制基序和選定的殘基的位置，來(lái)確定哪些殘基可能是適當(dāng)?shù)?，同時(shí)確保半胱氨酸蛋白酶抑制劑分子的蛋白酶抑制活性基本上保持不變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑是半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，并且允許胃蛋白酶抑制劑A綴合的優(yōu)選的殘基是蘇氨酸102，或精氨酸77，或亮氨酸117，如按照GenBank:CAA36497.1編號(hào)，所述殘基可以用半胱氨酸殘基替代，隨后半胱氨酸殘基能夠進(jìn)行反應(yīng)，從而允許與胃蛋白酶抑制劑A綴合，優(yōu)選地經(jīng)由增溶肽。所鑒定的殘基的修飾可以通過(guò)定點(diǎn)誘變進(jìn)行，例如，從而用允許與胃蛋白酶抑制劑A綴合的反應(yīng)性更高的殘基（諸如半胱氨酸或疊氮高丙氨酸）替代所述殘基。此外，還可以使用突變體和其他半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族抑制劑，其具有針對(duì)不同蛋白酶的不同的抑制模式。例如，可以突變半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的結(jié)合區(qū)，從而減少或改變特定蛋白酶或家族的抑制作用29。此外，還可以使用潛在的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，即半胱氨酸蛋白酶抑制劑F，其PLCP反應(yīng)性僅在攝入到細(xì)胞中后顯露出來(lái)（通過(guò)二聚體向單體的轉(zhuǎn)變）30。在第二方面中，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明的蛋白酶抑制劑綴合物分子以及其藥用載體的藥物組合物。從第三方面可見(jiàn)，本發(fā)明提供第一或第二方面的綴合物或制劑，或其生理學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酰胺或其他生理學(xué)功能性衍生物。其用于藥物中。從另一方面可見(jiàn)，本發(fā)明提供本發(fā)明的綴合物、或其生理學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酰胺或其他生理學(xué)功能性衍生物，其用于治療或預(yù)防疾病，特別是在需要抑制可能與特定疾病相關(guān)的蛋白酶的情形中，或者是在所述抑制可能促進(jìn)疾病的治療的情形中。所述疾病可以包括癌癥，炎性疾病，自身免疫疾病，寄生蟲(chóng)病，例如，錐蟲(chóng)?。═rypanosomiasis），和相關(guān)的溶酶體貯積?。╨ysosomalstoragediseases），諸如半乳糖唾液酸貯積癥（galactosialidosis）、戈謝病（Gaucher’sdisease）3及其他。從另一方面可見(jiàn)，本發(fā)明提供治療或預(yù)防與蛋白酶表達(dá)和/或功能相關(guān)的疾病/病癥的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的綴合物、或其生理學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酰胺或其他生理學(xué)功能性衍生物，或本發(fā)明的藥物制劑。從另一方面可見(jiàn)，本發(fā)明提供本發(fā)明的綴合物、或其生理學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯、酰胺或其他生理學(xué)功能性衍生物在制備用于本文所定義的任意的治療或預(yù)防的藥物中的應(yīng)用。從另一方面可見(jiàn)，本發(fā)明的綴合物/抑制劑可以用來(lái)通過(guò)減少疫苗已知的非生產(chǎn)性或破壞性加工的趨勢(shì)（參考文獻(xiàn)12和13）而特異性提高疫苗的性能。因此，本發(fā)明的綴合物還可以與其他藥劑（諸如其他治療劑）聯(lián)合施用，或可以作為疫苗的組分并且與免疫原性試劑聯(lián)合施用。所述其他治療劑的實(shí)例包括具有適當(dāng)佐劑的亞單位或肽疫苗，所述佐劑諸如固相或乳液載體、免疫系統(tǒng)佐劑和用以改善疫苗反應(yīng)的其他試劑。所述綴合物還可以添加到活細(xì)胞疫苗中，目的是提高其功效。對(duì)于與其他療法組合的活性綴合物的情形，兩種以上的治療可以分別給予不同的給藥時(shí)間表和/或通過(guò)不同途徑給予。綴合物和疫苗蛋白、任選地還與佐劑的混合物可以共同包封，例如共同包封在PLGA微球體、脂質(zhì)體或其他用于遞送目的的載體中。在另一個(gè)方面中，利用抑制劑的已證明的加強(qiáng)生長(zhǎng)因子受體信號(hào)傳導(dǎo)和減少其下調(diào)的能力（參見(jiàn)圖5a和5b），當(dāng)與生長(zhǎng)因子（諸如，但不限于EGF）聯(lián)合局部施用時(shí)，所述抑制劑可以輔助天然的傷口愈合過(guò)程。治療劑或預(yù)防劑與本發(fā)明的綴合物的組合將由醫(yī)師斟酌確定，醫(yī)師將使用其一般公知常識(shí)選擇劑量并選擇熟練的執(zhí)業(yè)者已知的給藥方案。當(dāng)本發(fā)明的綴合物以與一種、兩種、三種、四種或更多種、優(yōu)選一種或兩種、優(yōu)選一種其他的治療劑/預(yù)防劑的組合療法施用時(shí)，這些組分可以同時(shí)或序貫施用。當(dāng)序貫施用時(shí)，它們可以以緊密間隔的時(shí)間間隔（例如，在5-10分鐘的時(shí)期內(nèi)）施用，或者以更長(zhǎng)的時(shí)間間隔（例如，間隔1,2,3,4個(gè)或更多小時(shí)，或者需要時(shí)，間隔以甚至更長(zhǎng)的時(shí)期）施用，精確的給藥方案與所述治療劑的特性相稱。患者典型地為動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物，特別是人。治療或預(yù)防有效量的量意指能夠獲得需要的反應(yīng)的量，并且典型地將由醫(yī)學(xué)執(zhí)業(yè)者確定。所需要的量將取決于下述中的一種或多種：至少所考慮的一種或多種活性綴合物、患者、需要治療或預(yù)防的病癥和被治療的患者每kg體重1μg至1g綴合物的量級(jí)的制劑?？梢灶愃频亟o予不同的給藥方案，同樣典型地由醫(yī)學(xué)執(zhí)業(yè)者來(lái)斟酌確定。如下文提到的，本發(fā)明的化合物的低毒性及其對(duì)特定細(xì)胞類型的靶向性允許至少每日施用一次，例如，盡管本發(fā)明也包括更不頻繁地施用所述一種或多種化合物的方案，例如，每隔一天一次，每周一次或兩周一次。治療在本文中意指至少改善患者患有的病癥；所述治療不必是治愈性的（即，導(dǎo)致病癥的清除）。類似地，本文在本文中提及防止或預(yù)防不表示或需要完全防止病癥；而代之的是，其表現(xiàn)可以通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或防止而減輕或延緩。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用，本文所述的綴合物或其生理學(xué)可接受的鹽、溶劑化物、酯或其他生理學(xué)可接受的功能性衍生物可以以藥物制劑存在，所述藥物制劑包含所述綴合物或其生理學(xué)可接受的鹽、酯或其他生理學(xué)功能性衍生物，以及用于其的一種或多種藥用載體和任選地其他治療和/或預(yù)防成分。在與所述制劑的其他成分配伍并且對(duì)其接受者無(wú)害的意義上，任何載體是可接受的。根據(jù)本發(fā)明的綴合物的生理學(xué)可接受的鹽的實(shí)例包括與有機(jī)羧酸、有機(jī)磺酸和無(wú)機(jī)酸形成的酸加成鹽，所述有機(jī)羧酸諸如乙酸、乳酸、酒石酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、丙酮酸、草酸、延胡索酸、草酰乙酸、羥乙磺酸、乳糖酸和琥珀酸；所述有機(jī)磺酸如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和對(duì)甲苯磺酸，所述無(wú)機(jī)酸如鹽酸、硫酸、磷酸和氨基磺酸。本發(fā)明的化合物的生理學(xué)功能性衍生物是這樣的衍生物，其可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為母體綴合物。所述生理學(xué)功能性衍生物還可以稱為“前體藥物”或“生物前體”。本發(fā)明的綴合物的生理學(xué)功能性衍生物在體內(nèi)包括可水解的酯或酰胺，特別是酯。確定適當(dāng)?shù)纳韺W(xué)可接受的酯和酰胺也充分在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)。可以便利地或合乎需要地制備、純化和/或處理本文所述的綴合物的相應(yīng)的溶劑化物，所述溶劑化物可以用在所述的任一種應(yīng)用/方法中。術(shù)語(yǔ)溶劑化物用在本文中是指溶質(zhì)（如化合物或化合物的鹽）與溶劑的復(fù)合物。如果溶劑是水，則所述溶劑化物可以稱為水合物，例如，一水合物、二水合物、三水合物等，這取決于每分子底物中存在的水分子數(shù)目。應(yīng)該理解，本發(fā)明的綴合物可以以多種立體異構(gòu)形式存在，并且前文定義的本發(fā)明的化合物包括所有立體異構(gòu)形式及其混合物，包括對(duì)映體和外消旋混合物。本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括任意所述立體異構(gòu)形式或立體異構(gòu)體混合物的應(yīng)用。本發(fā)明的綴合物可以使用本領(lǐng)域容易獲得的試劑和技術(shù)和/或下文所述的示例性的方法來(lái)制備。藥物制劑包括適于口服、局部施用（包括皮膚、含服和舌下施用）、經(jīng)直腸或腸胃外（包括皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)和靜脈內(nèi)）、經(jīng)鼻和經(jīng)肺施用（例如通過(guò)吸入）的那些制劑。所述試劑在適當(dāng)時(shí)可以便利地以離散的劑量單位存在，并且可以通過(guò)制藥領(lǐng)域公知的任意方法制備。方法典型地包括下述步驟：使活性綴合物與液體載體或細(xì)碎的固體載體締合或與二者締合，然后，如果需要，將產(chǎn)物成形為所需的制劑。其中載體為固體的適于口服施用的藥物制劑最優(yōu)選以單位劑量制劑存在，諸如大丸劑、膠囊或片劑，其各自包含預(yù)先確定量的活性化合物。片劑可以通過(guò)壓制或模制制備，任選地與一種或多種輔助成分一起制備。壓制的片劑可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器內(nèi)壓制以自由流動(dòng)形式的活性化合物而制備，所述以自由流動(dòng)形式的活性化合物諸如任選地與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、潤(rùn)滑試劑、表面活性劑或分散劑混合的粉劑或顆粒劑。模制的片劑可以通過(guò)模制活性綴合物與液體稀釋劑而制備。片劑可以任選地被包衣，并且，如果是不包衣的，任選地可以是有刻痕的。膠囊可以通過(guò)將活性綴合物單獨(dú)的或與一種或多種輔助成分混合填充到膠囊殼中然后以常見(jiàn)方式密封所述膠囊而制備。扁囊劑與膠囊類似，其中活性化合物與任意的一種或多種輔助成分一起密封在米紙包膜中?；钚曰衔镆部梢耘渲茷榭煞稚⒌念w粒劑，例如，其可以在施用前混懸在水中，或者撒在食物上。顆粒劑可以進(jìn)行包裝，例如包裝在囊劑(sachet)中。其中載體為液體的適于口服施用的制劑可以作為在水性或非水性液體中的溶液或混懸劑存在，或者作為水包油液體乳劑存在。用于口服施用的制劑包括可控釋放的劑型，例如，其中活性綴合物配制在適當(dāng)?shù)目蒯尰|(zhì)中或者用適當(dāng)?shù)目蒯屇ぐ坏钠瑒?。此類制劑?duì)于預(yù)防應(yīng)用可能是特別便利的。其中載體是固體的適于直腸施用的藥物制劑最優(yōu)選地作為單位劑量栓劑存在。適當(dāng)?shù)妮d體包括可可脂和本領(lǐng)域常用的其他材料。栓劑可以便利地通過(guò)活性綴合物與軟化的或熔融的載體混合，然后在模具中淬火和成形而形成。適于腸胃外施用的藥物制劑包括活性綴合物在水性或油脂性賦形劑中的無(wú)菌溶液或混懸液。注射用制劑可以適于推注注射或連續(xù)的輸注。此類制劑便利地存在于單位劑量或多劑量容器中，所述容器在引入所述制劑后密封直到應(yīng)用需要時(shí)。備選地，活性綴合物可以是粉劑形式，其在使用前用適當(dāng)?shù)馁x形劑，如無(wú)菌、無(wú)熱原的水構(gòu)成?；钚跃Y合物還可以配制成長(zhǎng)期作用的長(zhǎng)效制劑，其可以通過(guò)肌內(nèi)注射或通過(guò)植入（例如，皮下或肌內(nèi)植入）而施用。長(zhǎng)效制劑可以包括，例如，適當(dāng)?shù)木酆衔镔|(zhì)或疏水物質(zhì)，或離子交換樹(shù)脂。此類長(zhǎng)期作用的制劑對(duì)于預(yù)防應(yīng)用是特別便利的。存在適于通過(guò)口腔進(jìn)行肺部施用的制劑，以使包含活性化合物且理想地直徑在0.5-7微米范圍內(nèi)的顆粒被遞送到接受者的支氣管樹(shù)中。作為一種可能性，所述制劑以細(xì)小粉碎的粉末形式存在，其可以便利地存在于可刺穿的膠囊中，例如，合適地，明膠膠囊中，用在吸入裝置中，或者備選地作為自推進(jìn)制劑存在，所述自推進(jìn)制劑包含活性化合物、適當(dāng)?shù)囊后w或氣體推進(jìn)劑和任選地其他成分，如表面活性劑和/或固體稀釋劑。適當(dāng)?shù)囊后w推進(jìn)劑包括丙烷和含氯氟烴（chlorofluorocarbons），適當(dāng)?shù)臍怏w推進(jìn)劑包括二氧化碳。還可以應(yīng)用這樣的自推進(jìn)制劑，其中活性綴合物以溶液或混懸液的小滴形式分散。所述自推進(jìn)制劑與本領(lǐng)域已知的那些類似，并且可以通過(guò)確定的程序制備。適當(dāng)?shù)兀鼈兇嬖谟谌萜髦?，所述容器提供有可手?dòng)操作的或自動(dòng)作用的具有需要的噴霧特征的閥門(mén)；有利地，所述閥門(mén)是在其每次操作時(shí)遞送固定體積（例如，25-100微升）的計(jì)量類型。作為另一個(gè)可能性，活性化合物可以采用用于在霧化器或噴霧器中的溶液或混懸液形式，由此應(yīng)用加速的氣流或超聲攪拌從而產(chǎn)生用于吸入的細(xì)小的小滴噴霧。適于鼻部施用的制劑包括通常與上文關(guān)于肺部施用所述的那些制劑類似的制劑。當(dāng)分散時(shí)，所述制劑應(yīng)該理想地具有10-200微米范圍內(nèi)的顆粒直徑，從而能夠保留在鼻腔中；適當(dāng)時(shí)，這可以通過(guò)使用適當(dāng)粒徑的粉劑或選擇適當(dāng)?shù)拈y門(mén)而實(shí)現(xiàn)。其他適當(dāng)?shù)闹苿┌w粒直徑在20-500微米范圍內(nèi)的粗粉劑，用于通過(guò)從緊挨鼻子固定的容器經(jīng)由鼻道快速吸入而施用，和在水性或油性溶液或混懸液中包含0.2-5%w/v的活性綴合物的鼻滴劑。應(yīng)該理解，除了前述載體成分之外，上述藥物制劑還可以包括適當(dāng)?shù)囊环N或多種另外的載體成分，諸如稀釋劑、緩沖劑、調(diào)味劑、粘合劑、表面活性劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑（包括抗氧化劑）等，以及為使所述制劑與目的接受體的血液等滲目的所包括的物質(zhì)。藥用載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且包括，但不限于，0.1M、優(yōu)選0.05M的磷酸鹽緩沖液或0.8%的鹽水。另外，藥用載體可以是水性或非水性的溶液、混懸液和乳液。非水性溶劑的實(shí)例是丙二醇、聚乙二醇、植物油（如橄欖油）和注射用有機(jī)酯（如油酸乙酯）。水性載體包括水、醇/水性溶液、乳液或混懸液，包括鹽水和緩沖的介質(zhì)。腸胃外賦形劑包括氯化鈉溶液、Ringer's右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸鹽Ringer's或不揮發(fā)性油。也可以存在防腐劑和其他的添加劑，諸如例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。適于局部制劑的制劑可以提供為例如凝膠、乳膏或軟膏劑。例如，所述制劑可以應(yīng)用在傷口或潰瘍上，通過(guò)直接涂抹在傷口或潰瘍表面上或者負(fù)載在適當(dāng)?shù)闹С治铮ㄈ缈噹?、沙布、網(wǎng)等）上，所述支持物可以應(yīng)用到待治療的區(qū)域處并且應(yīng)用在該區(qū)域上。也可以提供液體或粉末制劑，其可以噴霧或直接撒在待治療部位上，例如，傷口或潰瘍上。備選地，諸如繃帶、沙布、網(wǎng)等的載體可以噴上或撒上所述制劑，然后再應(yīng)用到待治療部位。用于獸醫(yī)用途的治療制劑可以便利地采用粉劑或液體濃縮形式。按照標(biāo)準(zhǔn)的獸醫(yī)制劑實(shí)踐，常規(guī)的水溶性賦形劑，諸如乳糖或蔗糖，可以摻和在所述粉劑中以改善其物理特性。因此，本發(fā)明的特別適合的粉劑包含50-100%w/w、優(yōu)選60-80%w/w的活性成分和0-50%w/w且優(yōu)選20-40%w/w的常規(guī)獸醫(yī)賦形劑。這些粉劑可以添加到動(dòng)物飼料中，例如，通過(guò)中間預(yù)混合物的方式添加，或者稀釋在動(dòng)物飲用水中。本發(fā)明的液體濃縮物適當(dāng)?shù)匕鼍Y合物或其衍生物或其鹽，并且可以任選地包括獸醫(yī)用水混溶性溶劑，例如聚乙二醇、丙二醇、甘油、甘油福爾馬林或與多至30%v/v的乙醇混合的此類溶劑。所述液體濃縮物可以施加在動(dòng)物的飲用水中。詳述現(xiàn)在將參考下述附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述附圖顯示：圖1a顯示作為所有3種主要的內(nèi)體蛋白酶家族：木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶(PLCP)、天冬氨酰蛋白酶(Cat-D/E)和天冬酰胺內(nèi)肽酶的潛在抑制劑(CPI)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑-胃蛋白酶抑制劑綴合物的圖示；圖1b鑒別被檢測(cè)的三種不同的半胱氨酸蛋白酶抑制劑突變體。挑選關(guān)于溶劑可及性、以及關(guān)于其位置的突變位點(diǎn)，排除作為抑制基序的一部分的殘基（通過(guò)虛線圓圈突出顯示）。選擇了三個(gè)突變，一個(gè)在b-片層上(R77C)，一個(gè)在a-螺旋上(L117C)，并且一個(gè)在蛋白的非結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)(T102C)。圖1c顯示在存在5ng組織蛋白酶L/孔的條件下通過(guò)連續(xù)稀釋不同的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C突變體（濃度以mM計(jì)）確定的三種突變體的相對(duì)抑制率。圖2a顯示作為所有3種主要的內(nèi)體蛋白酶家族：木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶(PLCP)、天冬氨酰蛋白酶(Cat-D/E)和天冬酰胺酰內(nèi)肽酶的潛在抑制劑(CPI)的4種優(yōu)選的半胱氨酸蛋白酶抑制劑-胃蛋白酶抑制劑綴合物。圖2b顯示綴合物4,5和6的質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及綴合物7的用抗-FLAG27抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。圖3顯示蛋白酶的抑制結(jié)果：1-3：半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(紅色)、胃蛋白酶抑制劑(藍(lán)色)或CPI(黑色)抑制重組的cathL(PLCP)、AEP和cathD(天冬氨酰蛋白酶)。4-6：通過(guò)熒光底物的周轉(zhuǎn)測(cè)量的樹(shù)突細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物中的這些相同的酶的抑制。7：在將抑制劑喂飼活的樹(shù)突細(xì)胞后檢測(cè)殘留的裂解后蛋白酶活性。8：使用猝滅的熒光團(tuán)酪蛋白底物測(cè)量的在喂飼構(gòu)建體后活免疫細(xì)胞中殘留的蛋白酶活性。圖4：顯示巨噬細(xì)胞溶酶體蛋白對(duì)apo-HRP降解的抑制作用。PBS和胃蛋白酶抑制劑A不保證保護(hù)。半胱氨酸蛋白酶抑制劑C似乎僅保護(hù)片段。CPI保護(hù)不穩(wěn)定的抗原恢復(fù)至野生型HRP水平。圖5a：CPI阻止EGF受體下調(diào)并且維持信號(hào)傳導(dǎo)。(A)在用或不用CPI或人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(～0.35mg/ml)預(yù)溫育后，用EGF刺激COS7細(xì)胞多至90分鐘。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定EGF受體的下調(diào)（上圖）以及磷酸化-Erk1/2(p42/44MAP激酶；中圖)和Rsk2的水平，從而評(píng)估總的細(xì)胞蛋白負(fù)荷。(B)對(duì)A中所示的數(shù)據(jù)的量化。圖5b：顯示細(xì)胞中用EGF刺激時(shí)CPI對(duì)EGF-EGFR復(fù)合物的壽命的影響。通過(guò)共聚焦顯微鏡可以觀察到在存在所述抑制劑時(shí)，EGFR受體的分解減慢。圖6a：顯示確定卵白蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制劑c在氧化鐵佐劑上的負(fù)載水平。通過(guò)針對(duì)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C和卵白蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析等量的修飾的氧化鐵。三種不同濃度的卵白蛋白與固定量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑c、胃蛋白酶抑制劑A或半胱氨酸蛋白酶抑制劑-胃蛋白酶抑制劑一起負(fù)載。圖6b：顯示如在圖6a中用或不用蛋白酶抑制劑確定的OT-I(上部)和OT-II(下部)T-細(xì)胞針對(duì)與攜帶三種不同量的卵白蛋白的構(gòu)建體溫育的樹(shù)突細(xì)胞的反應(yīng)。圖6c顯示通過(guò)共同包封抗原與CPI對(duì)I類MHC的改善的抗原呈遞（交叉呈遞）。將PLGA微球體滴定在96孔板中，并且通過(guò)加入鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(～5x104/孔)和OTIT細(xì)胞(～5x102/孔)測(cè)量卵白蛋白呈遞。(i)～72小時(shí)后，加入1μCi3H-胸苷測(cè)量T細(xì)胞增殖。16小時(shí)后收集細(xì)胞，并且通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量3H摻入。備選地，(ii)72小時(shí)后，取出上清液的等分試樣，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定測(cè)量IL-2的產(chǎn)生。圖6d顯示通過(guò)共同包封抗原與CPI對(duì)II類MHC的改善的抗原呈遞。條件與圖6c中的條件相似，不同在于使用OTII（II類MHC限制型的）T細(xì)胞替代OTI。圖6e顯示通過(guò)與CPI共同包封在體內(nèi)改善的卵白蛋白抗原的呈遞。用不同種類的包含卵白蛋白的PLGA微球體免疫C57BL/6小鼠，并且另外負(fù)載CFSE標(biāo)記的T細(xì)胞。（見(jiàn)方法概述）。將卵白蛋白與強(qiáng)佐劑alum混合作為陽(yáng)性對(duì)照。然后，通過(guò)在引流注射部位（尾巴的皮下(sub-cut.)基底）的淋巴結(jié)中的CFSE稀釋測(cè)量T細(xì)胞增殖。T細(xì)胞還用抗-CD8抗體染色，以區(qū)分OTI和OTII細(xì)胞。(i)最左側(cè)的圖顯示原始FACS數(shù)據(jù)，而中間和右側(cè)的圖顯示OTI(中間)和OTII(右側(cè))在不同細(xì)胞倍增時(shí)的T細(xì)胞數(shù)目的柱狀圖。(ii)通過(guò)積分細(xì)胞倍增數(shù)據(jù)的總共累積的T細(xì)胞。該數(shù)據(jù)揭示了OT1和OTII二者擴(kuò)充的等級(jí)性。如預(yù)測(cè)的，Ova/Alum促進(jìn)最強(qiáng)的擴(kuò)充，而Ova/CPIPLGA促進(jìn)比OvaPLG更強(qiáng)的擴(kuò)充。圖7：使用對(duì)組織蛋白酶B/L/S樣活性或組織蛋白酶D/E樣活性特異性的底物確定的布氏錐蟲(chóng)（T.brucei）細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中半胱氨酸蛋白酶活性和天冬氨酰蛋白酶活性的抑制。圖8：顯示可以用于連接蛋白酶抑制劑與另一種結(jié)構(gòu)部分的一些構(gòu)建體，所述另一種結(jié)構(gòu)部分例如靶向基團(tuán)，或具有靶向基團(tuán)的復(fù)合物。材料和方法卵白蛋白購(gòu)自西格瑪-奧德里奇（Sigma-Aldrich）(A5503)或Worthingtons(LS3056；在體外消化)，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C購(gòu)自Genway(11-511-248839)。牛血清白蛋白和肌紅蛋白（來(lái)自馬心臟）購(gòu)自西格瑪-奧德里奇（Sigma-Aldrich）?？?卵白蛋白獲自Polysciences(2344-5)，抗-5His購(gòu)自Quiagen(34660)，抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(mAb1196)和重組組織蛋白酶來(lái)自R&D系統(tǒng)（R&Dsystems）。胃蛋白酶抑制劑A和熒光底物購(gòu)自Bachem。NBoc-l-半胱氨酸甲烷硫代磺酸鹽購(gòu)自多倫多研究化學(xué)品（TorontoResearchChemicals）(B646250)。克隆并表達(dá)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C‐T102C‐6His突變體如之前所述1使用下述引物擴(kuò)增半胱氨酸蛋白酶抑制劑C：CysCFor(caggattacaattggtaccatggccgggcccc)和CysCRev(gcctactcgagcttaatgatgatgatgatgatggtcctgacag)，從而引入C-端6-組氨酸標(biāo)簽。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到之前2所用的pcDNA-DHFR載體的XhoI和KpnI限制性位點(diǎn)之間。使用NAccess軟件3基于人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C4和結(jié)構(gòu)域-交換的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C5的晶體結(jié)構(gòu)確定蘇氨酸102是溶劑可及的。該殘基也是遠(yuǎn)離木瓜蛋白酶樣組織蛋白酶和天冬酰胺內(nèi)肽酶二者的抑制基序的殘基6。使用引物CysCT102Cfor(caggtgtaccaagtgccagcccaacttgg)和CysCT102Crev(ccaagttgggctggcacttggtacacgtg)引入突變。將DHFR-陰性CHO細(xì)胞生長(zhǎng)在基于DMEM的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中含有10%透析的FCS，5mM谷氨酰胺和0.1mM次黃嘌呤以及0.01mM胸苷。在使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體用DHFR-CysC-T102C-6His質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，去除次黃嘌呤和胸苷補(bǔ)充物，并且將細(xì)胞在15cm培養(yǎng)皿中以低密度（每培養(yǎng)皿104個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)在含有20nM甲氨蝶呤(MTX)的培養(yǎng)基中。2天后，培養(yǎng)基替換為含有50mMMTX的培養(yǎng)基。細(xì)胞在5%CO2，37℃繼續(xù)生長(zhǎng)2天，此時(shí)開(kāi)始形成單個(gè)集落。挑取這些集落并且放置在96孔平板（經(jīng)組織培養(yǎng)物處理的）中的含有100nM甲氨蝶呤的培養(yǎng)基中。使用抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體MAB1196(R&D系統(tǒng)，小鼠抗-人CysC；1:3000稀釋液)評(píng)估所述集落的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C表達(dá)水平，并且收集產(chǎn)量最高的克隆并轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)皿中。在其中允許所述克隆生長(zhǎng)至80%匯合，然后加入含有增加量的MTX（多至2mM）的培養(yǎng)基。在最終的MTX-濃度下，選擇一個(gè)克隆(SvKD2-25-A7)用于大規(guī)模生產(chǎn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C。將該克隆在10225cm2組織培養(yǎng)瓶中在含有2mMMTX的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至匯合。將細(xì)胞在37℃培育2周，然后收集上清液。將上清液(2L)的pH調(diào)節(jié)至8.0，并且加入NaCl至終濃度為250mM。通過(guò)0.22μm濾器過(guò)濾上清液，然后使其在4℃通過(guò)6mL的NiNTA瓊脂糖(Quiagen)。用10個(gè)柱體積的50mMNaPO4,300mMNaCl(pH8.3)和5個(gè)柱體積的含有5mM咪唑的相同緩沖液洗滌該樹(shù)脂。通過(guò)用2x8mL含有500mM咪唑的緩沖液輕輕搖動(dòng)所述瓊脂糖，然后洗脫，而將所結(jié)合的蛋白洗脫下來(lái)。使洗脫物以1.5mL分批通過(guò)SuperdexG75柱（GEHealthcare，XK26/60）。匯集包含純半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的級(jí)分，并且通過(guò)超濾(MWCO6-8000)濃縮，產(chǎn)生21mL0.8mg/mL的蛋白溶液（通過(guò)UV吸光度確定）。質(zhì)譜（還原后）：延伸合成方案胃蛋白酶抑制劑A‐N‐羥基琥珀酰亞胺基酯(1a)將胃蛋白酶抑制劑(147mg,0.21mmol)溶解在DMF(15mL)中。加入N‐羥基琥珀酰亞胺(217mg,1.4mmol)和1‐乙基‐3‐(3‐二甲基氨基丙基)碳二亞胺(323mg,1.7mmol)，并且將混合物在室溫?cái)嚢?3小時(shí)。將混合物在高真空下濃縮，產(chǎn)生玻璃樣固體，將其用水(3x15mL)和二乙醚(3x15mL)洗滌，產(chǎn)生胃蛋白酶抑制劑A‐N‐羥基琥珀酰亞胺基酯的白色粉末(153mg，產(chǎn)率93%)。m/z(ESI+)觀察值783.4;計(jì)算值:783.5;1HNMR(300MHz,DMSO)δ7.91(d,J=7.3Hz,1H,NH),7.80(dd,J=11.3,9.0Hz,2H,2xNH),7.46(t,J=9.2Hz,2H2xNH),5.27(d,J=5.8Hz,1H,OH),4.82(d,J=5.0Hz,1H,OH),4.33–4.07(m,3H),3.83–3.94(m,4H),2.80(s,4H,HOSu),2.71(dd,J=16.5,2.2Hz,2H),2.21–1.84(m,5H),1.67–1.46(m,2H),1.47–1.23(m,4H),1.19(d,J=7.1Hz,3H,CH3),0.97–0.72(m,30H,10xCH3)。13CNMR(75MHz,DMSO)δ172.34,171.54,171.09,170.72,170.64,170.05,167.38,68.96,68.37,57.95,57.80,50.64,50.53,48.26,44.38,40.36,40.08,39.80,39.52,39.24,38.96,38.68,38.49,35.27,30.28,30.03,25.62,25.39,24.16,23.37,23.24,22.22,21.76,21.62,19.26,19.22,18.31,18.27,18.09。胃蛋白酶抑制劑A‐賴氨酸(2)將胃蛋白酶抑制劑(164mg,0.21mmol)溶解在DMF(20mL)中。加入FMoc-賴氨酸（77.2mg,0.21mmol）并且在室溫?fù)u動(dòng)2天。將反應(yīng)混合物在真空下濃縮，并且在凍干之前用0.1MHCl溶液(2x2x50mL)和水(6x50mL)洗滌，產(chǎn)生148mg白色固體，其可以通過(guò)HPLC進(jìn)一步純化。m/z(ESI+)觀察值:1036.6;計(jì)算值1036.6。1HNMR(300MHz,DMSO)δ7.91–7.29(m,15H,7xNH&Ar-H),4.84(s,2H,2xOH),4.33–4.05(m,6H),3.98–3.67(m,5H),3.02(dt,J=11.8,6.5Hz,2H),2.20–1.81(m,9H),1.77–1.22(m,15H),1.20(d,J=7.0Hz,3H),0.95–0.66(m,30H,10xCH3)。13CNMR(75MHz,DMSO)δ173.92,172.14,171.54,171.07,170.82,170.67,170.62,156.11,143.81,143.77,140.67,127.60,127.03,125.24,120.06,69.15,69.01,65.57,57.96,57.78,53.74,50.71,50.42,48.33,46.63,44.38,40.35,40.07,30.41,30.28,30.05,28.68,25.62,24.14,23.40,23.22,23.05,22.21,21.89,21.61,19.26,19.21,18.34,18.26,18.13。胃蛋白酶抑制劑‐Lys‐肽‐MTS3通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Fmoc‐固相肽化學(xué)使用Pybop作為偶聯(lián)劑在SyroI肽合成儀上合成。胃蛋白酶抑制劑-賴氨酸-Fmoc的偶聯(lián)反應(yīng)24小時(shí)。–在合成的最后一步使用標(biāo)準(zhǔn)Pybop偶聯(lián)條件（4倍過(guò)量的氨基酸和偶聯(lián)劑）人工引入Boc‐半胱氨酸MTS(TRCResearchChemicals)。m/z(ESI+)觀察值:1036.6;計(jì)算值1036.6。合成半胱氨酸蛋白酶抑制劑‐胃蛋白酶抑制劑綴合物(4)以類似的方式制備了另外三種綴合物5、6和7，這表明多種肽接頭結(jié)構(gòu)部分是適用的。向半胱氨酸蛋白酶抑制劑C‐T102C‐6His溶液(在PBS中1mg/mL,2.5mL)中加入DTT至終濃度為20mM。將混合物在室溫輕輕搖動(dòng)15分鐘，并且通過(guò)SephadexG‐25樹(shù)脂(GEHealthcare)緩沖液交換至磷酸鹽緩沖液(pH8.5,100mM磷酸鹽,300mMNaCl)中。向還原的蛋白(50μM3.5mL)中以1小時(shí)的時(shí)間間隔分4份加入3在DMSO中的溶液(2mM,4x50μL)。在表征之前，通過(guò)6His‐親和層析純化修飾的蛋白，然后進(jìn)行透析(PBS,6000‐8000MWCO,3x4L)。蛋白酶抑制研究所有的蛋白酶抑制研究在具有如前所述1-2,9-10的360nm激發(fā)和460nm發(fā)射波長(zhǎng)濾光器的FLUOstarOptima熒光計(jì)(BMG)上按照先前所述7-9進(jìn)行。重組的組織蛋白酶D和組織蛋白酶S購(gòu)自R&D系統(tǒng)。重組的天冬酰胺內(nèi)肽酶如前所述2進(jìn)行表達(dá)和激活。抑制天冬酰胺內(nèi)肽酶(AEP)向在測(cè)定緩沖液(50mMNaOAc,300mMNaCL,pH4.5,50μL)中的AEP(100ng/孔)中加入10μL抑制劑（在PBS中）。然后，將平板在室溫溫育20分鐘。然后加入ZAla‐Ala‐Asp‐MEC(100μM,Bachem,60μL)，并且通過(guò)熒光光譜法隨時(shí)間測(cè)量7-氨基-4-甲基香豆素釋放。將初始速率針對(duì)抑制劑濃度繪圖10。組織蛋白酶D活性的抑制研究組織蛋白酶D抑制研究如前所述9進(jìn)行。組織蛋白酶L的抑制研究向在測(cè)定緩沖液(25mMMES,pH5.5,30μL)中的激活的小鼠組織蛋白酶L(R&D系統(tǒng),0.25ng/μL)溶液中加入半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(從1.4μM開(kāi)始)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑‐胃蛋白酶抑制劑和單獨(dú)的胃蛋白酶抑制劑的各種連續(xù)稀釋液。將混合物在室溫輕輕搖動(dòng)5分鐘，然后加入Z‐Leu‐Arg‐AMC(在測(cè)定緩沖液中40μM，由1mMDMSO儲(chǔ)液制備)。通過(guò)熒光光譜法隨時(shí)間測(cè)量7-氨基-4-甲基香豆素釋放。將初始速率針對(duì)抑制劑濃度繪圖11。抑制樹(shù)突細(xì)胞或布氏錐蟲(chóng)溶胞產(chǎn)物中的蛋白酶將來(lái)自C57/B-6小鼠的三個(gè)脾臟或109個(gè)布氏錐蟲(chóng)前鞭毛體在玻璃勻漿器中在16mL檸檬酸鹽緩沖液(200mM,pH5.5)中勻漿。細(xì)胞通過(guò)重復(fù)的冷凍/解凍循環(huán)（6個(gè)循環(huán)）進(jìn)行裂解。通過(guò)以18,000g離心30分鐘澄清上清液。澄清的上清液具有5mg/mL的蛋白濃度。在同重組蛋白酶相同的抑制測(cè)定中使用20μg溶胞產(chǎn)物作為蛋白酶來(lái)源。在活的骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞中抑制內(nèi)體-溶酶體蛋白酶活性向如前所述12來(lái)源于骨髓前體的樹(shù)突細(xì)胞的混懸液(107個(gè)細(xì)胞,100μL)中加入抑制劑(70μM;在PBS中100μL)。將細(xì)胞在37℃，5%CO2溫育3小時(shí)。向每管中加入1mL冷的具有10%FCS的cRPMI，并且通過(guò)離心收集細(xì)胞。在裂解(50μL;50mM檸檬酸鹽,1%TritonX-100,pH5.0)之前，將細(xì)胞用培養(yǎng)基洗滌3次。如前所述1，使用5μg的該蛋白混合物來(lái)確定殘留的蛋白水解活性。使用純化的巨噬細(xì)胞溶酶體檢測(cè)Enzcheck底物將使用Percoll密度梯度分級(jí)分離從骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞分離的溶酶體(400ng/μL,10μL)重懸在測(cè)定緩沖液(100mM檸檬酸鹽,2mMDTT,pH4.5,0.5%v/vtritonX-100;590μL)中。將50μL這種稀釋的溶酶體混懸液一式三份涂布在96孔平底平板上。向每組三個(gè)孔中加入10μL的半胱氨酸蛋白酶抑制劑、胃蛋白酶抑制劑或CPI(終濃度為3μM)，PBS作為對(duì)照。將混合物在室溫溫育20分鐘，然后加入EnzChek底物(Invitrogen,目錄號(hào)E6638,在測(cè)定緩沖液中20μg/mL)。在37℃在熒光平板讀數(shù)儀上每5分鐘測(cè)量熒光出現(xiàn)（激發(fā)485nm；發(fā)射530nm）。將熒光出現(xiàn)的初始速率針對(duì)每種抑制劑繪圖。使用Enzchek底物確定活細(xì)胞中的蛋白水解抑制將A20細(xì)胞(5x106/mL;100μL/孔)涂布在96孔平板中。向每個(gè)孔中加入抑制劑(在PBS+1%DMSO中28μM;50μL)，并且將細(xì)胞在37℃,5%CO2中溫育30分鐘。這一時(shí)間之后，加入Enzchek(Invitrogen,目錄號(hào)E6638，在DMEM+10%FCS中20μg/mL)，并且在37℃在熒光平板讀數(shù)儀上每小時(shí)測(cè)量熒光出現(xiàn)（激發(fā)485nm;發(fā)射530nm）。將熒光出現(xiàn)的速率針對(duì)每種抑制劑繪圖。用純化的溶酶體在體外消化蛋白將使用Percoll密度梯度分級(jí)分離從骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞分離的溶酶體(400ng/μL,3.6μL)重懸在測(cè)定緩沖液(50mM檸檬酸鹽,pH4.5,0.5%TritonX‐100;59μL)中。加入抑制劑(70μM;在PBS+5%DMSO中12μL)，并且將混合物溫育15分鐘。向所述混合物中加入蛋白底物(在PBS中1mg/mL，9μL)，并且在37℃溫育反應(yīng)物。在指定的時(shí)間點(diǎn)，取出20μL反應(yīng)混合物，用LDS‐樣品緩沖液煮沸，并且通過(guò)SDS‐PAGE分析。確定CPI對(duì)EGF-信號(hào)傳導(dǎo)的影響將在12孔組織培養(yǎng)板中生長(zhǎng)的COS7細(xì)胞用或不用半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(0.35mg/ml)或CPI(0.32mg/ml)預(yù)先溫育1小時(shí)，然后用100ng/mlEGF刺激所示的時(shí)間。將細(xì)胞從孔中刮到50μl含有50mMTris,150mMNaCl,1mMEGTA,1mMEDTA,1%NP40加蛋白酶抑制劑(Roche,小蛋白酶（Miniprotease）片)的裂解緩沖液中。等分試樣在SDS樣品緩沖液中加熱并且在4x12%MOPS%凝膠(Invitrogen)上運(yùn)行。在轉(zhuǎn)移到HybondECL膜上后，用兔抗-EGF受體抗體(SantaCruz)，之后是綴合過(guò)氧化物酶的驢抗-兔(Jackson)和標(biāo)準(zhǔn)ECL流程(Millipore)顯現(xiàn)EGF受體。然后將印跡剝離，并且針對(duì)磷酸化-Erk（phosphor-Erk）(p42/44MAP激酶;細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)(Cellsignalling))重新探測(cè)，Rsk2(SantaCruz)和適當(dāng)?shù)亩?jí)抗體作為上樣對(duì)照。使用ImageJ分析軟件定量信號(hào)。免疫熒光(IF)顯微鏡檢按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行IF。為了顯現(xiàn)熒光底物加工（Enzchek，見(jiàn)下文），在蓋玻片上生長(zhǎng)鼠A20B-細(xì)胞胚細(xì)胞（A20B-cellblasts），并且在存在或不存在所示的蛋白酶抑制劑(20μM)時(shí)在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下用enzchek（終濃度為1μg/mL）溫育5小時(shí)。在處理之后，將細(xì)胞用在PBS中3.7%的多聚甲醛固定，用TritonX-100滲透化處理(在PBS中0.1%)，并且針對(duì)CD63免疫染色，用抗-小鼠二級(jí)抗體-Alexa647綴合物在LeicaSP-2共聚焦顯微鏡上使用63x放大倍數(shù)物鏡顯像。EGFR胞吞和運(yùn)輸?shù)姆治鋈缜八鲞M(jìn)行，具有下述修改。在蓋玻片上生長(zhǎng)HeLa細(xì)胞，在存在或不存在CPI(20μM;0.1%FCS，在DMEM-PBS1:1中)進(jìn)行血清饑餓，并且用EGF（終濃度為100ng/mL）刺激5分鐘或90分鐘。按照前述制備樣品。使用裝配有63x放大倍數(shù)物鏡的LeicaSP-2共聚焦顯微鏡采集所有的圖像。使用ImageJ進(jìn)行圖像后處理和數(shù)據(jù)分析。圖像定量是基于每次實(shí)驗(yàn)每種條件25-50個(gè)細(xì)胞，并且使用標(biāo)準(zhǔn)的斯氏T檢驗(yàn)計(jì)算顯著性。合成并分析由模式抗原和蛋白酶抑制劑組成的模式疫苗通過(guò)將模式抗原卵白蛋白和所有三種種類的蛋白酶的抑制劑二者綴合到固相佐劑上而合成疫苗構(gòu)建體。將His-標(biāo)簽化的蛋白綴合到氧化鐵納米顆粒上將Talon-修飾的氧化鐵珠子溶解在500μL的pH8.0具有0.02%吐溫20的100mM磷酸鹽緩沖液，600mMNaCl中。加入卵白蛋白-6His（0.3nmol;20μL0.23mg/mL溶液，1:2連續(xù)稀釋），將混合物在室溫?fù)u動(dòng)(1000rpm)2小時(shí)。然后，將樣品分成2等份。一份繼續(xù)搖動(dòng)。向另一份中加入0.3nmol的半胱氨酸蛋白酶抑制劑-胃蛋白酶抑制劑-綴合物-6His。然后將所述溶液繼續(xù)搖動(dòng)2小時(shí)。在這一時(shí)間期間后，在Dynal-顆粒集中器磁體（Dynal-particleconcentratormagnet，MPC-S）上收集所述顆粒，并且重懸在PBS(1.5mL)中。將所述顆粒重新集中并且用另外3份PBS洗滌。將純化的顆粒重懸在50μlPBS中。確定疫苗制劑中鐵的量基于Perry等31報(bào)道的紅菲咯啉（bathophenantroline）測(cè)定，使用該測(cè)定確定修飾的顆粒的鐵含量。確定卵白蛋白和蛋白酶抑制劑負(fù)荷將150μg顆粒(30μL)用LDS-樣品緩沖液(Invitrogen;NuPAGE)稀釋，并且在12%NuPAGESDS-凝膠(Invitrogen)上分析。將蛋白內(nèi)容物通過(guò)半干燥轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上。將該膜在室溫用在具有0.1%吐溫20的PBS中的5%w/v脫脂奶粉封閉1小時(shí)。在這一時(shí)間后，將抗-卵白蛋白(Polysciences,2344-5,5mg/mL,1:5000稀釋液)溶液加入在PBS-吐溫20中的5%脫脂奶粉中，并且將該膜在4℃輕輕搖動(dòng)17小時(shí)。在這一時(shí)間期間后，將凝膠用PBS-吐溫洗滌3次，并且用二級(jí)豬-抗-兔-辣根過(guò)氧化物酶綴合物（在PBS-吐溫20中的5%脫脂奶粉中1:3000）在室溫溫育1小時(shí)。在用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑(GEHealthcare)顯現(xiàn)HRP的存在并曝光到膠片上之前，將膜用PBS-吐溫洗滌4次。使用Totallab凝膠分析軟件(NonlinearDynamics,NewcastleuponTyne,UK)將條帶的密度針對(duì)已知濃度的卵白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)化，從而估計(jì)卵白蛋白在顆粒上的負(fù)荷。使用小鼠抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體(小鼠抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C,MAB1196,R&D系統(tǒng)，1:3000稀釋液)利用上述蛋白質(zhì)印跡流程確定半胱氨酸蛋白酶抑制劑水平和半胱氨酸蛋白酶抑制劑-胃蛋白酶抑制劑水平。OT-1和OT-II激活測(cè)定將10,000個(gè)小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞在96孔圓底平板中用0.1mg卵白蛋白/抑制劑修飾的顆粒溫育2小時(shí)。在向每個(gè)孔中加入100,000個(gè)OT-I或OT-IIT-細(xì)胞（通過(guò)陰性選擇純化的）之前，洗滌所述細(xì)胞。3天后，加入3H-標(biāo)記的胸苷，并且測(cè)量其摻入。PLGA包封的卵白蛋白的CPI增強(qiáng)體外研究：在存在能夠檢測(cè)來(lái)自加工的和呈遞的抗原的肽的呈遞的T細(xì)胞(OT1和OTII)的條件下，將樹(shù)突細(xì)胞用3種PLGA微球體（僅有CPI，僅有卵白蛋白和CPI/卵白蛋白）溫育48-72小時(shí)。然后通過(guò)在12-16小時(shí)期間內(nèi)的3H-胸苷摻入測(cè)量T細(xì)胞激活。體內(nèi)研究：將C57BL/6小鼠皮下注射相同的PLGA微球體（含有約5%w/w卵白蛋白的1.75mgPLGA）。注射的體積另外含有1μg/mlLPS，以在注射部位激活抗原呈遞細(xì)胞。所有的小鼠先前（30-60分鐘之前）接受106個(gè)CFSE標(biāo)記的OT1和OTIIT細(xì)胞。在24-48小時(shí)后，通過(guò)CFSE稀釋測(cè)量在引流淋巴結(jié)中的T細(xì)胞增殖。結(jié)果在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供顯示對(duì)引入的胃蛋白酶抑制劑的化學(xué)計(jì)量和位置的嚴(yán)密控制的分子；在遠(yuǎn)離半胱氨酸蛋白酶抑制劑c的抑制結(jié)構(gòu)域的位點(diǎn)處每半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有不超過(guò)一個(gè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑分子（例如，見(jiàn)圖1b），這已經(jīng)通過(guò)經(jīng)由定點(diǎn)誘變向半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的蛋白骨架中引入游離的半胱氨酸而實(shí)現(xiàn)25，原因在于在存在其他的親核殘基時(shí)其能夠被選擇性修飾。通過(guò)使用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)避免與半胱氨酸蛋白酶抑制劑C中的兩個(gè)現(xiàn)有的二硫鍵的二硫化物不規(guī)則性相關(guān)的問(wèn)題。檢測(cè)到了多種突變體（見(jiàn)表1和圖1b），并且發(fā)現(xiàn)T102C具有最有利的抑制特性。還引入了C端6His-標(biāo)簽，用于促進(jìn)純化和抑制劑與固相載體的可能的綴合。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，由于其對(duì)巰基的高選擇性并且其容易通過(guò)MTS-Boc-半胱氨酸結(jié)構(gòu)單元引入到肽骨架中，利用甲烷硫代磺酸酯化學(xué)將胃蛋白酶抑制劑引入到半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的游離半胱氨酸上25b,26。此外，存在通過(guò)用溶酶體硫醇還原酶GILT還原二硫化物而內(nèi)體釋放胃蛋白酶抑制劑的可能性27。由于已經(jīng)報(bào)道了在胃蛋白酶抑制劑的C末端綴合賴氨酸殘基并不顯著減少其抑制潛力23，本發(fā)明人決定在胃蛋白酶抑制劑和MTS基團(tuán)之間引入帶電荷的肽(圖2)，從而增加綴合物的溶解度。在偶聯(lián)之前，用例如5mMDTT（已經(jīng)證明半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的二硫鍵對(duì)該條件是穩(wěn)定的）輕度還原游離半胱氨酸殘基后，本發(fā)明人獲得>95%的蛋白回收水平和>80%的修飾，如通過(guò)質(zhì)譜法所確定的(圖2)。可以使用HPLC純化容易地將任何未反應(yīng)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與CPI分離。接著，針對(duì)三種目標(biāo)蛋白酶家族中的每一種的重組成員分析抑制能力。CPI顯示出相似的針對(duì)這三種種類的內(nèi)體蛋白酶的代表性成員的IC50值，甚至不還原半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與胃蛋白酶抑制劑A之間的二硫鍵（圖3，第1-3幅圖板）。此外，CPI能夠抑制樹(shù)突細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中存在的這3個(gè)種類的蛋白酶活性（圖3，第4-6幅圖板）。最重要的是，當(dāng)CPI綴合物與A20細(xì)胞溫育并用Enzcheck底物確定其蛋白酶活性時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)探針能夠同時(shí)消除組織蛋白酶D/E活性以及減少PLCP和AEP活性（圖3，第7幅圖板），而沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞死亡（如通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定所確定的）。所述CPI的一個(gè)潛在的治療應(yīng)用是作為抗原加工的調(diào)節(jié)劑。已經(jīng)報(bào)道了不穩(wěn)定的抗原可能在內(nèi)體-溶酶體途徑中被過(guò)度加工，導(dǎo)致抗原呈遞的減少28，并且蛋白酶抗性抗原通常形成更好的免疫原。本發(fā)明人檢測(cè)了這些不穩(wěn)定的抗原是否能夠被CPI‘保護(hù)’免于溶酶體的過(guò)度降解，最終目的是改善疫苗制劑中此類不穩(wěn)定的抗原的抗原呈遞。在Delamarre等最近的研究中，其證明辣根過(guò)氧化物酶的不穩(wěn)定變體（apo-HRP）（從辣根過(guò)氧化物酶上去除了血紅素基團(tuán)）在體外比含有血紅素的HRP對(duì)蛋白水解更敏感，并且在體內(nèi)產(chǎn)生弱得多的免疫應(yīng)答。該作者提出不含血紅素的HRP被抗原加工機(jī)制降解得太迅速，防止了MHC-復(fù)合物的有效負(fù)載。本發(fā)明人檢測(cè)了通過(guò)向本發(fā)明中加入CPI是否能夠在體外防止不穩(wěn)定的apo-HRP被溶酶體降解。作為內(nèi)體-溶酶體蛋白酶的來(lái)源，本發(fā)明人使用從小鼠巨噬細(xì)胞純化的溶酶體，原因在于其表達(dá)高水平的所有這些酶類。事實(shí)上，甚至在第一次測(cè)量之前，apo-HRP被巨噬細(xì)胞內(nèi)體/溶酶體完全降解(圖4)。加入單獨(dú)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑或單獨(dú)的胃蛋白酶抑制劑引起很少或沒(méi)有apo-HRP的穩(wěn)定，這表明在這些巨噬細(xì)胞中的溶酶體酶之間的功能冗余性。然而，當(dāng)加入CPI時(shí)，apo-HRP如wt-HRP一樣對(duì)溶酶體消化是穩(wěn)定的(圖4)。這些結(jié)果表明在用于不穩(wěn)定抗原的免疫學(xué)佐劑中結(jié)合CPI是值得的，并且目前正在進(jìn)行研究。本發(fā)明接著評(píng)估了CPI在活細(xì)胞中抑制內(nèi)體/溶酶體蛋白酶的能力，評(píng)估CPI能否成功地調(diào)節(jié)這一區(qū)室系統(tǒng)（compartmentalsystem）的生物學(xué)功能。胞吞途徑的一個(gè)重要的作用是在其配體刺激的胞吞作用后降解激活的生長(zhǎng)因子受體。例如，在EGF受體(EGFr)被泛化（ubiquitinated）后，其簇集在網(wǎng)格蛋白包被的凹處，并且被遞送至內(nèi)體系統(tǒng)中，在內(nèi)體系統(tǒng)中其被隔離在多泡體（MVBs）的內(nèi)部小泡上，防止再循環(huán)并且停止其信號(hào)傳導(dǎo)的能力29。然后，MVBs與溶酶體融合，并且所述EGF受體被降解；特異性的溶酶體蛋白酶仍然需要被充分定義11,35。本發(fā)明人在存在或不存在CPI或半胱氨酸蛋白酶抑制劑C時(shí)預(yù)先溫育EGFr陽(yáng)性腎細(xì)胞系COS-7（胃蛋白酶抑制劑A的難溶性使得該化合物在該實(shí)驗(yàn)中不能提供有意義的數(shù)據(jù)），然后用EGF攻擊。在不同時(shí)間，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡監(jiān)測(cè)剩余的EGFr水平(圖5)。在對(duì)照細(xì)胞中，40分鐘后EGFr的下調(diào)是明顯的，并且在90分鐘后幾乎是完全的(圖5a)。相反，在用CPI預(yù)先溫育的Cos7中EGFr水平要更持久得多，這證明了圖5b量化的對(duì)受體降解的阻斷。用半胱氨酸蛋白酶抑制劑預(yù)先溫育也抑制了EGFr下調(diào)，但是沒(méi)有到同CPI相同的程度，這表明半胱氨酸和天冬氨酰蛋白酶二者都參與了EGFr加工。由于MAP激酶Erk1/2在CPI和半胱氨酸蛋白酶抑制劑處理的細(xì)胞中被正常激活5，所以受體加工的停滯不是由于抑制劑毒性引起的。事實(shí)上，在CPI處理的細(xì)胞中存在更持久的Erk激活，這與EGFr的持久性一致(圖5a，第2幅圖板)。因此，CPI被細(xì)胞攝取，并且能夠抑制內(nèi)體/溶酶體系統(tǒng)中的關(guān)鍵蛋白水解事件。本發(fā)明人還在模式疫苗中檢測(cè)了所述蛋白酶抑制劑。首先，將確定量的抗原（卵白蛋白）和抑制劑（圖6a）負(fù)載在固相載體上，不同于市售疫苗制劑中所用的那些。然后，將這些疫苗制劑喂飼小鼠樹(shù)突細(xì)胞2小時(shí)。洗滌后，加入對(duì)卵白蛋白上的表位特異性的純化OT-I和OT-IIT-細(xì)胞，并且能夠觀察到提高的OT-I和OT-IIT-細(xì)胞反應(yīng)(圖6b)。圖6c和d顯示包含CPI充分改善卵白蛋白抗原的呈遞。含有單獨(dú)的CPI的珠子沒(méi)有產(chǎn)生T細(xì)胞增殖（未顯示）。此外，Ova/CPIPLGA(+LPS)制劑在體內(nèi)產(chǎn)生比OvaPLGA(+LPS)制劑更有力的抗原呈遞（參見(jiàn)圖6e）。這表明，原則上，泛-內(nèi)體蛋白酶抑制劑能夠改善相關(guān)的免疫細(xì)胞中的抗原呈遞。還檢測(cè)了泛蛋白酶抑制劑能否抑制致病物種的蛋白水解活性，更具體地是錐體蟲(chóng)的蛋白水解活性。實(shí)際上觀察到來(lái)自布氏錐蟲(chóng)的所有三種蛋白酶家族的活性都能夠被有效抑制(圖7)。綜上所述，本發(fā)明人已經(jīng)描述了構(gòu)建抑制所有三個(gè)主要的內(nèi)體/溶酶體蛋白酶家族的單分子實(shí)體。已經(jīng)表明這種廣泛的抑制在體外減少不穩(wěn)定蛋白的破壞性加工，并且在體內(nèi)減少內(nèi)體/溶酶體途徑中的蛋白水解事件。參考文獻(xiàn)1.Leung,D.;Abbenante,G.;Fairlie,D.P.,Proteaseinhibitors:Currentstatusandfutureprospects（蛋白酶抑制劑：目前的狀態(tài)和未來(lái)展望）.J.Med.Chem.（醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志）2000,43(3),305-341.2.Richardson,P.G.;Sonneveld,P.;Schuster,M.W.;Irwin,D.;Stadtmauer,E.A.;Facon,T.;Harousseau,J.L.;Ben-Yehuda,D.;Lonial,S.;Goldschmidt,H.;Reece,D.;San-Miguel,J.F.;Bladé,J.;Boccadoro,M.;Cavenagh,J.;Dalton,W.S.;Boral,A.L.;Esseltine,D.L.;Porter,J.B.;Schenkein,D.;Anderson,K.C.,Bortezomiborhigh-dosedexamethasoneforrelapsedmultiplemyeloma（用于復(fù)發(fā)的多發(fā)性骨髓瘤的硼替佐米或高劑量的地塞米松）.NewEngl.J.Med.（新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）2005,352(24),2487-2498.3.Reiser,J.;Adair,B.;Reinheckel,T.,Specializedrolesforcysteinecathepsinsinhealthanddisease（半胱氨酸組織蛋白酶在健康和疾病中的專門(mén)作用）.J.Clin.Invest.（臨床研究雜志）2010,120(10),3421-3431.4.Doyle,P.S.;Sajid,M.;O'Brien,T.;DuBois,K.;Engel,J.C.;Mackey,Z.B.;Reed,S.,Drugstargetingparasitelysosomes（靶向寄生蟲(chóng)溶酶體的藥物）.Curr.Pharm.Design（現(xiàn)代制藥設(shè)計(jì)）2008,14(9),889-900.5.Palermo,C.;Joyce,J.A.,Cysteinecathepsinproteasesaspharmacologicaltargetsincancer（作為癌癥制藥靶標(biāo)的半胱氨酸組織蛋白酶）.TrendsPharm.Sci.（制藥科學(xué)趨勢(shì)）2008,29(1),22-28.6.Briggs,J.J.;Haugen,M.H.;Johansen,H.T.;Riker,A.I.;Abrahamson,M.;Fodstad,O.;Maelandsmo,G.M.;Solberg,R.,CystatinE/Msuppresseslegumainactivityandinvasionofhumanmelanoma（半胱氨酸蛋白酶抑制劑E/M抑制legumain活性和人骨髓瘤的侵襲）.BMCCancer（BMC癌癥）2010,10.7.Colbert,J.D.;Matthews,S.P.;Miller,G.;Watts,C.,Diverseregulatoryrolesforlysosomalproteasesintheimmuneresponse（溶酶體蛋白酶在免疫應(yīng)答中的多樣性調(diào)節(jié)作用）.Eur.J.Immunol.（歐洲免疫學(xué)雜志）2009,39(11),2955-2965.8.Keppler,D.,Towardsnovelanti-cancerstrategiesbasedoncystatinfunction（面向基于半胱氨酸蛋白酶抑制劑功能的新抗癌策略）.CancerLetters（癌癥通信）2006,235(2),159-176.9.Henskens,Y.M.;Veerman,E.C.;NieuwAmerongen,A.V.,Cystatinsinhealthanddisease（健康和疾病中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑）.Biol.Chem.（生物化學(xué)）1996,377(2),71-86.10.Nicotra,G.;Manfroi,F.;Follo,C.;Castino,R.;Fusco,N.;Peracchio,C.;Kerim,S.;Valente,G.;Isidoro,C.,HighexpressionofcathepsinDinnon-Hodgkin'slymphomasnegativelyimpactsonclinicaloutcome（在非霍奇金淋巴瘤中組織蛋白酶D的高表達(dá)不利地影響臨床結(jié)果）.Dis.Markers（疾病標(biāo)記物）2010,28(3),167-83.11.Liaudet-Coopman,E.;Beaujouin,M.;Derocq,D.;Garcia,M.;Glondu-Lassis,M.;Laurent-Matha,V.;Prebois,C.;Rochefort,H.;Vignon,F.,CathepsinD:newl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