在遺傳修飾的植物中使用酰基輔酶A結(jié)合蛋白增強(qiáng)干旱耐受性的方法相關(guān)申請的交叉引用該申請要求享有2011年11月3日提交的U.S.S.N.61/555,287的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，其通過引用并入本文。序列表的引用序列表作為命名為“UHK_00404_ST25.txt”的文本文件提交于2012年11月2日，創(chuàng)建于2012年11月2日，并具有17,888字節(jié)大小，其由此通過引用并入。發(fā)明領(lǐng)域本公開一般涉及遺傳修飾的植物和賦予植物干旱耐受性的載體。發(fā)明背景干旱脅迫是農(nóng)業(yè)和人類最大的環(huán)境威脅之一。干旱是植物的主要脅迫并且當(dāng)植物細(xì)胞中的總蒸騰速率超過水分?jǐn)z取時它就會發(fā)生(Ingram和Bartels,AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol.,47:377-403,(1996))。作物在開花期間對干旱尤為敏感，并且沒有花則沒有形成大多數(shù)作物的收獲物的果實(shí)和種子（谷粒）。全球變暖進(jìn)一步加劇了干旱相關(guān)的問題。因此，需要鑒定賦予干旱耐受性的基因，以產(chǎn)生具有改善的能力以在水分缺乏脅迫中存活的轉(zhuǎn)基因植物（尤其是作物）。本發(fā)明的目標(biāo)是提供賦予轉(zhuǎn)基因植物和植物材料干旱耐受性的載體。本發(fā)明的目標(biāo)還有提供具有增強(qiáng)的干旱耐受性的轉(zhuǎn)基因植物和植物材料，及制備它們的方法。本發(fā)明的仍另一目標(biāo)是提供篩選賦予植物干旱耐受性的基因的方法。發(fā)明概述提供了具有改善的干旱耐受性的轉(zhuǎn)基因植物和植物材料以及用于產(chǎn)生它們的載體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，相對于未修飾的植物，在植物中表達(dá)擬南芥（Arabidopsisthaliana）酰基輔酶A結(jié)合蛋白2(ACBP2)改善了干旱耐受性。還提供了其中表達(dá)ACBP2多肽的修飾植物的植物部分包括例如果實(shí)、葉、塊莖、種子、花、莖、根以及所有其他解剖學(xué)部分。在具體的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化的植物是轉(zhuǎn)基因的或轉(zhuǎn)質(zhì)體的（transplastomic）擬南芥、番茄、煙草、棉花、玉米和稻植物。在具體的非限制性實(shí)例中，可以通過在缺水的情況下存活至少15天的能力測定植物中的干旱耐受性。用于在植物中改善干旱耐受性的植物轉(zhuǎn)化載體包括編碼ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或變體的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述載體包含啟動子（其可操作地連接編碼ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或變體的序列），和終止子，和/或其他調(diào)節(jié)元件。啟動子可以是組成型的、誘導(dǎo)型的或組織特異性的。在其他實(shí)施方案中，可以設(shè)計(jì)載體，以便其將在植物自身的內(nèi)源啟動子的控制下進(jìn)行表達(dá)。所述載體可以編碼作為操縱子的多于一個ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或變體。本文所述的載體包括植物質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體或核轉(zhuǎn)化載體。還提供的是產(chǎn)生具有干旱耐受性的修飾的植物或植物細(xì)胞的方法。所述方法包括用本文所述的載體轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞，所述載體包含編碼ACBP2的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，核轉(zhuǎn)化載體用于引起一個或多個ACBP2或其變體的表達(dá)，輸送與擬南芥ACBP2多肽相似的干旱耐受性。在其他實(shí)施方案中，質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體用于引起一個或多個ACBP2或其變體的表達(dá)，輸送與擬南芥ACBP2多肽相似的干旱耐受性。此類核轉(zhuǎn)化載體和質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體可單獨(dú)使用或彼此結(jié)合使用或與可以增強(qiáng)以其轉(zhuǎn)化的植物的干旱耐受性的其他重組載體結(jié)合使用。還提供的是用于篩選賦予植物干旱耐受性的ACBP2樣序列或變體的方法。所述方法包括向在干旱條件下顯示生長抑制的宿主細(xì)胞引入外源核酸，以形成測試細(xì)胞，其中生長抑制的解除表明賦予生長耐受性的ACBP2樣能力。在一些實(shí)施方案中，在引入到宿主細(xì)胞之前將外源核酸突變。在其他實(shí)施方案中，所述外源核酸是編碼ACBP2變體的合成核酸。附圖簡述圖1A和1B顯示了12天齡的擬南芥幼苗中ACBP2響應(yīng)ABA（圖1A）和干旱處理（圖1B）的表達(dá)。圖1A值是均值±SD。**P<0.01,*P<0.05,n=4。圖1B值是均值±SD。**P<0.01,n=4。圖1C顯示了在有或無ABA(2μM)處理的情況下在種子萌發(fā)過程中指示時間（小時）的ACBP2的表達(dá)。a，表明在0小時與H2O對照相比的顯著差異；b，表明在相似時間的顯著差異(P<0.05,n=5)。圖2A-2D顯示了與野生型植物相比ACBP2-OXs對干旱處理的耐受性。圖2A是顯示與ACBP2-OX3和ACBP2-OX6相比Col-0的存活，和與Col-0相比acbp2的存活的柱形圖。**P<0.01,*P<0.05。值為均值±SD(n=4)。圖2B是顯示干旱處理15天后野生型（Col-0和Col-6）、acbp2突變體、ACBP2-OX3和ACBP2-OX6植物的存活的柱形圖。**P<0.01。值為均值±SD（n=4，在四次實(shí)驗(yàn)的每一次中測試每一種基因型的30株植物）。圖2C顯示了ABA對野生型(Col-0)和ACBP2-OXs葉中氣孔閉合的影響。圖2D顯示了ABA對野生型(Col-6)和acbp2突變體葉中氣孔閉合的影響。棒（Bar）=20μm。值為均值±SD。星號表明統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。**P<0.01,*P<0.05,n=3（檢查每一株系的30個保衛(wèi)細(xì)胞并重復(fù)三次）。圖2E-2F顯示了與對照Col-0相比，在ABA缺失（圖2E）和存在（圖2F）的情況下ACBP2-OX3和ACBP2-OX6的萌發(fā)率。值為均值±SD,n=3。**P<0.01,*P<0.05。圖2G顯示了ABA處理后與對照相比，ACBP2-OX3和ACBP2-OX6中的相對根長。**P<0.01。值為均值±SD,n=3（測定每種基因型50株幼苗并將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次）。圖2H顯示了與對照相比，acbp2突變體中100μm或150μm處理后的相對根長。**P<0.05。值為均值±SD,n=3（測定每種基因型50株幼苗并將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次）。圖3A是顯示相對熒光強(qiáng)度的柱形圖，所述相對熒光強(qiáng)度表明響應(yīng)ACBP2的過表達(dá)，保衛(wèi)細(xì)胞中ABA誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生(%)。野生型（Col-0，對照組）中的ROS產(chǎn)生等于100%。*P<0.05。圖3B顯示了與10μmABA孵育3天或沒有與其孵育的5周齡野生型(Col-0)和ACBP2-OX(OX-3和OX-6)植物的離脫葉的離子滲漏。圖3C顯示了與10μmABA孵育3天或沒有與其孵育的5周齡野生型(Col-6)和acbp2突變體的離脫葉的離子滲漏。圖4A和4B顯示了轉(zhuǎn)化載體pAT351和pAT353的限制性圖譜。圖4A顯示了質(zhì)粒pAT351。圖4B顯示了質(zhì)粒pAT353。圖5A和5B顯示了如通過使用5溴-4-氯-3-吲哚-b-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)進(jìn)行組織化學(xué)GUS測定所證明的轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉（圖5A）和保衛(wèi)細(xì)胞（圖5B）中的ACBP2pro:GUS表達(dá)，比例尺=1mm(圖5A)和20μm(圖5B)。圖6A-6C是顯示ACBP2的過表達(dá)對HAB1(圖6A)、AtrbohD(圖6B)、AtrbohF.(圖6C)、AREB1(圖6D)、RD29A(圖6E)、ABI1(圖6F)、NCED3(圖6G)、ABA2(圖6H)、PLDα1(圖6I)和RPK1(圖6J)的影響的柱形圖。a表明與未處理野生型相比的顯著差異；b表明與ABA處理野生型相比的顯著差異(P<0.05,n=5)。發(fā)明詳述表達(dá)酰基輔酶A結(jié)合蛋白ACBP2（本文通過擬南芥ACBP2蛋白示例）的遺傳修飾的植物及其后代與未修飾的植物相比顯示改善的干旱耐受性。因此，作物植物中ACBP2多肽的過表達(dá)可以幫助它們抵抗干旱脅迫并擴(kuò)大栽培區(qū)域。I.定義“ACBP2”在本文中用于表示擬南芥?；o酶A結(jié)合蛋白2及其功能變體（如上下文表明的多核苷酸或多肽），其可以向其中表達(dá)它們的宿主輸送改善的干旱耐受性。在具體的非限制性實(shí)例中，可以通過在缺水的情況下存活至少15天的能力測定植物中的干旱耐受性。“ACBP2-OXs”在本文中用于表示過表達(dá)ACBP2多肽的轉(zhuǎn)基因擬南芥。如本文所用的“ACBP2樣多肽”包括與向宿主細(xì)胞輸送改善的干旱耐受性的ACBP2具有至少77%序列同一性的多肽，包括下文所述的ACBP2變體。如本文所用的ACBP2樣多肽、ACBP2變體和ACBP2同系物指像ACBP2一樣，多肽可以下調(diào)ABA介導(dǎo)的干旱調(diào)節(jié)蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)物（例如，HAB1）并上調(diào)正調(diào)節(jié)物（像AtrbohD和AtrbohF）。如與DNA序列相關(guān)的“化學(xué)合成的”表示組分核苷酸在體外進(jìn)行裝配。如本文所用的“構(gòu)建體”指重組核酸，一般是重組DNA，已產(chǎn)生其用于表達(dá)一種或多種特定核苷酸序列的目的，或待用于其他重組核苷酸序列的構(gòu)建中?！白尤~”指幼苗的胚第一葉?！癉NA調(diào)節(jié)序列”、“控制元件”和“調(diào)節(jié)元件”在本文中互換使用，指轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，如啟動子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號、終止子、蛋白質(zhì)降解信號等，其在宿主細(xì)胞中提供和/或調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)和/或編碼多肽的產(chǎn)生。如本文所用的“內(nèi)源核酸”指在自然界中通常發(fā)現(xiàn)于給定的細(xì)菌、生物或細(xì)胞和/或通過其產(chǎn)生的核酸。“內(nèi)源核酸”還指“天然核酸”或?qū)o定的細(xì)菌、生物或細(xì)胞是“天然的”的核酸。如本文所用的“外源核酸”指在自然界中不通?；蛱烊话l(fā)現(xiàn)于給定的細(xì)菌、生物或細(xì)胞和/或通過其產(chǎn)生的核酸。如本文所用，“異源核酸”指這樣的核酸，其中下列中的至少一項(xiàng)是正確的：(a)所述核酸在給定的宿主微生物或宿主細(xì)胞中是外來的（“外源的”，即非天然發(fā)現(xiàn)的）；(b)所述核酸包含天然發(fā)現(xiàn)于給定的宿主微生物或宿主細(xì)胞的例如對其是“內(nèi)源的”核苷酸序列（例如，該核酸包含對宿主微生物或宿主細(xì)胞內(nèi)源的核苷酸序列）；然而，在異源核酸的背景中，內(nèi)源發(fā)現(xiàn)的相同的核苷酸序列以非天然（例如，高于預(yù)期或高于天然發(fā)現(xiàn)）的量產(chǎn)生于細(xì)胞中，或包含在序列上不同于內(nèi)源核苷酸序列的核苷酸序列但編碼內(nèi)源發(fā)現(xiàn)的相同的蛋白質(zhì)（具有相同的或基本上相同的氨基酸序列）的核酸以非天然（例如高于預(yù)期或高于天然發(fā)現(xiàn)的）量產(chǎn)生于細(xì)胞中；(c)所述核酸包含兩條或多條核苷酸序列，所述核苷酸序列在自然界中未發(fā)現(xiàn)其彼此處于相同的關(guān)系中，例如該核酸是重組體。異源核酸的實(shí)例是可操作地連接轉(zhuǎn)錄控制元件（例如5啟動子）的編碼ACBP2的核苷酸序列，內(nèi)源（天然發(fā)生的）ACBP2編碼序列通常并不可操作地連接所述轉(zhuǎn)錄控制元件。異源核酸的另一實(shí)例是高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，其包含編碼ACBP2的核苷酸序列。異源核酸的另一實(shí)例是編碼ACBP2的核酸，其中利用編碼ACBP2的核酸遺傳修飾了通常不產(chǎn)生ACBP2的宿主細(xì)胞；因?yàn)榫幋aACBP2的核酸并不天然發(fā)現(xiàn)于宿主細(xì)胞中，所以該核酸對遺傳修飾的宿主細(xì)胞而言是異源的。如本文所用，“宿主細(xì)胞”表示體內(nèi)或體外的真核細(xì)胞、原核細(xì)胞或來自作為單細(xì)胞實(shí)體培養(yǎng)的多細(xì)胞生物（例如，細(xì)胞系）的細(xì)胞，所述真核細(xì)胞或原核細(xì)胞可以是或已經(jīng)用作核酸的受體（例如，包含編碼一個或多個基因產(chǎn)物如ACBPs的核苷酸序列的表達(dá)載體），并且包括已經(jīng)被核酸遺傳修飾的原始細(xì)胞的后代。應(yīng)理解，由于天然的、偶然的或有意的突變，單個細(xì)胞的后代在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA互補(bǔ)物上可以不必與原始親本完全相同?！爸亟M宿主細(xì)胞”（也稱為“遺傳修飾的宿主細(xì)胞”）是已經(jīng)向其中引入異源核酸，例如表達(dá)載體的宿主細(xì)胞?！胺蛛x的”意在描述處于不同于多核苷酸、多肽或細(xì)胞天然發(fā)生的環(huán)境中的多核苷酸、多肽或細(xì)胞。分離的遺傳修飾的宿主細(xì)胞可以存在于遺傳修飾的宿主細(xì)胞的混合群體中。如本文所用的應(yīng)用于核酸、細(xì)胞或生物的“天然發(fā)生的”或“天然的”指自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸、細(xì)胞或生物。例如，存在于可以從自然界來源中分離的生物（包括病毒）中并且并非在實(shí)驗(yàn)室中有意人為修飾的多肽或多核苷酸序列是天然發(fā)生的，并且“野生型”植物是天然發(fā)生的。如本文所用的“修飾的植物或植物部分”指植物或植物部分，無論其附著到整株植物還是與整株植物分離。它還包括修飾的植物或植物部分的后代，其通過有性生殖或無性生殖而產(chǎn)生。“可操作地連接”指這樣的并置（juxtaposition），其中如此描述的組分處于允許它們以其預(yù)期方式發(fā)揮功能的聯(lián)系中。例如，如果啟動子影響其轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，那么該啟動子可操作地連接編碼序列?！安倏v子”和“單一轉(zhuǎn)錄單位”在本文中互換使用，指兩個或多個鄰接的編碼區(qū)（編碼基因產(chǎn)物，如RNA或蛋白質(zhì)的核苷酸序列），其受一個或多個控制元件（例如，啟動子）的協(xié)同調(diào)節(jié)。如本文所用，術(shù)語“基因產(chǎn)物”指DNA編碼的RNA(反之亦然)或RNA或DNA編碼的蛋白質(zhì)，其中基因通常將包含編碼蛋白質(zhì)的一條或多條核苷酸序列，并且還可以包括內(nèi)含子和其他非編碼核苷酸序列?！半摹?、“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中互換使用，并且指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括編碼的和非編碼的氨基酸、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的或衍生的氨基酸，和具有修飾的肽骨架的多肽。多肽或多核苷酸與另一多核苷酸或多肽的百分比“序列同一性”表示，當(dāng)比較兩條序列進(jìn)行比對時，堿基或氨基酸是相同的并且在相同的相對位置上的百分比?！爸参锛?xì)胞培養(yǎng)物”指以下植物單位的培養(yǎng)物，如例如，原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞、植物組織中的細(xì)胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和處于發(fā)育多個階段的胚?！爸参锊牧稀敝溉~、莖、根、花或花部分、果實(shí)、花粉、卵細(xì)胞、合子、種子、插條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物，或植物的任何其他部分或產(chǎn)物。“植物組織”指組織成結(jié)構(gòu)和功能單位的植物細(xì)胞組。包括植物的任何組織，無論是植物中的還是培養(yǎng)物中的。該術(shù)語包括，但不限于整株植物、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)物和組織成結(jié)構(gòu)和/或功能單位的任何植物細(xì)胞組。該術(shù)語與如上文列出的或該定義另外包括的植物組織的任何具體類型結(jié)合使用或在缺少所述植物組織的任何具體類型的情況下使用并不旨在排除植物組織的任何其他類型。“多核苷酸”和“核酸”在本文中互換使用，并且指任何長度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。因此，該術(shù)語包括但不限于，單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體，或包含嘌呤和嘧啶堿基或其他天然的、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基的聚合物。“后代”包括起源于親本的后代的直接世代和所有后續(xù)世代。如本文所用，“重組體”表示特定核酸（DNA或RNA）是克隆、限制性酶切和/或連接步驟的多種組合產(chǎn)生具有區(qū)分于自然系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源核酸的結(jié)構(gòu)性編碼或非編碼序列的構(gòu)建體的產(chǎn)物。一般地，編碼所述結(jié)構(gòu)性編碼序列的DNA序列可以從cDNA片段和短寡核苷酸接頭或從一系列合成的寡核苷酸進(jìn)行裝配，以提供合成的核酸，其能夠從細(xì)胞或無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)中含有的重組轉(zhuǎn)錄單位進(jìn)行表達(dá)?？梢砸詢?nèi)在非翻譯序列或內(nèi)含子（其通常存在于真核基因中）不間斷的可讀框形式提供此類序列。包含相關(guān)序列的基因組DNA也可以用于形成重組基因或轉(zhuǎn)錄單位。非翻譯DNA的序列可以存在于可讀框的5'或3'，其中此類序列不干擾編碼區(qū)的操作或表達(dá)，并且的確通過多種機(jī)制作用于調(diào)節(jié)產(chǎn)生期望的產(chǎn)物（參見“DNA調(diào)節(jié)序列”，下文）。因此，例如，術(shù)語“重組”多核苷酸或核酸指這樣的多核苷酸或核酸，其是非天然發(fā)生的，例如通過人工干預(yù)人工組合序列的兩個另外分離的區(qū)段來制備。該人工組合經(jīng)常通過化學(xué)合成手段，或通過人工操作核酸的分離區(qū)段，例如通過遺傳改造技術(shù)來完成。一般完成此類人工組合以利用編碼相同或保守氨基酸的冗余密碼子替換密碼子，同時通常引入或去除序列識別位點(diǎn)。或者，進(jìn)行它來將具有期望的功能的核酸區(qū)段連接起來，以產(chǎn)生期望的功能組合?！稗D(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)化的”與“遺傳修飾”或“遺傳修飾的”在本文中互換使用并且指引入新的核酸（即，對細(xì)胞而言外源的DNA）后在細(xì)胞中誘導(dǎo)的持久的或瞬時的遺傳改變。遺傳改變（“修飾”）可以通過將新的DNA摻入到宿主細(xì)胞的基因組中，或通過瞬時或穩(wěn)定維持新的DNA作為游離元件來完成。當(dāng)細(xì)胞是真核細(xì)胞時，持久的遺傳改變一般通過向細(xì)胞的基因組或細(xì)胞的原質(zhì)體系中引入DNA來完成。在原核細(xì)胞中，持久的改變可以引入染色體中或通過染色體外元件，如質(zhì)粒、質(zhì)體和表達(dá)載體，其可以含有一種或多種可選標(biāo)記物，以幫助它們在重組宿主細(xì)胞中進(jìn)行維持?！稗D(zhuǎn)化載體”和“表達(dá)盒”在本文中互換使用?！昂铣傻暮怂帷笨梢匝b配自寡核苷酸結(jié)構(gòu)單元，其為使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的程序化學(xué)合成的。將這些結(jié)構(gòu)單元連接并退火，以形成基因區(qū)段，其然后經(jīng)酶促裝配來構(gòu)建完整基因。如本文所用的“變體”指ACBP2天然發(fā)生的遺傳突變體或ACBP2重組制備的變異，其每一種在其DNA中均含有一個或多個突變。術(shù)語“變體”還可以指給定肽的天然發(fā)生的變異或給定肽或蛋白質(zhì)的重組制備的變異，其中已經(jīng)通過氨基酸取代、添加或缺失修飾了一個或多個氨基酸殘基。II.賦予干旱抗性的載體在擬南芥中，已經(jīng)鑒定了酰基輔酶A結(jié)合蛋白(ACBPs)的共6種形式并且命名為ACBP1-ACBP6(Xiao,等,PlantJ.,54:141-151(2008))，其在10-73.1kD范圍內(nèi)(Leung,等,PlantMolBiol.,55:297-309(2004))。膜結(jié)合ACBP1和ACBP2亞細(xì)胞定位于ER和質(zhì)膜上(Chye,等,PlantJ.,18:205-214(1999);Li和Chye,PlantMolBiol.,51:483-492(2003))，ACBP3靶向細(xì)胞外(Leung,等,Planta,223:871-881(2006))，并且含有kelch-基序的ACBP4和ACBP5(Leung,等,PlantMolBiol.,55:297-309(2004))，以及ACBP6定位于細(xì)胞溶膠中(Chen等,PlantPhysiol.,148:304-315,2008)?？赡芙閷?dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域錨蛋白重復(fù)序列(ACBP1和ACBP2)以及kelch基序(ACBP4和ACBP5)(Leung等,PlantMolBiol.,55:297-309,2004;Li和Chye,PlantMolBiol.,54:233-243,2004)在較大的ACBPs中是明顯的。擬南芥ACBPs已經(jīng)涉及多種脅迫響應(yīng)，如冰凍(Chen等,PlantPhysiol.,148:304-315(2008);Du等,PlantPhysiol.,152:1585-1597(2010))和病原體抗性(Xiao和Chye,PlantPhysiol.,156:2069-2081(2011))。本文所述的實(shí)施例顯示，ACBP2的過表達(dá)在植物中賦予干旱耐受性。本文提供的植物轉(zhuǎn)化載體/表達(dá)盒包括編碼ACBP2多肽或其ACBP2功能變體的核酸序列。所述載體還可以任選地包括啟動子（其可操作地連接編碼序列）和終止子，和/或其他調(diào)節(jié)元件。在其他實(shí)施方案中，可以設(shè)計(jì)載體以引入異源多肽，以便其將在植物自身內(nèi)源啟動子的控制下進(jìn)行表達(dá)。植物轉(zhuǎn)化載體優(yōu)選包括一個或多個轉(zhuǎn)錄起始或轉(zhuǎn)錄控制區(qū)、目的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括在遺傳修飾的宿主細(xì)胞中提供目的蛋白質(zhì)過表達(dá)的那些；提供可誘導(dǎo)表達(dá)的那些，以便當(dāng)向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑時，目的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄被誘導(dǎo)或增加至比誘導(dǎo)前更高的水平。在一個實(shí)施方案中，構(gòu)建體含有以5'-3'方向可操作地連接的啟動子；編碼ACBP2或ACBP2的功能變體或片段的一條或多條核酸序列；和3'多腺苷酸化信號。在其中構(gòu)建體含有表達(dá)為操縱子的多于一個ACBP2或其ACBP2功能變體的實(shí)施方案中，核苷酸序列可以可操作地連接相同的啟動子。或者，所述核苷酸序列可以處于不同啟動子的控制之下?？色@得若干植物轉(zhuǎn)化載體選項(xiàng)，包括在"GeneTransfertoPlants"(Potrykus,等,編輯)Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork(1995);"TransgenicPlants:AProductionSystemforIndustrialandPharmaceuticalProteins"(Owen,等,編輯)JohnWiley&SonsLtd.England(1996);和"MethodsinPlantMolecularBiology:ALaboratoryCourseManual"(Maliga,等編輯)ColdSpringLaboratoryPress,NewYork(1995)中描述的那些。植物轉(zhuǎn)化載體一般包括在5'和3'調(diào)節(jié)序列（包括啟動子、轉(zhuǎn)錄終止和/或多腺苷酸化信號和可選擇或可篩選標(biāo)記基因）的轉(zhuǎn)錄控制之下的一條或多條目的編碼序列。對于來自單個轉(zhuǎn)錄物的一個或多個多肽的表達(dá)，可以將額外的RNA加工信號和核酶序列改造到構(gòu)建體中（美國專利號5,519,164）。該方法具有將多個轉(zhuǎn)基因定位在單個基因座中的優(yōu)勢，這在隨后的植物育種工作中是有利的。對于轉(zhuǎn)基因從質(zhì)體基因組的直接表達(dá)，使用通過同源重組轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體染色體的載體，在該情況下利用質(zhì)體基因組的原核性質(zhì)并插入許多轉(zhuǎn)基因作為操縱子是可能的。實(shí)例描述-McBride等的于美國專利號5,545,818中。WO2010/061186描述了使用用于將RNA從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到質(zhì)體（其中通過同源重組摻入所述RNA）中的適合的內(nèi)源細(xì)胞過程將基因引入質(zhì)體染色體的可選方法。該質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法也適合于實(shí)踐所公開的組合物和方法。A.ACBP2用于本文所述載體中的ACBP2基因包括天然發(fā)生的ACBP2。天然發(fā)生的ACBP2為本領(lǐng)域所知。ACBP2序列見于GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫的檢索號NM_118916(ACBP2)下。用于賦予植物干旱抗性的其他基因包括ACPB2的變體。在一些實(shí)施方案中，所述變體是合成的核酸。優(yōu)選地，所述變體相對于擬南芥ACBP2包括少于25、少于20、少于15、少于10、少于5、少于4、少于3或少于2個氨基酸取代、重排、插入和/或缺失。在此方面，術(shù)語“變體”可以包括擬南芥ACBP2的片段、衍生物和同系物。所述ACBP2同系物優(yōu)選是與ACBP2具有至少77%的DNA同源性的ACBP2樣序列，其可以在野生型中從其自身的啟動子在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)并且當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物中過表達(dá)時，像ACBP2一樣，其下調(diào)HAB1并上調(diào)AtrbohD和AtrbohF。更優(yōu)選地，所述變體包括與擬南芥ACBP2具有至少90%氨基酸序列同一性的肽序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法確定序列相似性。例如，確定序列同一性，可以使用在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST的萬維網(wǎng)（worldwideweb）上可獲得的方法和計(jì)算機(jī)程序，包括BLAST比對序列。參見，例如Altschul，等J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。另一比對算法是可在來自Madison,Wis.,USA的OxfordMolecularGroup,Inc完全擁有的子公司的GeneticsComputingGroup(GCG)程序包中獲得的FASTA。用于比對的其他技術(shù)描述于MethodsinEnzymology,266卷:ComputerMethodsforMacromolecularSequenceAnalysis(1996),編輯Doolittle,AcademicPress,Inc.,adivisionofHarcourtBrace&Co.,SanDiego,Calif.,USA。特別感興趣的是在序列中允許缺口的比對程序。Smith-Waterman是在序列比對中允許缺口的算法的一種類型。Meth.Mol.Biol.,70:173-187(1997)。同樣，使用Needleman和Wunsch比對方法的GAP程序可以用于比對序列。J.Mol.Biol.,48:443-453(1970)。在其他實(shí)施方案中，ACBP2的變體是從如本文所述的宿主細(xì)胞中分離的突變體。在仍其他實(shí)施方案中，變體ACBP2由在嚴(yán)格條件下與編碼擬南芥ACBP2或另一已知ACBP2的核酸雜交的核酸所編碼。B.啟動子用于表達(dá)載體中的啟動子的選擇決定了轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的時空表達(dá)模式。啟動子在其強(qiáng)度上，即在促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力上可以變化。所選啟動子在具體細(xì)胞類型（如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮層細(xì)胞）或具體組織或器官（例如根、葉或花）中表達(dá)轉(zhuǎn)基因并且該選擇反映了基因產(chǎn)物積累的期望定位?；蛘?，所選啟動子驅(qū)動基因在多種誘導(dǎo)條件下的表達(dá)。1.組成型啟動子用于核編碼表達(dá)的合適的組成型啟動子包括例如，Rsyn7啟動子的核心啟動子和美國專利號6,072,050中公開的其他組成型啟動子；核心CAMV35S啟動子(Odell,等,Nature313:810-812(1985))；稻肌動蛋白(McElroy,等,PlantCell2:163-171(1990),)；泛素(Christensen,等,PlantMol.Biol.,12:619-632(1989)和Christensen,等,PlantMol.Biol.18:675-689(1992))；pEMU(Last,等,Theor.Appl.Genet.81:581-588(1991))；MAS(Velten,等,EMBOJ.,3:2723-2730(1984));和ALS啟動子(美國專利號5,659,026)。其他組成型啟動子包括例如，美國專利號5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142。2.組織特異性啟動子“組織優(yōu)選的”啟動子可以用于將基因表達(dá)靶定在特定組織，如種子、葉或根組織內(nèi)。組織優(yōu)選的啟動子描述于Yamamoto,等,PlantJ.12(2)255-265(1997);Kawamata,等,PlantCellPhysiol.38(7):792-803(1997);Hansen,等,Mol.Gen.Genet.254(3):337-343(1997);Russell,等,TransgenicRes.6(2):157-168(1997);Rinehart,等,PlantPhysiol.112(3):1331-1341(1996);VanCamp,等,PlantPhysiol.112(2):525-535(1996);Canevascini,等,PlantPhysiol.112(2):513-524(1996);Yamamoto,等,PlantCellPhysiol.35(5):773-778(1994);Lam,ResultsProbl.CellDiffer.20:181-196(1994);Orozco,等,PlantMol.Biol.23(6):1129-1138(1993);Matsuoka,等,ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590(1993);和Guevara-Garcia,等,PlantJ.4(3):495-505(1993)中。合適的組織特異性表達(dá)模式包括綠色組織特異性的、根特異性的、莖特異性的和花特異性的。適合于在綠色組織中表達(dá)的啟動子包括調(diào)節(jié)參與光合作用的基因的許多啟動子和已經(jīng)從單子葉植物和雙子葉植物中克隆的許多啟動子。葉特異性啟動子為本領(lǐng)域所已知。參見例如Yamamoto,等,PlantJ.12(2):255-265(1997);Kwon,等,PlantPhysiol.105:357-67(1994);Yamamoto,等PlantCellPhysiol.35(5):773-778(1994);Gotor,等PlantJ.3:509-18(1993);Orozco,等,PlantMol.Biol.23(6):1129-1138(1993);和Matsuoka,等Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590(1993)。另一實(shí)例是來自磷酸烯醇式（phosphoenol）羧化酶基因的玉米PEPC啟動子(Hudspeth和Grula,PlantMolec.Biol.12:579-589(1989))，并且啟動子包括編碼rbsC的那些啟動子(Coruzzi等,EMBOJ.,3:1671-1697(1984))。根優(yōu)選的啟動子是已知的并且可以選自可從文獻(xiàn)中獲得的或從多種相容(compatible)物種中從頭分離的許多啟動子。參見例如，Hire等PlantMol.Biol.20(2):207-218(1992)(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner,PlantCell,3(10):1051-1061(1991)(菜豆（Frenchbean）的GRP1.8基因中的根特異性控制元件)；Sanger等,PlantMol.Biol.14(3):433-443(1990)(根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）的甘露堿合酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；和Miao等,PlantCell,3(1):l1'-22(1991)(編碼細(xì)胞溶膠谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達(dá))。還參見美國專利號5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；5,023,179和7,285,656。用于根特異性表達(dá)的合適的啟動子是deFramondFEBS290:103-106(1991);deFramond的EP0452269描述的那種啟動子并且根特異性啟動子是來自T-1基因的那種啟動子。SAHH或SHMT(Sivanandan等,BiochimicaetBiophysicaActa,1731:202-208,2005)對根特異性的表達(dá)是特異性的。同樣，已經(jīng)報道花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子在其啟動子區(qū)具有根特異性的和葉特異性的組件(Benfey等,EMBOJ.,8:2195-2202,1989)。其他組織特異性的啟動子是眾所周知的并且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是廣泛可得的。合適的莖特異性啟動子是描述于美國專利號5,625,136中并且驅(qū)動玉米trpA基因表達(dá)的那種啟動子。質(zhì)體特異性的啟動子包括PrbcL啟動子[Allison,等,EMBOJ.15:2802-2809(1996);Shiina,等,PlantCell,10:1713-1722(1998)]；PpsbA啟動子[Agrawal,等,NucleicAcidsResearch,29:1835-1843(2001)]；Prrn16啟動子[Svab和Maliga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917(1993),Allison,等,EMBO15:2802-2809(1996)]；PaccD啟動子(WO97/06250;Hajdukiewicz,等,EMBOJ.16:4041–4048(1997))。3.誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)型啟動子，例如化學(xué)品調(diào)節(jié)的啟動子可以用于通過應(yīng)用外源化學(xué)品調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)在植物中基因的表達(dá)。根據(jù)目標(biāo)，啟動子可以是化學(xué)品誘導(dǎo)型啟動子，其中化學(xué)品的應(yīng)用誘導(dǎo)基因表達(dá)，或化學(xué)品抑制型啟動子，其中化學(xué)品的應(yīng)用抑制基因表達(dá)。此外，廣泛的誘導(dǎo)型啟動子也是眾所周知的并且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是廣泛可得的。已經(jīng)充分地綜述了成功用于植物中的誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)(Padidam,Curr.Opin.PlantBiol.6:169(2003);Wang,等Trans.Res.:12,529(2003);Gatz和Lenk,TrendsPlantSci.3:352(1998))。這些誘導(dǎo)型系統(tǒng)可以被化學(xué)品，如四環(huán)素、原始霉素、病原體、光、糖皮質(zhì)激素、雌激素、銅、除草劑安全劑、乙醇、IPTG（異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷）和病原體激活。有用的化學(xué)品誘導(dǎo)型啟動子包括但不限于，被苯磺酰胺除草劑安全劑激活的玉米1n2-2啟動子、被用作萌發(fā)前除草劑（pre-emergentherbicides）的疏水性親電化合物激活的玉米GST啟動子，和被水楊酸激活的煙草PR-1啟動子。其他化學(xué)品調(diào)節(jié)的目的啟動子包括類固醇響應(yīng)的啟動子（參見例如，Schena,等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10421-10425(1991)和McNellis,等PlantJ.,14(2):247-257(1998)中的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子）和四環(huán)素誘導(dǎo)型以及四環(huán)素抑制型啟動子（參見例如Gatz,等,Mol.Gen.Genet.227:229-237(1991),和美國專利號5,814,618和5,789,156），以其整體通過引用并入本文。誘導(dǎo)型啟動子的另一合適種類是創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動子。已經(jīng)描述了在創(chuàng)傷部位上表達(dá)的許多啟動子。該類型的優(yōu)選啟動子包括Stanford,等,Mol.Gen.Genet.215:200-208(1989),Xu,等,PlantMolec.Biol.,22:573-588(1993),Logemann,等,PlantCell,1:151-158(1989),Rohrmeier和Lehle,PlantMolec.Biol.,22:783-792(1993),Firek,等,PlantMolec.Biol.,22:129-142(1993),和Warner,等,PlantJ.,3:191-201(1993)中描述的那些啟動子。C.轉(zhuǎn)錄終止子可獲得多種轉(zhuǎn)錄終止子用于表達(dá)盒中。這些啟動子負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因以外的轉(zhuǎn)錄終止及其正確的多腺苷酸化。因此，在轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄物的3’最末端，可以改造多腺苷酸化信號。多腺苷酸化信號指可以在將mRNA輸出到細(xì)胞溶膠之前在核中導(dǎo)致mRNA多腺苷酸化的任何序列，如胭脂堿合酶的3’區(qū)(Bevan,等NucleicAcidsRes.,11:369-385(1983)。其他轉(zhuǎn)錄終止子是已知在植物中發(fā)揮功能的那些終止子并且包括CaMV35S終止子、tm1終止子、胭脂堿合酶終止子和豌豆rbcSE9終止子。這些啟動子用于單子葉植物和雙子葉植物中。D.用于增強(qiáng)或調(diào)節(jié)表達(dá)的序列已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多序列增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達(dá)并且這些序列可以用于與基因結(jié)合以增加其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。例如，已經(jīng)顯示多種內(nèi)含子序列，如玉米Adh1基因的內(nèi)含子增強(qiáng)表達(dá)，特別是在單子葉植物細(xì)胞中。此外，也已知來源于病毒的許多非翻譯前導(dǎo)序列增強(qiáng)表達(dá)，并且這些前導(dǎo)序列在雙子葉植物細(xì)胞中特別有效。E.編碼序列優(yōu)化可以通過改變編碼序列來遺傳改造所選基因的編碼序列，用于在目的作物物種中增加表達(dá)或優(yōu)化表達(dá)。用于修飾編碼序列以實(shí)現(xiàn)在特定作物物種中的優(yōu)化表達(dá)的方法是眾所周知的（參見例如Perlak,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:3324(1991)；和Koziel,等,Biotechnol.11:194(1993)）。F.靶向序列所公開的載體在編碼待表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)可以進(jìn)一步包括編碼靶向序列的一條或多條核苷酸序列?！鞍邢颉毙蛄惺蔷幋a氨基酸序列或基序的核苷酸序列，所述氨基酸序列或基序指導(dǎo)所編碼的蛋白質(zhì)到達(dá)特定的細(xì)胞區(qū)室，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的定域化（localization）或區(qū)室化。蛋白質(zhì)中靶向氨基酸序列的存在通常導(dǎo)致靶蛋白的全部或部分易位通過細(xì)胞器膜并進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)部?；蛘撸邢螂目梢灾笇?dǎo)靶蛋白保持包埋在細(xì)胞器膜中。靶蛋白的“靶向”序列或區(qū)域可以含有鄰接氨基酸串或非鄰接氨基酸組?？梢赃x擇靶向序列以指導(dǎo)靶蛋白達(dá)到植物細(xì)胞器，如核、微體（例如過氧化物酶體或其專門化形式，如乙醛酸循環(huán)體）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)體、液泡、質(zhì)膜、細(xì)胞壁、線粒體、葉綠體或質(zhì)體中。葉綠體靶向序列是可以將蛋白質(zhì)靶向葉綠體或質(zhì)體的任何肽序列，如苜蓿核酮糖-二磷酸羧化酶小亞基的轉(zhuǎn)移肽(Khoudi,等,Gene,197:343-351(1997))。過氧化物酶體靶向序列指N末端、內(nèi)部或C末端的任何肽序列，其可以將蛋白質(zhì)靶向過氧化物酶體，如植物C末端靶向三肽SKL(Banjoko和Trelease,,PlantPhysiol.,107:1201-1208(1995);Wallace,等,“PlantOrganellularTargetingSequences,”PlantMolecularBiology,Ed.R.Croy,BIOSScientificPublishersLimited(1993)第287-288頁,并且植物中的過氧化物靶向顯示于Volokita,ThePlantJ.,361-366(1991))。質(zhì)體靶向序列為本領(lǐng)域所知并且包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的葉綠體小亞基(deCastroSilvaFilho等PlantMol.Biol.30:769-780(1996);Schnell等J.Biol.Chem.266(5):3335-3342(1991))；5-(烯醇式丙酮酸)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer,等,J.Bioenerg.Biomemb.,22(6):789-810(1990))；色氨酸合酶(Zhao等,,J.Biol.Chem.,270(11):6081-6087(1995))；質(zhì)體藍(lán)素(Lawrence,等,J.Biol.Chem.,272(33):20357-20363(1997))；分支酸合酶(Schmidt,等,J.Biol.Chem.,268(36):27447-27457(1993))；和捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHBP)(Lamppa,等,J.Biol.Chem.,263:14996-14999(1988))。還參見VonHeijne,等,PlantMol.Biol.Rep.,9:104-126(1991);Clark,等,J.Biol.Chem.264:17544-17550(1989);Della-Cioppa等PlantPhysiol.84:965-968(1987);Romer等Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421(1993);和Shah等Science,233:478-481(1986)。還已經(jīng)在下文中描述了可選質(zhì)體靶向信號：US2008/0263728;Miras,等JBiolChem,277(49)(2002):47770-8(2002);Miras,等,JBiolChem,282:29482-29492(2007)。G.可選標(biāo)記本文所述的表達(dá)盒可以編碼可選標(biāo)記，以能夠選擇轉(zhuǎn)化事件。存在已經(jīng)描述用于選擇轉(zhuǎn)化植物的許多方法[對于綜述參見(Miki,等,JournalofBiotechnology,107:193-232(2004))及其中并入的參考文獻(xiàn)]。已經(jīng)廣泛用于植物中的可選標(biāo)記基因包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptII(美國專利號5,034,322,U.S.5,530,196)、潮霉素抗性基因(美國專利號5,668,298)、編碼針對草胺膦的抗性的bar基因(美國專利號5,276,268)、氨基葡糖苷3”-腺苷轉(zhuǎn)移酶(aadA)的表達(dá)賦予壯觀霉素抗性(美國專利號5,073,675)、抑制抗性5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶的使用(美國專利號4,535,060)和用于產(chǎn)生草甘膦耐受植物的方法(美國專利號5,463,175；美國專利號7,045,684)。先前已經(jīng)描述了不使用抗生素或除草劑作為選擇劑的植物選擇方法，并且其包括表達(dá)葡糖胺-6-磷酸脫氨基酶，以在植物選擇培養(yǎng)基(美國專利號6,444,878)和利用D-氨基酸的正向/反向系統(tǒng)(Erikson,等,NatBiotechnol,22:455-8(2004))中失活葡糖胺。歐洲專利公開號EP0530129描述了正向選擇系統(tǒng)，其通過表達(dá)轉(zhuǎn)基因（其編碼激活向生長培養(yǎng)基中加入的失活化合物的酶）使得所轉(zhuǎn)化的植物生長能夠超過未轉(zhuǎn)化的株系。美國專利號5,767,378描述了甘露糖或木糖用于正向選擇轉(zhuǎn)基因植物的用途。還已經(jīng)描述了使用山梨醇脫氫酶將山梨醇轉(zhuǎn)化成果糖用于植物生長的正向選擇方法(WO2010/102293)?？珊Y選標(biāo)記基因包括β-葡糖苷酸酶基因(Jefferson,等,EMBOJ.,6:3901-3907(1987)；美國專利號5,268,463)和天然的或修飾的綠色熒光蛋白基因(Cubitt,等,TrendsBiochem.Sci.20:448-455(1995);Pan,等,PlantPhysiol.,112:893-900(1996)。也可以通過熒光蛋白，如來自非生物發(fā)光珊瑚（Anthozoa）物種的熒光蛋白（包括DsRed，其為來自珊瑚的香菇珊瑚（Discosoma）屬的紅色熒光蛋白(Matz,等,NatBiotechnol,17:969-73(1999))）的可視化來選擇轉(zhuǎn)化事件。已經(jīng)開發(fā)了DsRed蛋白的改進(jìn)形式(Bevis和Glick,NatBiotech,20:83-87(2002))用于減少蛋白質(zhì)的聚集。也可以利用黃色熒光蛋白(YFP)，包括具有加速的信號成熟的變體(Nagai,等,NatBiotech.,20:87-90(2002))、藍(lán)色熒光蛋白、藍(lán)綠色熒光蛋白，和綠色熒光蛋白(Sheen,等,PlantJ,8:777-84(1995);Davis和Vierstra,PlantMolecularBiology,36:521-528(1998))來進(jìn)行可視篩選。熒光蛋白的概述可以見于Tzfira等(Tzfira,等,PlantMolecularBiology,57:503-516(2005))以及Verkhusha和LukyanovNatBiotech,22:289-296(2004))，其參考文獻(xiàn)以整體并入。已經(jīng)產(chǎn)生許多熒光蛋白的改進(jìn)形式用于多種應(yīng)用。這些蛋白質(zhì)的改進(jìn)形式或這些蛋白質(zhì)的組合用于選擇轉(zhuǎn)化體的用途對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。簡單地分析轉(zhuǎn)化事件的后代中PHB的存在由此避免使用任何可選標(biāo)記物也是可行的。對于質(zhì)體轉(zhuǎn)化構(gòu)建體，優(yōu)選的可選標(biāo)記物是質(zhì)體16S核糖體RNA基因的壯觀霉素抗性等位基因(Staub和Maliga,PlantCell,4:39-45(1992);Svab,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:8526-8530(1990))。自此以后成功用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的可選標(biāo)記物包括編碼賦予壯觀霉素和鏈霉素抗性的氨基糖苷3’-腺苷轉(zhuǎn)移酶(AadA)的細(xì)菌aadA基因(Svab,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:913-917(1993))、編碼用于在卡那霉素上選擇的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的nptII(Carrer,等,Mol.Gen.Genet.,241:49-56(1993);Lutz,等,PlantJ.,37:906-913(2004);Lutz,等,PlantPhysiol.,145:1201-1210(2007))、另一氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶aphA6(Huang,等,Mol.Genet.Genomics,268:19-27(2002))和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Li,等PlantMolBiol,76(5-6):443-451(2010))。已經(jīng)報道了另一選擇方案，其使用能夠?qū)⒂卸镜奶鸩巳┺D(zhuǎn)化成無毒的甜菜堿的嵌合甜菜醛脫氫酶基因(BADH)(Daniell,等,Curr.Genet.,39:109-116(2001))。III.植物/植物材料可以改造廣泛的植物和植物細(xì)胞系統(tǒng)，以表達(dá)ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或變體。因此可獲得植物材料，如葉、莖、根、花或花部分、果實(shí)、花粉、卵細(xì)胞、合子、種子、插條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物，或植物的任何其他部分或產(chǎn)物，因此遺傳修飾的植物材料顯示改善的干旱耐受性。遺傳修飾的植物或植物材料包含編碼ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或變體的一個或多個基因。在一些實(shí)施方案中，所述遺傳修飾的植物/植物材料包含編碼兩個或多個ACBP2s的兩條核苷酸序列，其每一條可以包含在單獨(dú)的表達(dá)載體上，或在共同啟動子控制下的單個表達(dá)載體上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于改造的靶植物和植物細(xì)胞包括單子葉植物和雙子葉植物，如作物，包括谷類作物（例如，小麥、玉米、稻、黍、大麥）、煙草、水果作物（例如，番茄、草莓、橙子、葡萄柚、香蕉）、飼料作物（例如，苜蓿）、根菜類蔬菜作物（例如，胡蘿卜、馬鈴薯、甘蔗、甘薯）、葉菜類蔬菜作物（例如，萵苣、菠菜）；顯花植物（例如，牽牛花、玫瑰、菊花）、針葉樹和松樹（例如，松杉、云杉）；油料作物（例如，向日葵、油菜籽）；和用于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡闹参铮ɡ?，擬南芥）。其他實(shí)例包括通常在多于約10株植物的組中種植的植物，以獲得完整植物或植物的部分，例如果實(shí)、花，或作物，例如，煙草、植物生產(chǎn)的谷物等，樹（即，果樹、種植用于木材生產(chǎn)的樹、種植用于裝飾的樹等）、任何類型的花（即，例如收獲后為裝飾目的種植的植物）、仙人掌。其中可以表達(dá)ACBP2s的植物的其他實(shí)例包括綠色植物（Viridiplantae）、鏈形植物（Streptophyta）、有胚植物（Embryophyta）、維管植物（Tracheophyta）、真葉植物（Euphyllophytes）、種子植物（Spermatophyta）、木蘭植物（Magnoliophyta）、百合綱（Liliopsida）、鴨跖草亞綱（Commelinidae）、禾本目（Poales）、禾本科（Poaceae）、稻屬（Oryza）、水稻（Oryzasativa）、玉米屬（Zea）、玉米（Zeamays）、大麥屬（Hordeum）、大麥（Hordeumvulgare）、小麥屬（Triticum）、小麥（Triticumaestivum）、真雙子葉植物（Eudicotyledons）、核心真雙子葉植物（Coreeudicots）、菊亞綱（Asteridae）、類真菊分支（Euasterids）、薔薇亞綱（Rosidae）、類真薔薇分支II（EurosidsII）、十字花目（Brassicales）、十字花科（Brassicaceae）、擬南芥、木蘭綱（Magnoliopsida）、Solananae、茄目（Solanales）、茄科（Solanaceae）、茄屬（Solanum）和煙草（Nicotiana）。可以使用本文所述的載體轉(zhuǎn)化的另外的植物包括，但不限于來自以下屬的物種：腰果屬（Anacardium）、落花生屬（Arachis）、天門冬屬（Asparagus）、顛茄屬（Atropa）、燕麥屬（Avena）、蕓苔屬（Brassica）、柑橘屬（Citrus）、西瓜屬（Citrullus）、辣椒屬（Capsicum）、紅花屬（Carthamus）、椰子屬（Cocos）、咖啡屬（Coffea）、黃瓜屬（Cucumis）、南瓜屬（Cucurbita）、胡蘿卜屬（Daucus）、油棕屬（Elaeis）、草莓屬（Fragaria）、大豆屬（Glycine）、棉屬（Gossypium）、向日葵屬（Helianthus）、萱草屬（Heterocallis）、大麥屬（Hordeum）、天仙子屬（Hyoscyamus）、萵苣屬（Lactuca）、亞麻屬（Linum）、黑麥草屬（Lolium）、羽扇豆屬（Lupinus）、番茄屬（Lycopersicon）、蘋果屬（Malus）、木薯屬（Manihot）、Majorana、苜蓿屬（Medicago）、煙草屬（Nicotiana）、木犀欖屬（Olea）、稻屬（Oryza）、Panieum、Panneserum、鱷梨屬（Persea）、菜豆屬（Phaseolus）、Pistachia、豌豆屬（Pisum）、梨屬（Pyrus）、李屬（Prunus）、蘿卜屬（Raphanus）、蓖麻屬（Ricinus）、黑麥屬（Secale）、千里光屬（Senecio）、白芥屬（Sinapis）、茄屬（Solanum）、高粱屬（Sorghum）、可可樹屬（Theobromus）、胡蘆巴屬（Trigonella）、小麥屬（Titicum）、野豌豆屬（Vicia）、葡萄屬（Vitis）、豇豆屬（Vigna）、和玉米屬（Zea）。IV.用于產(chǎn)生干旱抗性植物/植物細(xì)胞的方法可以通過將表達(dá)如本文所述的ACBP2多肽或ACBP2的功能片段或變體的一個或多個載體改造到多種植物細(xì)胞類型，包括但不限于原生質(zhì)體、組織培養(yǎng)細(xì)胞、組織和器官外植體、花粉、胚以及整株植物中來獲得本文所述的植物和植物細(xì)胞/材料。轉(zhuǎn)化方案以及用于將核苷酸序列引入植物中的方案可以根據(jù)靶向轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類型而變化。將核苷酸序列引入植物細(xì)胞并隨后插入到植物基因組中的合適方法包括顯微注射(Crossway,等,Biotechniques,4:320-334(1986))、電穿孔(Riggs,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:5602-5606(1986))、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Townsend,等,美國專利號5,563,055;Horsch,等,Science,227:1227-1231(1985))、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski,等EMBOJ.,3:2717-2722(1984))和彈道粒子加速（ballisticparticleacceleration）(參見例如，Sanford等,美國專利號4,945,050;Tomes,等,PlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods,編輯Gamborg和Phillips(Springer-Verlag,Berlin)(1995);和McCabe,等,Biotechnology6:923-926(1988))。還參見Weissinger,等Ann.Rev.Genet.,22:421-477(1988);Sanford,等,ParticulateScienceandTechnology,5:27-37(1987)(洋蔥);Christou,等,PlantPhysiol.,87:671-674(1988)(大豆);McCabe,等,BioTechnology,6:923-926(1988)(大豆);Finer和McMullen,InVitroCellDev.Biol.,27P:175-182(1991)(大豆);Singh,等,Theor.Appl.Genet.,96:319-324(1998)(大豆);Dafta,等,Biotechnology,8:736-740(1990)(稻);Klein,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4305-4309(1988)(玉米);Klein,等,Biotechnology,6:559-563(1988)(玉米);Tomes,美國專利號5,240,855;Buising,等,美國專利號5,322,783和5,324,646;Tomes,等(1995)PlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods,編輯Gamborg(Springer-Verlag,Berlin)(玉米);Klein,等,PlantPhysiol.,91:440-444(1988)(玉米);Fromm,等,Biotechnology,8:833-839(1990)(玉米);Hooykaas-VanSlogteren,等,Nature,311:763-764(1984);Bowen,等,美國專利號5,736,369(谷類);Bytebier,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:5345-5349(1987)(百合科);DeWet,等TheExperimentalManipulationofOvuleTissues,編輯Chapman等(Longman,N.Y.),第197-209頁(1985)(花粉);Kaeppler等PlantCellReports9:415-418(1990)和Kaeppler,等,Theor.Appl.Genet.,84:560-566(1992)(頸須（whisker）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化);D’Halluin,等,PlantCell,,4:1495-1505(1992)(電穿孔);Li,等,PlantCellReports,12:250-255(1993);Christou和Ford,AnnalsofBotany,75:407-413(1995)(稻);Osjoda,等,NatureBiotechnology,14:745-750(1996)(通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米)；其全部以其整體通過引用并入本文。Agrisoma技術(shù)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和/或基因槍方法描述于WO2010/037209中?？色@得用于轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的方法，包括使用聚乙二醇(PEG)的轉(zhuǎn)化、電穿孔和磷酸鈣沉淀（參見例如Potrykus,等,Mol.Gen.Genet.,199:183-188(1985);Potrykus,等,PlantMolecularBiologyReporter,3:117-128(1985)）。也已經(jīng)描述了用于從原生質(zhì)體再生植物的方法[Evans等,在HandbookofPlantCellCulture,卷1中,(MacmillanPublishingCo.,NewYork,1983);Vasil,IK在CellCultureandSomaticCellGenetics中(Academic,Orlando,1984)]。用于轉(zhuǎn)化質(zhì)體如葉綠體的方法為本領(lǐng)域所知。參見例如，Svab,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:8526-8530(1990);Svab和Maliga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:913-917(1993);Svab和Maliga,EMBOJ.12:601-606(1993)以及Staub和Maliga,PlantJ.6:547-553(1994);Kuehnle,美國公開號2009/7618819。所述方法依賴于基因槍遞送含有可選標(biāo)記物的DNA并通過同源重組將所述DNA靶向質(zhì)體基因組中。此外，可以通過組織優(yōu)選表達(dá)核編碼的且質(zhì)體指向的RNA聚合酶(McBride,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:7301-7305(1994))或通過使用整合酶，如phiC31噬菌體位點(diǎn)特異性整合酶將基因插入靶向先前插入的噬菌體附著位點(diǎn)(Lutz,等,PlantJ,37:906-13(2004))來轉(zhuǎn)活沉默的質(zhì)體攜帶的轉(zhuǎn)基因而完成質(zhì)體轉(zhuǎn)化?？梢栽O(shè)計(jì)質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體，以便轉(zhuǎn)基因從在質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中已經(jīng)與轉(zhuǎn)基因一起插入的啟動子序列進(jìn)行表達(dá)，或者從內(nèi)源質(zhì)體啟動子進(jìn)行表達(dá)，以便完成現(xiàn)有質(zhì)體操縱子的擴(kuò)展(Herz,等,TransgenicResearch,14:969-982(2005))。還可以使用如WO2010/061186中描述的用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的可選方法，其中在植物細(xì)胞的核中產(chǎn)生的RNA可以靶向質(zhì)體基因組中。也已經(jīng)報道了使用合成的核開關(guān)（riboswitch）從質(zhì)體基因組誘導(dǎo)基因表達(dá)(Verhounig,等,ProcNatlAcadSciUSA,107:6204-6209(2010))。Lutz,等,PlantPhysiol,145:1201-10(2007)描述了用于設(shè)計(jì)質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的方法。用于產(chǎn)生所公開的轉(zhuǎn)基因植物的重組酶技術(shù)包括cre-lox、FLP/FRT和Gin系統(tǒng)。為本文所述目的，這些技術(shù)可以使用的方法描述于例如美國專利號5,527,695;Dale和Ow,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10558-10562(1991);Medberry,等,NucleicAcidsRes.23:485-490(1995)中。根據(jù)下文所述的手段和方法或本領(lǐng)域已知的篩選方法選擇或篩選改造的植物/植物材料的轉(zhuǎn)化體（即，已經(jīng)摻入或整合了引入的一個或多個基因構(gòu)建體的那些植物）。通過上文所述方法的任一種轉(zhuǎn)化后，可以用于獲得表達(dá)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化植物的程序包括，但不限于：在選擇性培養(yǎng)基上選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；再生已經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以產(chǎn)生分化的植物；選擇轉(zhuǎn)化的植物，其表達(dá)在期望的組織和細(xì)胞位置中產(chǎn)生期望水平的一種或多種期望多肽的轉(zhuǎn)基因。可以通過選擇或篩選改造的植物材料其在引入的表達(dá)盒上存在的選擇標(biāo)記基因編碼的性狀來鑒定和分離轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或植物。例如，可以通過在含有抑制量的抗生素或除草劑（轉(zhuǎn)化基因構(gòu)建體賦予針對其的抗性）的培養(yǎng)基上生長改造的植物材料進(jìn)行選擇。此外，還可以通過篩選本文所述的載體上可能存在的任何可見標(biāo)記基因（例如，β-葡糖苷酸酶、熒光素酶、B或C1基因）的活性來鑒定轉(zhuǎn)化的植物和植物材料。此類選擇和篩選方法學(xué)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?；蛘呋虼送猓缈梢酝ㄟ^觀察生長抑制的降低來篩選如本文教導(dǎo)的改善的干旱耐受性。物理和生物化學(xué)方法也可以用于鑒定含有本文所述的基因構(gòu)建體/載體的植物或植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。這些方法包括，但不限于：1）Southern分析或PCR擴(kuò)增，其用于檢測和確定重組DNA插入片段的結(jié)構(gòu)；2）Northern印跡、S1RNase保護(hù)、引物延伸或逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增，其用于檢測和檢查基因構(gòu)建體的RNA轉(zhuǎn)錄物；3）用于檢測酶活性的酶測定，其中此類基因產(chǎn)物由基因構(gòu)建體編碼；4）蛋白質(zhì)凝膠電泳(PAGE)、western印跡技術(shù)、免疫沉淀，或酶聯(lián)免疫測定，其中基因構(gòu)建體產(chǎn)物是蛋白質(zhì)。另外的技術(shù)，如原位雜交、酶染色和免疫染色也可以用于檢測具體植物器官和組織中重組構(gòu)建體的存在或表達(dá)。用于完成所有這些測定的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在具體的實(shí)施方案中，指定卡那霉素抗性的可選標(biāo)記基因nptII用于核轉(zhuǎn)化。可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長成植物。參見例如，McCormick,等,PlantCellReports5:81-84(1986)?？梢陨L這些植物，或者用相同轉(zhuǎn)化品種或不同品種授粉，并且所得雜合體具有鑒定的期望表型特征的組成型表達(dá)。可以生長兩代或更多代以保證期望表型特征的組成型表達(dá)得到穩(wěn)定維持和遺傳，然后收獲種子以保證已經(jīng)實(shí)現(xiàn)期望表型特征的組成型表達(dá)。分離的轉(zhuǎn)化體可以通過有性或無性生殖或生長再生成植物及其后代（包括直接世代和后續(xù)世代）。或者，改造的植物材料可以在選擇或篩選來源植物的標(biāo)記基因性狀之前再生成植物。用于在選擇或篩選一種或多種標(biāo)記基因之前或之后從植物細(xì)胞、組織或器官再生植物的程序?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在質(zhì)體轉(zhuǎn)化程序中，可以從轉(zhuǎn)化植物或組織的外植體進(jìn)行進(jìn)一步輪次的植物再生，以增加轉(zhuǎn)基因質(zhì)體的數(shù)目，以便轉(zhuǎn)化植物達(dá)到同型異源性（homoplasmy）的狀態(tài)（所有質(zhì)體含有統(tǒng)一的原質(zhì)體系，其含有轉(zhuǎn)基因插入片段）。V.用于鑒定賦予干旱抗性的基因的方法提供用于鑒定ACPB2的變體或同系物（其像ACPB2一樣賦予干旱抗性）的方法。示例性篩選方法涉及將外源核酸引入宿主細(xì)胞，產(chǎn)生測試細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是當(dāng)水受限或停止給予至生長抑制水平并持續(xù)生長抑制時期時，在干旱條件下顯示生長抑制的細(xì)胞。當(dāng)包含編碼ACPB2或ACBP2樣多肽的核苷酸序列的外源核酸被引入宿主細(xì)胞時，測試細(xì)胞的生長抑制得到緩解。因此，生長抑制的降低表明，外源核酸編碼ACPB2或ACBP2樣多肽，其中所編碼的多肽以緩解干旱誘導(dǎo)的生長抑制的水平產(chǎn)生和/或具有緩解干旱誘導(dǎo)的生長抑制的活性。與未遺傳修飾的宿主相比，生長抑制的降低包括至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或更高的生長抑制降低。為了產(chǎn)生本發(fā)明的遺傳修飾的宿主細(xì)胞，使用建立的技術(shù)，包括但不限于電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、粒子轟擊、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等將包括編碼輸送干旱耐受性的一個或多個ACBP2多肽的核苷酸序列的一個或多個核酸穩(wěn)定或瞬時引入親本宿主細(xì)胞中。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸一般將還包括可選標(biāo)記物，例如任何若干眾所周知的可選標(biāo)記物，如新霉素抗性、氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性、氯霉素抗性和卡那霉素抗性。將外源核酸插入到表達(dá)載體中。適合用于原核和真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體為本領(lǐng)域所知，并且可以使用任何合適的表達(dá)載體。其中實(shí)例包括，染色體、游離型和病毒來源的系統(tǒng)，例如來源于細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒如桿狀病毒、乳多空病毒，如SV40、痘苗病毒、腺病毒、雞痘病毒、偽狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，和來源于其組合的載體，如來源于質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件，如粘粒和噬菌粒的那些載體。表達(dá)系統(tǒng)可以含有調(diào)節(jié)以及引起表達(dá)的控制區(qū)。一般地，可以使用適合于在宿主中維持、繁殖或表達(dá)多核苷酸以產(chǎn)生多肽的任何系統(tǒng)或載體?？梢酝ㄟ^多種眾所周知的和常規(guī)技術(shù)中的任何一種將適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄胁迦氡磉_(dá)系統(tǒng)中，如，例如Sambrook等,MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUAL(第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989))中描述的那些。其中親本宿主細(xì)胞已經(jīng)被遺傳修飾以產(chǎn)生兩個或多個ACBP2s時，編碼兩個或多個ACBP2s的核苷酸序列在一些實(shí)施方案中將各自包含在單獨(dú)的表達(dá)載體上。其中宿主細(xì)胞被遺傳修飾以表達(dá)一個或多個ACBP2s時，編碼一個或多個ACBP2s的核苷酸序列在一些實(shí)施方案中將包含在單個表達(dá)載體中。其中編碼一個或多個ACBP2s的核苷酸序列包含在單個表達(dá)載體中時，在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列將可操作地連接常見的控制元件（例如，啟動子），以便所述常見的控制元件控制所有ACBP2編碼核苷酸序列在單個表達(dá)載體上的表達(dá)。外源核酸在一些實(shí)施方案中將分離自處于其天然環(huán)境中的細(xì)胞或生物。從測試細(xì)胞中分離外源核酸的方法為本領(lǐng)域所熟知。合適的方法包括，但不限于本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的許多堿裂解方法中的任何一種。在其他實(shí)施方案中，在從細(xì)胞或生物中分離核酸之前所述細(xì)胞或生物的核酸將突變。在其他實(shí)施方案中，在體外無細(xì)胞系統(tǒng)中合成外源核酸。在一些實(shí)施方案中，篩選方法包括進(jìn)一步表征候選基因產(chǎn)物。在這些實(shí)施方案中，從如上所述的測試細(xì)胞中分離包含編碼一個或多個ACBP2的一條或多條核苷酸序列的外源核酸。可以將所分離的核酸進(jìn)行核苷酸序列分析，并且基因產(chǎn)物的氨基酸序列從核苷酸序列推導(dǎo)而來。在一些實(shí)施方案中，將基因產(chǎn)物的氨基酸序列與氨基酸序列公共數(shù)據(jù)庫中的其他氨基酸序列進(jìn)行比較，以確定是否與已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列存在任何顯著的氨基酸序列同一性。在已經(jīng)將外源基因鑒定為具有賦予干旱抗性能力后，該新鑒定的ACBP2變體/同系物可以用于提供具有改善的干旱抗性的植物/植物細(xì)胞。A.外源核酸適合于引入宿主細(xì)胞以產(chǎn)生測試細(xì)胞的外源核酸包括但不限于，從細(xì)胞中分離的天然發(fā)生的核酸?？梢酝ㄟ^在嚴(yán)格條件下與編碼ACBP2的核酸雜交鑒定待向宿主細(xì)胞中引入的外源核酸。也可以將與ACBP2顯示77%或更高核苷酸序列同源性的外源序列引入宿主細(xì)胞中以形成測試細(xì)胞。將與ACBP2具有至少77%的DNA同源性的ACBP2樣序列鑒定為ACBP2樣多肽、變體或同系物，其在野生型的保衛(wèi)細(xì)胞中從其自身啟動子表達(dá)并且例如像ACBP2一樣，當(dāng)在轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中過表達(dá)時，類似于ACBP2下調(diào)HAB1并上調(diào)AtrbohD和AtrbohF。更優(yōu)選地，序列同源性為80%或更高，最優(yōu)選90%或更高。從細(xì)胞中分離之前或之后已經(jīng)修飾（例如通過突變）的天然發(fā)生的核酸；合成的核酸，例如使用化學(xué)合成核酸的標(biāo)準(zhǔn)方法在實(shí)驗(yàn)室中合成的或通過重組方法產(chǎn)生的核酸；已經(jīng)在體外（在細(xì)胞內(nèi)或在無細(xì)胞系統(tǒng)中）擴(kuò)增的合成的或天然發(fā)生的核酸；等等。示例性的外源核酸包括但不限于，基因組DNA；RNA；從細(xì)胞中分離的mRNA的互補(bǔ)DNA(cDNA)拷貝；重組DNA；以及例如使用用于DNA合成的標(biāo)準(zhǔn)無細(xì)胞體外方法在體外合成的DNA。在一些實(shí)施方案中，外源核酸是從細(xì)胞（原核細(xì)胞或真核細(xì)胞）中產(chǎn)生的cDNA文庫。在一些實(shí)施方案中，外源核酸是從細(xì)胞（原核細(xì)胞或真核細(xì)胞）中產(chǎn)生的基因組DNA文庫。在一些實(shí)施方案中，例如，其中外源核酸是多個外源核酸（如，例如，cDNA文庫、基因組文庫、或核酸的群體等，其各自編碼具有不同氨基酸序列的ACBP2或ACBP2樣多肽，等）時，將所述外源核酸引入多個宿主細(xì)胞中，形成多個測試細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在干旱條件下在培養(yǎng)物中生長測試細(xì)胞，以便相同類型的天然細(xì)胞會顯示生長抑制和/或死亡；包含外源核酸（其包含編碼ACBP2/ACBP2樣多肽的核苷酸序列）的那些測試細(xì)胞將比不包含外源核酸（其包含編碼ACBP2/ACBP2樣多肽的核苷酸序列）的測試細(xì)胞生長得快，或者包含外源核酸（其包含編碼ACBP2/ACBP2樣多肽的核苷酸序列）的那些測試細(xì)胞將存活下來，而不包含外源核酸（其包含編碼ACBP2/ACBP2樣多肽的核苷酸序列）的測試細(xì)胞將死亡或者受到不利影響。在其他實(shí)施方案中，外源核酸是合成的核酸，其包含例如這樣的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼變體ACBP2，例如在氨基酸序列上有一個或多個氨基酸不同于天然發(fā)生的擬南芥ACBP2或其他親本ACBP2的ACBP2。在一些實(shí)施方案中，與天然發(fā)生的親本ACBP的氨基酸序列相比，變體ACBP2在氨基酸序列上有一個氨基酸、兩個氨基酸、三個氨基酸、四個氨基酸、五個氨基酸、六個氨基酸、七個氨基酸、八個氨基酸、九個氨基酸、或十個氨基酸，或更多個氨基酸不同。在一些實(shí)施方案中，與天然發(fā)生的親本ACBP的氨基酸序列相比，變體ACBP在氨基酸序列上有約10個氨基酸至約15個氨基酸、約15個氨基酸至約20個氨基酸、約20個氨基酸至約25個氨基酸、約25個氨基酸至約30個氨基酸、約30個氨基酸至約35個氨基酸、約35個氨基酸至約40個氨基酸、約40個氨基酸至約50個氨基酸、或約50個氨基酸至約60個氨基酸不同?？梢允褂媒⑼晟频某绦蛲瓿蒁NA的手動化學(xué)合成，或可以使用許多市售機(jī)器中的一種進(jìn)行自動化學(xué)合成?？梢孕揎椇怂岬暮塑账嵝蛄杏糜谠趦?yōu)化核苷酸序列以反映宿主細(xì)胞的密碼子偏好性的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)。技術(shù)人員理解在密碼子選擇偏向于宿主偏愛的那些密碼子時成功表達(dá)的可能性?？梢栽趤碓从谄渲锌色@得序列信息的宿主細(xì)胞的基因調(diào)查的基礎(chǔ)上確定優(yōu)選密碼子。可以通過本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)，如通過產(chǎn)生編碼期望部分的合成核酸；或通過使用Bal31核酸外切酶產(chǎn)生更長核酸的片段來產(chǎn)生的全長蛋白質(zhì)的片段。在仍其他實(shí)施方案中，變體ACBP2由在嚴(yán)格條件下與編碼擬南芥ACBP2或另一已知ACBP2的核酸雜交的核酸所編碼。在一些實(shí)施方案中，在引入宿主細(xì)胞形成測試細(xì)胞之前將核酸突變。在這些實(shí)施方案中，使用多種建立完善的方法中的任何一種將包含編碼天然發(fā)生的ACBP的核苷酸序列的核酸突變，產(chǎn)生包含編碼變體ACBP2的核苷酸序列的核酸。編碼ACBPs的核苷酸序列為本領(lǐng)域所知，并且可以改變?nèi)魏我阎狝CBP2編碼核苷酸序列，以產(chǎn)生用于本發(fā)明方法的合成核酸。突變核酸的方法為本領(lǐng)域所熟知并且包括建立完善的化學(xué)突變方法、輻射誘發(fā)的誘變以及在合成過程中突變核酸的方法。突變DNA的化學(xué)方法包括將DNA暴露于化學(xué)誘變劑，例如甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-亞硝基脲(ENU)、N-甲基-N-硝基-N'-亞硝基胍、4-硝基喹啉N-氧化物、硫酸二乙酯、苯并芘、環(huán)磷酰胺、博來霉素、三乙基三聚氰胺、丙烯酰胺單體、氮芥、長春新堿、二環(huán)氧烷烴（例如，二環(huán)氧丁烷）、ICR-170、甲醛、鹽酸甲基芐肼、環(huán)氧乙烷、二甲基亞硝胺、7,12二甲基苯并(a)蒽、苯丁酸氮芥、六甲基磷酸酰胺、白消安（bisulfan）等。輻射突變誘導(dǎo)劑包括紫外線輻射、γ輻射、X射線和快中子轟擊。還可以使用例如三甲呋豆素，利用紫外線將突變引入核酸中。隨機(jī)或靶向插入可移動的DNA元件，例如轉(zhuǎn)座因子是用于產(chǎn)生突變的另一種合適的方法。例如可以使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，如易錯PCR在無細(xì)胞體外系統(tǒng)中的擴(kuò)增過程中向核酸引入突變?？梢允褂肈NA改組技術(shù)（例如，外顯子改組、結(jié)構(gòu)域切換等）在體外將突變引入核酸中。還可以因細(xì)胞中DNA修復(fù)酶的缺失而將突變引入核酸中，例如期望細(xì)胞中存在編碼突變DNA修復(fù)酶的突變基因，以在細(xì)胞的基因組中產(chǎn)生高頻率的突變（即，約1個突變/100個基因-1個突變/10,000個基因）。編碼DNA修復(fù)酶的基因的實(shí)例包括但不限于MutH、MutS、MutL和MutU，及其在其他物種中的同系物（例如MSH16、PMS12、MLH1、GTBP、ERCC-1等）。突變核酸的方法為本領(lǐng)域所熟知，并且任何已知方法適合于使用。參見例如，Stemple,NatureReviews,5:1-7(2004);Chiang,等PCRMethodsAppl.,2(3):210-217(2003);Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747-10751(1994);和美國專利號6,033,861,和6,773,900。因此，例如，包含編碼天然發(fā)生的ACBP的核苷酸序列的核酸暴露于如上所述的化學(xué)誘變劑中，或進(jìn)行輻射突變，或進(jìn)行易錯PCR，并且將誘變的核酸引入到如上所述的一種或多種遺傳修飾宿主細(xì)胞中。使用細(xì)菌的“誘變物”菌株隨機(jī)誘變的方法也為本領(lǐng)域所熟知并且可以用于產(chǎn)生變體ACBP。參見例如，Greener,等,MethodsinMolecularBiology,57:375-385(1995)。使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的飽和誘變技術(shù)也是眾所周知的并且可以使用。參見例如美國專利號6,171,820。通過緩解鉛引起的生長抑制的能力鑒定包含編碼變體ACBP的核苷酸序列的核酸。B.宿主細(xì)胞用于本文所述的篩選方法的宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞、原核細(xì)胞，或來自多細(xì)胞生物的細(xì)胞（例如，細(xì)胞系）。實(shí)施例提出以下實(shí)施例，以為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員提供怎樣制備和使用本發(fā)明的完整公開和描述，并不旨在限制發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍或者并不旨在代表下文的實(shí)驗(yàn)是所有或僅進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。已經(jīng)努力保證所用數(shù)字（例如量、溫度等）方面的精確性，但應(yīng)該考慮一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說明，份是重量份，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，并且壓力是大氣壓或接近大氣壓?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)縮寫，例如bp，堿基對；kb,千堿基；pl,皮升；s或sec,秒；min,分鐘；h或hr,小時；aa,氨基酸；kb，千堿基；bp,堿基對；nt，核苷酸；等。材料和方法用于實(shí)施例中的材料和方法以及額外的數(shù)據(jù)描述于Du,等,Plant,CellandEnvironment,2012年7月,doi:10.1111/j.1365-3040.2012.02574.x.[Epub印刷前]中，其內(nèi)容以其整體通過引用并入本文中。植物材料、生長條件和脅迫處理擬南芥突變體acbp2和ACBP2-OXs(OX-3和OX-6)分別來源于Columbia生態(tài)型Col-0和Col-6(Gao,等,NewPhytol.,181:89-102(2009)。將這些擬南芥株系的種子表面消毒，并播種在補(bǔ)充有0.8%(w/v)瓊脂和2%(w/v)蔗糖的MS培養(yǎng)基上，在生長室中16-h-光照(23℃)/8-h-黑暗(21℃)周期下進(jìn)行生長。土壤生長的植物也生長在類似的環(huán)境條件下。土壤中盆栽的三周齡植物用于干旱處理。停止?jié)菜?5天，然后在拍照之前對植物重新澆水7天。RNA分析還使用TRIzol?試劑用于持續(xù)白光下100μMABA或干旱處理多個時間（0、1、3、6和24小時）的12天齡擬南芥幼苗的RNA提取。使用SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystem(Invitrogen)合成第一鏈。使用StepOnePlus(AppliedBiosystems)和FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Roche)進(jìn)行QRT-PCR。根據(jù)Schmittgen和Livak(Nat.Protoc.3:1101-1108(2008)分析三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄物變化。用于RT-PCR分析的引物：。保衛(wèi)細(xì)胞和葉中的ROS檢測使用2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(H2DCF-DA,Sigma-Aldrich;Lee等1999;Pei等2000)分析保衛(wèi)細(xì)胞中的活性氧簇（ROS）產(chǎn)生。來自5周齡植物的表皮在含有30mMKCl和10mMMes-KOH(pH6.15)的孵育緩沖液中在冷白光，23℃下孵育2小時。隨后，向溶液中加入50μMH2DCF-DA并孵育15分鐘。用孵育緩沖液短暫洗滌后，向溶液中加入50μMABA或0.1%乙醇（對照）并處理15分鐘。然后用蒸餾水洗滌上皮組織并使用ZeissLSM510META顯微鏡，以488nm激發(fā)和535nm發(fā)射觀察熒光。通過LSMImageBrowser和ImageJ(NationalInstitutesofHealth)測定DCF熒光強(qiáng)度。通過3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色(Thordal-Christensen等1997)檢查葉中的ROS產(chǎn)生。收獲5周齡植物的葉并在室溫下將其浸泡在1mgmL-1DAB溶液(pH3.8)中大約8小時。在96%煮沸的乙醇中清洗10分鐘后對樣品拍照。ACBP2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的產(chǎn)生通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生過表達(dá)ACBP2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物(Clough和Bent,PlantJ.,16:735-743(1998)，并將所得轉(zhuǎn)化體隨后用于測試ACBP2過表達(dá)是否增強(qiáng)了干旱耐受性。在下文提供了ACBP2全長cDNA。從雙元載體pSMB的CaMV35S啟動子表達(dá)ACBP2全長cDNA(Mylne和Botella,PlantMol.Biol.Rep.,16:257-262.)用于擬南芥(Col-0)的轉(zhuǎn)化。CaMV35S啟動子特異性正向引物35SB的序列是。在Northern印跡分析(Gao,等,NewPhytol.,181:89-102(2009)中，將兩個獨(dú)立的T2ACBP2過表達(dá)株系(ACBP2-OX3和ACBP2-OX6)鑒定為過表達(dá)1.6-kbACBP2mRNA。在下文中提供了ACBP2的氨基酸序列。ACBP2pro:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的產(chǎn)生為了產(chǎn)生ACBP2pro:GUS融合構(gòu)建體，通過引物對ACBP25’-側(cè)翼序列中的ML805:-1704至-1677和ACBP2gDNA中的ML806:121-96擴(kuò)增ACBP25’-側(cè)翼區(qū)的1.8-kb的片段，并將其克隆至pGEM-TEasy載體中(Promega,Madison,WI,USA)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pAT351(圖4A)。在下文中提供了ACBP2pro:GUS融合物的核苷酸序列。在下文中提供了ACBP2pro:GUS融合物的氨基酸序列。隨后，將來自pAT351的1.8-kbBamHI-SmaI片段克隆至雙元載體pBI101.3的BamHI-SmaI位點(diǎn)上，以產(chǎn)生pAT353(圖4B)。通過DNA序列分析驗(yàn)證該構(gòu)建體并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(浸花（floraldip）法；Clough和Bent,PlantJ.16:735-743,1998)將其引入擬南芥（Columbia生態(tài)型）中。根據(jù)Liu等,PlantCell,16:5-20(2004)，使用5溴-4-氯-3-吲哚-b-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc)進(jìn)行組織化學(xué)GUS測定。將植物樣品浸沒在GUS染色溶液(100mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0，0.1%TritonX-100，2mM鐵氰化鉀，2mM亞鐵氰化鉀,1mg/mL5溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸)中并真空過濾30分鐘，在37℃孵育并觀察3-16小時的時期。隨后，在70%的乙醇中清洗樣品并拍照。對于共聚焦顯微鏡觀察，將12天齡幼苗在補(bǔ)充有50mMImageneGreen(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的0.1%SilwetL-77溶液中孵育1小時。然后在0.1%SilwetL-77中短暫洗滌樣品并在共聚焦激光掃描顯微鏡(ZeissLSM510META;Zeiss,Hamburg,Germany)下拍照。萌發(fā)時ABA的敏感性為了測試萌發(fā)時ABA的敏感性，每次實(shí)驗(yàn)在存在或不存在0.75mMABA(Sigma-Aldrich,StLouis,MO,USA)的MS培養(yǎng)基上播種超過200粒種子。在4℃下2天后，萌發(fā)種子并在16-小時光照(23℃)/8-小時黑暗(21℃)周期下進(jìn)行生長。利用顯微鏡(LeicaMZ6;Leica,Solms,Germany)每天檢查萌發(fā)并在7天后對幼苗拍照。對于萌發(fā)后生長測定，種子在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)4天，隨后在進(jìn)行拍照和根測量前轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基或補(bǔ)充有100或150mmABA的MS培養(yǎng)基上7天。離子滲漏測定根據(jù)Welti等(2002)測定離子滲漏。簡言之，將ABA處理的離脫葉在去離子水中23℃下攪拌1小時。利用測量儀表(YSI55型)測定溶液的電導(dǎo)率。隨后，通過在水浴中煮沸溶液10分鐘，然后冷卻至23℃來確定總離子強(qiáng)度。序列本文包括的序列數(shù)據(jù)可見于GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫檢索號NM_118916(ACBP2)、NM_105936(HAB1)、NM_124165(AtrbohD)和NM_105079(AtrbohF)下。實(shí)施例1ACBP2受ABA和干旱誘導(dǎo)脫落酸(ABA)是調(diào)節(jié)許多生理學(xué)過程，包括種子休眠和萌發(fā)、幼苗建成、營養(yǎng)發(fā)育和響應(yīng)多種非生物脅迫（包括干旱和鹽度）的植物激素(Schroeder,Kwak和Allen2001;Finkelstein,Gampala和Rock2002;Hirayama和Shinozaki2007;Fujii和Zhu2009;Lee和Luan2012)。輕度和嚴(yán)重的水分缺乏均影響植物發(fā)育(Davies和Zhang1991;Zhu2002;Skirycz和Inzé2010;Skirycz等2011)。在水分缺乏脅迫過程中，ABA水平上升調(diào)節(jié)多個基因的表達(dá)，以促進(jìn)適應(yīng)性響應(yīng)(Christmann等2007;Raghavendra等2010)。為了確定ABA處理對ACBP2表達(dá)的影響，在持續(xù)白光下ABA處理之前和之后的12天齡幼苗中通過實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)使用引物ML1122和ML1123(SEQIDNOs:1和2)檢查ACBP2的表達(dá)。使用StepOnePlus(AppliedBiosystems)和FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Roche)進(jìn)行qRT-PCR。根據(jù)Schmittgen和Livak(Nat.Protoc.3:1101-1108(2008)分析三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄物變化。qRT-PCR結(jié)果顯示在持續(xù)白光下ACBP2受ABA(100mM)處理的顯著誘導(dǎo)。因此，研究了在持續(xù)白光下干旱處理后12天齡幼苗中ACBP2的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示在持續(xù)白光下ACBP2受干旱處理的誘導(dǎo)。在qRT-PCR分析中，ACBP2在干旱處理3、6小時和24小時后上調(diào)（圖1B）。ACBP2受ABA和干旱處理的誘導(dǎo)表明其在干旱響應(yīng)中的可能作用。為了進(jìn)一步檢查種子萌發(fā)和早期幼苗發(fā)育中的ACBP2表達(dá)，進(jìn)行了組織化學(xué)和qRT-PCR分析。數(shù)據(jù)顯示，ACBP2pro:GUS在萌發(fā)后第一天的整個胚中表達(dá)，并且隨后局限于子葉和胚根的伸長區(qū)和分化區(qū)。從萌發(fā)的第４天開始，ACBP2pro:GUS在根維管束中表達(dá)，但不在根尖中表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示）。隨著萌發(fā)的進(jìn)行，GUS表達(dá)快速降低，然而ABA處理抑制萌發(fā)并維持GUS表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示）。qRT-PCR分析的類似結(jié)果暗示，ACBP2表達(dá)可由ABA處理部分恢復(fù)（圖1C）。綜上所述，ACBP2的表達(dá)模式暗示其在種子萌發(fā)和早期幼苗發(fā)育中的可能作用。實(shí)施例2干旱處理和氣孔開度測定如Osakabe,等,JournalofBiologicalChemistry,285:9190-9201(2010)所述進(jìn)行干旱處理。簡言之，將在MS平板上生長的4周齡植物轉(zhuǎn)移到濾紙上并在室中40±3%RH下孵育6或8小時。然后對這些植物重新澆水，并在3天恢復(fù)后計(jì)算存活率。對于在土壤中盆栽的3周齡植物，停止?jié)菜?5天，然后在拍照前對植物重新澆水7天。在圖2B中顯示了存活率。acbp2突變體對干旱脅迫更敏感，而ACBP2-OXs對干旱脅迫更耐受。對在MS培養(yǎng)基上生長的4周齡ACBP2-OXs植物和在土壤中生長的3周齡ACBP2-OXs進(jìn)行失水脅迫。干旱處理并恢復(fù)后，與野生型（Col-0）相比，在MS培養(yǎng)基（圖2A）和土壤（圖2B）中生長的ACBP2-OXs均對干旱脅迫更耐受，而acbp2突變體植物比野生型（Col-6；圖2A和B）對干旱更敏感。為了進(jìn)一步研究ACBP2在干旱脅迫下的功能，在野生型(Col-0和Col-6)、acbp2突變體和ACBP2-OXs中分析響應(yīng)ABA的葉氣孔閉合。根據(jù)Pei,等PlantCell,9:409-423(1997)進(jìn)行氣孔閉合實(shí)驗(yàn)。來自4周齡擬南芥植物的蓮座葉在含有10mMKCl、0.2mMCaCl2和10mMMes-KOH(pH6.15)的氣孔開放溶液中，在23℃冷白光下孵育2小時。隨后，將這些葉轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有ABA的同一新鮮溶液中并孵育2小時。在LeicaDMRXA顯微鏡下對保衛(wèi)細(xì)胞拍照并利用ImageJ(NationalInstitutesofHealth)測定氣孔開度。來自ACBP2-OXs的保衛(wèi)細(xì)胞與野生型（Col-0；圖2C）相比顯示對5μM和10μMABA的增加的氣孔敏感性。相反，來自acbp2突變體的保衛(wèi)細(xì)胞比野生型（Col-6；圖2D）更少受到影響。這些結(jié)果暗示在干旱脅迫過程中通過減少水分損失ACBP2與ABA信號傳遞之間的聯(lián)系。通過在ABA脅迫下的萌發(fā)測試ACBP2-OX種子。ACBP2-OXs(OX-3和OX-6)的萌發(fā)測定揭示了ABA敏感性。對于在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)的種子，在轉(zhuǎn)基因株系和野生型之間沒有注意到顯著差異（圖2E）。然而，存在外源ABA時，ACBP2-OXs對ABA更敏感并且萌發(fā)比野生型（Col-0；圖2F）更慢，而在acbp2突變體與野生型之間沒有檢測到顯著差異（數(shù)據(jù)未顯示）。除了種子萌發(fā)，已知ABA調(diào)節(jié)根發(fā)育(Finkelstein等2002;Fujii和Zhu2009)。對于根生長測定，將在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)的4天齡幼苗轉(zhuǎn)移到含有ABA的MS培養(yǎng)基上。生長7天后，ACBP2-OXs的根比野生型的根（Col-0；圖2G）顯著更短。acbp2突變體的種子在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)并生長4天，隨后將其轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有100或150μmABA的新鮮MS培養(yǎng)基上用于進(jìn)一步的7天孵育。存在100μmABA的情況下，acbp2突變體的根生長在根長度上與野生型（Col-6）沒有顯示出顯著差異。然而，存在150μmABA的情況下，acbp2突變體幼苗的根長比野生型（Col-6）顯著更長（圖2H）。實(shí)施例3ACBP2-OXs顯示增加的ROS產(chǎn)生兩種擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞表達(dá)的NAD(P)H氧化酶AtrbohD和AtrbohF對保衛(wèi)細(xì)胞中ABA介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和氣孔閉合是必需的(Kwak,等,EMBOJ.,22:2623–2633(2003)。從ACBP2-OXs的基因表達(dá)結(jié)果觀察到AtrbohD和AtrbohF受ABA的上調(diào)。通過2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(H2DCF-DA)和3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色研究5周齡野生型和ACBP2-OXs擬南芥植物中的ROS產(chǎn)生。H2DCF-DA是可滲透到質(zhì)膜中的非熒光化合物并轉(zhuǎn)化成不可滲透的二氯熒光素(H2DCF)。細(xì)胞過氧化物酶和H2O2將H2DCF氧化，以產(chǎn)生表明ROS產(chǎn)生的DCF熒光。與H2DCF-DA孵育后，記錄到了保衛(wèi)細(xì)胞中以類似于無ABA處理情況下野生型和ACBP2-OXs擬南芥植物水平的ROS產(chǎn)生。然而，利用50μMABA處理15分鐘后，如更高的熒光強(qiáng)度所示，來自ACBP2-OXs的保衛(wèi)細(xì)胞比野生型積累更多的ROS產(chǎn)生（圖3A）。使用來自野生型(Col-0和Col-6)、acbp2突變體和ACBP2-OXs的離脫葉測試ABA相關(guān)衰老中ACBP2的功能。用10mmABA處理3天后，來自ACBP2-OXs的葉比野生型(Col-0)顯示更明顯的衰老，而acbp2突變體與野生型表現(xiàn)類似（數(shù)據(jù)未顯示）。通過離子滲漏測定進(jìn)一步分析來自acbp2突變體和ACBP2-OXs(OX3和OX6)的葉的膜完整性。結(jié)果顯示，滲漏在ACBP2-OXs中比在野生型(Col-0；圖3B)中更高，這與ACBP2過表達(dá)促進(jìn)ABA介導(dǎo)的葉衰老的觀察結(jié)果一致。相反地，野生型(Col-6)與acbp2突變體之間的差異并不顯著，但是來自acbp2突變體植物的葉在ABA處理后顯示降低（5.8%）的離子滲漏（圖3c）。實(shí)施例4ACBP2的空間表達(dá)數(shù)據(jù)顯示，ACBP2在葉（5A）和保衛(wèi)細(xì)胞（圖5B）中高表達(dá)。比例尺=1mm(圖5A)和20μm(圖5B)。GUS染色也揭示，ACBP2在早期魚雷形胚（early-torpedo）階段、彎曲子葉（bentcotyledonary）階段和成熟階段強(qiáng)表達(dá)。在成熟階段，除根頂端分生組織外，ACBP2在胚的大部分中表達(dá)。除了在胚中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因擬南芥上的GUS組織化學(xué)染色進(jìn)一步揭示了擬南芥多個器官中的ACBP2pro:GUS表達(dá)模式。ACBP2pro:GUS在3周齡擬南芥幼苗、子葉和真葉的保衛(wèi)細(xì)胞、以及主根和側(cè)根維管束中表達(dá)。在開放的花中，ACBP2pro:GUS在花藥的花粉中表達(dá)，但不在花瓣、萼片和雌蕊中表達(dá)。熒光GUS底物測試驗(yàn)證了幼苗保衛(wèi)細(xì)胞中的GUS表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示，但發(fā)表于Du,等,Plant,CellandEnvironment,2012年7月,doi:10.1111/j.1365-3040.2012.02574.x.[Epub印刷前]，其通過引用并入）。實(shí)施例7ACBP2的過表達(dá)調(diào)節(jié)AtrbohD、AtrbohF和HAB1的表達(dá)使用qRT-PCR研究ACBP2在ABA信號傳遞中的作用，以確定ACBP2是否調(diào)節(jié)與ABA信號傳遞相關(guān)的基因。AtrbohD和AtrbohF編碼在ABA響應(yīng)中生產(chǎn)ROS產(chǎn)生的兩個NAD(P)H氧化酶。研究已經(jīng)顯示，AtrbohD和AtrbohF的雙突變削弱了ABA誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和氣孔閉合，表明其蛋白質(zhì)在ABA信號傳遞中的主要作用(Kwak,等,EMBOJ.22:2623–2633(2003))。此外，已經(jīng)觀察到，HAB1是ABA信號傳遞和干旱耐受性的顯性負(fù)調(diào)節(jié)物(Saez,等,PlantJ.,37:354-369(2004)。因此，在野生型(Col-0)與ACBP2-OXs之間比較AtrbohD、AtrbohF和HAB1的表達(dá)。此外，在野生型(Col-0)與ACBP2-OXs之間比較ABA應(yīng)答元件結(jié)合蛋白1(AREB1)、ABA缺損2(ABA2)、9-順式–環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶3(NCED3)、響應(yīng)脫水29A(RD29A)、脫落酸不敏感1(ABI1)、磷脂酶Dα1(PLDα1)和受體樣蛋白激酶1(RPK1)的表達(dá)。在Murashige和Skoog(MS)平板上生長的20天齡ACBP2-OXs(OX-3和OX-6)幼苗保持未處理或用100μMABA處理3小時。通過qRT-PCR檢查基因表達(dá)。qRT-PCR分析顯示，HAB1的表達(dá)在ACBP2-OXs中下調(diào)，由此促進(jìn)ACBP2-OXs中的ABA信號傳遞并增強(qiáng)干旱耐受性。相反地，在ABA處理的ACBP2-OXs中，AtrbohD和AtrbohF的表達(dá)被顯著上調(diào)，這與ABA處理后ACBP2-Oxs的保衛(wèi)細(xì)胞中的ROS產(chǎn)物累積一致。在ABA處理之前和之后觀察到AREB1的顯著上調(diào)。當(dāng)用ABA處理植物時，ACBP2-OXs中的NCED3表達(dá)下調(diào)。響應(yīng)脫水29A(RD29A)、ABI1、PLDa1和受體樣蛋白激酶1(RPK1)的表達(dá)在野生型(Col-0)與ACBP2-OXs之間沒有顯著差異（圖6A-6I）?？偨Y(jié)實(shí)施例使用定量實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)證明，ACBP2mRNA表達(dá)受脫落酸（ABA；調(diào)節(jié)干旱耐受性的主要植物激素）和干旱的誘導(dǎo)（圖1）。數(shù)據(jù)還顯示，過表達(dá)ACBP2(ACBP2-OXs)的轉(zhuǎn)基因擬南芥被賦予改善的干旱耐受性。這些細(xì)胞中ABA介導(dǎo)的活性氧簇（ROS）產(chǎn)生的累積促進(jìn)氣孔閉合，其繼而減少水分損失并改善干旱耐受性（圖2A-D和3）。β-葡糖苷酸酶(GUS)測定證實(shí)，ACBP2pro:GUS在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)（圖4和5），支持在保衛(wèi)細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的與ACBP2相關(guān)的上調(diào)。進(jìn)一步的研究揭示，ACBP2的過表達(dá)誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)氧化酶同系物D(AtrbohD)和AtrbohF的表達(dá)（圖6），其為編碼在ABA響應(yīng)中生成ROS產(chǎn)生的兩個NAD(P)H氧化酶的兩個基因(Kwak,等,EMBOJ.,22:2623–2633(2003)。此外，ACBP2過表達(dá)還抑制編碼對ABA1高度敏感的蛋白質(zhì)(HAB1)的mRNA的表達(dá)，所述HAB1是ABA信號傳遞和干旱耐受性的顯性負(fù)調(diào)節(jié)物(Saez,等,PlantJ.,37:354-369(2004)，暗示了ACBP2在這些過程中的正作用。ACBP2過表達(dá)顯著增加了（平均～2倍）暴露于干旱中的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的存活率。除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本公開發(fā)明隸屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同含義。本文引用的出版物及其引用的材料通過引用明確并入。本領(lǐng)域的技術(shù)人員僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)將認(rèn)識到或能夠確定本文所述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等同。此類等同旨在包括在以下權(quán)利要求書中。