用于檢測(cè)SNAP/CLIP標(biāo)記物的單克隆抗體本發(fā)明涉及用于檢測(cè)SNAP/CLIP標(biāo)記物的單克隆抗體,編碼該抗體的核酸和該抗體用于檢測(cè)含有SNAP/CLIP標(biāo)記物的蛋白的用途。SNAP和CLIP標(biāo)記技術(shù)是一種相對(duì)年輕的技術(shù)。它是給靶蛋白，特別是融合蛋白提供所需配體的精細(xì)方法。WO20009/114748A1披露了SNAP-25組合物，制造α-SNAP-25抗體的方法，α-SNAP-25抗體，檢測(cè)BoNT/A活性的方法和檢測(cè)中和α-BoNT/A抗體的方法，所述α-SNAP-25抗體與某種表位結(jié)合，而所述表位包含SNAP-25切割產(chǎn)物的BoNT/A切割位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處的羧基末端。M.Yamamoto,L.Hassinger,J.E.Crandall在JournalofNeurocytology19,619-627(1990)報(bào)道了階段特異性神經(jīng)突相關(guān)蛋白在發(fā)育中大鼠大腦和小腦皮質(zhì)中的超微結(jié)構(gòu)定位。SNAP/TAG-1是135kDa的糖蛋白，在發(fā)育的嚙齒動(dòng)物CNS中生長(zhǎng)軸突子集的表面表達(dá)。采用免疫電子顯微術(shù)和識(shí)別SNAP/TAG-1(4D7)的單克隆抗體以及過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗，分析了大鼠的胚胎期第17天大腦皮層和出生后第4天和第8天小腦皮層中這種抗原的超微結(jié)構(gòu)定位。在胚胎皮層，免疫反應(yīng)性與位于中間區(qū)(intermediatezone)，基底板(subplate)和皮質(zhì)板(corticalplate)的有限組的神經(jīng)軸突的質(zhì)膜，神經(jīng)元胞體(neuronalsomata)以及它們的主導(dǎo)過(guò)程相關(guān)。免疫反應(yīng)性軸突結(jié)合在一起成為10-20個(gè)的一組，并與非免疫反應(yīng)性軸突隔開(kāi)。有些生長(zhǎng)錐呈免疫反應(yīng)性，然而不是所有4D7-免疫反應(yīng)性軸突的生長(zhǎng)錐顯示染色。在出生后的小腦中，免疫反應(yīng)活性與位于外部顆粒細(xì)胞層(externalgranulecelllayer)的最內(nèi)部分的顆粒細(xì)胞的胞體和軸突相關(guān)。在大腦和小腦皮層，免疫反應(yīng)活性以間插方式出現(xiàn)在相鄰細(xì)胞膜的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，規(guī)律性的周期為100-200nm。該文獻(xiàn)討論了SNAP/TAG-1用作發(fā)育CNS中特定亞組軸突的粘附分子的可能性。RichardJWard,JohnDPediani,和GraemeMilligan在BritishJournalPharmacology(2011),162,1439-1452中報(bào)道了通過(guò)N-端SNAP和CLIP-標(biāo)記技術(shù)評(píng)估配體誘導(dǎo)的食欲肽OX1和大麻素CB1受體的內(nèi)在化。通過(guò)抗體識(shí)別表位標(biāo)簽和熒光團(tuán)與O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶變體的共價(jià)結(jié)合檢測(cè)每一種受體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞表面形態(tài)。可采用各方法監(jiān)測(cè)對(duì)激動(dòng)劑而非拮抗劑作起反應(yīng)的受體內(nèi)在化，但當(dāng)使用SNAP標(biāo)記物的新型、時(shí)間分辨熒光探針時(shí)，靈敏度最高是其它方法的6-10倍以上。然而，就CLIP標(biāo)記物而言，靈敏度沒(méi)有提高，可能由于非特異性結(jié)合水平較高。SNAP標(biāo)記物基于人DNA修復(fù)酶O(6)-烷基鳥(niǎo)嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶。后者已通過(guò)引入突變而得到改變，其改變程度使得可以選出具有更小分子體積并對(duì)芐基鳥(niǎo)嘌呤具有極高親和力的蛋白變體。SNAP標(biāo)記物與芐基鳥(niǎo)嘌呤衍生物高度特異性反應(yīng)，使芐基與和自身共價(jià)偶聯(lián)的底物結(jié)合并切除鳥(niǎo)嘌呤。作為一種重組蛋白標(biāo)記物，它能共價(jià)和化學(xué)計(jì)量地限定各種芐基鳥(niǎo)嘌呤修飾底物與融合蛋白的偶聯(lián)。CLIP標(biāo)記物是通過(guò)誘變從SNAP形成，其與芐基胞嘧啶衍生物而非芐基鳥(niǎo)嘌呤發(fā)生高度特異性反應(yīng)。因此，可能在一個(gè)實(shí)驗(yàn)方法中同時(shí)差別性標(biāo)記SNAP和CLIP標(biāo)記物。SNAP技術(shù)(SNAP/CLIP質(zhì)粒和底物)由新英格蘭生物試驗(yàn)室公司(NEB)分銷。在"JournalofBiomedicineandBiotechnology",Vol.2010的ID658954,doi:10.1155/2010/658954的文章中Aliprandi等人披露了一種以VHH形式的重組抗SNAP的抗體。有一種能同時(shí)檢測(cè)CLIP和SNAP標(biāo)記物的分析工具是最好了。本發(fā)明的目的通過(guò)權(quán)利要求1所述的抗體得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的單克隆抗體特異性地結(jié)合SNAP標(biāo)記物基序和CLIP標(biāo)記物并包含具有氨基酸序列SEQIDNo.3,4,5和8,9,10的CDR。特別是，本發(fā)明的抗體是鼠科抗體。本發(fā)明的主題也是編碼本發(fā)明抗體的核酸，特別是具有SEQIDNo.1或6所示核酸序列的核酸。本發(fā)明抗體可通過(guò)本發(fā)明方法獲得，其中借助SNAP標(biāo)記物蛋白在非人類哺乳動(dòng)物，特別是小鼠中實(shí)施免疫，以及從中獲得雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)結(jié)合試驗(yàn)鑒定同時(shí)識(shí)別SNAP和CLIP標(biāo)記物的抗體細(xì)胞系。本發(fā)明抗體同時(shí)檢測(cè)SNAP和CLIP標(biāo)記物的用途。Aliprandi等描述了能識(shí)別SNAP標(biāo)記物的重組抗體。本發(fā)明的抗體可以用于染色組織切片。本發(fā)明的鼠科抗-SNAP抗體可以用于，特別是染色冷凍切片和石蠟切片。與Aliprandi等人已經(jīng)發(fā)表過(guò)的抗體相比，本發(fā)明抗體的優(yōu)越性在于其更高的價(jià)位，重組蛋白只能識(shí)別一個(gè)表位，而本發(fā)明抗體能識(shí)別兩個(gè)表位。圖1：免疫組織化學(xué)；用HAI(抗-EGFR)和M2D11染色從小鼠獲得的A431腫瘤冷凍切片。圖2：流式細(xì)胞術(shù)；圖片顯示在流式細(xì)胞術(shù)中M2D11和兩種不同的SNAP融合蛋白結(jié)合。圖3：Westernblot分析：兩個(gè)圖片顯示，一方面在變性凝膠中M2D11與SNAP和CLIP-EGF兩種蛋白結(jié)合。圖4：Westernblot分析；此圖片顯示檢測(cè)溶液中M2D11和SNAP蛋白結(jié)合的天然聚丙烯酰胺凝膠印跡。本發(fā)明的抗體能同時(shí)檢測(cè)SNAP標(biāo)記物和CLIP標(biāo)記物。本發(fā)明的抗體的優(yōu)勢(shì)在于可以在流式細(xì)胞術(shù)中檢測(cè)SNAP融合蛋白。該抗體在ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)和Westernblot中的靈敏度與Aliprandi等人描述的抗體相似。除了描述的方法，免疫組織化學(xué)試驗(yàn)中測(cè)驗(yàn)本發(fā)明抗體。它可以用于檢測(cè)冷凍切片和石蠟切片中的SNAP融合蛋白。在特定的實(shí)施例中，抗體是單克隆抗體。特別是，抗體可以是鼠源的。鼠科抗體有優(yōu)越性的原因在于鼠科IgG抗體屬于分子生物學(xué)研究中最常用的抗體形式。因此，很多實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員熟悉使用這類抗體和檢測(cè)鼠科IgG抗體。本發(fā)明抗體的重鏈可變區(qū)示于SEQIDNo.2，SEQIDNo.1涉及編碼該區(qū)的核酸。本發(fā)明抗體的輕鏈可變區(qū)示于SEQIDNo.7，SEQIDNo.6涉及編碼該區(qū)的核酸。本發(fā)明抗體重鏈的CDR見(jiàn)氨基酸序列SEQIDNo.3-5。本發(fā)明抗體輕鏈的CDR見(jiàn)氨基酸序列SEQIDNo.8-10。本發(fā)明也涉及編碼所述蛋白的核酸，尤其是SEQIDNo.1和6。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明抗體的方法，其中借助SNAP標(biāo)記物蛋白在非人類哺乳動(dòng)物，特別是小鼠中實(shí)施免疫。從中獲得雜交瘤細(xì)胞系以及通過(guò)相應(yīng)的結(jié)合試驗(yàn)鑒定能同時(shí)識(shí)別SNAP和CLIP標(biāo)記物的抗體細(xì)胞系。本發(fā)明的抗體可以分別用于檢測(cè)SNAP和CLIP標(biāo)記物，也可以是二者的組合。實(shí)施例聚丙烯酰胺凝膠電泳和Westernblot在Laemmli緩沖液中使待分析的樣本變性(或在不含SDS的天然樣本緩沖液中)并在12％(w/v)SDS的聚丙烯酰胺凝膠和聚丙烯酰胺凝膠(160V,60min)上進(jìn)行電泳。蛋白用考馬斯染色法顯色或轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Whatman,Schleicher&Schuell,Dassel,德國(guó))(350mA,70分鐘)顯現(xiàn)。轉(zhuǎn)移后，膜在室溫下用1％(w/v)BSA阻斷1小時(shí)。在PBS-T中洗滌三次后，蛋白印跡與一抗溫育(1小時(shí))。在進(jìn)一步三次洗滌步驟后，用酶偶聯(lián)的二抗(1小時(shí))和對(duì)應(yīng)的底物(10分鐘)檢測(cè)特異性結(jié)合。在對(duì)SNAP和CLIP蛋白的分析中，樣本在變性前和BG或BC底物溫育。結(jié)果在圖3中顯示。圖3.Westernblot分析。兩張圖片3A，3B和3C顯示，一方面，M2D11與兩種蛋白SNAP和CLIPEGF在變性凝膠中結(jié)合。抗體顯示與其它His6-標(biāo)記蛋白(GFP-Ki4)沒(méi)有交叉反應(yīng)。此外，圖3B顯示抗體不與SNAP底物競(jìng)爭(zhēng)與SNAP的結(jié)合。用BG生物素生物素化SNAP蛋白后，用M2D11進(jìn)一步檢測(cè)蛋白。另外，圖3C顯示抗體與不同的SNAP-scFv融合物(H22-SNAP,SNAP-2715)和與CLIP-scFv-SNAP融合蛋白結(jié)合。圖4：Westernblot分析。該圖顯示檢測(cè)溶液中M2D11和SNAP蛋白結(jié)合的天然聚丙烯酰胺凝膠印跡。圖A部分顯示通過(guò)Myc標(biāo)記物標(biāo)記蛋白表明有SNAP蛋白存在?？梢悦黠@看出，在溶液中蛋白也與M2D11結(jié)合，而游離蛋白只有超過(guò)1:4的比例能被檢測(cè)到。在圖B部分，抗體被額外檢測(cè)到以致可以顯示兩種蛋白的共定位(colocalization)。免疫組織化學(xué)從源自具有A-431腫瘤的BALB/c小鼠(DSMZNo.ACC91)的EGFR陽(yáng)性皮下腫瘤制備組織切片。殺死動(dòng)物后，把腫瘤包埋入“榮格組織冷凍介質(zhì)”(LeicaMicrosystems,Nussloch,德國(guó))并冷凍于液氮。用Leica3050skryostat制備8um的冷凍切片并干燥過(guò)夜。切片用丙酮固定10分鐘，干燥并用Immunopen(SigmaAldrich)勾畫出輪廓。腫瘤細(xì)胞用EGFR特異性scFv融合蛋白425scFvSNAP(0.034mg/ml)作為一抗染色。用PBST三次洗滌后，用不同濃度的過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體M2D11(儲(chǔ)備液:657ng/μl)檢測(cè)SNAP融合蛋白。兩種抗體孵化步驟在室溫下進(jìn)行45分鐘，洗滌步驟在室溫下進(jìn)行5分鐘并振蕩。用PBST洗滌兩次和用TBST洗滌一次后，組織切片在3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)溶液中溫育直至染色可見(jiàn)。隨后用蘇木精進(jìn)行復(fù)染，然后將切片安置在甘油凝膠中。結(jié)果顯示于圖1。圖1:免疫組織化學(xué)。用425(scFv)-SNAP(抗-EGFR)和M2D11染色從小鼠獲得的A431腫瘤冷凍切片。流式細(xì)胞術(shù)用流式細(xì)胞儀(Becton&Dickinson)和CellQuest軟件，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析M2D11的功能。就像檢測(cè)SNAP融合蛋白與細(xì)胞特異性結(jié)合一樣檢測(cè)與不同細(xì)胞系細(xì)胞表面的非特異性結(jié)合。大約4*105細(xì)胞先在100ul的PBS中與1-2μgSNAP/CLIP融合蛋白溫育，然后在100ul的PBS中與3.3ngM2D11在冰上溫育30分鐘。為作檢測(cè)，細(xì)胞與GaM-PE(1:100,Dianova,漢堡,德國(guó))在冰上溫育30分鐘。細(xì)胞隨后用流式細(xì)胞術(shù)分析。在所有步驟之間，用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞洗滌離心機(jī)進(jìn)行PBS洗滌步驟。將細(xì)胞重懸在300ulPBS中以便測(cè)試。結(jié)果在圖2中顯示。圖2：流式細(xì)胞術(shù)；圖片顯示在流式細(xì)胞術(shù)中M2D11與兩種不同的SNAP融合蛋白結(jié)合。在兩種細(xì)胞系上，沒(méi)有檢測(cè)到或只檢測(cè)到非常少的抗體與細(xì)胞表面的交叉反應(yīng)。本文顯示的MonoMac1和A431細(xì)胞是例子。利用PC-3、CHO-K1、Kasumi、Mcf-7、L3.6pl、L540和FG細(xì)胞系額外進(jìn)行了分析。