植物調(diào)控元件及其應(yīng)用本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年3月30日和發(fā)明名稱為“植物調(diào)控元件及其應(yīng)用”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本申請(qǐng)要求于2008年4月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/042,957號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過引用方式結(jié)合在本文中。序列表引入包含于文件名為“MONS222WO_Sequence_Listing”的文件中的序列表(其按Microsoft測(cè)定為30.2千字節(jié)，并且于2009年3月30日創(chuàng)建)，在此通過電子方式提交并且以引用方式結(jié)合在本文中。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)和植物遺傳工程和用于調(diào)節(jié)植物中基因表達(dá)的DNA分子的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
調(diào)控元件為通過調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄、以調(diào)控基因活性的遺傳元件。這樣的元件包括啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和3’非翻譯區(qū)，并且可用于植物分子生物學(xué)和植物遺傳工程領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供用于植物中的來(lái)自小米(Foxtailmillet)(小米(Setariaitalica(L.)Beauv))的新型調(diào)控元件。本發(fā)明還提供含有調(diào)控元件的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明還提供包含可操作地連接至可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子。本發(fā)明還提供制備和使用調(diào)控元件、包含調(diào)控元件的DNA構(gòu)建體和包含可操作地連接至可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子的方法。特別地，本發(fā)明涉及以下各項(xiàng)：1.一種包含調(diào)控元件的DNA分子，該調(diào)控元件具有選自以下的DNA序列：(a)與選自SEQIDNO：1-20的DNA序列具有至少85％序列一致性的序列，(b)選自SEQIDNO：1-20的序列，以及(c)具有啟動(dòng)子活性的SEQIDNO：1-20中任意序列的片段，其中所述調(diào)控元件可操作地連接至異源可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。2.如第1項(xiàng)所述的DNA分子，其中，所述序列與選自SEQIDNO：1-20的DNA序列具有至少90％的序列一致性。3.如第1項(xiàng)所述的DNA分子，其中，所述序列與選自SEQIDNO：1-20的DNA序列具有至少95％的序列一致性。4.一種包含調(diào)控元件的DNA構(gòu)建體，該調(diào)控元件具有選自以下的DNA序列：(a)與選自SEQIDNO：1-20的DNA序列具有至少85％序列一致性的序列，(b)選自SEQIDNO：1-20的序列，以及(c)具有啟動(dòng)子活性的SEQIDNO：1-20中任意序列的片段，其中所述調(diào)控元件可操作地連接至異源可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。5.如第4項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子為農(nóng)學(xué)目的基因。6.如第4項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子為在植物中能夠提供除草劑抗性的基因。7.如第4項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中，所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子為在植物中能夠提供植物害蟲控制的基因。8.一種用第1項(xiàng)所述的DNA分子穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。9.如第8項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞為單子葉植物細(xì)胞。10.一種用第1項(xiàng)所述的DNA分子穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。11.一種如第10項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物的植物部分，其中，所述植物部分包含所述DNA分子。12.一種如第10項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物的種子，其中，所述種子包含所述DNA分子。附圖簡(jiǎn)述圖1表示根據(jù)來(lái)自脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因的調(diào)控元件設(shè)計(jì)的三個(gè)啟動(dòng)子變體。SEQIDNO：15為P-SETit.Rcc3-1：1：1，長(zhǎng)度為2062個(gè)核苷酸堿基對(duì)；SEQIDNO：20為P-SETit.Rcc3-1：1：11，長(zhǎng)度為915個(gè)核苷酸堿基對(duì)；以及SEQIDNO：18為P-SETit.Rcc3-1：1：10，長(zhǎng)度為1563核苷酸堿基對(duì)。圖2表示根據(jù)來(lái)自類金屬硫蛋白基因的調(diào)控元件設(shè)計(jì)的兩個(gè)啟動(dòng)子變體。SEQIDNO：5為P-SETit.Mtha-1：1：1，長(zhǎng)度為483個(gè)堿基對(duì)；SEQIDNO：8為P-SETit.Mthb-1：1：2，長(zhǎng)度為1516個(gè)堿基對(duì)。圖3A和3B共同表示通過使用CLUSTALW(1.82)多序列比對(duì)來(lái)自脫水相關(guān)蛋白基因的啟動(dòng)子的兩個(gè)等位基因變體，得到的序列比對(duì)。在比對(duì)序列下的共有序列中，將匹配標(biāo)記為“*”，將錯(cuò)配標(biāo)記為“.”，以及將缺失/插入標(biāo)記為“-”。當(dāng)比對(duì)時(shí)，兩個(gè)等位基因變體具有相同的前導(dǎo)序列，但是啟動(dòng)子序列為序列變體。SEQIDNO：10為P-SETit.DRPa-1：1：1，SEQIDNO：13為P-SETit.DRPb-1：1：1。具體實(shí)施方式提供了以下定義和方法以更好地限定本發(fā)明并且指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除非特殊說(shuō)明，根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來(lái)理解這些術(shù)語(yǔ)。DNA分子如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“DNA”或“DNA分子”是指基因組雙鏈DNA分子或合成的雙鏈DNA分子，即脫氧核苷酸堿基的聚合物或多核苷酸分子，從5’(上游)端至3’(下游)端讀取。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文中所使用的命名按美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)(UnitedStatesCodeofFederalRegulations)§1.822第37款所規(guī)定的，并且在WIPO標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)，附錄2，表1和3的表格中有所闡述。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的DNA分子”是指與其自然或天然狀態(tài)存在時(shí)通常與其相伴的其他分子至少部分分離的DNA分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指與其自然或天然狀態(tài)存在時(shí)通常與其側(cè)翼相接的核酸至少部分分離的DNA分子。因此，融合至通常與它們不相關(guān)的調(diào)控或編碼序列的DNA分子(例如作為重組技術(shù)的結(jié)果)，在本文中被認(rèn)為是分離的。即使被整合至宿主細(xì)胞的染色體中或者與其他DNA分子存在于核酸溶液中，這樣的分子也被認(rèn)為是分離的。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員公知的任何方法均可用于分離和操作本發(fā)明公開的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)可用于擴(kuò)增特定的起始DNA分子和/或產(chǎn)生原始分子的變體。DNA分子或其片段也可通過其他技術(shù)(例如用化學(xué)手段直接合成片段，正如通常使用自動(dòng)化寡核苷酸合成儀進(jìn)行的)獲得。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“序列一致性”是指兩個(gè)優(yōu)化比對(duì)的多核苷酸序列為一致的程度。優(yōu)化的序列比對(duì)是通過手動(dòng)比對(duì)兩個(gè)序列(例如，參考序列和另一序列)產(chǎn)生的，以最大化在序列比對(duì)中具有適合的內(nèi)部核苷酸的插入、缺失或間隙的核苷酸匹配的數(shù)目。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“參考序列”是指SEQIDNO：1-20所示的序列。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“百分比序列一致性”或“百分比一致性”或“％一致性”為一致性分?jǐn)?shù)乘以100。同參考序列優(yōu)化比對(duì)的序列的“一致性分?jǐn)?shù)”為在優(yōu)化的比對(duì)中核苷酸匹配除以參考序列中的核苷酸總數(shù)(例如整個(gè)參考序列總長(zhǎng)度的核苷酸總數(shù))。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式為當(dāng)與參考序列(在此為SEQIDNO：1-20)優(yōu)化比對(duì)時(shí)，包含與參考序列具有約85％或更高的一致性、約90％或更高的一致性、約95％或更高的一致性，或至少96％的一致性、97％的一致性、98％的一致性，或99％的一致性并且具有基因調(diào)控活性的序列的DNA分子。調(diào)控元件調(diào)控元件為具有基因調(diào)控活性的DNA分子，即具有影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的能力的DNA分子。因此術(shù)語(yǔ)“基因調(diào)控活性”是指通過影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯而影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)模式的能力?；蛘{(diào)控活性可以為正向和/或負(fù)向，并且該影響可通過其時(shí)間、空間、發(fā)育、組織、環(huán)境、生理、病理、細(xì)胞周期和/或化學(xué)響應(yīng)特性以及定量或定性指標(biāo)進(jìn)行表征。例如啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的調(diào)控元件為具有基因調(diào)控活性以及對(duì)活體細(xì)胞的基因整體表達(dá)起重要作用的DNA分子。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”是指具有基因調(diào)控活性的DNA分子，即具有影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的能力的DNA分子。因此，在植物中起作用的例如啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列的分離的調(diào)控元件可用于通過遺傳工程方法修飾植物表型。調(diào)控元件可通過它們的表達(dá)模式進(jìn)行表征，即作為構(gòu)成性的和/或通過它們的時(shí)間、空間、發(fā)育、組織、環(huán)境、生理、病理、細(xì)胞周期和/或化學(xué)響應(yīng)表達(dá)模式以及其任意組合，和定量或定性指標(biāo)進(jìn)行表征。啟動(dòng)子被用作調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)的調(diào)控元件。如本文所使用的，“基因表達(dá)模式”為將可操作地連接的DNA分子轉(zhuǎn)錄為轉(zhuǎn)錄的RNA分子的任何模式。表達(dá)可通過其時(shí)間、空間、發(fā)育、組織、環(huán)境、生理、病理、細(xì)胞周期和/或化學(xué)響應(yīng)特性以及定量或定性指標(biāo)進(jìn)行表征。轉(zhuǎn)錄的RNA分子可被翻譯以產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子或可提供反義或其他調(diào)控RNA分子，例如dsRNA、tRNA、rRNA、miRNA等。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)表達(dá)”為將轉(zhuǎn)錄的RNA分子翻譯為蛋白質(zhì)分子的任何模式。蛋白質(zhì)表達(dá)可通過其時(shí)間、空間、發(fā)育或形態(tài)學(xué)特性以及定量或定性指標(biāo)進(jìn)行表征。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”通常是指參與識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶II和其他蛋白質(zhì)(反式作用(trans-acting)轉(zhuǎn)錄因子)以啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA分子。啟動(dòng)子可最初從基因的基因組拷貝的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)分離?？蛇x地，啟動(dòng)子可為合成產(chǎn)生的或操控的DNA分子。啟動(dòng)子也可為嵌合的，也就是通過兩個(gè)或更多個(gè)異源DNA分子的融合產(chǎn)生的啟動(dòng)子?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括SEQIDNO：2、5、8、10、13和20或其片段或變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了本文公開的啟動(dòng)子序列的片段。啟動(dòng)子片段可具有啟動(dòng)子活性，并且可單獨(dú)使用，或在例如構(gòu)建嵌合的啟動(dòng)子中與其他啟動(dòng)子和啟動(dòng)子片段聯(lián)合使用。在具體的實(shí)施方式中，提供了包含具有本文公開的啟動(dòng)子活性的多核苷酸分子的至少約50、95、150、250、500或約750個(gè)連續(xù)核苷酸的啟動(dòng)子片段。當(dāng)與參考序列優(yōu)化比對(duì)時(shí)，該片段可顯示出與參考序列具有至少約85％、約90％、約95％、約98％、或約99％或更高的一致性。也可以分析啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段中已知啟動(dòng)子元件的存在，即例如TATA-框和其他已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)基序的DNA序列特性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過這些已知啟動(dòng)子元件的識(shí)別來(lái)設(shè)計(jì)具有與原始啟動(dòng)子有相似表達(dá)模式的啟動(dòng)子的變體。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)子”或“增強(qiáng)子元件”是指順式作用(cis-acting)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，也就是順式元件，其提供整體表達(dá)模式的一個(gè)方面，但是通常不足以單獨(dú)促使可操作地連接的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。與啟動(dòng)子不同，增強(qiáng)子元件通常不包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)或TATA框。啟動(dòng)子可以天然包含一個(gè)或多個(gè)影響可操作地連接的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件。分離的增強(qiáng)子元件也可與啟動(dòng)子融合以產(chǎn)生嵌合的啟動(dòng)子順式元件，其提供基因表達(dá)的整體調(diào)節(jié)的一方面。啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段可包含一個(gè)或多個(gè)影響可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子元件。據(jù)認(rèn)為，許多啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件結(jié)合DNA結(jié)合蛋白和/或影響DNA拓?fù)鋵W(xué)，從而產(chǎn)生選擇性地允許或限制RNA聚合酶接觸DNA模板或在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)促進(jìn)雙螺旋選擇性打開的局部構(gòu)型。增強(qiáng)子元件可起作用以結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。一些增強(qiáng)子元件結(jié)合多于一種轉(zhuǎn)錄因子，并且轉(zhuǎn)錄因子可通過不同的親和力與多于一個(gè)增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域相作用。增強(qiáng)子元件可通過多種技術(shù)進(jìn)行識(shí)別，包括缺失分析(即從啟動(dòng)子5’端或內(nèi)部缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸)；DNA結(jié)合蛋白分析，使用DNaseI足印法、甲基化干擾、電泳遷移率改變測(cè)試、通過連接介導(dǎo)PCR的體內(nèi)基因組足印法和其他常規(guī)測(cè)試；或通過使用已知順式元件基序或增強(qiáng)子元件作為靶標(biāo)序列或靶標(biāo)基序、使用常規(guī)DNA序列比較方法(例如BLAST)進(jìn)行DNA序列相似性分析。增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域的精細(xì)結(jié)構(gòu)可通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸的誘變(或取代)或通過其他常規(guī)方法進(jìn)一步研究。增強(qiáng)子元件可通過化學(xué)合成獲得，或從包括該元件的調(diào)控元件中分離獲得，并且它們可與另外的含有可用的限制性酶切位點(diǎn)的側(cè)翼核苷酸一起合成以有利后續(xù)操作。因此，根據(jù)本文公開的用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)的方法的增強(qiáng)子元件的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和使用包含于本發(fā)明中。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“前導(dǎo)序列”是指從基因的基因組拷貝的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)分離、并且通常定義為在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)以及蛋白編碼序列起始位點(diǎn)之間的核苷酸節(jié)段的DNA分子?？蛇x地，前導(dǎo)序列可為合成產(chǎn)生的或操控的DNA元件。前導(dǎo)序列可用作5’調(diào)控元件，以調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)。前導(dǎo)序列分子可與異源啟動(dòng)子或它們的天然啟動(dòng)子共同使用。因此，本發(fā)明的啟動(dòng)子分子可以可操作地連接至它們的天然前導(dǎo)序列或可操作地連接至異源前導(dǎo)序列?？捎糜趯?shí)現(xiàn)本發(fā)明的前導(dǎo)序列包括SEQIDNO：3、6、11和16或其片段或變體。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“嵌合的”是指通過將第一個(gè)DNA分子與第二個(gè)DNA分子融合而生成的單個(gè)DNA分子，其中第一個(gè)或第二個(gè)DNA分子通常都不會(huì)在該構(gòu)型、即融合其他的構(gòu)型中發(fā)現(xiàn)。因此，嵌合的DNA分子為新的DNA分子而不是通常在自然界中發(fā)現(xiàn)的。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“嵌合的啟動(dòng)子”是指通過對(duì)DNA分子進(jìn)行這樣的操作而生成的啟動(dòng)子。嵌合的啟動(dòng)子可以結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)DNA片段；例子可為啟動(dòng)子與增強(qiáng)子元件的融合。因此，根據(jù)本文公開的用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)的方法的嵌合的啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和使用包含于本發(fā)明中。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“變體”是指與第一個(gè)DNA分子組成相似但不相同的第二個(gè)DNA分子，而第二個(gè)DNA分子仍保持通常的功能，即與第一個(gè)DNA分子具有相同或相似的表達(dá)模式。變體可為第一個(gè)DNA分子的較短或截短形式和/或第一個(gè)DNA分子的序列變化形式(例如具有不同的限制性酶切位點(diǎn)和/或內(nèi)部缺失、取代和/或插入的DNA分子)。在本發(fā)明中，SEQIDNO：1-20所示的多核苷酸序列可用于生成與原始調(diào)控元件的多核苷酸序列組成相似但不相同的變體，而它們?nèi)员３滞ǔ９δ?即與原始的調(diào)控元件相同或相似的表達(dá)模式)。本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員根據(jù)說(shuō)明書的公開內(nèi)容熟知本發(fā)明中這樣的變體的生成，其包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。構(gòu)建體如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建體”是指衍生自任何來(lái)源、能夠進(jìn)行基因組整合或自主復(fù)制、包含多核苷酸分子(其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸分子已經(jīng)以功能性操作方式連接，即操作性地連接的)的任何重組多核苷酸分子(例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制多核苷酸分子、噬菌體，或線狀或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“載體”是指任何可用于轉(zhuǎn)化目的(即將異源DNA引入宿主細(xì)胞)的重組多核苷酸構(gòu)建體。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指第一個(gè)分子連接到第二個(gè)分子，其中分子如此排列以使第一個(gè)分子影響第二個(gè)分子的功能。兩個(gè)分子可以或可以不是單個(gè)連續(xù)分子的一部分，并且可以或可以不相鄰。例如，如果啟動(dòng)子調(diào)控細(xì)胞中目的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子可操作地連接至可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。本發(fā)明的構(gòu)建體通常為雙Ti質(zhì)粒邊界(border)DNA構(gòu)建體，其具有從根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)分離的包含T-DNA的Ti質(zhì)粒的右邊界(RB或AGRtu.RB)和左邊界(LB或AGRtu.LB)區(qū)域，隨著根癌土壤桿菌細(xì)胞提供的轉(zhuǎn)化分子，允許T-DNA整合至植物細(xì)胞的基因組中(參見，例如，美國(guó)專利6,603,061)。構(gòu)建體也可包含可在細(xì)菌細(xì)胞中提供復(fù)制功能和抗生素選擇性的質(zhì)粒骨架DNA節(jié)段，例如，大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)(例如ori322)、廣范圍宿主復(fù)制起點(diǎn)(例如oriV或oriRi)，以及編碼Tn7氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(aminoglycosideadenyltransferase)(aadA)從而對(duì)壯觀霉素或鏈霉素耐受的可選擇標(biāo)記(如Spec/Strp)或者慶大霉素(Gm，Gent)可選擇性標(biāo)記基因的編碼區(qū)。對(duì)于植物的轉(zhuǎn)化，宿主細(xì)菌菌株通常為根癌土壤桿菌ABI、C58或LBA4404；然而，植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他菌株也可以在本發(fā)明中起作用。通過將可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄為可翻譯和表達(dá)為蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能性mRNA分子的方式，將構(gòu)建體組裝和導(dǎo)入細(xì)胞中的方法在本領(lǐng)域是已知的。對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知制備和使用構(gòu)建體和宿主細(xì)胞的常規(guī)組合物和方法，參見，例如，MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rdeditionVolumes1、2和3(2000)J.F.Sambrook、D.W.Russell和N.Irwin，ColdSpringHarborLaboratoryPress。制備特別適合于植物轉(zhuǎn)化的重組載體的方法包括但不局限于整體記載于美國(guó)專利4,971,908、4,940,835、4,769,061和4,757,011中的那些。這些類型的載體也已在科技文獻(xiàn)中綜述過(參見，例如，Rodriguez等人，Vectors：ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses，Butterworths，Boston，(1988)和Glick等人，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)L.(1993))。用于在高等植物中表達(dá)核酸的典型載體是本領(lǐng)域已知的，并且包括衍生自根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的載體(Rogers等人，MethodsinEnzymology，153：253-277(1987))。用于植物轉(zhuǎn)化的包括pCaMVCN轉(zhuǎn)化控制載體的其他重組載體也已經(jīng)描述在科技文獻(xiàn)中(參見，例如，F(xiàn)romm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：5824-5828(1985))。構(gòu)建體可包含不同的調(diào)控元件。任何該調(diào)控元件可與其他調(diào)控元件聯(lián)合提供。該組合可被設(shè)計(jì)或改造以產(chǎn)生所需的調(diào)控特性。本發(fā)明的構(gòu)建體可典型地包含至少一個(gè)可操作地連接至可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的調(diào)控元件，所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子可操作地連接至3’轉(zhuǎn)錄終止分子。本發(fā)明的構(gòu)建體可包括本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子或前導(dǎo)序列。例如，本發(fā)明的啟動(dòng)子可以可操作地連接至異源5’非翻譯前導(dǎo)序列(例如衍生自熱休克蛋白基因的異源5’非翻譯前導(dǎo)序列)(參見，例如，美國(guó)專利No.5,659,122和5,362,865)?？蛇x地，本發(fā)明的前導(dǎo)序列可以可操作地連接至例如花椰菜花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的異源啟動(dòng)子(參見，美國(guó)專利No.5,352,605)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)含子”是指可被從基因的基因組拷貝中分離或識(shí)別、并且通常定義為在翻譯前在mRNA的處理過程中剪接出的區(qū)域的DNA分子?？蛇x地，內(nèi)含子可為合成產(chǎn)生的或操控的DNA元件。內(nèi)含子可包含影響可操作地連接的基因轉(zhuǎn)錄的元件增強(qiáng)子元件。內(nèi)含子可用作調(diào)控元件以調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)。DNA構(gòu)建體可包含內(nèi)含子，該內(nèi)含子與可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子序列可以是或者不是異源的。本領(lǐng)域的內(nèi)含子的例子包括水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子(美國(guó)專利No.5,641,876)以及玉米HSP70內(nèi)含子(美國(guó)專利No.5,859,347)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“3’轉(zhuǎn)錄終止分子”或“3’UTR”是指在轉(zhuǎn)錄中用于生成mRNA分子3’非翻譯區(qū)(3’UTR)的DNA分子。mRNA分子的3’非翻譯區(qū)可通過特定的切割和3’多腺苷酸化(即聚A尾)產(chǎn)生。3’UTR可以可操作地連接至多核苷酸分子并且位于可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的下游，并且可包括提供多腺苷酸化信號(hào)和其他能夠影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)控信號(hào)的多核苷酸。聚A尾被認(rèn)為在穩(wěn)定mRNA和啟動(dòng)翻譯中起作用。本領(lǐng)域的3’轉(zhuǎn)錄終止分子的例子為胭脂堿合成酶3′區(qū)域(參見，F(xiàn)raley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4803-4807(1983))；小麥hsp173′區(qū)域；豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亞基3′區(qū)域；棉花E63′區(qū)域(美國(guó)專利6,096,950)；WO0011200A2公開的3′區(qū)域；以及薏苡辛(coixin)3’UTR(美國(guó)專利No.6,635,806)。構(gòu)建體和載體也可包含表達(dá)連接的肽類的轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列，該連接的肽用于將蛋白質(zhì)產(chǎn)物靶向至特別是葉綠體、白色體或其他質(zhì)體細(xì)胞器；線粒體；過氧化物酶體；液泡或細(xì)胞外部位。使用葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的記載，可參見美國(guó)專利No.5,188,642和美國(guó)專利No.5,728,925。許多葉綠體-定位(chloroplast-localized)蛋白質(zhì)從核基因中表達(dá)為前體，并且通過葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)靶向葉綠體。該分離的葉綠體蛋白質(zhì)的例子包括但不局限于：與核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶的小亞基(SSU)、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白氧化還原酶、獲光復(fù)合物蛋白I和蛋白II、硫氧還蛋白F、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)相關(guān)的那些以及記載于美國(guó)專利No.7,193,133的轉(zhuǎn)運(yùn)肽類。已在體內(nèi)和體外證明，通過與異源CTP的蛋白質(zhì)融合可將非-葉綠體蛋白質(zhì)靶向葉綠體，并且CTP足夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶向葉綠體。適合的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(例如擬南芥(Petuniahybrida)EPSPSCTP(CTP2)(參見，Klee等人，Mol.Gen.Genet.，210：437-442(1987))或矮牽牛(Petuniahybrida)EPSPSCTP(CTP4)(參見，della-Cioppa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：6873-6877(1986)))的引入已顯示在轉(zhuǎn)基因植物中將異源EPSPS蛋白質(zhì)序列靶向葉綠體(參見，美國(guó)專利No.5,627,061、5,633,435和5，312,910和EP0218571、EP189707、EP508909和EP924299)。可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子”是指任何能夠被轉(zhuǎn)錄為RNA分子的DNA分子，包括但不局限于具有蛋白質(zhì)編碼序列的那些以及具有用于基因抑制的序列的那些?！稗D(zhuǎn)基因”是指與宿主細(xì)胞異源的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子和/或人工摻入宿主細(xì)胞基因組的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以可操作地連接至相對(duì)于啟動(dòng)子分子為異源的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“異源的”是指當(dāng)該組合通常不存在于自然界時(shí)的兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸分子的組合。例如，兩個(gè)分子可衍生自不同種類和/或兩個(gè)分子可衍生自不同基因，比如，來(lái)自相同種類的不同基因或來(lái)自不同種類的相同基因。因此如果該組合通常不存在于自然界，則啟動(dòng)子相對(duì)于可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子為異源的，即該可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子與該啟動(dòng)子分子的組合不是自然發(fā)生的可操作地連接的?？赊D(zhuǎn)錄的多核苷酸分子通?？蔀楸磉_(dá)RNA轉(zhuǎn)錄體所需的任何DNA分子。RNA轉(zhuǎn)錄體的該表達(dá)可導(dǎo)致所得到的mRNA分子的翻譯以及蛋白質(zhì)的表達(dá)。可選地，可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子可設(shè)計(jì)為最終導(dǎo)致特定基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)降低。這可通過使用以反義方向定向的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子來(lái)實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉該反義技術(shù)的使用。簡(jiǎn)而言之，當(dāng)反義可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子被轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA產(chǎn)物在細(xì)胞中與互補(bǔ)RNA分子雜交并且隔絕(sequester)互補(bǔ)RNA分子。該雙螺旋RNA分子不能通過細(xì)胞的翻譯機(jī)制翻譯為蛋白質(zhì)，并且在細(xì)胞中降解?？梢赃@種方式反向調(diào)控任何基因。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式為本發(fā)明的調(diào)控元件(例如SEQIDNO：1-20所示的調(diào)控元件)，其可操作地連接至可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，從而當(dāng)將所述構(gòu)建體引入植物細(xì)胞中時(shí)以需要的水平或以需要的模式調(diào)控可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方式中，可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子包含基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，并且啟動(dòng)子影響被翻譯和表達(dá)為蛋白質(zhì)產(chǎn)物的RNA分子的轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子包含基因的反義區(qū)域，并且啟動(dòng)子影響反義RNA分子或其他相似抑制性RNA分子的轉(zhuǎn)錄以抑制靶標(biāo)宿主細(xì)胞中特定目的RNA分子的表達(dá)。農(nóng)學(xué)目的基因可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子可為農(nóng)學(xué)目的基因。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“農(nóng)學(xué)目的基因”是指當(dāng)在特定的植物組織、細(xì)胞或細(xì)胞類型中表達(dá)時(shí)提供與植物形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生長(zhǎng)、發(fā)育、產(chǎn)量、產(chǎn)物、營(yíng)養(yǎng)分布、疾病或害蟲抗性和/或環(huán)境或化學(xué)耐受性相關(guān)的所需特征的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。農(nóng)學(xué)目的基因包括但不局限于編碼產(chǎn)量蛋白、抗壓蛋白、發(fā)育控制蛋白、發(fā)育調(diào)控蛋白、組織分化蛋白、分生組織蛋白、環(huán)境響應(yīng)蛋白、衰老蛋白、激素響應(yīng)蛋白、脫落蛋白(abscissionprotein)、來(lái)源蛋白、SINK蛋白、花調(diào)控蛋白、種子蛋白、除草劑抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、殺蟲蛋白或例如靶向抑制特定基因的反義或RNAi分子的任何其他試劑的基因。農(nóng)學(xué)目的的基因產(chǎn)物可在植物中起作用以對(duì)植物生理學(xué)或代謝起作用，或可作為以植物為食的害蟲的食物的殺蟲劑起作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的啟動(dòng)子被引入構(gòu)建體中，以使啟動(dòng)子可操作地連接至作為農(nóng)學(xué)目的基因的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。為了獲得農(nóng)學(xué)有益特征，農(nóng)學(xué)目的基因的表達(dá)是想要的。有益農(nóng)學(xué)特性可為但不局限于，例如除草劑耐受性、昆蟲控制、改良的產(chǎn)量、真菌疾病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細(xì)菌疾病抗性、植物生長(zhǎng)和發(fā)育、淀粉生產(chǎn)、改良的油生產(chǎn)、高油生產(chǎn)、改良的脂肪酸含量、高蛋白質(zhì)生產(chǎn)、果實(shí)成熟、提高的動(dòng)物和人類營(yíng)養(yǎng)、生物聚合物、環(huán)境壓力抗性、藥用肽類和可分泌肽類、改良的加工特性、改良的消化率、酶生產(chǎn)、味道、固氮、雜交制種、纖維生產(chǎn)和生物燃料生產(chǎn)。本領(lǐng)域已知的農(nóng)學(xué)目的基因的例子包括具有除草劑抗性(美國(guó)專利No.6,803,501、6,448,476、6,248,876、6,225,114、6,107,549、5,866,775、5,804,425、5,633,435和5,463,175)、提高的產(chǎn)量(美國(guó)專利No.USRE38,446、6,716,474、6,663,906、6,476,295、6,441,277、6,423,828、6,399,330、6,372,211、6,235,971、6,222,098和5,716,837)、昆蟲控制(美國(guó)專利No.6,809,078、6,713,063、6,686,452、6,657,046、6,645,497、6,642,030、6,639,054、6,620,988、6,593,293、6,555,655、6,538,109、6,537,756、6,521,442、6,501,009、6,468,523、6,326,351、6,313,378、6,284,949、6,281,016、6,248,536、6,242,241、6,221,649、6,177,615、6,156,573、6,153,814、6,110,464、6,093,695、6,063,756、6,063,597、6,023,013、5,959,091、5,942,664、5,942,658、5,880,275、5,763,245和5,763,241)、真菌疾病抗性(美國(guó)專利No.6,653,280、6,573,361、6,316,407、6,215,048、5,516,671、5,773,696、6,121,436、6,316,407和6,506,962)、病毒抗性(美國(guó)專利No.6,617,496、6,608,241、6,015,940、6,013,864、5,850,023和5,304,730)、線蟲抗性(美國(guó)專利No.6,228,992)、細(xì)菌疾病抗性(美國(guó)專利No.5,516,671)、植物生長(zhǎng)和發(fā)育(美國(guó)專利No.6,723,897和6,518,488)、淀粉生產(chǎn)(美國(guó)專利No.6,538,181、6,538,179、6,538,178、5,750,876、6,476,295)、改良的油生產(chǎn)(美國(guó)專利No.6,444,876、6,426,447和6,380,462)、高油生產(chǎn)(美國(guó)專利No.6,495,739、5,608,149、6,483,008和6,476,295)、改良的脂肪酸含量(美國(guó)專利No.6,828,475、6,822,141、6,770,465、6,706,950、6,660,849、6,596,538、6,589,767、6,537,750、6,489,461和6,459,018)、高蛋白質(zhì)生產(chǎn)(美國(guó)專利No.6,380,466)、果實(shí)成熟(美國(guó)專利No.5,512,466)、提高的動(dòng)物和人類營(yíng)養(yǎng)(美國(guó)專利No.6,723,837、6,653,530、6,5412,59、5,985,605和6,171,640)、生物聚合物(美國(guó)專利No.USRE37,543、6,228,623和5,958,745和6,946,588)、環(huán)境壓力抗性(美國(guó)專利No.6,072,103)、藥用肽類和可分泌肽類(美國(guó)專利No.6,812,379、6,774,283、6,140,075和6,080,560)、改良的加工特性(美國(guó)專利No.6,476,295)、改良的消化率(美國(guó)專利No.6,531,648)、低棉子糖(美國(guó)專利No.6,166,292)、工業(yè)酶生產(chǎn)(美國(guó)專利No.5,543,576)、改良的味道(美國(guó)專利No.6,011,199)、固氮(美國(guó)專利No.5,229,114)、雜交制種(美國(guó)專利No.5,689,041)、纖維生產(chǎn)(美國(guó)專利No.6,576,818、6,271,443、5,981,834和5,869,720)和生物燃料生產(chǎn)(美國(guó)專利No.5,998,700)?？蛇x地，農(nóng)學(xué)目的基因可以通過編碼引起內(nèi)源基因的基因表達(dá)的靶向調(diào)節(jié)的RNA分子而影響以上所述的植物特征或表型，例如通過反義(參見，例如，美國(guó)專利5,107,065)、抑制性RNA(“RNAi”，包括通過miRNA-、siRNA-、反式作用siRNA-和相控sRNA-調(diào)節(jié)機(jī)理調(diào)節(jié)基因表達(dá)，例如，如描述于發(fā)表的申請(qǐng)US2006/0200878、US2008/0066206和US2009/0070898)，或共抑制-調(diào)節(jié)機(jī)理。RNA也可以為催化的RNA分子(例如，核酶或核開關(guān)；參見例如，US2006/0200878)，其經(jīng)工程化用于切割需要的內(nèi)源性mRNA產(chǎn)物。因此，任何編碼影響農(nóng)學(xué)重要表型或目的形態(tài)學(xué)變化的可轉(zhuǎn)錄的RNA分子的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，可對(duì)本發(fā)明的實(shí)施有益處。構(gòu)建構(gòu)建體和將構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)從而將可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄至能夠引起基因抑制的分子中的方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，在植物中使用構(gòu)建體和反義方向的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子以調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制公開于美國(guó)專利No.5,107,065和5,759,829中，并且在植物中使用構(gòu)建體和正義方向可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子以調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制公開于美國(guó)專利No.5,283,184和5,231,020中。在植物細(xì)胞中表達(dá)可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸也可用于抑制食用植物細(xì)胞的植物害蟲，例如，從鞘翅目害蟲分離的組合物(美國(guó)專利公布No.US2007/0124836)和從線蟲害蟲分離的組合物(美國(guó)專利公布No.US2007/0250947)。植物害蟲包括但不局限于節(jié)肢類害蟲、線蟲害蟲和真菌或微生物害蟲。導(dǎo)入本發(fā)明的構(gòu)建體的示例性的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子包括，例如，來(lái)自于不同于目標(biāo)物種之物種的DNA分子或基因，或起始于或存在于相同物種但通過遺傳工程方法而不是傳統(tǒng)的繁殖或育種技術(shù)摻入受體細(xì)胞中的基因。多核苷酸分子的類型包括但不局限于已經(jīng)存在于植物細(xì)胞中的多核苷酸分子、來(lái)自另一植物的多核苷酸分子、來(lái)自不同機(jī)體的多核苷酸分子或外部產(chǎn)生的多核苷酸分子(例如含有基因反義信使的多核苷酸分子，或編碼人工、合成的或另外的改良類型的轉(zhuǎn)基因的多核苷酸分子)。可選擇性標(biāo)記如在本文中所用術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”是指任何可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，其表達(dá)或不表達(dá)可以某種方式篩選或評(píng)分。用于實(shí)施本發(fā)明的標(biāo)記基因包括但不局限于，編碼β-葡萄糖醛酸酶(GUS，描述于美國(guó)專利5,599,670中)、綠色熒光蛋白及其變體(GFP，描述于美國(guó)專利5,491,084和6,146,826中)、提供抗生素耐藥性的蛋白質(zhì)或提供除草劑耐受性的蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子?？捎玫目股啬退幮缘臉?biāo)記，包括編碼提供卡那霉素(nptII)、潮霉素B(aphIV)、鏈霉素或壯觀霉素(aad，spec/strep)和慶大霉素(aac3和aacC4)耐藥性的蛋白質(zhì)的那些標(biāo)記在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?。已證實(shí)轉(zhuǎn)基因植物的耐受性并且可應(yīng)用本發(fā)明方法的除草劑，包括但不局限于：氨基-甲基-膦酸、草甘膦、草丁膦(glufosinate)、磺酰脲類、咪唑啉酮、溴草腈、茅草枯、二氯甲氧苯酸、環(huán)己二酮、原卟啉原氧化酶抑制劑和異噁唑草酮(isoxaflutole)除草劑。編碼與除草劑耐受性有關(guān)的蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子在本領(lǐng)域?yàn)橐阎模⑶野ǖ痪窒抻?，編碼5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(用于草甘膦耐受性的EPSPS，描述于美國(guó)專利5,627,061、5,633,435、6,040,497和5,094,945中)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子；編碼草甘膦氧化還原酶和草甘膦-N-乙?；D(zhuǎn)移酶(GOX描述于美國(guó)專利5,463,175中、GAT描述于美國(guó)專利公布No.2003/0083480中)以及二氯甲氧苯酸單加氧酶(美國(guó)專利公布No.2003/0135879中)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子；編碼溴草腈腈水解酶(用于溴草腈耐受性的Bxn，描述于美國(guó)專利4,810,648中)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子；用于達(dá)草滅耐受性的編碼八氫番茄紅素去飽和酶(crtI)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子(描述于Misawa等人，PlantJournal，4：833-840(1993)和Misawa等人，PlantJournal，6：481-489(1994)中)、用于磺酰脲類除草劑耐受性的編碼乙酰羥酸合成酶(AHAS，也就是ALS)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子(描述于Sathasiivan等人，Nucl.AcidsRes.，18：2188-2193(1990))，以及用于草丁膦和雙丙氨磷耐受性的bar基因(描述于DeBlock等人，EMBOJournal，6：2513-2519(1987)中)。本發(fā)明的啟動(dòng)子分子可表達(dá)連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，其編碼草胺膦(phosphinothricin)乙?；D(zhuǎn)移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、羥苯基丙酮酸酯脫氫酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、茅草枯脫鹵素酶、溴草腈抗性腈水解酶、鄰氨基苯甲酸合成酶、芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶、乙酰CoA羧化酶、草甘膦氧化還原酶和草甘膦-N-乙?；D(zhuǎn)移酶。包含于術(shù)語(yǔ)“可選擇性標(biāo)記”中的也有編碼可分泌的標(biāo)記的基因，其分泌可作為識(shí)別或選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方式。例子包括編碼可通過抗體相互作用識(shí)別的可分泌的抗原的標(biāo)記或甚至編碼可催化檢測(cè)的可分泌的酶的標(biāo)記?？蛇x擇的分泌的標(biāo)記蛋白質(zhì)劃分為幾個(gè)類型，包括可被檢測(cè)的(例如通過ELISA)小的可擴(kuò)散的蛋白質(zhì)、可在細(xì)胞外溶液中檢測(cè)到的小的活性酶(例如，α-淀粉酶、β-內(nèi)酰胺酶、草胺膦轉(zhuǎn)移酶)或插入或禁錮在細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)(例如包括在例如延伸表達(dá)單元中發(fā)現(xiàn)的前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)或者與煙草致病相關(guān)的蛋白質(zhì)，也就是煙草PR-S)。其他可能的可選擇性標(biāo)記基因?qū)τ诒绢I(lǐng)域的技術(shù)人員是明顯的并且包含在本發(fā)明中。細(xì)胞轉(zhuǎn)化本發(fā)明還涉及產(chǎn)生包含可操作地連接至可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和植物的方法。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指將核苷酸導(dǎo)入受體宿主。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“宿主”是指細(xì)菌、真菌或植物，包括細(xì)菌、真菌或植物的任何細(xì)胞、組織、器官或子代。特定的目標(biāo)植物組織和細(xì)胞包括原生質(zhì)體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉、幼苗、胚芽和花粉。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的”是指被導(dǎo)入外源多核苷酸分子(例如構(gòu)建體)的細(xì)胞、組織、器官或生物體。導(dǎo)入的多核苷酸分子可被整合至受體細(xì)胞、組織、器官或生物體的基因組DNA，因而被導(dǎo)入的多核苷酸分子被遺傳至后續(xù)后代。“轉(zhuǎn)基因的”或“轉(zhuǎn)化的”細(xì)胞或生物體也包括細(xì)胞或生物體的子代，以及產(chǎn)生于應(yīng)用了該轉(zhuǎn)基因生物體做為母代雜交并且顯示來(lái)自外源多核苷酸分子的改變的表型的育種程序的子代。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指含有一個(gè)或更多個(gè)異源多核苷酸分子的細(xì)菌、真菌或植物。存在許多將多核苷酸分子導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。方法通常包括選擇合適的宿主細(xì)胞、使用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以及獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的步驟。合適的方法包括細(xì)菌轉(zhuǎn)染(例如土壤桿菌屬)、雙元細(xì)菌人工染色體載體、DNA的直接遞送(例如，通過PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)、干燥/抑制-介導(dǎo)的DNA攝取、電穿孔、用碳化硅纖維攪動(dòng)以及DNA涂層顆粒的加速等(綜述在Potrykus等人，Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，42：205(1991)中)。將DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在本發(fā)明的實(shí)施中，通過將植物DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物基因組中來(lái)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法和材料可包括任何公知的和證實(shí)的方法，包括但不局限于：(1)化學(xué)方法(Graham和VanderEb，Virology，54：536-539(1973)和Zatloukal等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：136-153(1992))；(2)物理方法，例如顯微注射(Capecchi，Cell，22：479-488(1980))、電穿孔(Wong和Neumann，Biochim.Biophys.Res.Commun.，107：584-587(1982)；Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：5824-5828(1985)；美國(guó)專利No.5,384,253)、粒子加速(Johnston和Tang，MethodsCellBiol.，43(A)：353-365(1994)；Fynan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：11478-11482(1993))和微粒轟擊(如描述于美國(guó)專利No.5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865中)；(3)病毒載體(clapp，Clin.Perinatol.，20：155-168(1993)；Lu等人，J.Exp.Med.，178：2089-2096(1993)；Eglitis和Anderson，Biotechniques，6：608-614(1988))；(4)受體介導(dǎo)的機(jī)理(Curiel等人，Hum.Gen.Ther.，3：147-154(1992)和Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：6099-6103(1992))；(5)細(xì)菌介導(dǎo)的機(jī)理，例如土壤桿菌屬-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(如描述于美國(guó)專利No.5,824,877、5,591,616、5,981,840和6,384,301中)；(6)通過注射植物再生器官向花粉的直接導(dǎo)入(Zhou等人，MethodsinEnzymology，101：433，(1983)；Hess，InternRev.Cytol.，107：367(1987)；Luo等人，PlantMolBiol.Reporter，6：165(1988)；Pena等人，Nature，325：274(1987))；(7)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(如描述于美國(guó)專利No.5,508,184中)；以及(8)注射入未成熟的胚芽(Neuhaus等人，Theot.Appl.Genet.，75：30(1987))。上述任何方法均可以應(yīng)用于用本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子和/或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為例如植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、藻類、真菌細(xì)胞、真菌、細(xì)菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞的任何細(xì)胞或生物體。優(yōu)選的宿主和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括來(lái)自于植物、曲霉屬、酵母、昆蟲、細(xì)菌和藻類的細(xì)胞。主要通過使用根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物以及獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法已經(jīng)發(fā)表，用于棉花(美國(guó)專利No.5,004,863、5,159,135和5,518,908)；大豆(美國(guó)專利No.5,569,834和5,416,011；也參見，McCabe等人，Biotechnology，6：923(1988)和Christou等人，PlantPhysiol.87：671-674(1988))；蕓苔(美國(guó)專利No.5,463,174)；花生(Cheng等人，PlantCellRep.，15：653-657(1996)和McKently等人，PlantCellRep.，14：699-703(1995))；番木瓜；和豌豆(Grant等人，PlantCellRep.，15：254-258(1995))。已經(jīng)報(bào)道了使用電穿孔、粒子轟擊和土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法。已經(jīng)在蘆筍(Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5354(1987)；大麥(Wan和Lemaux，PlantPhysiol，104：37(1994))；玉米(Rhodes等人，Science240：204(1988)，Gordon-Kamm等人，PlantCell，2：603-618(1990)，F(xiàn)romm等人，Bio/Technology，8：833(1990)，Koziel等人，Bio/Technology，11：194(1993)和Armstrong等人，CropScience，35：550-557(1995))；燕麥(Somers等人，Bio/Technology，10：1589(1992))；鴨茅(orchardgrass)(Horn等人，PlantCellRep..7：469(1988))；黑麥(DelaPena等人，Nature，325：274(1987))；甘蔗(Bower和Birch，PlantJournal，2：409(1992))；高羊茅(tallfescue)(Wang等人，Bio/Technology，10：691(1992))；和小麥(Vasil等人，Bio/Technology，10：667(1992)和美國(guó)專利No.5,631,152)中實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化和植物再生。從轉(zhuǎn)化的植物原生質(zhì)體或外植體再生、發(fā)育和栽培植物在本領(lǐng)域?yàn)楣?參見，例如，Weissbach和Weissbach，MethodsforPlantMolecularBiology，(Eds.)，AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA(1988)和Horsch等人，Science，227：1229-1231(1985))。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通常在選擇的培養(yǎng)基存在下栽培，其選擇出成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并且誘發(fā)植物芽和根再生成完整的植物(Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803(1983))。轉(zhuǎn)化的植物通常在二至四個(gè)月間獲得。再生的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行自花授粉，以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物?？蛇x地，來(lái)自再生的轉(zhuǎn)基因植物的花粉可與非轉(zhuǎn)基因植物雜交，優(yōu)選為農(nóng)學(xué)重要物種的自交系。通常用于不同特性和作物的育種方法的描述可見于幾本參考書中的一本，參見，例如，Allard，PrinciplesofPlantBreeding，JohnWiley&Sons，NY，U.ofCA，Davis，CA，50-98(1960)；Simmonds，Principlesofcropimprovement，Longman，Inc.，NY，369-399(1979)；Sneep和Hendriksen，Plantbreedingperspectives，Wageningen(ed)，CenterforAgriculturalPublishingandDocumentation(1979)；Fehr，Soybeans：Improvement，ProductionandUses，2ndEdition，Monograph.，16：249(1987)；Fehr，Principlesofvarietydevelopment，TheoryandTechnique，(Vol1)andCropSpeciesSoybean(Vol2)，IowaStateUniv.，MacmillanPub.Co.，NY，360-376(1987)。相反的，來(lái)自非轉(zhuǎn)基因植物的花粉可用于再生的轉(zhuǎn)基因植物的授粉。可以分析轉(zhuǎn)化的植物的目標(biāo)基因的存在以及本發(fā)明調(diào)控元件所賦予的表達(dá)水平和/或分布。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道許多可用于分析轉(zhuǎn)化的植物的方法。例如，植物分析方法包括但不局限于Southern印跡法或northern印跡法、基于PCR的方法、生化分析、表型篩選方法、現(xiàn)場(chǎng)鑒定以及免疫診斷測(cè)試?？赊D(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的表達(dá)可用(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)試劑和制造商描述的方法和使用TestingMatrix確定的PCR周期時(shí)間來(lái)測(cè)量。可選地，(ThirdWaveTechnologies，Madison，WI)試劑和制造商描述的方法可用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)。本發(fā)明的植物的種子可從能繁殖的轉(zhuǎn)基因植物中收獲并且用于生長(zhǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的植物子代，包括包含本發(fā)明構(gòu)建體和表達(dá)農(nóng)學(xué)目標(biāo)基因的植物雜交系。本發(fā)明還提供本發(fā)明植物的部分。不受局限地，植物的部分包括葉、莖、根、塊莖、種子、胚乳、胚珠和花粉。本發(fā)明還包括和提供包含本發(fā)明的核苷酸分子的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因植物可將轉(zhuǎn)基因多核苷酸分子傳遞至其子代。子代包括任何可再生的包含衍生自祖代植物的轉(zhuǎn)基因的植物部分或種子。轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選對(duì)轉(zhuǎn)化的多核苷酸分子為純合的，并且作為有性繁殖的結(jié)果將該序列傳遞至所有后代。子代可從產(chǎn)生于轉(zhuǎn)基因植物的種子生長(zhǎng)。然后，這些另外的植物可以進(jìn)行自花授粉，以產(chǎn)生植物的真正的育種系。在其他事項(xiàng)中，評(píng)價(jià)來(lái)自這些植物的子代的基因表達(dá)?；虮磉_(dá)可通過例如western印跡法、northern印跡法、免疫沉淀和ELISA的幾種常規(guī)方法檢測(cè)。現(xiàn)已概括地描述了本發(fā)明，通過參考以下實(shí)施例將會(huì)更加容易地理解本發(fā)明，除非特別說(shuō)明，這些實(shí)施例僅是示例性的，并不意圖限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，以下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的技術(shù)，以很好地實(shí)施本發(fā)明。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，可以對(duì)公開的具體實(shí)施方式做出許多改變，并仍然會(huì)得到相同或相似的結(jié)果，而不會(huì)偏離本發(fā)明的精神和范圍，因此提出或顯示在所附附圖中的所有內(nèi)容應(yīng)被理解為示例性的，而不是限制性的。實(shí)施例分離了用于促使轉(zhuǎn)基因植物中的可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸表達(dá)的調(diào)控元件，并且在轉(zhuǎn)基因玉米植物中分析了這些可操作地連接至可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的調(diào)控元件的表達(dá)模式。實(shí)施例1：調(diào)控元件的確定和克隆從單子葉物種小米(小米(Setariaitalica(L.)Beauv))的基因組DNA中識(shí)別和分離新型調(diào)控元件。EST序列用于設(shè)計(jì)引物，引物繼而用在按照制造商的試驗(yàn)方案構(gòu)建的GenomeWalkerTM(ClontechLaboratories，Inc，MountainView，CA)庫(kù)中，以克隆相應(yīng)的基因組DNA序列5’區(qū)域。該克隆的區(qū)域包含來(lái)自小米的每個(gè)基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域上游的5’UTR序列。使用該序列，在每個(gè)基因的該5’UTR內(nèi)識(shí)別出生物信息學(xué)意義上的調(diào)控元件。生物信息學(xué)分析用于識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)以及序列中存在的任何雙向性、內(nèi)含子或上游編碼序列。通過該分析的結(jié)果，確定了在5’UTR序列內(nèi)的調(diào)控元件。然后，設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增調(diào)控元件。采用標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈反應(yīng)條件、使用含有獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)的引物和從小米分離的基因組DNA，擴(kuò)增每個(gè)調(diào)控元件的相應(yīng)的DNA分子。使用兼容限制性位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)限制性酶消化和DNA連接方法，產(chǎn)生的DNA片段被連接至基礎(chǔ)植物表達(dá)載體中。產(chǎn)生的植物表達(dá)載體包含來(lái)自根癌土壤桿菌的右邊界區(qū)域(B-AGRtu.右邊界)、可操作地連接至衍生自玉米的HSP70熱休克蛋白的內(nèi)含子的測(cè)試調(diào)控元件、可操作地連接至β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的編碼序列的測(cè)試調(diào)控元件、可操作地連接至來(lái)自根癌土壤桿菌的胭脂堿合成酶3’終止區(qū)域的測(cè)試調(diào)控元件以及來(lái)自根癌土壤桿菌的左邊界區(qū)域(B-AGRtu.左邊界)。調(diào)控元件序列在此提供為SEQIDNO：1-20并且列在下面表1中。啟動(dòng)子序列在此提供為SEQIDNO：2、5、8、10、13和20。前導(dǎo)序列在此提供為SEQIDNO：3、6、11和16。在此提供的SEQIDNO：1、4、7、9、12、14、17和19序列為可操作地連接的啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列。表1：調(diào)控元件SEQID注釋cDNA注釋1EXP-SETit.TIP液泡膜內(nèi)在蛋白2P-SETit.Tip-1：1：1液泡膜內(nèi)在蛋白3L-SETit.Tip-1：1：1液泡膜內(nèi)在蛋白4EXP-SETit.Mtha類金屬硫蛋白5P-SETit.Mtha-1：1：1類金屬硫蛋白6L-SETit.Mth-1：1：1類金屬硫蛋白7EXP-SETit.Mthb類金屬硫蛋白8P-SETit.Mthb-1：1：2類金屬硫蛋白9EXP-SETit.DRPa脫水相關(guān)蛋白a10P-SETit.DRPa-1：1：1脫水相關(guān)蛋白a11L-SETit.DRP-1：1：2脫水相關(guān)蛋白a/b12EXP-SETit.DRPb脫水相關(guān)蛋白b13P-SETit.DRPb-1：1：1脫水相關(guān)蛋白b14EXP-SETit.Rcc3-1脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白15P-SETit.Rcc3-1：1：1脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白16L-SETit.Rcc3-1：1：2脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白17EXP-SETit.Rcc3-10脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白18P-SETit.Rcc3-1：1：10脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白19EXP-SETit.Rcc3-11脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白20P-SETit.Rcc3-1：1：11脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白表達(dá)元件EXP-SETit.TIP(SEQIDNO：1)由P-SETit.Tip-1：1：1啟動(dòng)子(SEQIDNO：2)和L-SETit.Tip-1：1：1前導(dǎo)序列(SEQIDNO：3)組成。對(duì)于來(lái)自脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因的調(diào)控元件，設(shè)計(jì)了三個(gè)啟動(dòng)子變體(附圖1)。P-SETit.Rcc3-1：1：1為2062個(gè)核苷酸的版本(SEQIDNO：15)；P-SETit.Rcc3-1：1：10為1563個(gè)核苷酸的版本(SEQIDNO：18)以及P-SETit.Rcc3-1：1：11為915個(gè)核苷酸的版本(SEQIDNO：20)。表達(dá)元件EXP-SETit.Rcc3-1(SEQIDNO：14)由P-SETit.Rcc3-1：1：1啟動(dòng)子(SEQIDNO：15)和P-SETit.Rcc3-1：1：2前導(dǎo)序列(SEQIDNO：16)組成。表達(dá)元件EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)由P-SETit.Rcc3-1：1：10啟動(dòng)子(SEQIDNO：18)和L-SETit.Rcc3-1：1：2前導(dǎo)序列(SEQIDNO：16)組成。表達(dá)元件EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)由P-SETit.Rcc3-1：1：11啟動(dòng)子(SEQIDNO：20)和P-SETit.Rcc3-1：1：2前導(dǎo)序列(SEQIDNO：16)組成。對(duì)于來(lái)自類金屬硫蛋白基因的調(diào)控元件，設(shè)計(jì)了兩個(gè)啟動(dòng)子變體(附圖2)。P-SETit.Mtha-1：1：1為較短的483個(gè)核苷酸的版本；P-SETit.Mthb-1：1：2為其較長(zhǎng)的1516個(gè)核苷酸的版本。表達(dá)元件EXP-SETit.Mtha(SEQIDNO：4)由P-SETit.Mtha-1：1：1啟動(dòng)子(SEQIDNO：5)和L-SETit.Mth-1：1：1前導(dǎo)序列(SEQIDNO：6)組成。表達(dá)元件EXP-SETit.Mthb(SEQIDNO：7)由P-SETit.Mthb-1：1：2啟動(dòng)子(SEQIDNO：8)和L-SETit.Mth-1：1：1前導(dǎo)序列(SEQIDNO：5)組成。對(duì)于來(lái)自脫水相關(guān)蛋白基因的調(diào)控元件，分離了兩個(gè)等位基因變體的調(diào)控元件(附圖3A和3B)。兩個(gè)等位基因變體具有相同的前導(dǎo)序列，但是啟動(dòng)子序列為當(dāng)比對(duì)時(shí)有幾個(gè)堿基改變和插入/缺失的變體。表達(dá)元件EXP-SETit.DRPa(SEQIDNO：9)由P-SETit.DRP-1：1：1啟動(dòng)子(SEQIDNO：10)和L-SETit.DRP-1：1：2前導(dǎo)序列(SEQIDNO：11)組成。表達(dá)元件EXP-SETit.DRPb(SEQIDNO：12)由P-SETit.DRPb-1：1：1啟動(dòng)子(SEQIDNO：13)和L-SETit.DRP-1：1：2前導(dǎo)序列(SEQIDNO：11)組成。實(shí)施例2：在轉(zhuǎn)基因玉米中驅(qū)動(dòng)GUS的調(diào)控元件的分析玉米植物轉(zhuǎn)化有含有促使β-葡萄糖醛酸酶(GUS)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的測(cè)試調(diào)控元件的植物表達(dá)載體，并且在產(chǎn)生的植物中分析GUS蛋白的表達(dá)。玉米植物轉(zhuǎn)化有植物GUS表達(dá)構(gòu)建體-pMON101552(EXP-SETit.TIP，SEQIDNO：1)、pMON99662(EXP-SETit.Mtha，SEQIDNO：4)和pMON99663(EXP-SETit.DRPa，SEQIDNO：9)。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的粒子轟擊方法和玉米H99的未成熟合子胚轉(zhuǎn)化植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米植物。簡(jiǎn)而言之，玉米H99植物的穗在授粉10-13天后從溫室培育植物中收集并且使其絕育。從穗上切除1.2-1.5mm的未成熟合子胚，并且在用作轟擊的靶標(biāo)組織前在黑暗中在28℃培育3-5天。用限制性內(nèi)切酶水解含有卡那霉素抗性的可選擇性標(biāo)記(NPTII基因)和GUS表達(dá)盒的植物轉(zhuǎn)化載體。含有可選擇性標(biāo)記和GUS表達(dá)盒兩者的單個(gè)DNA片段經(jīng)過凝膠純化，并用于涂布0.6微米的金顆粒(目錄#165-2262Bio-Rad，Hercules，CA)，以用于轟擊。對(duì)宏載體裝載DNA涂層的金顆粒(目錄#165-2335Bio-Rad，HerculesCA)。將胚芽轉(zhuǎn)移至滲透性培養(yǎng)基，盾片側(cè)向上。PDS1000/He基因槍(biolisticgun)用于轉(zhuǎn)化(目錄#165-2257Bio-Rad，HerculesCA)。培養(yǎng)了受轟擊的未成熟的胚芽，并且選擇轉(zhuǎn)基因愈傷組織和轉(zhuǎn)移至組織再生培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)基因玉米植物從轉(zhuǎn)基因愈傷組織中再生并且轉(zhuǎn)移至溫室中。組織化學(xué)GUS分析用于轉(zhuǎn)化的植物的定性表達(dá)分析。用GUS染色溶液X-葡萄糖(5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)(1毫克/毫升)培養(yǎng)整個(gè)組織切片適當(dāng)?shù)臅r(shí)間、潤(rùn)洗，并且視覺上檢查藍(lán)色著色。使用選擇的植物器官和組織、通過直接視覺檢查或在顯微鏡下檢查來(lái)定性確定GUS活性。檢查R0植物在根和葉中的表達(dá)。調(diào)控元件EXP-SETit.TIP(SEQIDNO：1)、EXP-SETit.Mtha(SEQIDNO：4)和EXP-SETit.DRPa(SEQIDNO：9)證明了GUS在R0轉(zhuǎn)化株中在根和葉兩者中的表達(dá)。轉(zhuǎn)化有由EXP-SETit.TIP(SEQIDNO：1)或EXP-SETit.Mtha(SEQIDNO：4)促使的GUS表達(dá)的植物與非轉(zhuǎn)化的H99植物雜交，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化株的F1種群。在發(fā)育過程中，在選擇的組織中測(cè)量GUS表達(dá)水平。用于該研究的F1組織包括：浸滲的種子胚、浸滲的種子胚乳、根(發(fā)芽后3天)、胚芽鞘(發(fā)芽后3天)、V3主根和冠根、V3葉、V7種子根和冠根、V7成熟葉、VT(抽穗時(shí)，繁殖前)種子根、VT結(jié)間、VT穗軸、VT花粉囊、VT花粉、VT穗絲、授粉后7天的種仁、授粉后21天的胚芽、授粉后21天的胚乳、授粉后35天的胚芽、授粉后35天的胚乳。F1GUS表達(dá)可見于研究的轉(zhuǎn)化有EXP-SETit.TIP(SEQIDNO：1)和EXP-SETit.Mtha(SEQIDNO：4)的事件(event)兩者的所有組織中。實(shí)施例3：在轉(zhuǎn)基因玉米中驅(qū)動(dòng)TIC809的調(diào)控元件的分析用含有促使TIC809轉(zhuǎn)基因表達(dá)的測(cè)試調(diào)控元件的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米植物，并且分析產(chǎn)生的植物的TIC809蛋白表達(dá)。調(diào)控元件被可操作地連接至植物轉(zhuǎn)化載體中的昆蟲毒素轉(zhuǎn)基因TIC809(PCTUS2006/033867)。轉(zhuǎn)基因盒由可操作地連接至衍生自玉米HSP70熱休克蛋白的內(nèi)含子的調(diào)控元件、可操作地連接至TIC809轉(zhuǎn)基因的調(diào)控元件、可操作地連接至衍生自小麥HSP17基因3’UTR的調(diào)控元件組成。植物轉(zhuǎn)化載體還含有用于選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的草甘膦耐受性可選擇性標(biāo)記。使用本領(lǐng)域已知的方法，采用根癌土壤桿菌介導(dǎo)的與質(zhì)粒pMON70539(EXP-SETit.TIP，SEQIDNO：1)、pMON70540(EXP-SETit.Mtha，SEQIDNO：4)和pMON70538(EXP-SETit.DRPa，SEQIDNO：9)的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化來(lái)自變種LH244的玉米組織。R0植物從轉(zhuǎn)化的玉米組織再生，并且測(cè)試以確定TIC809轉(zhuǎn)基因的存在和完整性。在V4或V6階段使用TIC809用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分析來(lái)自這些植物的葉和根，以確定TIC809蛋白聚集程度。通過TIC809對(duì)照樣品確定蛋白質(zhì)值，并且以百萬(wàn)分率(ppm)為單位表示。ELISA數(shù)據(jù)顯示于以下表2中，其中“N”表明測(cè)試的植物數(shù)量。表2：TIC809R0ELISA數(shù)據(jù)。在根和葉兩者中觀察到由表達(dá)元件EXP-SETit.TIP(SEQIDNO：1)、EXP-SETit.Mtha(SEQIDNO：4)和EXP-SETit.DRPa(SEQIDNO：9)驅(qū)動(dòng)的TIC809的表達(dá)，因此證明了調(diào)控元件EXP-SETit.TIP、EXP-SETit.Mtha和EXP-SETit.DRPa對(duì)于調(diào)控植物中農(nóng)學(xué)目的的可操作地連接的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的能力。由EXP-SETit.TIP(SEQIDNO：1)、EXP-SETit.Mtha(SEQIDNO：4)和EXP-SETit.DRPa(SEQIDNO：9)驅(qū)動(dòng)的平均TIC809表達(dá)在葉中相對(duì)于所有三個(gè)構(gòu)建體的根而言至少為2倍或更高。含有載體pMON70539(EXP-SETit.TIP，SEQIDNO：1)、pMON70540(EXP-SETit.Mtha，SEQIDNO：4)和pMON70538(EXP-SETit.DRPa，SEQIDNO：9)的轉(zhuǎn)化的R0植物與變種LH59雜交，使用LH59作為雌株植物以及轉(zhuǎn)化的LH244作為雄株植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的F1種群。對(duì)于含有EXP-SETit.TIP(SEQIDNO：1)和EXP-SETit.Mtha(SEQIDNO：4)的植物，繼而使用ELISA，在V3、V7和VT階段測(cè)量F1葉中的TIC809蛋白含量；在V3和V7階段測(cè)量根中的TIC809蛋白含量；在大約VT階段(花粉囊、花粉和穗絲)測(cè)量再生組織中的TIC809蛋白含量；以及測(cè)量正在發(fā)育的種子或種仁中的TIC809蛋白含量。ELISA結(jié)果以百萬(wàn)分率(ppm)表示，其中標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)量表示為“SE”，并顯示于下面表3中。對(duì)于含有EXP-SETit.DRPa(SEQIDNO：9)的植物，使用ELISA通過選自V9階段的組織，測(cè)量根中的TIC809蛋白含量。ELISA結(jié)果以百萬(wàn)分率(ppm)表示，并顯示于以下表4中。表3：EXP-SETit.TIP和EXP-SETit.Mtha的TIC809F1ELISA數(shù)據(jù)。F1種群中由調(diào)控元件EXP-SETit.TIP(SEQIDNO：1)和EXP-SETit.Mtha(SEQIDNO：4)驅(qū)動(dòng)的平均TIC809蛋白表達(dá)水平與R0轉(zhuǎn)化株中觀察到的表達(dá)水平一致，因而確定TIP和Mtha調(diào)控元件驅(qū)動(dòng)可操作地連接的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的能力。EXP-SETit.TIP(SEQIDNO：1)在根和葉中在V3階段看起來(lái)具有其最高的表達(dá)水平，在V7階段表達(dá)下降以及在再生組織和正在發(fā)育的種子中表達(dá)低。EXP-SETit.Mtha(SEQIDNO：4)顯示在V3和V7階段中TIC809在根和葉中的表達(dá)一致，在VT階段中葉中的表達(dá)降低，在再生組織中的表達(dá)降低以及在正在發(fā)育的種子中無(wú)表達(dá)。表4：EXP-SETit.DRPa的TIC809F1ELISA數(shù)據(jù)。F1雜交組織ppmLH59/ZM_S1982270.95LH59/ZM_S1982302.69LH59/ZM_S1982350.5LH59/ZM_S1994291.26LH59/ZM_S2010321.09LH59/ZM_S2010490.64平均TIC809表達(dá)1.19標(biāo)準(zhǔn)偏差0.79在F1種群的根中由調(diào)控元件EXP-SETit.DRPa(SEQIDNO：9)驅(qū)動(dòng)的平均TIC809蛋白表達(dá)水平與R0轉(zhuǎn)化株中所觀察到的表達(dá)水平相一致，因而確定了DRPa調(diào)控元件提供可操作地連接的轉(zhuǎn)基因的根表達(dá)的能力。如上所述產(chǎn)生了用pMON120408(EXP-SETit.Rcc3-1，SEQIDNO：14)、pMON120407(EXP-SETit.Rcc3-10，SEQIDNO：17)和pMON120410(EXP-SETit.Rcc3-11，SEQ1DNO：19)轉(zhuǎn)化的植物的R0種群。使用ELISA，采用取自V4或V6階段的組織，測(cè)量了這些植物在根和葉中的TIC809蛋白含量。ELISA結(jié)果以百萬(wàn)分率(ppm)表示并顯示于以下表5中。表5：EXP-SETit.Rcc3-1、EXP-SETit.Rcc3-10和EXP-SETit.Rcc3-11的TIC809R0ELISA數(shù)據(jù)。元件名稱事件根(ppm)葉(ppm)EXP-SETit.Rcc3-1(SEQIDNO：14)10.2920EXP-SETit.Rcc3-1(SEQIDNO：14)22.790EXP-SETit.Rcc3-1(SEQIDNO：14)31.1710EXP-SETit.Rcc3-1(SEQIDNO：14)平均1.420EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)12.1290EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)21.7930EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)30.4250EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)40.6770EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)50.8770EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)61.8470EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)71.4790EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)80.3590EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)91.840EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)103.3090EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)111.5890EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)123.6520.294EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)131.0190EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)142.7150.56EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)150.9810EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)163.1470.317EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)平均1.740.07EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)12.3560EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)22.3430EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)31.4650EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)42.2710EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)50.2470EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)62.9490EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)73.360EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)84.7710EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)91.7570EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)102.2550EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)113.3140EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)124.9580EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)130.2320EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)141.5030EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)151.4250EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)163.60EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)173.5330EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)182.1580EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)平均2.470由表達(dá)元件變體EXP-SETit.Rcc3-1(SEQIDNO：14)、EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)和EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)促驅(qū)動(dòng)的TIC809的表達(dá)在根中為強(qiáng)的，且在葉中為弱的或無(wú)。除了三個(gè)轉(zhuǎn)化的事件中表達(dá)元件變體EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)顯示出葉中的低TIC809表達(dá)水平以外，在三個(gè)SETit.Rcc3變體中觀察到低或無(wú)葉表達(dá)。使用表達(dá)元件變體EXP-SETit.Rcc3-11(SEQIDNO：19)的根中平均TIC809蛋白表達(dá)比EXP-SETit.Rcc3-1(SEQIDNO：14)和EXP-SETit.Rcc3-10(SEQIDNO：17)變體中的高，但是所有三個(gè)變體均提供了可操作地連接的轉(zhuǎn)基因的根表達(dá)。已經(jīng)例證和描述了本發(fā)明的原則，對(duì)于本領(lǐng)域研究人員應(yīng)該明白，在不背離該原則的前提下可以改變本發(fā)明的安排和細(xì)節(jié)。我們要求保護(hù)權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)的所有變型。本文引用的所有出版物和公布的專利文件在此以引用方式結(jié)合入本文，就好像每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)均以引用的方式具體地和單獨(dú)地結(jié)合入本文一樣。