本發(fā)明涉及具有對氮化硅(Si3N4)的親和性的肽，以及所述肽的用途。

背景技術：
過去，已經(jīng)在多個領域，諸如臨床檢驗、藥物開發(fā)研究、環(huán)境監(jiān)測和生物化學中使用下列技術。即，將蛋白、核酸、糖鏈、細胞等固定化至基材，并且使其用于對所需的底物進行檢測、定量、分析等。甚至在今天也積極地研究這種技術以便實現(xiàn)高度準確和有效的檢測、定量、分析等。例如，當?shù)鞍?，諸如酶和/或抗體被固定化至基材并且通過使用與固定化蛋白的酶反應或抗原-抗體反應檢測所需的底物以便實現(xiàn)高精度和高效率的檢測時，重要的是將蛋白固定化至基材，同時有效地保持其活性。針對執(zhí)行這樣的固定化，已經(jīng)報道了允許蛋白固定化至聚苯乙烯基材的聚苯乙烯親和肽(專利文獻1)。證實諸如酶和/或抗體的蛋白的活性甚至在它們已經(jīng)被固定化至聚苯乙烯基材后仍然得到充分地保持。此外，作為另一種肽，已經(jīng)報道親和肽可以特異性地和牢固地將蛋白固定化至聚碳酸酯基材或聚甲基丙烯酸甲酯基材(專利文獻2)。用作此類基材之一的氮化硅(Si3N4)，也可用作半導體材料。因此，如果蛋白可以被合意地固定化至氮化硅，則可以期望進一步開發(fā)利用氮化硅基材的技術。然而，在檢查無機物質(zhì)的表面和生物分子之間的相互作用時，已經(jīng)報道個別氨基酸，諸如組氨酸或精氨酸，附著于氮化硅的表面(非專利文獻1)；然而，還沒有公開具有對氮化硅基材的親和性的肽。引用列表專利文獻[PTL1]WO2009/101807A1[PTL2]JP2011-168505A非專利文獻[NPL1]R.L.Willett等人，“Differentialadhesionofaminoacidstoinorganicsurfaces(氨基酸在無機表面的差別附著)”，ProcNatlAcadSciUSA.,Vol.102,no.22,p.7817-7822.

技術實現(xiàn)要素：
技術問題本發(fā)明的目的是提供具有對氮化硅的親和性的肽(Si3N4)。本發(fā)明進一步的目的是提供編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸。本發(fā)明還有一個目的是提供用于表達具有對氮化硅的親和性的肽的表達載體，所述表達載體包含多核苷酸。此外，本發(fā)明的目的是提供表達肽融合蛋白的表達載體，所述肽融合蛋白包含具有對氮化硅的親和性的肽和靶蛋白，所述表達載體還包含編碼所述靶蛋白的多核苷酸。本發(fā)明還有一個目的是提供通過將表達載體引入至宿主細胞來轉(zhuǎn)化所述宿主細胞獲得的轉(zhuǎn)化體，和/或由所述轉(zhuǎn)化體獲得的肽融合蛋白。此外，本發(fā)明提供了已經(jīng)結合有具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材，和用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的方法。本發(fā)明還有一個目的是提供用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的組合物，所述組合物包含具有對氮化硅的親和性的肽，用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的接頭，所述接頭包含具有對氮化硅的親和性的肽，以及所述具有對氮化硅的親和性的肽用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的用途。解決問題的方式本發(fā)明人進行了廣泛的研究以解決上述問題，并且發(fā)現(xiàn)了具有對氮化硅的親和性的肽(Si3N4)。基于此發(fā)現(xiàn)已經(jīng)實現(xiàn)了本發(fā)明。本發(fā)明提供了如下：項1.一種具有對氮化硅的親和性的肽，包含(1-1)或(1-2)的肽，或其片段；(1-1)具有由SEQIDNOS:1,2和23-27中任一個所示的氨基酸序列的肽；(1-2)具有對氮化硅的親和性并且包含其中在(1-1)的氨基酸序列中缺失、置換和/或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列的肽。項2.根據(jù)項1所述的具有對氮化硅的親和性的肽，其中所述片段包含6-77個氨基酸殘基。項3.根據(jù)項1或2所述的具有對氮化硅的親和性的肽，其中所述片段是具有由SEQIDNOS:3-11和28-35中任一個所示的氨基酸序列的肽。項4.一種編碼項1-3中任一項所述的具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸。項5.根據(jù)項4所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQIDNOS:12-22和36-48中任一個所示。項6.一種用于表達具有對氮化硅的親和性的肽的表達載體，所述表達載體包含項4或5所述的多核苷酸。項7.一種用于表達肽融合蛋白的表達載體，所述肽融合蛋白包含項1-3中任一項所述的具有對氮化硅的親和性的肽和靶蛋白，所述表達載體包含項6所述的多核苷酸和與所述多核苷酸連接的編碼所述靶蛋白的多核苷酸。項8.通過將項7所述的表達載體引入至宿主細胞來轉(zhuǎn)化所述宿主細胞獲得的轉(zhuǎn)化體。項9.包含項1-3中任一項所述的具有對氮化硅的親和性的肽和靶蛋白的肽融合蛋白，所述肽融合蛋白可由項8所述的轉(zhuǎn)化體獲得。項10.一種氮化硅基材，其結合了項1-3中任一項所述的具有對氮化硅的親和性的肽。項11.根據(jù)項10所述的氮化硅基材，其中所述靶蛋白經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至氮化硅基材。項12.一種用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的方法，包括：使引入至所述靶蛋白中的項1-3中任一項所述的具有對氮化硅的親和性的肽與氮化硅基材接觸。項13.根據(jù)項12所述的固定化方法，其中與所述氮化硅基材接觸的所述具有對氮化硅的親和性的肽構成通過使用項7所述的載體或項8所述的轉(zhuǎn)化體獲得的肽融合蛋白。項14.一種用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的方法，包括：將結合至項10所述的氮化硅基材的具有對氮化硅的親和性的肽與所述靶蛋白結合。項15.一種用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的組合物，所述組合物包含項1-3中任一項所述的具有對氮化硅的親和性的肽。項16.一種用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的接頭，所述接頭包含項1-3中任一項所述的具有對氮化硅的親和性的肽。項17.項1-3中任一項所述的具有對氮化硅的親和性的肽用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的用途。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的肽具有對氮化硅的親和性并且因此可以容易地經(jīng)由所述肽固定化至氮化硅基材。具體地，本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽使得其能夠以高密度固定化靶蛋白。本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽也允許靶蛋白固定化至氮化硅基材的同時保持靶蛋白的活性。本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽進一步允許靶蛋白固定化至氮化硅基材，同時控制靶蛋白取向的一致性。如上所述，本發(fā)明可以實現(xiàn)在氮化硅基材中靶蛋白的致密化、活化和高度受控的取向。這表明本發(fā)明允許靶蛋白經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽以高度準確和高度有效的方式固定化至氮化硅基材。此外，本發(fā)明允許與靶蛋白具有相互作用的物質(zhì)經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽以高度準確和高度有效的方式結合至氮化硅基材。因此，本發(fā)明的肽可用作用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的接頭。通過使用本發(fā)明的多核苷酸、載體和/或轉(zhuǎn)化體，可以容易地制備包含具有對氮化硅的親和性的肽和靶蛋白的肽融合蛋白。本發(fā)明的已經(jīng)結合了具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材、用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的方法、和用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的組合物，允許靶蛋白以高度致密的方式固定化至氮化硅基材，同時充分地保持靶蛋白活性，并且還同時一致地控制靶蛋白取向。這允許靶蛋白以高度準確和有效的方式固定化至氮化硅基材，并且與靶蛋白具有相互作用的所需物質(zhì)以高度準確和有效的方式結合。如上所述，本發(fā)明使得能夠以高度準確和有效的方式對所需物質(zhì)進行檢測、定量、分析等，提高在各種分析手段，諸如生物芯片中的技術。附圖說明圖1表明由SEQIDNOS:1和2所示的肽具有對氮化硅基材的親和性。圖2表明由SEQIDNOS:4,5,7和11所示的肽具有對氮化硅基材的親和性。圖3表明本發(fā)明的肽具有對氮化硅基材的親和性。圖4表明本發(fā)明的肽具有對氮化硅基材的親和性。圖5表明GST-融合肽具有對氮化硅基材的親和性，并且固定化至基材的GST表現(xiàn)出其優(yōu)異的固有活性。圖6表明本發(fā)明的肽具有對氮化硅基材的親和性。具體實施方式本發(fā)明解釋如下。1.具有對氮化硅的親和性的肽本發(fā)明提供了具有對氮化硅的親和性的肽。本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽包含(1-1)或(1-2)的肽，或其片段：(1-1)具有由SEQIDNOS:1,2和23-27中任一個所示的氨基酸序列的肽；(1-2)具有對氮化硅的親和性并且包含其中在(1-1)的氨基酸序列中缺失、置換和/或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列的肽。在本發(fā)明中，肽是指包含由肽鍵連接的兩個或多個氨基酸殘基的肽，包括取決于氨基酸殘基的數(shù)目，被稱為寡肽、多肽和蛋白的那些。在(1-2)的肽中，術語“一個或多個”的范圍不受限制，只要所述肽具有對氮化硅的親和性即可。“一個或多個”的范圍為，例如，1-15，優(yōu)選1-10，更優(yōu)選1-5，進一步更優(yōu)選1-4，特別優(yōu)選1-3，并且還更特別優(yōu)選1或2。在具體的氨基酸序列中，用于缺失、置換和/或添加一個或多個氨基酸的技術是已知的。具有這樣的缺失、添加和/或置換的肽的實例是，所述肽的氨基酸序列與由SEQIDNOS:1,2和23-27中任一個所示的氨基酸序列具有50％及以上的同一性，并且具有對氮化硅的親和性。所述肽與所述氨基酸序列的同一性通常為70％及以上，優(yōu)選80％及以上，更優(yōu)選90％及以上，進一步更優(yōu)選95％及以上，特別優(yōu)選97％及以上，和還特別優(yōu)選98％及以上。本發(fā)明的肽不限于下列的實例。(1-2)中所述的肽的實例包括其中在由SEQIDNOS:1,2和23-27中任一個所示的氨基酸序列中缺失、添加和/或置換一個或多個氨基酸，至少一個氨基酸序列與由SEQIDNOS:3-11和28-35所示的那些不同，和具有對氮化硅的親和性的肽的那些。上面(1-2)中所述的肽的其他實例包括其中在由SEQIDNO.:1所示的氨基酸序列中缺失、添加和/或置換一個或多個氨基酸，至少一個氨基酸序列與由SEQIDNOS:3-5所示的那些不同，和具有對氮化硅的親和性的肽的那些。上面(1-2)中所述的肽的進一步實例包括其中在由SEQIDNO.:2所示的氨基酸序列中缺失、添加和/或置換一個或多個氨基酸，至少一個氨基酸序列與由SEQIDNOS:6-11所示的那些不同，和具有對氮化硅的親和性的肽的那些；其中在由SEQIDNO.:23所示的氨基酸序列中缺失、添加和/或置換一個或多個氨基酸，至少一個氨基酸序列與由SEQIDNOS：28-30所示的那些不同，和具有對氮化硅的親和性的肽的那些；和其中在由SEQIDNO.:24所示的氨基酸序列中缺失、添加和/或置換一個或多個氨基酸，至少一個氨基酸序列與由SEQIDNOS：31-35所示的那些不同，和具有對氮化硅的親和性的肽的那些。(1-1)或(1-2)的肽的片段也不受限制，只要其是上述(1-1)或(1-2)的肽的片段并且所述片段具有對氮化硅的親和性即可。所述片段的實例包括包含6-77個氨基酸殘基，優(yōu)選6-30氨基酸殘基，和更優(yōu)選6-15氨基酸殘基的那些，所述片段具有對氮化硅的親和性。所述片段不特別地受下面的實例限制，所述實例包括具有對氮化硅的親和性和具有由SEQIDNOS:3-11和28-35中任一個所示的氨基酸序列的肽。本發(fā)明也不特別地受下面的實例限制，并且所述片段可以是其中由SEQIDNOS:3-11和25-35中任一個所示的氨基酸序列重復兩次以上并且具有對氮化硅的親和性的肽。在此，術語“具有對氮化硅的親和性”不特別地受限制，只要肽和沒有表面改性的氮化硅可以直接結合即可。結合條件可以根據(jù)使用的肽的類型、待經(jīng)由所述肽固定化至氮化硅基材的靶蛋白的性質(zhì)，或根據(jù)與靶蛋白具有相互作用的所需物質(zhì)的性質(zhì)適當?shù)剡x擇。例如，可以采用在下述實施例中使用的結合(孵育)條件，或本領域技術人員可以參照實施例中描述的那些適當?shù)剡x擇條件。例如，可以通過將任何溶液，諸如包含所述肽的緩沖溶液與氮化硅基材接觸特定的時間段來使所述肽(例如，PBS溶液)結合至氮化硅基材。在下文所述的實施例中使用的PBS含有10×PBS(NaCl1.38M(80.8g)，KCl27mM(2g)，Na2HPO4·12H2O80mM(29g)，和KH2PO415mM(2g))，使用離子交換水稀釋至1L的總體積，并且用HCl將其pH調(diào)整至7.4。如從對實施例的描述很清楚的是，即使當PBS適當?shù)乇幌♂尰蚱鋚H值被調(diào)整時，所述肽還可以結合至氮化硅基材?！暗杌摹辈皇芟拗疲灰浒?，并在基材的部分表面或整個表面上沒有表面改性，并且具有對氮化硅的親和性的肽可以結合至氮化硅的表面即可。氮化硅基材的實例包括由氮化硅形成的基材，和包含氮化硅以外的一種或多種組分的基材(其中氮化硅沉積在或覆蓋其部分表面或整個表面上)。本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽可以采用已知的基因工程技術或化學合成法來制備。例如，所需的肽可以通過將編碼由SEQIDNOS:1-11和23-35中任一個所示的肽的多核苷酸插入至載體等中，然后培養(yǎng)包含其中包含有所述載體的轉(zhuǎn)化體來制備。本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽可以通過從能夠產(chǎn)生本發(fā)明的肽的微生物分離和/或純化所述肽來獲得。本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽也可以通過已知的化學合成法基于由SEQIDNOS:1-11和23-35中任一個所示的氨基酸序列或編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列的信息合成?；瘜W合成法包括肽合成法，諸如液相肽合成和固相肽合成?？梢砸匀缟纤龅南嗤绞?，基于獲得的肽是否可以直接結合至沒有表面改性的氮化硅基材上來確定所獲得的肽是否具有對氮化硅的親和性。如果肽可以直接結合至氮化硅，則可以得出結論所述肽具有親和性。如上所述，可以根據(jù)使用的肽的類型，根據(jù)待經(jīng)由所述肽固定化至氮化硅基材的靶蛋白，或根據(jù)與所述靶蛋白具有相互作用的所需物質(zhì)的性質(zhì)來合適地選擇結合條件。由于本發(fā)明的肽具有對氮化硅的親和性，靶蛋白因此可以容易地并且以高度致密的方式經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽被固定化至氮化硅基材。本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽還允許靶蛋白被固定化至氮化硅基材，同時充分保持其活性，并且進一步允許在控制靶蛋白取向的一致性的同時將靶蛋白固定化至氮化硅基材。這表明本發(fā)明允許以高度準確和有效的方式經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽將靶蛋白固定化至氮化硅基材。此外，本發(fā)明允許以高度準確和有效的方式經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽將與靶蛋白具有相互作用的物質(zhì)結合至氮化硅基材。因此，本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽可以適當?shù)卦谏镄酒?，包括蛋白芯片，柱填充材料，用于ELISA中的微孔板和固定化酶的制備中使用。如上所述，本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽非常適用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材。這表明本發(fā)明提供了用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的接頭,其中所述接頭包含具有對氮化硅的親和性的肽；用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的組合物，所述組合物包含具有對氮化硅的親和性的肽；和具有對氮化硅的親和性的肽用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的用途。在所述接頭中，根據(jù)本發(fā)明的具有對氮化硅的親和性的肽的組合物和用途，具有對氮化硅的親和性的肽，氮化硅基材，靶蛋白，固定化(結合)條件等，和由其獲得的效果與上面解釋的那些是相同的。如上所述，接頭可以經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽將靶蛋白固定化至氮化硅基材。用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的組合物(其中所述組合物包含具有對氮化硅的親和性的肽)不受限制，只要其包含具有對氮化硅的親和性的肽即可，并且其可以進一步包含用于經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽將靶蛋白固定化至氮化硅基材所必需的組分，諸如,任意溶液包括緩沖液，例如，PBS，其允許具有對氮化硅的親和性的肽結合至氮化硅基材、靶蛋白和/或氮化硅基材。這種組合物的使用使得能夠容易地將具有對氮化硅的親和性的肽結合至氮化硅基材。這允許靶蛋白容易地經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至氮化硅基材。在本說明書中，術語“包含”還涵蓋“基本上由…組成”和“由…組成”的意思。2.多核苷酸本發(fā)明還提供編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸不受限制，只要其編碼上述具有對氮化硅的親和性的肽即可，多核苷酸的實例包括下列：(2-1)編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸，(2-2)包含由SEQIDNOS:12-22和36-48中任一項所示的核苷酸序列的多核苷酸，和(2-3)在嚴格條件下與(2-1)或(2-2)的多核苷酸任一個的互補鏈雜交并且編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸。在此，本領域普通技術人員可以容易地通過已知的方法基于具有對氮化硅的親和性的肽的氨基酸序列分析并獲得上述(2-1)的多核苷酸。由(2-2)的各個多核苷酸編碼的氨基酸序列分別對應于由SEQIDNOS:1-11和23-35所示的氨基酸序列。在上述的(2-3)，表述“在嚴格條件下雜交”表示兩個多核苷酸片段可以在標準雜交條件下彼此雜交。所述條件公開在Sambrook等人，MolecularCloning:Alaboratorymanual(分子克隆：實驗室指南)(1989),ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,USA。更具體地，“嚴格條件”當在本文中使用時是指在約45℃在6.0xSSC中雜交，然后在50℃用2.0xSSC洗滌。在嚴格條件下與互補鏈雜交的多核苷酸通常與上述(2-1)和(2-2)的核苷酸序列中的任一個具有一定程度以上的同一性。所述多核苷酸與上面提到的核苷酸序列具有，例如，70％及以上，優(yōu)選85％及以上，更優(yōu)選90％及以上，還更優(yōu)選95％及以上，特別優(yōu)選98％及以上，和仍更特別優(yōu)選99％及以上的同一性。核苷酸序列的同一性可以使用市售的分析工具或通過電信(例如，互聯(lián)網(wǎng))可獲得的分析工具確定。例如，軟件，諸如FASTA，BLAST，PSI-BLAST，或SSEARCH可以用于計算。術語“具有對氮化硅的親和性”的意思與上面的解釋相同，并且不特別地受限制，只要使用多核苷酸和沒有表面改性的氮化硅制備的肽可以直接結合即可，并且本領域普通技術人員可以如上所述適當?shù)剡x擇結合條件。由多核苷酸制備肽可以使用基因工程技術或本領域中已知的化學合成法來進行，這對于本領域技術人員來說是很容易的。例如，肽可以通過使用如下述的表達載體制備。本發(fā)明的多核苷酸還可以通過已知的基因工程技術或化學合成法制備(參見Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,78,6613(1981)；Science,222,778(1983)；MolecularCloning2dEd,ColdSpringHarborLab.Press(1989)；LecturesonBiochemicalExperiments(GeneticResearchMethodsI,II,III),JournalofTheJapaneseBiochemistrySociety(1986)。例如，所述多核苷酸可以通過從合適的來源，諸如包含所需的多核苷酸的微生物，使用標準方法制備cDNA文庫，然后使用合適的探針等從文庫獲得所需的多核苷酸來獲得。備選地，本發(fā)明的多核苷酸可以容易地通過已知的化學DNA合成方法基于由SEQIDNOS:1-11和23-35中任一個所示的氨基酸的序列信息或由SEQIDNOS:12-22和36-48中任一個所示的核苷酸的序列信息來制備和/或獲得。3.表達載體本發(fā)明提供用于表達具有對氮化硅的親和性的肽的包含上述多核苷酸的表達載體。本發(fā)明中用于表達具有對氮化硅的親和性的肽的表達載體不特別地受限制，只要其包含所述多核苷酸并且可以基于多核苷酸的堿基序列、具有對氮化硅的親和性的肽或用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的接頭(所述接頭包含具有對氮化硅的親和性的肽)在宿主細胞中表達。如常規(guī)已知的那樣，載體通?；谂c宿主細胞的關系合適地選擇。更具體地，在本發(fā)明中使用的載體不受限制，只要其是在基因工程領域中通常使用的表達載體即可。其實例包括質(zhì)粒載體，諸如從細菌諸如大腸桿菌或酵母中得到的pBR，pUC，pCD，pET，pGEX，pCMV，pMSG和pSVL；和從逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、噬菌體等得到的病毒載體。如上所述，這些載體可以根據(jù)與宿主細胞的關系適當?shù)剡x擇。如果需要，將啟動子與這些載體連接。啟動子不受限制，只要其適合于宿主細胞即可，并且可以使用任何已知的啟動子。啟動子的實例包括lac啟動子，trp啟動子，tac啟動子，trc啟動子，racA啟動子，λPL啟動子，lpp啟動子和T7啟動子，并且例如，當大腸桿菌用作宿主細胞時，使用這些啟動子。啟動子的其他實例包括SV40啟動子，CMV啟動子，RSV啟動子，HSV-TK啟動子，LTR啟動子，SRα啟動子，和EF-1α啟動子。當使用動物細胞作為宿主細胞時使用這些啟動子。鑒于與宿主細胞的關系，還可以使用下列的啟動子：酵母細胞啟動子，昆蟲細胞啟動子和病毒啟動子。當載體中具有內(nèi)源性啟動子時，也可以使用內(nèi)源性啟動子。本發(fā)明的用于表達具有對氮化硅的親和性的肽的表達載體中的啟動子-結合位點不受限制，只要具有對氮化硅的親和性的肽可以在宿主細胞中表達即可。通常，啟動子連接至編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸的堿基序列中的上游位點。更具體地，在本發(fā)明的用于表達具有對氮化硅的親和性的肽的表達載體中，編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸在啟動子的控制下。作為宿主細胞，可以使用多種已知的原核細胞和真核細胞。其實例包括細菌，諸如大腸桿菌(E.coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，鏈球菌(Streptococcus)，葡萄球菌(Staphylococcus)，放線菌(actinomycetes)和絲狀真菌；細胞，諸如酵母，曲霉菌，昆蟲細胞包括果蠅S2和草地夜蛾(Spodoptera)Sf9；動物或植物細胞，諸如L細胞，CHO細胞，COS細胞，Art-20細胞，HeLa細胞，C127細胞，骨髓瘤細胞，GH3細胞，F(xiàn)L細胞，VERO細胞，CV-1細胞，Bowes黑色素瘤細胞，和滑爪蟾(platanna)的卵母細胞。這些載體、啟動子和宿主細胞可以基于本領域中的常用公知技術知識來合適地組合。組合的實例包括pET(T7啟動子)/大腸桿菌BL21(DE3)和pGEX(Tac啟動子)/大腸桿菌BL21。在本發(fā)明的用于表達具有對氮化硅的親和性的肽的表達載體中，可以進一步包含增強子，剪接信號，poly-A輔助信號，耐藥基因，綠色熒光蛋白(GFP)或其他標志物基因的堿基序列。取決于目的，這些堿基序列可以在表達載體的任何位點處連接。構成用于將具有對氮化硅的親和性的肽插入至靶蛋白中的接頭的堿基序列可以進一步連接至本發(fā)明的用于表達具有對氮化硅的親和性的肽的表達載體。例如，構成所述接頭的堿基序列可以連接至編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸的5’末端和/或3’末端。構成所述接頭的堿基序列不受限制，只要可以實現(xiàn)本發(fā)明的效果即可，并且本領域技術人員可以使用已知技術在研究的總范圍內(nèi)合適地選擇。接頭的實例包括所謂的柔性接頭，并且廣泛使用的柔性接頭的氨基酸序列的實例是(G4S)n(例如，n＝1-4)。當使用所述接頭時，可以將能夠適當?shù)乇磉_所述接頭的核苷酸序列連接至所述接頭。此外，在本發(fā)明的用于表達具有對氮化硅的親和性的肽的表達載體中，編碼靶蛋白的多核苷酸可以進一步連接至編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸。通過將編碼靶蛋白的連接至編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸，可以表達被具有對氮化硅的親和性的肽連接的靶蛋白。這也使得能夠表達被用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的接頭連接的靶蛋白。包含編碼靶蛋白和具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸的表達載體或包含編碼靶蛋白和用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的接頭的多核苷酸的表達載體，可以稱為用于表達包含具有對氮化硅的親和性的肽和靶蛋白的肽融合蛋白的表達載體。在此，靶蛋白不特別地受限制，并且包括任何蛋白，諸如抗原，抗體，酶，生物底物，受體蛋白，和植物凝集素。更具體地，盡管不限于這些，其實例包括谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST:谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)，GFP(綠色熒光蛋白)，堿性磷酸酶，過氧化物酶，熒光素酶，β-半乳糖苷酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶，凝血酶，Xa因子，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，酪氨酸激酶，胰島素受體，EGF受體，麥芽糖結合蛋白，單克隆抗體，多克隆抗體，單鏈抗體，多價單鏈抗體(例如，雙價單鏈抗體)，恒定區(qū)融合單鏈抗體，F(xiàn)ab片段和F(ab’)2片段(包含抗原結合位點的抗體片段)，補體系統(tǒng)蛋白C1q，伴刀豆球蛋白A，小扁豆凝集素，抗體結合蛋白(例如，蛋白A，ZZ，蛋白G，和蛋白L)，生物素和鏈霉抗生物素蛋白(抗生物素蛋白)。當編碼這些靶蛋白的核苷酸的堿基序列已知時，基于編碼靶蛋白的核苷酸的已知序列信息，可以通過已知的方法將所需的核苷酸序列定位在表達載體上。當編碼靶蛋白的核苷酸的堿基序列未知時，可以采用已知的基因工程技術或化學合成法來基于靶蛋白的氨基酸序列分析和制備編碼所述靶蛋白的核苷酸，并且可以將得到的核苷酸定位在表達載體上。為了表達肽融合蛋白，以與編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸相同的方式將編碼靶蛋白的多核苷酸定位處于啟動子的控制下。只要滿足上述，本領域技術人員可以適當?shù)剡x擇編碼靶蛋白的多核苷酸是否連接在編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸的上游或下游，并且編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸是否連接至靶蛋白的內(nèi)部分子。在任一種情況下，多核苷酸優(yōu)選連接至不負面地影響靶蛋白的生理活性和構象的位點。例如，當靶蛋白是抗原時，多核苷酸優(yōu)選定位在不負面地影響抗原測定的位點上；當靶蛋白是抗體時，多核苷酸可以定位在不負面地影響抗原結合的位點上；并且當靶蛋白是酶時，多核苷酸可以定位在不負面地影響酶活性的位點上；等等。本領域技術人員可以適當?shù)剡x擇引入位點，取決于靶蛋白，諸如抗原、抗體、酶、生物底物、受體蛋白和植物凝集素的性質(zhì)和結構。在任一種情況下，具有對氮化硅的親和性的肽或用于固定化的接頭優(yōu)選連接至不影響具有對氮化硅的親和性的肽的性質(zhì)(諸如對基材的親和性)并且不負面地影響本發(fā)明的效果的位點。在本發(fā)明的用于表達肽融合蛋白的表達載體中，編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸連接至編碼靶蛋白的多核苷酸，并且連接結構不受限制，只要所需的肽融合蛋白在宿主細胞中表達即可。例如，在本發(fā)明的肽融合蛋白表達載體中，編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸和編碼靶蛋白的多核苷酸可以作為連續(xù)堿基序列存在。更具體地，編碼靶蛋白的多核苷酸可以直接連接而不使用接頭，或編碼靶蛋白的多核苷酸可以通過一些序列(諸如能夠連接這些多核苷酸的堿基序列)連接至編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸。用于將編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸連接至編碼靶蛋白的多核苷酸的接頭不受限制，只要表達肽融合蛋白并且實現(xiàn)本發(fā)明的效果即可，并且本領域技術人員可以使用已知技術在常規(guī)范圍內(nèi)適當?shù)剡x擇接頭。作為其一個實例，可以提到上述的柔性接頭。本發(fā)明的這些表達載體可以使用本領域中的已知方法通過使用限制性內(nèi)切酶等將必需的堿基序列，諸如編碼具有對氮化硅的親和性的肽的多核苷酸或編碼靶蛋白的多核苷酸定位在載體的合適位點上制備。4.轉(zhuǎn)化體本發(fā)明提供了通過將表達載體引入至宿主細胞來轉(zhuǎn)化宿主細胞獲得的轉(zhuǎn)化體。在本發(fā)明中，宿主細胞的實例包括上述那些。用于通過將肽融合蛋白表達載體引入至宿主細胞獲得轉(zhuǎn)化體的方法不特別地受限制，并且可以采用公知的方法。例如，轉(zhuǎn)化體可以通過標準實驗室指南中所述的多種方法形成。其具體實例包括氯化鈣法，氯化銣法，使用DEAE-葡聚糖的轉(zhuǎn)染，微注射，使用例如脂質(zhì)體的陽離子脂質(zhì)-介導的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導和通過噬菌體感染。5.肽融合蛋白本發(fā)明提供了包含具有對氮化硅的親和性的肽和靶蛋白的肽融合蛋白，其中所述肽融合蛋白可以由上述的轉(zhuǎn)化體獲得。轉(zhuǎn)化體、具有對氮化硅的親和性的肽和靶蛋白與上述的那些相同。在本發(fā)明中，肽融合蛋白是如上所述通過將具有對氮化硅的親和性的肽連接至靶蛋白聯(lián)合在一起的融合蛋白。在本發(fā)明中，肽融合蛋白可以通過將轉(zhuǎn)化體在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并從轉(zhuǎn)化體和/或培養(yǎng)物收集所需的肽融合蛋白來制備。培養(yǎng)和收集方法不特別地受限制，并且可以采用常規(guī)已知的通用方法。例如，可以通過傳代培養(yǎng)或分批培養(yǎng)使用適合于宿主細胞的任何培養(yǎng)基來進行培養(yǎng)。培養(yǎng)可以持續(xù)至可以獲得足量的肽融合蛋白，使用轉(zhuǎn)化體的內(nèi)部和外部產(chǎn)生的蛋白量作為指標。在前述培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基可以根據(jù)宿主細胞從多種常用的培養(yǎng)基中適當?shù)剡x擇。培養(yǎng)條件，諸如溫度和時間，也可以根據(jù)宿主細胞從已知條件中適當?shù)剡x擇。如果需要，由此獲得的肽融合蛋白可以通過利用其物理性質(zhì)、化學性質(zhì)等的多種分離操作進一步分離或純化。分離操作的實例包括溶劑萃取，蒸餾和各種類型的色譜法(參見生物化學數(shù)據(jù)手冊(BiochemistryDataBook)II),1175–1259頁,第一版,第一次印刷,1980,Kagaku-DojinPublishingCo.,Inc.,Tokyo；Biochemistry,25(25),8274(1986)；Eur.J.Biochem.,163,313(1987))。本發(fā)明的肽融合蛋白具有對氮化硅的親和性。因此，肽融合蛋白可以通過將從培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)化體獲得的產(chǎn)物與氮化硅基材接觸以使具有對氮化硅的親和性的肽結合至氮化硅基材來分離和純化。當使用轉(zhuǎn)化體表達蛋白時，肽融合蛋白有時可以作為包涵體存在。在這種情況下，本發(fā)明的肽融合蛋白可以通過適當?shù)厝芙獍w并使其與氮化硅基材接觸以將具有對氮化硅的親和性的肽結合至氮化硅基材從而分離和純化本發(fā)明的肽融合蛋白來進行分離或純化。當本發(fā)明的肽融合蛋白的構象已經(jīng)改變時，肽融合蛋白可以結合至氮化硅基材并保持所述構象改變，并且如果需要，所述構象也可以在結合的同時被重折疊，以分離或純化本發(fā)明的肽融合蛋白。6.已經(jīng)結合有具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材本發(fā)明提供了已經(jīng)結合有具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材。其包含結合至氮化硅基材的具有對氮化硅的親和性的肽。具有對氮化硅的親和性的肽與如上所述的相同。在本發(fā)明中，氮化硅基材與上述的相同。本發(fā)明的氮化硅基材不受限制，只要其包含在基材的部分和/或整個表面上沒有表面改性的氮化硅，并且具有對氮化硅的親和性的肽可以結合至氮化硅的表面即可。氮化硅基材的實例包括由氮化硅形成的基材，和包含不同于氮化硅的一種或多種組分的基材(其中氮化硅沉積在其部分或整個表面上或覆蓋其部分或整個表面)。氮化硅基材的形狀不受限制，只要具有對氮化硅的親和性的肽可以結合于其上即可，并且氮化硅基材可以具有任何形狀，諸如板狀，膜狀(片)，球形，顆粒狀(珠狀)，纖維狀，微孔板或圓柱形。當本發(fā)明的氮化硅基材用作生物芯片諸如蛋白芯片時，氮化硅基材優(yōu)選地，例如，為板、膜(片)等的形狀。已經(jīng)結合有具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材可以通過接觸具有對氮化硅的親和性的肽或包含具有對氮化硅的親和性的肽的用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的接頭以便將具有對氮化硅的親和性的肽結合至氮化硅基材來制備。結合條件可以根據(jù)具有對氮化硅的親和性的肽的類型，待經(jīng)由所述肽固定化至氮化硅基材的靶蛋白的性質(zhì)或根據(jù)與靶蛋白具有相互作用的所需物質(zhì)的性質(zhì)來適當?shù)剡x擇。例如，氮化硅基材可以通過諸如將通過使具有對氮化硅的親和性的肽與任選的一種或多種溶劑混合獲得的溶液，或用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的組合物(所述組合物包含具有對氮化硅的親和性的肽)滴在氮化硅基材上的方法，或通過諸如將氮化硅基材浸沒在所述溶液中，然后使所得物靜置一段時間的方法來制備。為了去除未結合于氮化硅基材的非必要組分，所述非必要組分可以，例如，使用溶劑諸如緩沖溶液或水洗掉?？梢圆捎孟挛乃龅膶嵤├慕Y合條件，并且本領域技術人員可以參照實施例中所述的那些適當?shù)剡x擇結合條件。因為所述肽具有對氮化硅的親和性，在本發(fā)明中其與氮化硅基材的直接結合是可能的。本發(fā)明的已經(jīng)結合有具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材可以進一步包含經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至氮化硅基材的靶蛋白。所述靶蛋白與上述的那些相同。固定化不受限制，只要靶蛋白經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至氮化硅基材即可。靶蛋白可以經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽通過將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白并且將得到的蛋白與氮化硅基材接觸而固定化至氮化硅基材。備選地，靶蛋白可以經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽通過將結合至氮化硅基材的具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中而固定化至氮化硅基材。這樣的接觸使得能夠經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽制備包含靶蛋白的氮化硅基材。用于氮化硅基材的接觸條件與上面所述的那些相同。將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白不受限制，只要其不負面地影響本發(fā)明的效果即可，并且只要可以引入具有對氮化硅的親和性的肽即可。具有對氮化硅的親和性的肽可以直接或經(jīng)由接頭引入至靶蛋白。以如上所述相同的方式，本領域技術人員可以基于已知的常用一般技術知識適當?shù)剡x擇接頭，只要其不負面影響本發(fā)明的效果即可。具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白的位點不受限制，只要其不負面地影響靶蛋白的活性和取向，具有對氮化硅的親和性的肽相對于基材的親和性和其他性質(zhì)，和本發(fā)明的效果即可；具有對氮化硅的親和性的肽可以引入至任何位點中。例如，當靶蛋白是抗原時，具有對氮化硅的親和性的肽可以定位在不負面地影響抗原測定的位點上；當靶蛋白是抗體時，具有對氮化硅的親和性的肽可以定位在不負面地影響抗原結合的位點上；并且當靶蛋白是酶時，具有對氮化硅的親和性的肽可以定位在不負面地影響酶活性的位點上；等。本領域技術人員可以根據(jù)靶蛋白的性質(zhì)和結構來適當?shù)剡x擇所述位點，所述靶蛋白諸如抗原、抗體、酶、生物底物、受體蛋白或植物凝集素。特別地，在本發(fā)明中可以適當?shù)剡x擇具有對氮化硅的親和性的肽的引入位點；這允許靶蛋白固定化至氮化硅基材，同時充分地保持靶蛋白活性，并且同時還一致地控制靶蛋白取向。將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中的方法不特別地受限制，并且所述肽可以通過適當選擇的已知基因工程技術或化學合成法來引入。例如，所述肽可以通過利用如上所述的表達載體引入。此外，可以使用交聯(lián)劑包括戊二醛，NHS/EDC(N-羥基琥珀酰亞胺/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)等將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中。備選地，具有對氮化硅的親和性的肽可以通過生物素化的具有對氮化硅的親和性的肽和鏈霉抗生物素蛋白(抗生物素蛋白)-標記的靶蛋白之間經(jīng)由生物素-鏈霉抗生物素蛋白(抗生物素蛋白)的特異性結合而引入至靶蛋白中。此外，具有對氮化硅的親和性的肽還可以通過生物素化的具有對氮化硅的親和性的肽和生物素化的靶蛋白之間經(jīng)由生物素-鏈霉抗生物素蛋白(抗生物素蛋白)的特異性結合而引入至靶蛋白中?？梢酝ㄟ^如上所述的已知方法進行所述引入。用于將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中的優(yōu)選實例是使用肽融合蛋白。通過如上所述將肽融合蛋白與氮化硅基材接觸，靶蛋白可以經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至氮化硅基材。備選地，靶蛋白也可以通過使用交聯(lián)劑或特異性結合將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至氮化硅基材，然后如上所述使所得物與氮化硅基材接觸而引入。這表明本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生能夠固定化至氮化硅基材的靶蛋白的方法，所述方法包括將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中，或提供了包含引入其中的具有對氮化硅的親和性的肽的靶蛋白。靶蛋白還可以通過使用上面提到的交聯(lián)劑、特異性結合等將結合至氮化硅基材的具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至氮化硅基材。本發(fā)明的已經(jīng)結合有具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材允許靶蛋白以高度致密的方式固定化至氮化硅基材，同時充分地保持靶蛋白活性，并且同時還一致地控制靶蛋白取向。因此，本發(fā)明的已經(jīng)結合有具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材允許以高度準確和有效的方式對靶蛋白和/或與靶蛋白具有相互作用的物質(zhì)進行檢測、測量、分析等。因此，當根據(jù)本發(fā)明的已經(jīng)結合有具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材為板、膜(片)等的形狀時，其可以用作生物芯片，特別地，用作蛋白芯片。根據(jù)本發(fā)明的已經(jīng)結合有具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材適合用作利用抗原-抗體反應、酶促反應等的柱填充材料，用于ELISA等中的微孔板，和固定化的酶。本發(fā)明的基材可用于各種領域，諸如臨床檢驗，藥物開發(fā)研究，環(huán)境監(jiān)測和生物化學領域。7.用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的方法本發(fā)明提供了用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的方法，所述方法包括使引入至靶蛋白中的具有對氮化硅的親和性的肽與氮化硅基材接觸的步驟。在此，靶蛋白、具有對氮化硅的親和性的肽、氮化硅基材、將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中，和使引入至靶蛋白中的具有對氮化硅的親和性的肽與氮化硅基材接觸，與上面所述的那些相同。根據(jù)本發(fā)明的固定化方法，因為肽具有對氮化硅的親和性，通過簡單地使引入至靶蛋白中的具有對氮化硅的親和性的肽與氮化硅基材接觸，其與氮化硅基材的結合是可能的。因此，本發(fā)明的固定化方法使得能夠?qū)械鞍捉?jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽容易地固定化至氮化硅基材。本發(fā)明的固定化方法可以通過進一步結合將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中的步驟來執(zhí)行。更具體地，所述方法可以在進行將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中的步驟后執(zhí)行。將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中的步驟不受限制，只要其不負面地影響本發(fā)明的效果并且可以引入具有對氮化硅的親和性的肽即可。可以通過采用已知的基因工程技術或化學合成法，例如，通過利用表達載體來適當?shù)貓?zhí)行所述引入。作為一個實例，可以根據(jù)上述表達肽融合蛋白的程序執(zhí)行所述引入。因此，在將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中，上述的表達載體或轉(zhuǎn)化體的使用也可以作為優(yōu)選的實施例。以如上所述相同的方式，交聯(lián)劑、生物素和鏈霉抗生物素蛋白(抗生物素蛋白)之間的特異性結合等也可作為用于將具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中的優(yōu)選實例。此外，以如上所述相同的方式，引入位點不受限制，只要可以將具有對氮化硅的親和性的肽直接或經(jīng)由接頭引入至靶蛋白中即可，并且本領域技術人員可以根據(jù)靶蛋白的性質(zhì)和結構適當?shù)剡x擇引入位點。根據(jù)上述本發(fā)明的固定化方法，可以容易地制備包含固定化至其上的靶蛋白的氮化硅基材。此外，在本發(fā)明的固定化方法中，由于靶蛋白經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至氮化硅基材，靶蛋白可以以高度致密的方式固定化，同時充分地保持靶蛋白活性，并且同時還一致地控制靶蛋白取向。本發(fā)明的固定化方法允許容易地制備包含經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至其上的靶蛋白的氮化硅基材。這也允許制備生物芯片，諸如蛋白芯片，以及利用抗原-抗體反應、酶促反應等的柱填充材料，在ELISA中使用的微孔板，和固定化酶。這表明本發(fā)明的固定化方法可用于多個領域，諸如臨床檢驗、藥物開發(fā)、環(huán)境監(jiān)測和生物化學。此外，本發(fā)明提供了用于將靶蛋白固定化至氮化硅基材的方法，該方法包括將靶蛋白結合至在已經(jīng)結合有具有對氮化硅的親和性的肽的氮化硅基材中包含的具有對氮化硅的親和性的肽。在此，靶蛋白、具有對氮化硅的親和性的肽和氮化硅基材與如上所述的相同。將具有對氮化硅的親和性的肽結合至氮化硅基材也與如上所述的相同。在本發(fā)明中，將結合至氮化硅基材的具有對氮化硅的親和性的肽與靶蛋白結合不受限制，只要其不負面地影響本發(fā)明的效果即可，并且只要它們可以結合即可；本領域技術人員可以基于已知的常用一般技術知識來適當?shù)剡x擇所述方法。例如，通過使用交聯(lián)劑或特異性結合將結合至氮化硅基材的具有對氮化硅的親和性的肽引入至靶蛋白中,靶蛋白可以經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至氮化硅基材。如上所述，所述結合不受限制不受限制，只要具有對氮化硅的親和性的肽直接或經(jīng)由接頭與靶蛋白結合即可，并且如上所述，本領域技術人員可以基于已知的常用一般技術知識在不負面地影響本發(fā)明的效果的范圍內(nèi)適當?shù)剡x擇接頭。具有對氮化硅的親和性的肽與靶蛋白結合的結合位點不受限制，只要本發(fā)明的效果不負面地受影響即可，并且本領域技術人員可以如上所述根據(jù)靶蛋白的性質(zhì)和結構適當?shù)剡x擇結合位點。本發(fā)明的固定化方法可以通過進一步結合使具有對氮化硅的親和性的肽與氮化硅基材接觸的步驟來執(zhí)行。更具體地，其可以在進行使具有對氮化硅的親和性的肽與氮化硅基材接觸的步驟之后執(zhí)行。使具有對氮化硅的親和性的肽與氮化硅基材接觸可以如上所述執(zhí)行。根據(jù)本發(fā)明的固定化方法，如上所述，可以制備包含固定化于其上的靶蛋白的氮化硅基材。由于靶蛋白經(jīng)由具有對氮化硅的親和性的肽固定化至氮化硅基材，靶蛋白可以以高度致密的方式固定化，同時充分地保持靶蛋白活性，并且同時還一致地控制靶蛋白取向。因此，本發(fā)明能夠容易地制備生物芯片包括蛋白芯片，利用抗原-抗體反應、酶促反應等的柱填充材料，在ELISA等中使用的微孔板，和固定化酶。這表明本發(fā)明的固定化方法可用于多個領域，諸如臨床檢驗、藥物開發(fā)研究、環(huán)境監(jiān)測和生物化學。實施例下面，本發(fā)明將參照實施例進行描述，但本發(fā)明不限于下列的實施例。實施例1根據(jù)下面所述的程序檢查由SEQIDNO:1所示的多肽(SIN1肽)和由SEQIDNO:2所示的多肽(SIN2肽)對氮化硅(Si3N4)基材的親和性。1.程序延伸因子Tu(ELN)表達載體的構建1)使用DNA純化試劑盒(由PromegaKK制造)提取大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)的染色體DNA。2)利用該染色體DNA作為模板使用KODplusver.2PCR試劑盒(由ToyoboCo.,Ltd.制造)進行PCR以擴增ELN基因。3)使用In-Fusion(注冊商標)AdvantagePCR克隆試劑盒(由ClontechLaboratories,Inc.制造)將擴增的ELN基因插入至pET-22(b)載體(由Novagen制造)的NdeI位點和NotI位點之間，然后進行克隆。4)大腸桿菌HST08Premium(TAKARABIOINC.)利用上述載體轉(zhuǎn)化，并在LB-Amp瓊脂培養(yǎng)基上靜態(tài)培養(yǎng)過夜。5)將1mL含氨芐西林的Plusgrow(由NacalaiTesque,Inc.制造)置于1.5-mL試管中，接種來自瓊脂平板的菌落，并且在37℃和200rpm培養(yǎng)約7小時。6)在培養(yǎng)后，收集載體并通過堿性SDS法純化。7)基因的插入通過瓊脂糖電泳確認，并且進一步，插入的ELN基因的核苷酸序列通過DNA序列分析確認。8)大腸桿菌JM109(TAKARABIOINC.)用在上述步驟6)中獲得的載體轉(zhuǎn)化并培養(yǎng)，然后收集并純化ELN表達載體。GST表達載體pGEX-3X的構建1)將1μLGST表達載體(pGEX-3X)(由GEHealthcare制造)加入至500μL大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，并將混合物在冰上孵育10分鐘。2)混合物在42℃孵育45秒，并在冰上冷卻。3)10mL含氨芐西林的Plusgrow置于15-mL試管中，并向其中加入500μL上面轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，并將混合物在37℃和200rpm培養(yǎng)過夜。4)在4,500rpm進行離心分離15分鐘，并移除上清液。5)通過堿裂解法收集pGEX-3X。6)25μLNEBuffer(由NewEnglandBiolabs,Inc.制造),2.5μL×100BSA(由NewEnglandBiolabs,Inc.制造)，2.5μLCIAP(小牛腸堿性磷酸酶，由ToyoboCo.,Ltd.制造)，2.5μLEcoRI-HF(由NewEnglandBiolabs,Inc.制造)，和2.5μLBamHI-HF(由NewEnglandBiolabs,Inc.制造)加入至215μL收集的載體溶液中，并將混合物在37℃孵育過夜以對載體進行裂解/脫磷酸化處理。pGEX-3X的裂解狀態(tài)通過瓊脂糖電泳確認。7)酶處理的載體使用PCRClean-UpSystem(由PromegaKK制造)純化。與SIN1肽或SIN2肽融合的GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)的制備1)編碼SIN1肽和SIN2肽的核苷酸序列中的每一個使用上述的ELN表達載體作為模板進行擴增。編碼SIN1肽的核苷酸序列由SEQIDNO:12表示，并且編碼SIN2肽的核苷酸序列由SEQIDNO:13表示。2)在上述步驟1)中獲得的核苷酸序列中的每一個在如上所述構建的GST表達載體pGEX-3X的BamHI位點和EcoRI位點之間進行克隆，并且已經(jīng)插入至所述載體中的編碼SIN1肽和SIN2肽的核苷酸序列中的每一個通過DNA序列分析確認。3)大腸桿菌BL21(DE3)用構建的表達載體轉(zhuǎn)化，并且在含有氨芐西林(Amp.,由NacalaiTesque,Inc.制造)的10mL2×YT培養(yǎng)基(由Novagen制造)中培養(yǎng)過夜。4)將培養(yǎng)過的培養(yǎng)基加入至50mL與上面步驟3)中相同的培養(yǎng)基中直至OD600＝0.1，并將混合物在37℃和200rpm培養(yǎng)直至獲得OD600＝1.0(約2小時)。5)加入5μL1MIPTG(異丙基-β-D(-)-硫代半乳糖吡喃糖苷，由WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)，并將混合物在30℃和200rpm進一步培養(yǎng)7小時。6)培養(yǎng)后，在4,500rpm進行離心分離20分鐘，并去除上清液。7)將3mLBugBuster(BugBuster蛋白提取試劑，由Novagen制造)，1.5μL全能核酸酶(BenzonaseNuclease)(由Novagen制造)，和3mg溶菌酶(由SeikagakuCorporation制造)加入至細菌細胞，并將混合物充分攪拌，并在37℃孵育1小時以裂解細菌細胞。8)在10,000rpm進行離心分離20分鐘，并將上清液作為可溶部分去除。9)將所述可溶部分加樣至GSTrapHP柱(由GEHealthcare制造)，并且柱的內(nèi)部用含有1mMDTT(二硫蘇糖醇，由NacalaiTesque,Inc.制造)的PBS洗滌。10)利用含有20mM還原谷胱甘肽的100mMTris-HCl(pH8.0)通過梯度洗脫收集野生型GST，SIN1肽-融合的GST和SIN2肽-融合的GST。11)洗脫液用PBS透析過夜，并且它們的密度通過DC蛋白測定試劑盒(由Bio-RadLaboratories,Inc.制造)測定。實施例1中使用的PBS通過在量筒中向預先制備的10×PBS(NaCl(80.8g)1.38M,KCl(2g)27mM,Na2HPO4/12H2O(29g)80mM,KH2PO4(2g)15mM)添加離子交換水以獲得1L的總體積并用HCl將其pH調(diào)整至7.4來獲得。野生型GST(wt-GST)，SIN1肽-融合的GST和SIN2肽-融合的GST吸附至Si3N4基材1)使用PBS以下述方式制備GST溶液使得wt-GST、SIN1肽-融合的GST或SIN2肽-融合的GST成為50μg/mL(1cm3)，并且使1mL每種GST溶液和2gSi3N4基材(表面積:31.2cm2，面積/體積:31.2cm-1)彼此接觸并且在25℃孵育3小時。2)回收每種上清液，并且每種上清液中的GST濃度通過DC蛋白測定(由Bio-RadLaboratories,Inc.制造)測定。3)吸附量基于吸附前后GST濃度的差來計算，并且吸附密度通過將吸附量除以接觸面積(31.2cm2)來計算。在此使用的Si3N4基材通過熱沉積在二氧化硅(SiO2)基材上涂覆Si3N4層來獲得。對于涂覆Si3N4層使用公知的通用化學氣相沉法，并且通過使用二氯硅烷(SiH2Cl2)和氨(NH3)將Si3N4層沉積在SiO2基材上來制備Si3N4基材。另外，在此制備的SIN1肽-融合的GST和SIN2肽-融合的GST中的每一個是通過在GST的C-末端區(qū)處融合SIN1肽或SIN2肽所獲得的肽-融合的GST。2.結果結果顯示在圖1中。圖1示出至Si3N4基材的吸附密度。如從圖1很清楚的是，相對于wt-GST，對于SIN1肽-融合的GST(GST-SIN1)和SIN2肽-融合的GST(GST-SIN2)觀察到至Si3N4基材的吸附密度的顯著提高。這表明由SEQIDNO:1或2所示的肽的引入使得GST容易和致密地固定化至Si3N4基材。因此，其揭示了由SEQIDNO:1或2所示的肽對Si3N4基材具有良好的親和性并且可用于靶蛋白至Si3N4基材的固定化。另外，由于有可能將每一種肽引入至GST的所需位置并且如上所述對于由此獲得的肽-融合的GST觀察到吸附密度的提高，其揭示了，利用每一種肽，也有可能充分地保持靶蛋白活性，和對靶蛋白取向的一致地控制。實施例2根據(jù)下面所述的程序檢驗由SEQIDNOS:4,5,7和11所示的肽對Si3N4基材的親和性。在下面，TP24表示由SEQIDNO:4所示的肽，TP25表示由SEQIDNO:5所示的肽，TP14表示由SEQIDNO:7所示的肽，并且TP19表示由SEQIDNO:11所示的肽。1.程序1)由商業(yè)供應商執(zhí)行在N-末端區(qū)被生物素化的上面四種類型的肽(TP24，TP25，TP14和TP19)的合成。這些生物素化肽中的每一種溶解在DMF中以便達到1mg/mL的濃度并保存在-20℃。2)10μL(10μg(190pmol))Alexa-Fluor633-標記的鏈霉抗生物素蛋白(SA)和相當于1.5當量(284pmol)的每種生物素化肽混合，并向混合物中添加PBS以獲得1mL的總體積。3)將1mL所獲得的液體混合物與1g(15.6cm2)Si3N4基材接觸，并且在25℃孵育2小時。作為對照，將PBS添加至SA，并且將混合物與Si3N4基材接觸并孵育。4)孵育后，用PBS將每種Si3N4基材洗滌5次，并且在5mLPBS中浸泡。5)將每個Si3N4基材轉(zhuǎn)移至微孔板(Nunc#267061)上，并且利用酶標儀(激發(fā)波長:620nm，熒光波長:666nm)測量基材表面的熒光強度?？紤]到信號強度的變異，對每種樣品總計進行98次測量，將其取平均值并獲得標準差。使用的Si3N4基材和PBS與實施例1中的那些相同。2.結果結果顯示在圖2中。如從圖2中很清楚的是，其示出與不使用任何肽的對照(SA)相比，當使用由SEQIDNOS:4,5,7和11所示的肽(SA-TP24，SA-TP25，SA-TP14和SA-TP19)時熒光強度趨于增加。這表明每種肽的介入使得靶蛋白容易地并致密地固定化至Si3N4基材。因此，類似于實施例1，其揭示了由SEQIDNOS:4,5,7和11所示的肽也對Si3N4基材具有良好的親和性并且可用于靶蛋白至Si3N4基材的固定化。實施例3根據(jù)下面所述的程序研究由SEQIDNOS:1-11所示的肽是否存在對Si3N4基材的親和性。1.程序1)12g(近似表面積:187.4cm2)的與實施例1中相同的Si3N4基材與含有由SEQIDNOS:1-11所示的肽的每種PBS溶液混合，并且每種溶液在25℃和200rpm振蕩2小時。2)每種溶液的一部分上清液通過HPLC分析，并且每種溶液的剩余部分進一步與Si3N4基材混合。此時，基材量/1mL被設定為1.5g。3)步驟2)總計重復5次。4)確定在吸附后表現(xiàn)出顯著減小的峰面積的肽具有對Si3N4基材的親和性；因此，比較吸附前后的色譜圖。在上述步驟2)中，如下進行HPLC分析。首先，啟動HPLC系統(tǒng)，然后將用于HPLC的A溶液和B溶液注入至A和B道。之后，將A溶液以1mL/min的流速注入至柱中以平衡柱的內(nèi)部。下一步，還沒有應用于試驗的每一種PBS溶液和上面步驟2)中收集的所述部分上清液通過預處理濾器過濾，并將其100μL注入至柱中。根據(jù)下面表1中顯示的程序線性地增加B溶液的濃度，以從柱中洗脫所述肽。之后，比較吸附前后的色譜圖。HPLC系統(tǒng)、A溶液、B溶液、預處理濾器和程序如下。HPLC系統(tǒng)PU-2089四元梯度泵(由JASCOInternationalCo.,Ltd.制造)LC-NetII/ADC(由JASCOInternationalCo.,Ltd.制造)MD-2018Plus光電二極管陣列檢測器(由JASCOInternationalCo.,Ltd.制造)UV-1575智能UV/VIS檢測器(由JASCOInternationalCo.,Ltd.制造)TSKgelODS-100Z3μm(柱尺寸:4.6mm，I.D.:×15cm)(由TOSOHCORPORATION制造)A溶液超純水(1L)TFA(三氟乙酸，用于高效液相色譜，由WakoPureChemicalIndustries,Ltd.制造)(1mL)0.1v/v％B溶液乙腈[Chromasolv，用于HPLC，梯度級，≥99.9％](由Sigma-AldrichJapan制造)(1L)TFA(用于高效液相色譜)(1mL)0.1v/v％預處理濾器Non-Sterile4mmMillex(注冊商標)HV注射器驅(qū)動的過濾裝置(syringeDrivenFilterUnit)(450nm)(由MilliporeCorporation制造)程序表170分鐘程序時間(min)乙腈(％)00605065100701002.結果結果，從吸附前后的色譜圖的比較確認不管使用哪種溶液，吸附后的峰面積均減小，因此由SEQIDNOS:1-11所示的肽中的每一種對Si3N4基材均具有親和性。因此，其揭示了使用具有這些氨基酸序列的肽使得能夠增加靶蛋白的密度和活性，并且使得經(jīng)由這些肽固定化至氮化硅基材的靶蛋白獲得高度受控的取向。此外，確認峰面積的減小比率為50％及以上。色譜圖的比較也允許人們理解吸附前后峰面積的減小比率；即，可以確定減小比率越高，肽對氮化硅的親和性越高。從對氮化硅的親和性較高的角度來看，考慮峰面積的示例性減小比率為50％及以上，更優(yōu)選70％及以上，和再更優(yōu)選80％及以上。實施例4根據(jù)下面所述的程序檢驗每種肽對氮化硅基材的親和性。1.程序以如實施例1相同的程序制備與每種肽融合的GST，不同之處是使用由SEQIDNOS:6-8和10(具有由SEQIDNOS:17-19和21所示的核苷酸序列的多核苷酸)所示的多肽代替由SEQIDNOS:1和2所示的肽。在下面，V821表示由SEQIDNO:6所示的肽，TP14表示由SEQIDNO:7所示的肽，V829表示由SEQIDNO:8所示的肽，CT22表示由SEQIDNO:10所示的肽。另外，制備的與各種肽融合的GST分別表示為GST-V821，GST-TP14，GST-V829和GST-CT22。這些GST也通過將肽融合至GST的C-末端區(qū)來獲得。根據(jù)下面所述的程序評價制備的與每種肽融合的GST與Si3N4基材的吸附。不與任何肽融合的野生型GST(wt-GST)用作對照。首先，類似于上述的實施例1，使用與實施例1中相同的PBS以下列的方式制備GST溶液使得wt-GST或與每種肽融合的GST為100μg/mL(1cm3)。此時，制備具有不同離子強度水平的三種類型的GST溶液(離子強度:0.075，0.15和0.3)。將Si3N4基材(傳感器芯片)貼附于RIfS傳感器(MI-Affinity，由KonicaMinolta,Inc.制造)，并將PBS以100μL/min的流速注入以平衡流路的內(nèi)部。將100μL的每種GST溶液注入至傳感器芯片，并且監(jiān)測檢測到的波長偏移量的值(Δλ(nm))。當通過兩次或三次注射建立吸附平衡時獲得的波長偏移量的值作為吸附量的指標進行評價。2.結果結果顯示在圖3中。圖3示出至Si3N4基材的吸附密度。如從圖3很清楚的是，相對于wt-GST，對于GST-V821，GST-CT22，GST-TP14，和GST-V829中的任一個觀察到至Si3N4基材的吸附密度的顯著提高。這表明由SEQIDNOS:6-8和10所示的肽的引入使得GST容易和致密地固定化至Si3N4基材。因此，其揭示了SEQIDNOS:6-8和10所示的肽中的任一個對Si3N4基材具有良好的親和性并且可用于靶蛋白至Si3N4基材的固定化。另外，由于有可能將所述肽引入至GST的所需位置，并且對于獲得的肽-融合的GST觀察到吸附密度的提高，其揭示了，這些肽的使用使得可能保持靶蛋白的活性，和對靶蛋白取向的控制。而且，盡管在此沒有示出，但當將由SEQIDNOS:3-5,9和11所示的肽中的每一種引入至GST中時還觀察到了相同的趨勢。此外，圖3示出了pH7下的結果，但在pH9下進行的試驗中也觀察到相同的趨勢。實施例5使用與實施例4中不同的儀器根據(jù)下面所述的程序檢驗如上所述構建的GST-TP14，GST-V821，GST-V829和GST-CT22對Si3N4基材的親和性。1.程序以與實施例4中相同的方式使用PBS以下列的方式制備GST溶液使得wt-GST或與每種肽融合的GST為0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL，and100μg/mL(1cm3)。在本實施例中，也對具有每種濃度的GST溶液制備具有不同離子強度水平的溶液(離子強度:0.075，0.15和0.3)。將Si3N4基材(傳感器芯片)貼附于RIfS傳感器(Wacaris，由NisshaPrintingCo.,Ltd.制造)，并將PBS以100μL/min的流速注入以平衡流路的內(nèi)部。將100μL的每種GST溶液注入至傳感器芯片，并且監(jiān)測檢測到的波長偏移量的值(Δλ(nm))。當通過兩次或三次注射建立吸附平衡時獲得的波長偏移量的值作為吸附量的指標進行評價。2.結果結果顯示在圖4中。如從圖4很清楚的是，在本實施例中，不管使用何種肽-融合的GST，與wt-GST相比也觀察到吸附量的顯著提高。另外，盡管在此沒有示出，但當將由SEQIDNOS:3-5,9和11所示的肽中的每一種引入至GST中時也觀察到了相同的趨勢。實施例6除了檢驗肽-融合的GST的吸附密度以外，還檢驗形成固定化至Si3N4基材的肽-融合的GST的GST是否保持了原始的GST活性。1.程序1)以下面的方式使用PBS制備GST溶液使得wt-GST，GST-TP14，或GST-V821為100μg/mL(1cm3)，并且2mL每種GST溶液與2g(表面積:31.2cm2，面積/體積:31.2cm-1)Si3N4基材接觸并在25℃孵育2小時。2)收集每種上清液，并通過DC蛋白測定法測定每種上清液中的GST濃度。3)基于吸附前后的GST濃度差計算吸附量，并且通過將吸附量除以接觸面積(31.2cm2)計算吸附密度。4)下一步，將Si3N4基材用PBS洗滌三次，用0.1-M磷酸鉀水溶液(pH6.5)洗滌一次，并且通過吸液器將溶液完全移除。5)加入3mL含有1mMCDNB和1mMGSH的0.1M磷酸鉀水溶液，在25℃和以300rpm攪拌，利用示蹤分光光度計NanoDrop(由ThermoFisherScientificInc.制造)每30秒測量在340nm處的吸光度改變，并計算吸光度變化(min-1·cm-1)。基于產(chǎn)物CDNB-GSH的摩爾吸光系數(shù)ε＝9.6mM-1·cm-1計算在1分鐘內(nèi)形成的產(chǎn)物的量，并定義為酶活性。1U是在1分鐘內(nèi)制備1μmolCDNB-GSH所需的酶量。6)將檢測到的酶活性除以Si3N4基材的面積以計算每單位面積的酶活性mU/cm-2。2.結果結果顯示在圖5中。如從結果中很清楚的是，GST被致密地固定化至Si3N4基材，并且形成肽-融合的GST的GST甚至在肽-融合的GST被固定化至Si3N4基材后仍保持了原始的GST活性。這證實將靶蛋白與具有對Si3N4的親和性的肽連接允許靶蛋白致密地固定化至Si3N4基材上，并且還允許靶蛋白甚至在靶蛋白被固定化后仍表現(xiàn)出高活性。盡管在此沒有示出，但當將由SEQIDNOS:3-5，和9-11所示的肽中的每一種引入至GST中時也觀察到了相同的趨勢。實施例7根據(jù)下面所述的程序研究由SEQIDNOS:23-35所示的肽中的每一種是否存在對Si3N4基材的親和性。1.程序1)10.5g(近似表面積:164.02cm2)的與實施例1中相同的Si3N4基材與含有由SEQIDNOS:23-35所示的肽的每種PBS溶液混合，并且每種溶液在25℃和200rpm振蕩2小時。2)每種溶液的一部分上清液通過HPLC分析，并且每種溶液的剩余部分進一步與Si3N4基材混合。此時，基材量/1mL被設定為1.5g。3)步驟2)總計重復6次。4)確定在吸附后表現(xiàn)出顯著減小的峰面積的肽具有對Si3N4基材的親和性；因此，比較吸附前后的色譜圖。在上述步驟2)中，以與實施例3中相同的方式進行HPLC分析以從柱洗脫所述肽。之后，比較吸附前后的色譜圖。2.結果結果，從吸附前后的色譜圖的比較確認不管使用哪種溶液，吸附后的峰面積均減小，并且因此由SEQIDNOS:23-35所示的肽中的每一種對Si3N4基材均具有親和性。因此，其揭示了使用具有這些氨基酸序列的肽使得能夠增加靶蛋白的密度和活性，并且使得經(jīng)由這些肽固定化至氮化硅基材的靶蛋白獲得高度受控的取向。此外，確認峰面積的減小比率為50％及以上。實施例8根據(jù)下面所述的程序檢驗由SEQIDNOS:23，24和26所示的肽中的每一種對Si3N4基材的親和性。1.程序異檸檬酸脫氫酶(ISD)表達載體的構建以與實施例1中相同的方式收集和純化ISD表達載體，不同之處是使用異檸檬酸脫氫酶(ISD)基因代替ELN基因。GST表達載體pGEX-3X的構建在本實施例中，使用與實施例1中純化的載體相同的載體進行下面的試驗。與肽融合的GST的制備和肽-融合的GST與Si3N4基材的吸附以與實施例5中相同的程序制備與每種肽融合的GST，不同之處在使用由SEQIDNOS:23，24和26所示的肽代替由SEQIDNOS:6-8和10所示的肽。在下面，SIN3表示由SEQIDNO:23所示的肽，SIN4表示由SEQIDNO:24所示的肽，TP4表示由SEQIDNO:26所示的肽。制備的與各種肽融合的GST分別表示為GST-SIN3，GST-SIN4和GST-TP4。制備的與每種肽融合的GST與Si3N4基材的吸附量采用與實施例5中相同的程序使用其上貼附有Si3N4基材(傳感器芯片)的RIfS傳感器(Wacaris，由NisshaPrintingCo.,Ltd.制造)評價。使用沒有融合任何肽的野生型GST(wt-GST)作為對照。對于wt-GST，GST濃度設定為100ug/mL，對于每種肽-融合的GST設定為50ug/mL。2.結果結果顯示在圖6中，如從圖6中很清楚的是，對于GST-SIN3，GST-SIN4和GST-TP4的任一肽-融合的GST，與wt-GST相比觀察到至Si3N4基材的吸附密度的提高。特別地，盡管wt-GST的濃度為GST-SIN3，GST-SIN4和GST-TP4中每一種的兩倍，但對于GST-SIN3，GST-SIN4和GST-TP4觀察到吸附量的顯著提高。此結果表明由SEQIDNOS:23，24和26中任一個所示的肽的引入也使得GST容易和致密地固定化至Si3N4基材。因此，其揭示了由SEQIDNOS:23，24和26所示的肽對Si3N4基材具有良好的親和性并且可用于靶蛋白至Si3N4基材的固定化。另外，由于有可能將這些肽中的每一種引入至GST的所需位置并且如上所述對于獲得的肽-融合的GST觀察到吸附密度的提高，其揭示了，所述肽也能夠保持靶蛋白活性和對靶蛋白的取向控制。此外，對于與由SEQIDNOS:25和27-35所示的肽中的每一種融合的GST也觀察到相同的趨勢。