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      一種山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制備方法與流程

      文檔序號(hào):11995710閱讀:331來源:國(guó)知局
      一種山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制備方法與流程
      本發(fā)明屬于生物活性肽技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種抗菌肽及其制備,特別涉及一種山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制備方法。

      背景技術(shù):
      生物活性肽是由氨基酸通過肽鍵相連的、具有調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能和為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)的肽類化合物?;钚噪牡恼{(diào)節(jié)功能涉及激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖等各個(gè)領(lǐng)域。全世界的科學(xué)工作者已經(jīng)從不同的動(dòng)植物個(gè)體以及微生物中分離鑒定出了2000多種活性肽。由于抗生素的大量使用,耐藥菌株和多重耐藥菌株的不斷增加,使抗感染治療成為一個(gè)棘手難題。近三十多年來,新型合成抗生素藥物研究進(jìn)展緩慢,抗菌肽正是在這種形勢(shì)下出現(xiàn)的一類具有發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬???咕挠纸锌刮⑸镫幕蛱烊豢股兀话闶怯?0~50個(gè)氨基酸組成的一類小分子肽類物質(zhì)。它廣泛存在于生物體內(nèi),包括細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物等。天然的抗菌肽是一類由基因編碼或者經(jīng)大分子蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小分子多肽,具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒等活性??咕某哂袕V譜抗微生物活性外,還具有耐高溫、熱穩(wěn)定好的特性,并對(duì)細(xì)菌毒素具有中和作用,其作用機(jī)制獨(dú)特,不易產(chǎn)生耐藥性,這將為解決細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗菌藥物日益增強(qiáng)的耐藥性這一棘手難題提供新途徑,有望給臨床醫(yī)藥學(xué)、食品和化妝品加工、動(dòng)物和植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)等領(lǐng)域帶來廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景,尤其在食品保鮮方面,可以作為綠色食品保鮮劑使用,對(duì)降低合成防腐劑的副作用方面具有重要價(jià)值。乳是新生哺乳動(dòng)物的主要食物來源,酪蛋白是牛乳中的主要蛋白質(zhì),約占牛奶中蛋白質(zhì)總量的80%,在酶解過程中可以產(chǎn)生促進(jìn)礦質(zhì)元素吸收、抗菌和抗氧化等多種活性肽。牛乳的抗菌特性最初由Jones和Simms于1930年發(fā)現(xiàn),他們鑒定了一種能夠抑制鏈球菌生長(zhǎng)的物質(zhì)命名為乳烴素(lactenin);Hill等(1974)通過凝乳酶水解牛αs1-酪蛋白,得到了第一個(gè)從牛αs1-酪蛋白分離出來的抗菌肽Isracidin;國(guó)內(nèi)胡志和等(2003)、翟青新等(2006)均用胰蛋白酶酶解酪蛋白制備抗菌肽,對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好抑菌作用;Birkemo等(2009)從牛初乳中分離并鑒定出三種抗菌肽。山羊奶是北方僅次于牛奶的第二大奶源,山羊乳酪蛋白與牛乳的酪蛋白具有一定的同源性,但在酪蛋白質(zhì)的構(gòu)成、同一組分蛋白的氨基酸序列等方面存在很大的差異,以山羊乳酪蛋白為原料同樣能獲得多種活性肽,如抗氧化肽和抗菌肽。根據(jù)申請(qǐng)人所進(jìn)行的資料檢索,已授權(quán)的中國(guó)專利申請(qǐng)基本都屬于乳鐵蛋白抗菌肽,例如,乳鐵蛋白抗菌肽及其制備方法與它們的用途(專利號(hào):ZL200810110996.6),一種酶法制備乳鐵蛋白抗菌肽的方法(專利號(hào):ZL200710190609.X)和一種牛乳鐵蛋白工程菌及抗菌肽牛乳鐵蛋白素的制備方法(ZL200610166536.6)等,因?yàn)槿殍F蛋白本身就有抗菌作用,經(jīng)過酶水解后只是提高了乳鐵蛋白的抗菌作用和利用穩(wěn)定性。乳酪蛋白抗菌肽也有報(bào)道,中國(guó)專利(專利號(hào):ZL201010104660.6)公開一種牛乳源抗菌肽的制備方法,選用胃蛋白酶水解乳酪蛋白,所得抗菌肽的分子量在7000-140000之間。由于分子量為140000的抗菌“肽”就根本不能稱為“肽”,而實(shí)質(zhì)上還是蛋白質(zhì)。中國(guó)專利申請(qǐng)(公開號(hào):CN201210218734.8)公開一種乳酪蛋白抗菌肽的制備方法,該方法選用胰蛋白酶水解酪蛋白,所得抗菌肽的分子量在3000-10000之間,從文獻(xiàn)公開的內(nèi)容,尚不清楚其抗菌肽的一二級(jí)結(jié)構(gòu)。

      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
      針對(duì)一般抗菌素的耐藥性及合成防腐劑存在的副作用,以及目前乳源抗菌肽存在的缺陷,本發(fā)明的目的在于,提供一種來源于山羊乳酪蛋白抗菌肽的制備方法,采用木瓜蛋白酶將山羊乳酪蛋白酶解,酶解物經(jīng)過大孔非極性樹脂分離及脫鹽,再經(jīng)過半制備凝膠色譜儀純化,冷凍干燥,即加工成山羊乳酪蛋白源抗菌肽粉,其分子量均在3000以下。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù),本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案:一種山羊乳酪蛋白抗菌肽的制備方法,其特征在于,具體按下列步驟進(jìn)行:1)酪蛋白的提取山羊乳酪蛋白的提取是將鮮山羊乳離心脫脂后,利用等電點(diǎn)沉淀法將酪蛋白提取出來。2)酪蛋白酶解物的制備酪蛋白酶解液的制備是用木瓜蛋白酶在規(guī)定的底物濃度、pH、溫度和加酶量條件下水解規(guī)定時(shí)間后,滅酶,冷卻,離心,上清液真空濃縮后得酶解濃縮液。3)抗菌肽脫鹽及分離純化將步驟2)獲得的山羊乳酪蛋白酶解濃縮液,先通過大孔吸附樹脂層析柱脫鹽、再用乙醇梯度洗脫,收集抑菌作用較高的乙醇洗脫液,真空濃縮,再過凝膠色譜柱和半制備型高效液相色譜進(jìn)行分離純化,冷凍干燥,即得山羊乳酪蛋白源抗菌肽粉。采用本方法得到的山羊乳酪蛋白源抗菌肽,經(jīng)申請(qǐng)人進(jìn)行的抗菌功能試驗(yàn),結(jié)果表明具有如下顯著的技術(shù)優(yōu)勢(shì):(1)山羊乳酪蛋白源抗菌肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等具有優(yōu)良的抗菌性能。(2)山羊乳酪蛋白源抗菌肽分子量均小于3000,易于吸收利用。(3)山羊乳酪蛋白源抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲,屬于無毒天然的抗菌肽。(4)山羊乳酪蛋白源抗菌肽是兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的抗菌肽,在乳與乳制品、化妝品和其他食品保鮮方面具有極其廣闊應(yīng)用前景。附圖說明圖1是山羊乳酪蛋白源粗抗菌肽凝膠色譜圖;圖2是山羊乳酪蛋白源精制抗菌肽HPLC分離圖;圖3山羊乳酪蛋白源抗菌肽F3-1和F3-2一級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)譜圖,其中,圖(a)是F3-1一級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)譜圖,圖(b)是F3-2一級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)譜圖;圖4是山羊乳酪蛋白源抗菌肽F3-1和F3-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)框圖,其中,圖(a)是F3-1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)框圖,圖(b)是F3-2二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)框圖;圖5是山羊乳酪蛋白源抗菌肽F3-1和F3-2二級(jí)結(jié)構(gòu)圓二色譜驗(yàn)證圖;以下結(jié)合附圖和實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。具體實(shí)施方式本實(shí)施例給出一種山羊乳酪蛋白源抗菌肽的制備方法,包括酪蛋白的提取、酪蛋白酶解液的制備和抗菌肽的分離純化三部分。1)酪蛋白的提取取鮮山羊乳過濾除雜,低溫離心脫脂,用2mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)脫脂羊乳的pH值到4.3,水浴40℃靜置30min沉淀酪蛋白,4000r/min離心10min,棄去上清液,沉淀用pH值為4.3的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌2次,每次洗滌后4000r/min離心10min,所得沉淀物即為酪蛋白粗品。2)酪蛋白酶解物的制備稱取適量的山羊乳酪蛋白粗品置于酶解罐中,用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液助溶,用去離子水定容至規(guī)定體積,得到30g/kg~120g/kg(優(yōu)化為60g/kg~100g/kg)的山羊乳酪蛋白溶液,調(diào)節(jié)pH值至5.0~7.0(優(yōu)化5.5~6.5),95℃加熱5min,冷卻到50℃~70℃,準(zhǔn)確加入3000U/g~7000U/g(優(yōu)化4000U/g~6000U/g)的木瓜蛋白酶,水解過程中流加2mol/L的NaOH溶液,使pH值保持恒定,酶解0.5h~4.0h后(優(yōu)化1.0h~2.0h),95℃滅酶10min,冷卻到室溫,10000×g離心15min,取上清液在45~50℃,0.09MPa下濃縮,得山羊乳酪蛋白酶解濃縮物(即粗抗菌肽)。3)抗菌肽脫鹽及分離純化對(duì)大孔吸附樹脂LS-106等進(jìn)行預(yù)處理后,將一定量的樹脂用無水乙醇浸泡24h,然后用無水乙醇將樹脂洗至220nm處無吸收峰,再用去離子水洗去乙醇并濕法裝層析柱。將步驟2)獲得的山羊乳酪蛋白酶解濃縮物(粗抗菌肽),先后通過大孔吸附樹脂層析柱、凝膠色譜和半制備型高效液相色譜進(jìn)行分離純化。所述大孔吸附樹脂可以是LS-106等比表面積較大的極性大孔吸附樹脂。將粗抗菌肽以0.5~1BV/h的流速,通過LS-106大孔吸附樹脂層析柱,再用一定量的去離子水洗脫層析柱,當(dāng)水洗脫液的電導(dǎo)率和純水基本一致時(shí),脫鹽結(jié)束,然后用乙醇進(jìn)行梯度洗脫。所述乙醇濃度的體積分?jǐn)?shù)為40%、60%和80%(以下百分?jǐn)?shù)均為體積分?jǐn)?shù)),流速為1.5~2BV/h,收集60%的乙醇洗脫液,真空濃縮,再過凝膠色譜柱。所述凝膠色譜的色譜柱為SephadexG-75等,流動(dòng)相為50mmol/L(pH6.0)醋酸-醋酸銨溶液,流速0.8mL/min,進(jìn)樣量500μL,收集左數(shù)第3個(gè)峰即峰3(圖1),濃縮后即為精制抗菌肽。精制抗菌肽可以用半制備型高效液相色譜儀進(jìn)一步純化。所述半制備型高效液相色譜儀,采用C18柱,流動(dòng)相A相為含0.1%三氟乙酸(TFA)的超純水,B相為含0.1%TFA的乙腈,流速0.8mL/min,柱溫30℃,洗脫程序:0~2min:A相100%~90%,B相0~10%;2~50min:A相90%~0,B相10%~100%;50~65min:A相0,B相濃度為100%;65~70min:A相0~100%,B相100%~0。總洗脫時(shí)間為70min,收集其中的兩個(gè)主峰,分別稱為F3-1和F3-2(圖2),經(jīng)過檢測(cè)F3-1和F3-2為單一峰,冷凍干燥即得純山羊乳酪蛋白抗菌肽粉。F3-1峰和F3-2峰經(jīng)過納升電噴霧串聯(lián)氣質(zhì)聯(lián)用儀鑒定,所獲得的山羊乳酪蛋白源抗菌肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)分別為:Arg-Val-Asp-Thr-Asn-Pro-Asp-Pro-Glu-Gln-Val-Gly-Gly-Leu(1497.76)和Pro-Asn-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Leu(1101.62),分子量均在3000以下。采用Netsurfp1.1軟件預(yù)測(cè)并經(jīng)圓二色譜鑒定,所得山羊乳酪蛋白源抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲,為無毒性的綠色天然抗菌肽。以下是發(fā)明人給出的具體實(shí)施例,但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例,在實(shí)施例中,以下參考文獻(xiàn)被引用?!?】JonesFS,SimmsHS.Thebacterialgrowthinhibitor(lactenin)ofmilk【J】.TheJounalofExperimentalMedicine,1930,51(2):327–339.【2】HillRD,LahovE,GivolD.Arennin-sensitivebondinalphaandbetacasein[J].JournalofDairyResearch,1974,41(2):147-153.【3】胡志和,龐廣昌,陳慶森,等.不同條件下水解酪蛋白所得到的抗菌肽抑菌效果比較[J].食品科學(xué),2003,24(2):130-133.【4】翟青新,張?jiān)词?哈惠馨.乳源抗菌肽的分離純化及部分性質(zhì)的研究[J].藥物生物技術(shù).2006,13(06),422-425.實(shí)施例1:(1)取鮮山羊乳過濾除雜,4℃,5000r/min離心20min脫去乳脂肪,用2mol/LHCl溶液調(diào)節(jié)脫脂山羊乳的pH值到4.3,水浴40℃靜置30min沉淀酪蛋白,4000r/min離心10min,棄去上清液,沉淀用pH4.3的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌2次,每次洗滌后4000r/min離心10min,所得沉淀物即為粗酪蛋白,凱氏定氮法測(cè)定粗酪蛋白的蛋白質(zhì)含量。(2)稱取一定量的山羊乳粗酪蛋白置于酶解罐中,用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液助溶,用去離子水定容至規(guī)定體積,得到80g/kg的山羊乳酪蛋白溶液,調(diào)節(jié)pH值至6.0,95℃加熱5min,冷卻到60℃,準(zhǔn)確加入5000U/g的木瓜蛋白酶,水解過程中流加2mol/L的NaOH溶液,使pH值保持在6.0±0.1,60℃酶解1.5h后,95℃滅酶10min,冷卻到室溫,10000×g離心15min,取上清液在45~50℃,0.09MPa下濃縮到原來體積的1/3。(3)將(2)獲得的山羊乳酪蛋白酶解濃縮物,通過LS-106大孔吸附樹脂層析柱,再用一定量的去離子水洗脫層析柱,當(dāng)水洗脫液的電導(dǎo)率和純水基本一致時(shí),脫鹽結(jié)束,然后用40%、60%和80%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫,收集60%的乙醇洗脫液,真空濃縮,再過凝膠色譜柱純化。凝膠色譜柱選SephadexG-75,流動(dòng)相為50mmol/L(pH6.0)醋酸-醋酸銨溶液,流速0.8mL/min,進(jìn)樣量500μL,收集左數(shù)第3個(gè)峰即峰3(圖2),真空濃縮后冷凍干燥即為精制抗菌肽。精制抗菌肽可以通過制備型高效液相色譜再純化得到純抗菌肽。實(shí)施例2:1)取鮮山羊乳過濾除雜,低溫離心脫脂,用2mol/LHCl溶液調(diào)節(jié)脫脂山羊乳的pH值到4.3,水浴40℃靜置30min沉淀酪蛋白,4000r/min離心10min,棄去上清液,沉淀用pH4.3的醋酸-醋酸鈉緩沖液洗滌2次,每次洗滌后4000r/min離心10min,所得沉淀物即為山羊乳粗酪蛋白。(2)稱取取一定量的山羊乳粗酪蛋白置于酶解罐中,用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液助溶,用去離子水定容至規(guī)定體積,得到70g/kg的山羊乳酪蛋白溶液,調(diào)節(jié)pH值至6.0,95℃加熱5min,冷卻到60℃,準(zhǔn)確加入6000U/g的木瓜蛋白酶,水解過程中流加2mol/L的NaOH溶液,使pH值保持在6.0±0.1,60℃酶解80min后,95℃滅酶10min,冷卻到室溫,10000×g離心15min,取上清液真空濃縮即得粗抗菌肽。(3)脫鹽及分離純化同實(shí)施例1得到精制抗菌肽和純抗菌肽粉。上述實(shí)施例中所用的木瓜蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白是根據(jù)發(fā)明人多次科學(xué)試驗(yàn)為依據(jù)而制定的,只要在本申請(qǐng)的技術(shù)方案給出的范圍內(nèi),均可以達(dá)到本發(fā)明的目的。酶解山羊乳酪蛋白制備抗菌肽,制備工藝比較簡(jiǎn)單,粗抗菌肽和精制抗菌肽易于規(guī)?;a(chǎn),在乳與乳制品、化妝品、其他食品貯藏保鮮、醫(yī)藥領(lǐng)域都有極大的發(fā)展前景。以下是發(fā)明人所做的羊乳酪蛋白抗菌肽分離純化試驗(yàn)及抗菌功能試驗(yàn)。試驗(yàn)1:大孔吸附樹脂分離山羊乳酪蛋白酶解物山羊乳酪蛋白酶解物,通過LS-106大孔吸附樹脂,各乙醇洗脫組分的抑菌效果見表1。表1表明60%乙醇洗脫液對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果遠(yuǎn)強(qiáng)于其他組分,收集60%乙醇洗脫液真空濃縮(得粗抗菌肽)做凝膠色譜分離。表1:山羊乳酪蛋白酶解物乙醇洗脫組分抑菌效果(n=3)注:青霉素鈉的濃度是1280μg/mL;瓊脂孔直徑為8.0mm;“-”表示沒有抑菌圈。試驗(yàn)2:凝膠色譜分離純化山羊乳酪蛋白源粗抗菌肽粗抗菌肽經(jīng)過凝膠色譜分離,基本得到三個(gè)色譜峰(圖1),其中峰1、峰2和峰3所占的比例分別為49.9%、18.24%和19.22%。分別收集這三個(gè)色譜峰,真空濃縮后做抑菌試驗(yàn),結(jié)果見表2。表2:山羊乳酪蛋白源粗抗菌肽凝膠色譜各洗脫峰的抑菌效果(n=3)注:青霉素鈉的濃度是1280μg/mL;瓊脂孔直徑為8.0mm;“-”表示沒有抑菌圈。由表2可知,粗抗菌肽經(jīng)過凝膠色譜分離后的3個(gè)組分中,峰1和峰3的抑菌作用較強(qiáng),測(cè)定可知,峰1和峰3的多肽含量分別為5.662mg/mL和1.993mg/mL,說明峰3抑菌作用遠(yuǎn)強(qiáng)于峰1,因此將峰3真空濃縮后(精制抗菌肽)用高效液相色譜實(shí)施進(jìn)一步分離,主要得到峰F3-1和F3-2兩個(gè)峰(圖2),收集峰F3-1和F3-2。峰F3-1和F3-2再經(jīng)過一次分離后檢測(cè)為單一峰,其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)見表4。經(jīng)納升電噴霧串聯(lián)氣質(zhì)聯(lián)用儀鑒定,峰F3-1和F3-2的一級(jí)結(jié)構(gòu)分別為Arg-Val-Asp-Thr-Asn-Pro-Asp-Pro-Glu-Gln-Val-Gly-Gly-Leu(1497.76)和Pro-Asn-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Leu(1101.62),分子量均在3000以下(圖3)。表4:山羊乳酪蛋白源抗菌肽F3-1和F3-2的MIC和MBC(n=3)注:青霉素鈉對(duì)三種菌的MIC均為10μg/mL,MBC均為160μg/mL。采用Netsurfp1.1軟件預(yù)測(cè)并經(jīng)圓二色譜鑒定,所得抗菌肽F3-1和F3-2二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件為無規(guī)則卷曲(圖4和圖5)。以α-螺旋為主要二級(jí)結(jié)構(gòu)的抗菌肽的抗菌活性較高,但其導(dǎo)致溶血的副作用也較高。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲的抗菌肽雖然抗菌作用稍弱,但卻沒有溶血副作用,因此,本試驗(yàn)獲得的山羊乳酪蛋白源抗菌肽是綠色天然的抗菌肽,在食品、藥品和化妝品等方面前景廣闊。
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