本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種鈣鍶/明膠仿生涂層修飾人工韌帶的制備方法。

背景技術(shù)：
聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韌帶作為膝關(guān)節(jié)交叉韌帶損傷重建的移植物，已在臨床上得到廣泛應用，其中短期療效及安全性較為滿意，但是仍存在腱骨愈合不佳和并發(fā)滑膜炎等問題。因此，提高PET材料的生物相容性，促進人工韌帶骨道部腱骨愈合尤為重要。對PET人工韌帶移植物表面進行涂層(surfacecoating)處理，以增進生物材料的親水性、生物相容性及骨傳導性已成為骨科生物材料的發(fā)展重點。合理利用多種成分復合構(gòu)建生物醫(yī)用材料，將大分子蛋白質(zhì)或酶等有機高分子物質(zhì)以及HAp或Ca-P物等無機材料同時引入材料表面，使復合涂層材料兼?zhèn)鋬烧叩膬?yōu)勢，已經(jīng)成為骨科領(lǐng)域促進植入物與宿主骨愈合的理想涂層方法。既往有應用固定劑交聯(lián)固定和去抗原處理過的動物韌帶或肌腱所形成的基材制備生物性的人工韌帶(如專利號CN1903144A)，也有應用臭氧化作用表面接枝法使得PET材料表面直接形成自由基，改性后的聚對苯二甲酸乙二醇酯生物相容性好(如專利號CN103289020A)，但此改性修飾的PET人工韌帶僅僅改良了PET材料表面的親水性，而對于對于成骨細胞的黏附、增殖和分化作用有限。這樣的表面修飾并不能滿足臨床日益增高的需要。鍶元素是人體骨中必需元素之一，在人體內(nèi)99％蓄積于骨骼，在骨中的含量約占骨重量的0.01％。目前研究表明，少量增加的鍶離子濃度可以顯著促進成骨細胞的生長復制，刺激新骨形成；并抑制破骨細胞活性，減少新形成骨的再吸收。羥基磷灰石具有很強的活性，其中的鈣易于被其他元素替代，用鍶替代鈣可以得到摻鍶羥基磷灰石。鍶的加入可以增加羥基磷灰石的機械性能；鍶的加入可引起晶格畸變，提高羥基磷灰石的降解性能，由于鍶本身就是人體重要的微量元素，加入鍶可以增加了生物相容性和安全性。研究發(fā)現(xiàn)，植入物中含有和/或釋放鍶離子的表面氧化物層則可誘導成骨細胞中的堿性磷酸酶的生成增加，其對于進一步的分化和礦化至關(guān)重要。目前一些研究表明通過應用明膠溶液復合羥基磷灰石(HAP)人工涂覆方法對PET人工韌帶材料表面進行涂層，可良好的改變PET材料人工韌帶的性能。但研究結(jié)果也顯示人工直接涂覆法存在涂層不均勻、缺乏穩(wěn)定性、實驗結(jié)果可重復性較差以及成骨分化速率不高等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的存在缺陷，提供一種鈣鍶/明膠仿生涂層修飾人工韌帶的制備方法。通過利用仿生礦化的方法，在人工韌帶表面以明膠作為礦化模板，形成礦化結(jié)構(gòu)均勻且性能穩(wěn)定的HAP(羥基磷石灰)摻合鍶復合涂層，實現(xiàn)對人工韌帶的表面改性，促進人工韌帶在膝關(guān)節(jié)交叉韌帶重建中的腱骨愈合。本發(fā)明方法操作簡單，條件溫和，成本低且環(huán)境友好，仿生礦化涂層修飾后的人工韌帶穩(wěn)定性和生物相容明顯改善，是一種對目前人工韌帶技術(shù)改進的簡單方法，擁有巨大的市場應用價值。本發(fā)明采用明膠誘導HAp摻雜鍶的礦化方法形成有機/無機雜化體的結(jié)構(gòu)和性能。這種技術(shù)模擬自然骨的生物礦化機制，將天然高分子或明膠作為基質(zhì)或模版沉積磷灰石無機鹽層，在材料表面進行復合涂層，使得人工韌帶載有納米級的鍶羥基磷灰石，從而改善材料的生物相容性及骨傳導性，使之在生物活性和力學性能方面滿足臨床醫(yī)學的要求。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：本發(fā)明涉及一種鈣鍶/明膠仿生涂層修飾人工韌帶的制備方法，所述方法包含如下步驟：第一步，配置明膠溶液：在50℃～60℃的溫度下，將明膠溶解于去離子水，配制成質(zhì)量濃度為2％～10％的明膠溶液；第二步，人工韌帶材料表面改性：對人工韌帶材料表面用等離子體處理，取出，投入嫁接劑溶液浸泡2～6h，最后純水清洗并真空干燥，得到表面改性的人工韌帶；第三步，在所述明膠溶液中加入鈣鹽和鍶鹽，攪拌使充分溶解，得到混合均勻的溶液；將表面改性的人工韌帶浸入所述溶液中,取出晾干，再浸泡于60mM～90mM磷酸鹽溶液中，在太陽光或模擬太陽光照射下20～60min，取出，吸干；所述鈣鹽和鍶鹽的摩爾比為2～4:1；第四步，重復第三步(即：將韌帶重新浸入上述第三步的含鈣鹽、鍶鹽的明膠溶液后，取出晾干，再浸泡于上述第三步的磷酸鹽溶液)，直至達到預設的礦化循環(huán)次數(shù)，得到所述鈣鍶/明膠仿生涂層修飾人工韌帶。即厚度在20nm～500nm之間的羥基磷灰石摻雜鍶復合明膠礦化涂層修飾的新型人工韌帶。優(yōu)選地，所述等離子體處理為：在本底真空5×10-2～8×10-2Pa、功率200～400W條件下，用H2或Ar等離子體對人工韌帶材料表面處理8～20min。優(yōu)選地，所述嫁接劑選自丙烯酸單體、聚乙二醇、肝素、胰島素和白蛋白中的一種或者幾種的混合物。優(yōu)選地，所述嫁接劑溶液的濃度為10mM～100mM。優(yōu)選地，所述磷酸鹽選自磷酸二氫鈉、磷酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸鉀、磷酸二氫銨、磷酸銨中的一種或幾種的混合物。優(yōu)選地，所述鍶鹽選自硝酸鍶、氯化鍶和二氯化鍶中的一種或幾種的混合物。優(yōu)選地，所述鈣鹽選自氯化鈣、硝酸鈣和碳酸鈣中的一種或幾種的混合物。優(yōu)選地，所述人工韌帶材料為PET人工韌帶材料。優(yōu)選地，所述礦化循環(huán)次數(shù)為20～30次，所預設的礦化循環(huán)次數(shù)以鈣鍶/明膠仿生涂層達到20nm～500nm時為止。優(yōu)選地，加入鍶鹽和鈣鹽后，溶液的pH調(diào)至7～8。本發(fā)明通過對PET移植物表面進行鍶/明膠仿生涂層(surfacecoating)處理，不僅能有效改善PET表面的親水性，也能進一步促進表面黏附成骨細胞的增殖和分化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：(1)仿生無機磷灰石層沉積于類似人體組織內(nèi)環(huán)境條件，其成分更接近于人體骨無機質(zhì)，從而提高材料的生物相容性和骨結(jié)合能力；(2)鍶離子可進一步改善人工韌帶的生物相容性、骨傳導性及良好力學性能，促進腱骨愈合；(3)明膠結(jié)構(gòu)單元為甘氨酸-脯氨酸和羥脯氨酸與賴氨(Gly-Pro-Hyp-Hyl)，為柔性兩性電解質(zhì)，利于細胞粘連；用明膠作為鈣磷鹽生長模板，可模擬生物礦化體系；(4)該工藝在低溫下進行，為共沉積蛋白質(zhì)等生物大分子提供了可能性；(5)該方法可使人工韌帶制備成較為均勻的仿生礦化納米涂層，可解決前期研究中通過在材料表面應用直接人工涂覆的方法而造成的涂層不均勻、穩(wěn)定性較差的問題，通過改性增加人工韌帶的組織相容性，增加腱骨愈合的幾率。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：圖1為掃描電鏡SEM觀測示意圖；其中，a為新鮮制備的涂層修飾PET人工韌帶的SEM圖，b為在人體模擬液浸泡14天后的涂層修飾PET人工韌帶的SEM圖；圖2為PET人工韌帶表面涂層修飾前后的接觸角對比示意圖；圖3為表面處理前后的PET人工韌帶與293T細胞共培養(yǎng)48小時后MTT檢測結(jié)果示意圖；圖4為未處理的PET人工韌帶和表面涂層修飾后的PET人工韌帶與骨髓間充質(zhì)細胞共同培養(yǎng)14天后堿式磷酸酶的活性示意圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。以下實施例中的原料均為現(xiàn)有常用原料，可以直接通過商家購買獲得。本發(fā)明以下實施例中沒有特別說明的操作，均可以采用現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)手段。實施例1在本底真空5×10-2Pa、功率200W條件下用H2等離子體對PET人工韌帶處理8min，后投入10mM丙烯酸單體嫁接溶液浸泡2h，最后純水清洗并真空干燥備用；將骨明膠顆粒2g加入到100ml去離子水中溶脹，而后加熱至55℃形成2wt.％的骨明膠溶液；然后將6ml40mM的CaCO3和6ml20mMSrNO3加入明膠溶液中，調(diào)節(jié)pH值到7，25℃下攪拌10min，得到混合均勻的溶液；將預處理后的人工韌帶浸泡于此混合液中，使游離的Ca和Sr離子和明膠與韌帶充分結(jié)合，將韌帶取出濾紙晾干，最后浸泡于500ml60mM新鮮制備的Na2HPO4溶液，在太陽光照射下20min，重復以上步驟20次，得到羥基磷灰石摻雜鍶復合明膠20nm～500nm之間的礦化涂層修飾的新型人工韌帶。通過利用掃描電鏡觀測涂層修飾的PET人工韌帶如下圖1.a，可以觀測到所制備的涂層均一，表面光滑。此外將所制備的材料靜置與人體模擬液14天后，所制備的涂層仍均有比較好的穩(wěn)定性，沒有出現(xiàn)崩解的現(xiàn)象(圖1.b)，說明所制備的涂層具有很好的均一性和穩(wěn)定性。同時，通過接觸角測試，發(fā)現(xiàn)PET材料表面由疏水轉(zhuǎn)為親水(圖2)。同時，將高壓濕熱滅菌的新型人工韌帶加入10mLMEM完全培養(yǎng)基，37℃浸提36h，離心取上清為原始材料浸提液。復蘇293T細胞，DMEM培養(yǎng)基生長至對數(shù)生長期，消化傳代，接種96孔板。24h后待細胞貼壁長好，加入原始材料浸提液，同時設置PET人工韌帶浸提液處理細胞作為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，MTT法測定細胞成活率。如圖3，也證實相較于未處理的PET人工韌帶，本發(fā)明所制備的涂層修飾人工韌帶具有更好的生物相容性(圖3)。進一步的細胞實驗，通過培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)(BMCS)細胞，DMEM培養(yǎng)基生長至對數(shù)生長期，消化傳代，24h后待細胞貼壁長好，加入原始材料浸提液，同時設置未表面處理PET人工韌帶浸提液處理細胞作為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)不同時間后，通過堿性磷酸酶(ALP)試劑盒測定細胞的ALP活性。如圖4，也表明堿式磷酸酶(ALP)在羥基磷灰石/鍶/明膠涂層修飾PET人工韌帶組中表達明顯高于未處理的PET人工韌帶組，說明所制備的涂層能有效促進骨髓間充質(zhì)細胞的成骨分化，有利于腱骨愈合。其他實施例中，相關(guān)實驗檢測結(jié)果類似，在此就不一一例舉。實施例2在本底真空8×10-2Pa、功率400W條件下用Ar等離子體對PET人工韌帶處理20min后投入100mM聚乙二醇單體嫁接溶液浸泡3h，最后純水清洗并真空干燥備用；將骨明膠顆粒10g加入到100ml去離子水中溶脹，而后加熱至50℃形成10％骨明膠溶液，然后將6ml120mM的CaCO3和6ml30mM二氯化鍶加入明膠溶液中，調(diào)節(jié)pH值到8，25攝氏度下攪拌20min，得到混合均勻的溶液；將預處理后的人工韌帶浸泡于此混合液中，攪拌反應45min。使游離的Ca和Sr離子和明膠與韌帶充分結(jié)合，將韌帶取出濾紙晾干，最后浸泡于600ml90mM新鮮制備的磷酸鈉溶液，在模擬太陽光照射下30min，重復以上步驟30次，得到羥基磷灰石摻雜鍶復合明膠20nm～500nm之間的礦化涂層修飾的新型人工韌帶。實施例3將骨明膠顆粒10g加入到200ml去離子水中溶脹，而后加熱至60℃形成5％骨明膠溶液，將6ml300mM的硝酸鈣和碳酸鈣混合液,以及6ml50mM硝酸鍶和氯化鍶的混合液加入5％明膠溶液中，調(diào)節(jié)pH值到7.4，25℃下攪拌30min，得到混合均勻的溶液；然后在本底真空7×10-2Pa、功率350W條件下用H2等離子體對PET人工韌帶處理15min后投入55mM肝素單體嫁接溶液浸泡6h，最后純水清洗并真空干燥；將預處理后的人工韌帶浸泡于此混和液中，攪拌反應50min，使游離的Ca和Sr離子和明膠與韌帶充分結(jié)合，將韌帶取出濾紙晾干，最后浸泡于250ml75mM新鮮制備的磷酸二氫鉀和磷酸鉀混合溶液，在模擬太陽光照射下60min，重復以上步驟25次，得到羥基磷灰石摻雜鍶復合明膠20nm～500nm之間的礦化涂層修飾的新型人工韌帶。實施例4在本底真空5×10-2Pa、功率285W條件下用H2等離子體對PET人工韌帶處理15min后投入30mM聚乙二醇和胰島素嫁接溶液浸泡2.3h，最后純水清洗并真空干燥備用。將骨明膠顆粒20g加入到200ml去離子水中溶脹，而后加熱至55℃形成10％骨明膠溶液，將6ml280mM的CaCl2和6ml75mM氯化鍶加入明膠溶液中，調(diào)節(jié)pH值到7.8，25℃下攪拌30min，得到混合均勻的溶液；然后將預處理后的人工韌帶浸泡于明膠液中，攪拌反應25min。使游離的Ca和Sr離子和明膠與韌帶充分結(jié)合，將韌帶取出濾紙晾干，最后浸泡于500ml90mM新鮮制備的磷酸銨溶液，在模擬太陽光照射下35min，重復以上步驟27次，得到羥基磷灰石摻雜鍶復合明膠20nm-500nm之間的礦化涂層修飾的新型人工韌帶。以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。