本發(fā)明涉及重組基因工程疫苗，具體地，本發(fā)明涉及一種用于預防動物和人類禽型H1N1流感的重組基因工程疫苗，更具體地，本發(fā)明所涉及的疫苗是一種用于預防動物和人類禽型H1N1流感的重組類禽型H1N1流感病毒滅活疫苗。

背景技術：
流感病毒是一種能廣泛感染禽類和哺乳動物的分節(jié)段的負鏈RNA構成的囊膜病毒。在全世界，流感常以零星暴發(fā)兼雜隨機的大流行的形式出現(xiàn)，在過去的幾十年里，各國家主要選擇利用的仍然是全病毒滅活苗，它主要刺激機體產(chǎn)生體液免疫抵抗相同亞型的血凝素表面糖蛋白。類禽型H1N1在我國豬群中流行廣泛，并且疫情仍在繼續(xù)擴大(YanChen,InfectGenetEvol.2013)。在2011年，我國江蘇省泗洪縣出現(xiàn)了人感染類禽型H1N1豬流感病毒事件，這也是我國第一次報道類禽型H1N1亞型豬流感感染人事件(HuanliangYang,Emerginfect2012)。A型流感病毒跨種傳播取決于病毒因適應性變異導致的宿主范圍變化、宿主自身的限制性因素和環(huán)境因素的變化。為了對應疫情的發(fā)展，本發(fā)明進行了自然重組疫苗株的研制。理想的疫苗株應具備與流行株良好的抗原匹配性，對雞胚無致病力及雞胚高滴度生長性等條件。然而，很難從自然界分離具備上述條件的毒株作為疫苗株。在國內，由于現(xiàn)地分離的野毒株雞胚適應性較差，致使現(xiàn)行國內的類禽型H1N1流感疫苗存在成本高、疫苗免疫期短等缺點。流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(簡稱PR8)是實驗室雞胚適應株，即該病毒可在雞胚內生長至很高滴度，這種雞胚適應性由病毒的6個內部基因決定。另外，當兩個流感病毒共同感染一個細胞或雞胚時，可發(fā)生基因互換，從而產(chǎn)生新的基因重組病毒。因此，通過遺傳重組方法，可將流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的6個內部基因和流行株的HA、NA基因的進行重組而獲得一個新的重組病毒，該重組病毒具有與HA和NA基因供體毒株一致的抗原性，同時還具有流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的雞胚高滴度生長特性。人工自然重組技術是一種簡單有效的構建2:6重組病毒疫苗株方法，流感病毒的基因組由8個分段的負鏈RNA片段組成，當2個病毒共同感染雞胚或細胞時，其基因組片段會發(fā)生互換，從而產(chǎn)生一些新的重組病毒(reassortant)，通過含有相應抗體陽性血清的處理，則能夠有效的篩選2:6重組病毒疫苗株。(HualanChen,Vaccine2003)。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題提供一種重組類禽型H1N1流感病毒滅活疫苗株及其制備方法。為了達到以上目的，本發(fā)明所采用的技術手段為：本發(fā)明發(fā)明人在江蘇類禽型H1N1感染人事件當?shù)胤蛛x得到一株豬流感病毒分離毒株，序列比對分析發(fā)現(xiàn)該毒株與感染人的毒株高度同源，將該分離得到的病毒株命名為A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)，簡稱SW/JS40(H1N1)。本發(fā)明利用人工重組方法，以H1N1亞型豬流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)為表面抗原血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因供體，以流感病毒A/PR/8/34(H1N1)為聚合酶PB2亞基，聚合酶PB1亞基，聚合酶PA亞基，核蛋白(NP)，基質蛋白(M)和非結構蛋白(NS)6個內部基因的供體，通過自然重組得到了1株重組的類禽型H1N1流感病毒滅活疫苗株，命名為A型流感病毒A/swine/Jiangsu/40/PR8(H1N1)(簡稱為JS40/PR8)，保藏在位于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在中國武漢的武漢大學，其保藏號為CCTCCNO：V201419，保藏時間為2014年6月19日。本發(fā)明選用流感病毒的可在雞胚內生長至很高滴度的實驗室雞胚適應株A/PR/8/34(H1N1)的6個內部基因作為骨架基因，并選用2011年分離得到的類禽型毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的HA和NA基因作為表面基因，利用自然重組方法，制備了重組病毒JS40/PR8，該重組毒株將可以作為類禽型H1N1流感的疫苗株。實驗證實，JS40/PR8與我國類禽型H1N1流感病毒流行株SW/JS40(H1N1)抗原性一致，將對類禽型H1N1流感病毒流行株SW/JS40(H1N1)產(chǎn)生良好的特異保護性。該病毒含有流感病毒雞胚高滴度適應株A/PR/8/34(H1N1)的6個內部基因，因此具有良好的雞胚適應性，病毒生長滴度與野毒相比，可提高8倍以上；以此為疫苗株生產(chǎn)疫苗，可大大降低疫苗生產(chǎn)成本，提高疫苗質量。因此，進一步的，本發(fā)明還提出了所述的重組的類禽型H1N1流感病毒滅活疫苗株在制備預防類禽型H1N1流感病毒所導致疾病的藥物中的應用。其中，優(yōu)選的，所述藥物用于預防動物或人的類禽型H1N1流感病毒感染。更進一步的，本發(fā)明還提出了一種構建所述的重組的類禽型H1N1流感病毒滅活疫苗株的方法，該方法包括：(1)用類禽型H1N1流感病毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和雞胚適應疫苗株A/PR/8/34(H1N1)共同接種雞胚尿囊腔或細胞進行自然重組；(2)用抗所述雞胚適應疫苗株A/PR/8/34(H1N1)的抗體篩選，除去表面基因來源于所述雞胚適應疫苗株A/PR/8/34(H1N1)的毒株；(3)將篩選得到的毒株在雞胚上進行3代有限克隆純化，利用Trizol強裂變劑法，提取病毒RNA，進行反轉錄，然后用設計的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)病毒的各8對特異性鑒別引物進行RT-PCR擴增，然后，對擴增產(chǎn)物進行核酸凝膠電泳，鑒定得到的重組病毒為HA和NA來自于類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)、6個內部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS來自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的重組病毒，即得。在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述的引物包括：只能擴增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)基因的8個特異性片段而不能擴增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的任何片段的類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的8對特異性鑒別引物，引物序列如下：以及只能擴增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8個特異性片段而不能擴增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的任何片段的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8對特異性鑒別引物，引物序列如下所示：綜上，實驗證明，本發(fā)明制備得到了一株優(yōu)良的可用于預防類禽型H1N1流感病毒所導致疾病的病毒株，本發(fā)明的為類禽型H1N1流感疫苗的進一步開發(fā)研究，奠定了堅實的基礎。附圖說明圖1A為以JS40和PR8毒株cDNA為模板，利用JS40毒株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物進行的擴增；其中第一至第八泳道為使用JS40毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物對JS40毒株cDNA的擴增；M為DNAMarker2000；第九至第十六泳道為使用JS40毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物對PR8毒株cDNA為模板的擴增；圖1B為以JS40和PR8毒株cDNA為模板，利用PR8毒株PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物進行的擴增；其中1～8泳道為使用PR8毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物對JS40毒株cDNA為模板的擴增；M為DNAMarker2000；9～16泳道為使用PR8毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物對PR8毒株cDNA為模板的擴增；圖2為JS40/PR8重組病毒的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的RT-PCR擴增；1～8泳道：重組病毒JS40/PR8利用JS40的8對特異性鑒別引物擴增的PCR產(chǎn)物；M：DNA分子質量標準；9～16泳道：重組病毒JS40/PR8利用PR8的8對特異性鑒別引物擴增的PCR產(chǎn)物；圖3為重組JS40/PR8病毒和野生型類禽型H1N1流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(簡稱JS40)在最佳培養(yǎng)溫度35℃測定的生長曲線；圖4為攻毒后各組小鼠的體重變化情況。序列說明：SEQIDNo.1：JS40/PR8HA基因；SEQIDNo.2：JS40/PR8NA基因；SEQIDNo.3：JS40/PR8PB2基因；SEQIDNo.4：JS40/PR8PB1基因；SEQIDNo.5：JS40/PR8PA基因；SEQIDNo.6：JS40/PR8NP基因；SEQIDNo.7：JS40/PR8M基因；SEQIDNo.8：JS40/PR8NS基因。具體實施方式下面結合具體實施例和附圖來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。實驗材料1.病毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(簡稱JS40)(記載在文獻：一株類禽型H1N1亞型豬流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)的建立，楊煥良等，《中國預防獸醫(yī)學報》，2013年02期)由本實驗室保存，A/PR/8/34(H1N1)(簡稱PR8)購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物流感中心。2.SPF雞胚及細胞9-11日齡的SPF雞胚購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF雞胚孵化室，MDCK細胞(狗腎細胞)購自中國科學院武漢病毒研究所。3.主要試劑DATP、dGTP、dCTP、dTTP和rTaqDNA聚合酶購于大連寶生物工程有限公司；RNA提取試劑TRIzol，鼠源反轉錄酶(MLV)試劑盒、DTT、RNaseOUT和DNA聚合酶購自Invitrogen公司；膠回收試劑盒與小量質粒提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；測序反應試劑盒(CEQTMDTCSQuickStartKit)購自BECKMAN公司；抗A/PR/8/34(H1N1)抗血清購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物流感中心。4.引物分析比較，設計合成能擴增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)基因的8個特異性片段而不能擴增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的任何片段的類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的16條鑒別引物，合成引物序列見表1。表1類禽型H1N1流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的8個特異性片段的鑒別引物序列另外，設計合成只能擴增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8個特異性片段而不能擴增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的任何片段的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)16條鑒別引物，合成引物序列見表2。表2流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8個特異性片段的鑒別引物序列實施例1：篩選、鑒定重組病毒方法的建立利用Trizol強裂變劑法，提取流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的RNA，進行反轉錄，然后用上述設計的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的片段特異性鑒別引物做PCR反應。根據(jù)流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的基因設計的片段特異性鑒別引物只能擴增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的8個特異性片段而不能擴增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)毒株的任何片段，根據(jù)類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的基因設計的片段特異性鑒別引物只能擴增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)毒株的8個特異性片段而不能擴增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的任何片段。這將證明篩選、鑒定重組病毒方法的建立。如圖1A所示，以類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的cDNA為模板，利用合成的流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的8對片段特異性引物擴增，只有A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的cDNA擴增出了8條特異性片段，而A/PR/8/34(H1N1)毒株cDNA沒有擴增出的任何片段。如圖1B所示，以類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的cDNA為模板，利用合成的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)8對片段特異性引物擴增，只有流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株cDNA擴增出了8條特異性片段，而流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)毒株cDNA沒有擴增出任何片段。由此證明已經(jīng)建立了篩選方法，這種系統(tǒng)可以鑒定所制備的重組病毒的8條基因分別是來源于流感病毒A/PR/8/34(H1N1)還是類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)。實施例2：重組類禽型H1N1流感病毒JS40/PR8的制備與鑒定1.共感染-使兩個病毒基因組發(fā)生重組：100μl的類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和50μl的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(簡稱PR8)混合加入850μlPBS中，共同接種10日齡的SPF雞胚尿囊腔進行自然重組。35℃培養(yǎng)24小時，收集尿囊液。2.抗體篩選-除去表面基因來源于流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的毒株：取50μl在上述特定的人工條件下收獲的尿囊液和600μl倍比(4倍)稀釋的抗A/PR/8/34(H1N1)抗血清混合，室溫作用30分鐘，再每個稀釋度接種三枚雞胚。接著，接種的雞胚在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，測定每個稀釋度接種的雞胚尿囊液的血凝價(參見實驗動物血凝抑制試驗國家標準(GB)(GB/T14926.54-2001))，收集并保留低稀釋度的A/PR/8/34(H1N1)抗血清處理后接種的雞胚有血凝價的尿囊液。然后，相同方法做第二次的抗血清處理，同樣收集并保留低稀釋度的A/PR/8/34(H1N1)抗血清處理后接種的雞胚有血凝價的尿囊液。3.稀釋純化-除去內部基因來源于H1N1流感病毒株的毒株：按照上述方法處理得到的病毒在雞胚上進行3代有限克隆純化，利用Trizol強裂變劑法，提取病毒RNA，進行反轉錄，然后用設計的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)病毒的各8對特異性鑒別引物(表1和2)進行RT-PCR擴增。然后，對擴增產(chǎn)物進行核酸凝膠電泳，鑒定得到的重組病毒為HA和NA來自于類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)、6個內部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS來自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的重組病毒(見圖2)，將獲得的重組病毒命名為A/swine/Jiangsu/40/PR8(H1N1)，簡稱JS40/PR8，保藏于位于中國武漢的武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCCNO：V201419。4.重組病毒的序列鑒定提取重組病毒JS40/PR8的RNA，RT-PCR分別擴增出重組病毒JS40/PR8的全基因組的8個片段，對PCR產(chǎn)物進行核酸凝膠電泳，膠回收后測定每一片段的特定序列。利用DNAStar軟件(DNAStarLasergeneV7.1)，對測定的序列與野生毒株類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的序列進行序列比較，發(fā)現(xiàn)重組病毒JS40/PR8的基因組均沒有任何核苷酸的變化，表明重組病毒的HA和NA來自于類禽型H1N1流感病毒國內分離A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)；6個內部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS來自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)。5.重組病毒JS40/PR8生長曲線的測定將親本病毒類禽型H1N1流感病毒流行株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(簡稱JS40)和重組病毒JS40/PR8接種5組SPF雞胚，在35℃條件下分別培養(yǎng)24、48、72和96小時，取上述培養(yǎng)不同時間的雞胚進行血凝測定，檢測親本毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和重組病毒JS40/PR8的生長曲線。從試驗結果可以看出重組病毒在35℃培養(yǎng)條件下，72小時時重組病毒的血凝效價遠高于野生毒株類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(如圖3所示)。制備流感疫苗株，不但要求其具有良好的免疫原性，而且要求在生產(chǎn)中具有良好的生長特性，從重組JS40/PR8病毒在35℃培養(yǎng)條件下測定的生長曲線可以看出，重組病毒生長滴度較親本類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)有明顯提高，血凝效價高出8倍(如圖3所示)。這說明本發(fā)明制備出了一株高生長滴度的重組病毒，將為以后的批量生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟利益。6.重組病毒JS40/PR8的抗原性分析根據(jù)親本毒株類禽型H1N1流感病毒國內分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)與重組病毒的抗原和血清進行交叉HI試驗(參見實驗動物血凝抑制試驗國家標準(GB)(GB/T14926.54-2001))的抗原性分析數(shù)據(jù)，從試驗結果可以看出抗原差異小于2倍，說明重組后，病毒依然保持著親本毒株的抗原性(參見表3)。表3：親本毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)與重組病毒JS40/PR8的抗原性分析7.重組病毒JS40/PR8的致病力試驗BALB/c小鼠經(jīng)常作為流感病毒致病性和宿主適應性的哺乳動物模型。為了解重組毒株的感染能力和致病性，本發(fā)明采用小鼠為動物模型，將重組毒株SW/JS/40/PR8和親本毒株SW/JS/40/2011分別以106TCID50劑量經(jīng)鼻腔接種小鼠，觀察小鼠存活、體內病毒復制及體重損失的情況。六周齡的SPF級雌性BALB/c小鼠(購自北京維通利華公司)，隨機分為三組，每組8只，稱量體重。所有小鼠分別經(jīng)CO2輕度麻醉后，第一組通過鼻腔接種50ul含有106TCID50的重組毒株SW/JS/40/PR8(JS40/PR8)的病毒液，第二組通過鼻腔接種50ul含有106TCID50的親本毒株SW/JS/40/2011(JS40/11)的病毒液，第三組接種50ulPBS作為對照組。感染病毒后每天稱量各組小鼠的單只體重，計算平均體重并觀察發(fā)病與存活情況，體重下降30％即實施安樂死。所有的小鼠均在擁有獨立通風系統(tǒng)的鼠籠里飼養(yǎng)。每組于攻毒后第3d，隨機抽取3只存活小鼠，經(jīng)CO2麻醉后剖殺，采集腦、鼻甲、脾臟、腎臟、肺臟，分別進行病毒含量的滴定；組織的病毒分離和鑒定收集的病料裝在滅菌EP管中，-70℃保存，取出用滅菌研磨器研磨，制成10％的DMEM組織懸液，離心后取上清液體在MDCK細胞上進行滴定，按照測定TCID50方法進行測定組織中病毒含量。小鼠每天稱量體重，至14d。結果表明所有組別小鼠均無死亡情況發(fā)生。在腦、脾、腎和鼻甲中均檢測不到病毒。在肺臟中重組毒株SW/JS/40/PR8病毒含量低于SW/JS/40/2011組(表4)，因病毒感染造成最大體重損失SW/JS/40/PR8為5％，低于SW/JS/40/2011組的10％(圖4)，表明重組毒株致病力低于親本毒株SW/JS/40/2011。表4兩組感染小鼠臟器病毒分離及致死情況結果8.重組病毒JS40/PR8的免疫原性實驗將含量為108EID50/mL的重組病毒JS40/PR8以0.1％甲醛滅活后，以賽比克公司提供的MONTANIDETMISA206佐劑制備疫苗，以10只6周齡的SPF級雌性BALB/c小鼠為模型動物，0.1ml肌肉注射免疫，免疫后14d檢測血清中HI抗體滴度，血清中HI抗體滴度在80-320之間，表明重組病毒JS40/PR8具有良好的免疫原性。參考文獻：1.YangH,QiaoC,TangX,ChenY,XinX,ChenH.Humaninfectionfromavian-likeinfluenzaA(H1N1)virusesinpigs,China.EmergInfectDis.2012Jul；18(7):1144-6.2.ChenY,ZhangJ,QiaoC,YangH,ZhangY,XinX,ChenH.Co-circulationofpandemic2009H1N1,classicalswineH1N1andavian-likeswineH1N1influenzavirusesinpigsinChina.InfectGenetEvol.2013,13:331-3382012Nov10.3.HualanChen，KantaSubbarao，DavidSwayne，QiChen，XiuhuaLu，JacquelineKatz，NancyCox，YumikoMatsuoka.Generationandevaluationofanhigh-growthreassortantH9N2influenzaAvirusasapandemicvaccinecandidate.Vaccine