本發(fā)明涉及一種利用栽培室制備冬蟲夏草菌種材料的方法。

背景技術(shù)：
冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis(Berk.)Sung，Sung，Hywel-Jones&Spatafora是一種蟲生子囊真菌，寄生于鱗翅目Lepidoptera蝠蛾科Hepialidae鉤蝠蛾屬Thitarodes昆蟲的幼蟲，其無性型為中國被毛孢HirsutellasinensisLiu，Guo，Yu&Zeng。冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾屬Thitarodes昆蟲的一個世代包括卵、幼蟲、蛹和成蟲四個發(fā)育階段，幼蟲營地下隧道式穴居生活，雜食性，喜食圓穗蓼、頭花蓼、小大黃和珠芽蓼等高寒植物的幼嫩根莖。冬蟲夏草分布于青藏高原高海拔區(qū)域，其生長范圍局限，產(chǎn)量也極為有限。它是青藏高原特色名貴滋補中藥材，具有重要的藥用和經(jīng)濟價值。由于冬蟲夏草的形成過程中仍有許多關(guān)鍵問題尚不清楚，冬蟲夏草菌侵染鉤蝠蛾昆蟲的侵染活性較弱，原生態(tài)冬蟲夏草道地藥材的產(chǎn)業(yè)化迄今仍存在許多障礙難題。冬蟲夏草寄主昆蟲的飼料高寒植物生長在青藏高原，其具有生長速度慢，繁殖系數(shù)不高等特點，在栽培室內(nèi)利用離體組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)可以解決高寒植物苗的來源問題，該技術(shù)是生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛、產(chǎn)生較大經(jīng)濟效益的一項技術(shù)，其特點是繁殖速度快、系數(shù)大，周年生產(chǎn)、生長整齊，利用這項技術(shù)可以使一個單株一年繁殖幾萬到幾百萬個植株。目前采用常規(guī)冬蟲夏草菌侵染寄主鉤蝠蛾昆蟲幼蟲仍存在侵染率低、耗費時間長等問題。中國發(fā)明專利申請(公開號：CN102696555A)公開了一種半野生人工培殖冬蟲夏草的方法，中國發(fā)明專利申請(公開號：CN102405763A)公開了一種冬蟲夏草的培育方法，上述2個專利申請均采用含有中國被毛孢的菌液連續(xù)噴灑寄主幼蟲體表的方法進(jìn)行接種侵染；中國發(fā)明專利申請(公開號：CN102696392A)公開了天然冬蟲夏草的增產(chǎn)方法，其中采用誘集液誘集蝙蝠蛾幼蟲后，向幼蟲噴灑蝙蝠蛾被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉兩種菌種液體種；中國發(fā)明專利申請(公開號：CN102106235A)公開了一種全人工培養(yǎng)冬蟲夏草的方法，其中采用一端直徑小于0.2mm的不銹鋼實心針或空心針的針狀器具，沾取中國被毛孢菌體和孢子混懸液刺傷寄主幼蟲的方法進(jìn)行接種侵染；中國發(fā)明專利申請(公開號：CN102792855A)公開了一種用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料及寄主感染方法，采用冬蟲夏草菌皮作為菌種材料灌注、或拌入飼料喂食、或注射、或噴淋侵染寄主幼蟲。但上述方法存在侵染活性低、或損傷后存活率低、或耗費時間過長、或菌種材料產(chǎn)量有限等問題，是制約原生態(tài)冬蟲夏草道地藥材產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種利用栽培室制備冬蟲夏草菌種材料的方法。該方法利用自動化或手動控制氣候條件的高寒植物組培苗栽培室，通過構(gòu)建冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢與活體高寒植物組培苗組織的共生體，激活中國被毛孢的侵染活性，得到對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料，達(dá)到高效侵染寄主鉤蝠蛾幼蟲的目的。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢在自然界中與其適生地中的多種高寒植物的根、莖、葉等組織存在共生現(xiàn)象。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高寒植物組織根、莖、葉等組織共生，共生后要比未共生的中國被毛孢的侵染活性高數(shù)十至數(shù)百倍，基于這一原理發(fā)明本方法。本發(fā)明制備具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料的方法包括：建立自動化或手動控制氣候條件的高寒植物組培苗栽培室，模擬青藏高原的溫度、濕度及光照等氣候條件，通過離體組織培養(yǎng)快速繁殖栽培技術(shù)，獲得冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲取食的高寒植物組培苗；將制備的冬蟲夏草菌源噴施接種到栽培室高寒植物組培苗上，促進(jìn)冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢與高寒植物組培苗共生，形成菌物-植物共生體，將菌絲檢測結(jié)果為中國被毛孢的菌物-植物共生體作為對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料。本發(fā)明的具體步驟包括：1.采用通常植物離體組織培養(yǎng)栽培室建造方法，建立自動化或手動控制氣候條件的高寒植物組培苗栽培室，以長10～20m×寬10～20m大小為建設(shè)單位，設(shè)置3～10層用于放置植物苗培養(yǎng)瓶或殺菌處理過的潔凈土壤的培養(yǎng)架，通過電制冷、電加熱設(shè)備(例如制冷壓縮機、電熱絲加熱設(shè)備等)調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣溫度；通過噴霧式管路及除濕機調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣濕度；培養(yǎng)架安裝日光燈等光照系統(tǒng)，對栽培植物提供光照；利用活性炭微濾膜空氣過濾系統(tǒng)，保持栽培室內(nèi)無塵、清潔狀態(tài)；栽培室內(nèi)安裝紫外燈，定期消毒；工作人員進(jìn)入栽培室前，在更衣室更換消毒過的工作服、鞋、帽等。2.在青海玉樹或西藏那曲等冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)海拔2500～5200米的高寒草甸采集高寒植物苗或其種子，通過常規(guī)植物離體組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，在栽培室內(nèi)用通常植物組培培養(yǎng)基及常規(guī)植物生長激素，快速繁殖和栽培高寒植物組培苗，通過人工或自動化控制栽培室的波動溫度保持在夜2℃～晝22℃，空氣濕度保持在65～95％，離體快繁高寒植物組培苗接受的光照強度為500-2000lx，光照時間每天10～16小時，使高寒植物組培苗旺盛生長。3.從青海玉樹或西藏那曲等冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)的冬蟲夏草適生地采集新鮮冬蟲夏草或其子囊孢子，采用合適嗜低溫菌物的工業(yè)微生物方法進(jìn)行分離純化，經(jīng)分子生物學(xué)方法或形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，通過常規(guī)低溫發(fā)酵法在13±5℃條件下發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子按發(fā)酵物與水體積比1∶10～1∶200稀釋成的懸浮液，或直接采用栽培室內(nèi)的潔凈的冬蟲夏草新鮮子囊孢子稀釋制成每毫升含有100～1000個子囊孢子的懸浮液，作為冬蟲夏草菌源。4.將制備的冬蟲夏草菌源噴淋接種到栽培室栽培的高寒植物組培苗上，每瓶噴施1～5ml菌懸液，或每平方米潔凈土壤培育區(qū)噴施50～100mL菌懸液，在1天內(nèi)噴施1～2次，噴施后利用10～100lx的低強度散射光進(jìn)行光照，通過人工或自動化控制栽培室內(nèi)溫度在13±5℃，空氣濕度保持在70～90％，共生培育3～15天，激活冬蟲夏草菌中國被毛孢的侵染活性；采用顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物組培苗的根、葉、莖組織纏繞形成共生體，經(jīng)分子檢驗為中國被毛孢后，可直接作為具有高侵染活性的菌種材料；或是將獲得的共生體組織切成5～20mm小段，制備成具有高侵染活性的菌種材料，用遮陰保水保鮮方法存放于2～4℃，保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明方法獲得的具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料可用于高效侵染鉤蝠蛾幼蟲，使用時可直接冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲投置到冬蟲夏草菌中國被毛孢與高寒植物組培苗形成共生體的培育瓶或潔凈土壤培育區(qū)內(nèi)，亦可將制備的高侵染活性菌種材料投喂冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種材料，從而被高效侵染。在寄主鉤蝠蛾幼蟲取食接觸菌種材料7～15天后，采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體，經(jīng)統(tǒng)計，鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為95.8～98.9％。本發(fā)明所述的植物組培培養(yǎng)基根據(jù)高寒植物對無機元素、有機營養(yǎng)元素需求的不同，可以是MS培養(yǎng)基(MurashigeandSkoog，1962)、LS培養(yǎng)基(LinsmairerandSkoog，1965)、BL培養(yǎng)基(BrownandLawrence，1968)、ER培養(yǎng)基(Eriksson，1965)、B5培養(yǎng)基(Gamborgetal.，1968)、N6培養(yǎng)基(朱至清等，1975)、SH培養(yǎng)基(SckenkandHidebrandt，1972)、Nitsch培養(yǎng)基(1969)、Miller培養(yǎng)基(1963)、H培養(yǎng)基(BourginandNitsch，1967)、White培養(yǎng)基(White，1943)、WS培養(yǎng)基(WolterandSkoog，1966)、HE培養(yǎng)基(Heller，1953)中的一種。本發(fā)明所述的植物激素可以是植物生長素包括：吲哚乙酸(indole-3-aceticacid，IAA)、吲哚丁酸(indole-3-butyricacid，IBA)、萘乙酸(naphthaleneaceticacid，NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D)；細(xì)胞分裂素包括：激動素(kinetin，KT)、玉米素(zeatin，ZT)、6-芐氨基腺嘌呤(6-Benzyladenine，6-BA)、噻重氮苯基脲(thidiazuron，TDZ)、異戊烯腺嘌呤(2-isopentenyladenine，2-ip)；或赤霉酸(gibberellins3，GA3)；或脫落酸(abscisicacid，ABA)中的一種或多種。本發(fā)明所述的采用合適嗜低溫菌物的工業(yè)微生物方法進(jìn)行分離純化所用的分離培養(yǎng)基可以是察氏培養(yǎng)基、或馬鈴薯培養(yǎng)基、或肉湯培養(yǎng)基、或酵母浸出粉葡萄糖培養(yǎng)基、或高氏一號培養(yǎng)基中的一種。所述的通常發(fā)酵方法可以是固體發(fā)酵，或是液體發(fā)酵，或是固液雙相發(fā)酵。所述固體發(fā)酵可以是大麥、小麥、大米、玉米等常規(guī)農(nóng)作谷物中的一種或多種作為固體培養(yǎng)基。所述液體發(fā)酵可以是普通肉湯、或蛋白胨水、或酵母提取物等常規(guī)底料中的一種或多種作為液體培養(yǎng)基。所述固液雙相發(fā)酵可采用深層發(fā)酵產(chǎn)生菌絲和分生孢子或芽生孢子后，在固體培養(yǎng)基上再繼續(xù)發(fā)酵的方法，其培養(yǎng)基可以是上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的各一種。本發(fā)明所述的高寒植物的種類包括柔軟點地梅(Androsacemollis)、東俄洛紫菀(Astertongolensis)、川滇苔草(Carexschneideri)、膨囊苔草(C.lehmanii)、青綠苔草(C.breviculmis)、黑褐苔草(C.atrofusca)、一歲苔草(C.heterostachya)、薩嘎苔草(C.sagaensis)、舌葉垂頭菊(Cremanthodiumlinguiatum)、裂葉藍(lán)鐘花(Cyananthuslobatus)、麗江藍(lán)鐘花(C.lichiangensis)、大萼藍(lán)鐘花(C.macrocalyx)、發(fā)草(Deschampsiacaespitosa)、錫金柳葉菜(Epilobiumsikkimense)、高山嵩草(Kobresiapygmaea)、大花嵩草(K.macrantha)、西藏嵩草(K.Schoenoides)、矮生嵩草(K.humilis)、線葉嵩草(K.capollifolia)、林芝橐吾(Ligularianyingchiensis)、聶拉木厚棱芹(Pachypleurumnyalamense)、西藏厚棱芹(P.xizangense)、斑唇馬先蒿(Pedicularislongifora)、昌都馬先蒿(P.sherriffii)、草甸馬先蒿(P.roylei)、西藏糙蘇(Phlomistibetica)、長果車前(Plantagoasiatica)、細(xì)莖蓼(Polygonumfilicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、珠芽蓼(P.viviparum)、圓穗蓼(P.macrophyllum)、狹葉圓穗蓼(P.macrophyllum)、頭花蓼(P.capitatum)、穆坪耳蕨(Polystichummoupinense)、楔葉委陵菜(Potentillacuneata)、纖細(xì)委陵菜(P.gracillima)、多頭委陵菜(P.multiceps)、大萼委陵菜(P.conferta)、多裂委陵菜(P.multifida)、西藏委陵菜(P.xizangensis)、雜色鐘報春(Primulaalpicola)、高原毛茛(Ranunculustanguticus)、云生毛茛(R.nephelogens)、西藏大黃(Rheumtibeticum)、小大黃(R.pumilum)、尼泊爾酸模(Rumexnepalensis)、雙齒風(fēng)毛菊(Saussurealavrenkoana)、禾葉風(fēng)毛菊(S.graminea)、星狀鳳毛菊(S.stella)、卵葉風(fēng)毛菊(S.ovatifolia)、鉤柱唐松草(Thalictrumuncatum)、高山唐松草(T.alpinun)和長果婆婆娜(Veronicachayuensis)中的一種或多種。本發(fā)明所述的冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾包括曲線鉤蝠蛾T.fusconebulosa(DeGeer，1778)(Hepialus)comb.n.、赭褐鉤蝠蛾T.gallicus(Lederer，1852)(Hepialus)comb.n.、白線鉤蝠蛾T.nubifer(Lederer，1853)(Hepialus)comb.n.、德氏鉤蝠蛾T.davidi(Poujade，1886)(Hepialus)comb.n.、蟲草鉤蝠蛾Thitarodesarmoricanus(Oberthur，1909)(Hepialus)、斜脈鉤蝠蛾T.oblifurcus(ChuetWang，1985)(Hepialus)、樟木鉤蝠蛾T.zhangmoensis(ChuetWang，1985)(Hepialus)、康姬鉤蝠蛾T.kangdingroides(ChuetWang，1985)(Hepialus)、康定鉤蝠蛾T.kangdingensis(ChuetWang，1985)(Hepialus)、德欽鉤蝠蛾T.deqingensis(Liang，1988)(Hepialus)、白馬鉤蝠蛾T.baimaensis(Liang，1988)(Hepialus)、梅里鉤蝠蛾T.meiliensis(Liang，1988)(Hepialus)、貢嘎鉤蝠蛾T.gonggaensis(FuetHuang，1991)(Hepialus)、人支鉤蝠蛾T.renzhiensis(Yang，1991)(Hepialus)、芒康鉤蝠蛾T.markamensis(Yangetal.，1992)(Hepialus)、草地鉤蝠蛾T.pratensis(Yangetal.，1992)(Hepialus)、銹色鉤蝠蛾T.ferrugineus(Yangetal.，1993)(Hepialus)、金沙鉤蝠蛾T.jinshaensis(Yang，1993)(Hepialus)、白紋鉤蝠蛾T.albipictus(Yang，1993)(Hepialus)、甲郎鉤蝠蛾T.jialangensis(Yang，1994)(Hepialus)、察里鉤蝠蛾T.zaliensis(Yang，1994)(Hepialus)、中支鉤蝠蛾T.zhongzhiensis(Liang，1995)(Hepialus)、葉日鉤蝠蛾T.yeriensis(Liang，1995)(Hepialus)、美麗鉤蝠蛾T.callinivalis(Liang，1995)(Hepialus)、里塘鉤蝠蛾T.litangensis(Liang，1995)(Hepialus)、循化鉤蝠蛾T.xunhuaensis(YangetYang，1995)(Hepialus)、白帶鉤蝠蛾T.cingulatus(YangetZhang，1995)(Hepialus)、巴青鉤蝠蛾T.baqingensis(YangetJiang，1995)(Hepialus)、當(dāng)雄鉤蝠蛾T.damxungensis(Yang，1995)(Hepialus)、玉樹鉤蝠蛾T.yushuensis(Wangetal.，1995)(Hepialus)、寬兜鉤蝠蛾T.latitegumenus(Shenetal.，1997)(Hepialus)comb.n.、雙帶鉤蝠蛾T.bibelteus(Shenetal.，1997)(Hepialus)comb.n.、拉脊蝠蛾T.lagii(Yan，2001)(Hepialus)comb.n.、比如鉤蝠蛾T.biruens(Fu，2002)(Hepialus)comb.n.、海南鉤蝠蛾T.hainanensis(ChuetWang，2004)(Hepialus)comb.n.、納木鉤蝠蛾T.namensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、日喀則鉤蝠蛾T.xigazeensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、永勝鉤蝠蛾T.yongshengensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、定結(jié)鉤蝠蛾T.dinggyeensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、南木林鉤蝠蛾T.nanmlinensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、亞東鉤蝠蛾T.yadongensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、蒲氏鉤蝠蛾T.pui(Zhangetal.，2007)(Hepialus)comb.n.、小金鉤蝠蛾T.xiaojinensis(Tuetal.，2009)(Hepialus)comb.n.、色季拉鉤蝠蛾T.sejilaensis(Zouetal.，2011)、加查鉤蝠蛾T.jiachaensis(Zouetal.，2011)中的一種或多種。具體實施方式實施例一1.選擇交通便利、電能便宜的地區(qū)，以10m×10m為一個房間單位，建造自動化控制氣候條件的高寒植物栽培室，栽培室內(nèi)設(shè)置5層培養(yǎng)架用于放置植物苗培養(yǎng)瓶；栽培室內(nèi)安裝常規(guī)工業(yè)冷庫用中央空調(diào)系統(tǒng)調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣溫度；安裝噴霧式管路與中央空調(diào)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣濕度；培養(yǎng)架安裝日光燈光照系統(tǒng)，對栽培植物提供光照；利用活性炭微濾膜空氣過濾系統(tǒng)，保持栽培室內(nèi)無塵、清潔狀態(tài)；栽培室內(nèi)安裝紫外燈，定期消毒，工作人員進(jìn)入栽培室前，在更衣室更換消毒過的工作服、鞋、帽等。2.在青海玉樹冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)海拔4700米的高寒草甸采集高山嵩草(Kobresiapygmaea)、一歲苔草(Carexheterostachya)、禾葉風(fēng)毛菊(Saussureagraminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、高山唐松草(Thalictrumalpinum)、火絨草(Leontopodiumhastioides)、頭花蓼(Polygonummacrophytum)的嫩苗或種子，通過常規(guī)植物離體組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，在栽培室內(nèi)用MS培養(yǎng)基及植物激素IAA(0.4mg/L)、6-BA(0.5mg/L)及GA3(0.4mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物組培苗，通過自動化控制栽培室的波動溫度保持在夜5℃～晝20℃，空氣濕度保持在65～95％，離體組培快繁植物苗接受的光照強度為500～1200lx，光照時間10～16小時，使組培苗旺盛生長并獲得高寒植物苗。3.從青海玉樹地區(qū)冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)察氏培養(yǎng)基分離純化菌種，經(jīng)分子生物學(xué)方法或形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，經(jīng)通常蛋白胨水液體培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并將發(fā)酵獲得的菌球用攪拌器均勻打碎，最后按發(fā)酵液與水體積比1∶10進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，作為冬蟲夏草菌源。4.將制備的冬蟲夏草菌源，用滅菌的注射器均勻噴淋接種到栽培室的高寒植物組培苗上，每瓶組培苗噴入1ml菌懸液，在1天內(nèi)噴施接種2次，噴施后利用20～50lx的低強度散射光進(jìn)行光照，通過人工或自動化控制栽培室內(nèi)溫度在13±5℃，空氣濕度保持在70～90％，共生培育3天，激活冬蟲夏草菌中國被毛孢的侵染活性；經(jīng)顯微鏡檢查冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成共生體，經(jīng)分子檢驗菌絲為中國被毛孢后，將獲得的共生體組織切成5～20mm小段，制備成對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的菌種材料，用遮陰保水保鮮方法存放于4℃，保存?zhèn)溆谩?.將制備的高侵染活性菌種材料投喂冬蟲夏草寄主玉樹鉤蝠蛾Thitarodesyushuensi幼蟲，每頭幼蟲投放5～10克，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種材料，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計，玉樹鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為98.4％。實施例二1.在青藏高原海拔4500米的鐵路運輸便利的地區(qū)，以20m×20m為一個單位建造自動化控制氣候條件的高寒植物栽培室，栽培室內(nèi)設(shè)置10層培養(yǎng)架用于放置植物苗培養(yǎng)瓶；栽培室內(nèi)安裝常規(guī)工業(yè)冷庫用中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣溫度；安裝噴霧式管路與中央空調(diào)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣濕度；培養(yǎng)架安裝日光燈光照系統(tǒng)，對栽培植物提供光照；利用活性炭微濾膜空氣過濾系統(tǒng)，保持栽培室內(nèi)無塵、清潔狀態(tài)；栽培室內(nèi)安裝紫外燈，定期消毒，工作人員進(jìn)入栽培室前，在更衣室更換消毒過的工作服、鞋、帽等。2.在西藏那曲冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)海拔5200米的高寒草甸采集高山嵩草(Kobrasiapygmaea)、矮生嵩草(Kobrasiahumilis)、苔草(Carexmoorcroftii)、風(fēng)毛菊(Saussureasuperba)、圓穗蓼(Polygonummacrophytum)、叉枝蓼(Polygonumtortuonum)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、高山唐松草(Thactriunalpinun)、矮火絨草(Leontopodiumalpinum)、委陵菜(Potentillaanserine)、火絨草(Leonlopodium)、斑唇馬先蒿(Pedicularislongifora)、黑褐苔草(Carexatrofusca)高寒植物的嫩苗或種子，通過常規(guī)植物離體組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，在栽培室內(nèi)用LS培養(yǎng)基及植物激素NAA(0.02mg/L)、IBA(0.4mg/L)、TDZ(0.2mg/L)及GA3(0.4mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物組培苗，通過自動化控制栽培室的波動溫度保持在夜2℃～晝18℃，空氣濕度保持在65～95％，離體組培快繁植物苗接受的光照強度為1000～2000lx，光照時間10～16小時，使組培苗旺盛生長并獲得高寒植物苗。3.從西藏冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)馬鈴薯培養(yǎng)基分離純化菌種，經(jīng)分子生物學(xué)方法及形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，進(jìn)一步經(jīng)通常的大麥固態(tài)培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，將發(fā)酵獲得的菌團用攪拌器均勻打碎，并按發(fā)酵物重量與水體積比1∶100進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，將培養(yǎng)基顆粒物用孔徑2mm的紗布粗過濾后，作為冬蟲夏草菌源。4.將制備的冬蟲夏草菌源用滅菌的注射器均勻噴淋接種到栽培室的高寒植物組培苗上，每瓶噴入5ml菌懸液，在1天內(nèi)噴施接種2次，噴施后利用20～80lx的低強度散射光進(jìn)行光照，通過人工或自動化控制栽培室內(nèi)溫度在13±5℃，空氣濕度保持在70～90％，共生培育5天后，激活冬蟲夏草菌中國被毛孢的侵染活性；經(jīng)顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成大量共生體，經(jīng)分子檢驗為中國被毛孢后，可直接作為對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的菌種材料。5.寄主蒲氏鉤蝠蛾(Thitarodespui)幼蟲投置到冬蟲夏草菌中國被毛孢與高寒植物組培苗形成共生體的培育瓶內(nèi)，每瓶控釋5～10頭，使蒲氏鉤蝠蛾幼蟲取食并充分接觸高侵染活性的共生體菌種材料，14天后將蒲氏鉤蝠蛾幼蟲從瓶中挖出采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計，蒲氏鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率為98.9％。實施例三1.在工業(yè)配套設(shè)施齊全、物資運輸便捷的工業(yè)區(qū)，以長20m×寬10m為一個單位建設(shè)，建造自動化控制氣候條件的高寒植物栽培室，栽培室內(nèi)設(shè)置3層滅菌土壤培養(yǎng)架；栽培室內(nèi)安裝常規(guī)工業(yè)冷庫用中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣溫度；安裝噴霧式管路與中央空調(diào)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣濕度；培養(yǎng)架安裝日光燈光照系統(tǒng)，對栽培植物提供光照；利用活性炭微濾膜空氣過濾系統(tǒng)，保持栽培室內(nèi)無塵、清潔狀態(tài)；栽培室內(nèi)安裝紫外燈，定期消毒，工作人員進(jìn)入栽培室前，在更衣室更換消毒過的工作服、鞋、帽等。2.在海拔2900～4600m的冬蟲夏草適生地區(qū)域采集西藏大黃(Rheumtibeticum)、小大黃(R.pumilum)、斑唇馬先蒿(Pedicularislongifora)、昌都馬先蒿(P.sherriffii)、草甸馬先蒿(P.roylei)、鉤柱唐松草(Thalictrumuncatum)、高山唐松草(T.alpinun)植株或種子，通過常規(guī)植物離體組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，在栽培室培養(yǎng)瓶內(nèi)用BL培養(yǎng)基及植物激素IAA(0.1mg/L)、2，4-D(0.2mg/L)、KT(0.2mg/L)及ABA(0.5mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物組培苗，然后將組培苗移栽到殺菌處理過的栽培室潔凈土壤中，通過自動化控制栽培室的波動溫度保持在夜4℃～晝20℃，空氣濕度保持在65～85％，離體組培快繁植物苗接受的光照強度為600～1500lx，光照時間10～12小時，使組培苗旺盛生長并獲得高寒植物苗。3.將室內(nèi)栽培獲得的潔凈冬蟲夏草噴發(fā)的子囊孢子套袋收集，直接用無菌生理鹽水稀釋制成子囊孢子懸浮液，通過顯微鏡計數(shù)使每毫升懸浮液中含有100個子囊孢子，作為冬蟲夏草菌源。4.將制備的冬蟲夏草菌源，用消毒過的噴霧器均勻噴淋接種到栽培室滅菌土壤中的高寒植物組培苗上，每平方米噴100ml菌懸液，在1天內(nèi)噴施接種2次，噴施后利用50～100lx的低強度散射光進(jìn)行光照，通過人工或自動化控制栽培室內(nèi)溫度在13±5℃，空氣濕度保持在70～90％，共生培育7天后，激活冬蟲夏草菌中國被毛孢的侵染活性；經(jīng)顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成大量共生體，經(jīng)分子檢驗為中國被毛孢后，可直接作為對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的菌種材料。5.寄主蟲草鉤蝠蛾(Thitarodesarmoricanus)幼蟲投置到冬蟲夏草菌中國被毛孢與高寒植物組培苗形成共生體的滅菌土壤培育區(qū)，每平方米約控釋100頭，使蟲草鉤蝠蛾幼蟲取食并充分接觸高侵染活性的共生體菌種材料，15天后將蟲草鉤蝠蛾幼蟲從土壤中挖出采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測蟲草鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計，蟲草鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為95.8％。實施例四1.在電網(wǎng)及交通方便的高山平臺區(qū)域，以長20m×寬15m為一個單位建設(shè)，建造自動化控制氣候條件的高寒植物栽培室，栽培室內(nèi)設(shè)置4層滅菌土壤培養(yǎng)架；栽培室內(nèi)安裝常規(guī)工業(yè)冷庫用中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣溫度；安裝噴霧式管路與中央空調(diào)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣濕度；培養(yǎng)架安裝日光燈光照系統(tǒng)，對栽培植物提供光照；利用活性炭微濾膜空氣過濾系統(tǒng)，保持栽培室內(nèi)無塵、清潔狀態(tài)；栽培室內(nèi)安裝紫外燈，定期消毒，工作人員進(jìn)入栽培室前，在更衣室更換消毒過的工作服、鞋、帽等。2.在海拔3800～4500m的冬蟲夏草適生地區(qū)域采集細(xì)莖蓼(Polygonumfilicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、圓穗蓼(P.macrophyllum)、狹葉圓穗蓼(P.macrophyllum)、頭花蓼(P.capitatum)、西藏大黃(Rheumtibeticum)、小大黃(R.pumilum)植株或種子，通過常規(guī)植物離體組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，在栽培室培養(yǎng)瓶內(nèi)用BL培養(yǎng)基及植物激素IBA(0.2mg/L)、2，4-D(0.05mg/L)、KT(0.5mg/L)及ABA(0.5mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物組培苗，然后將組培苗移栽到殺菌處理過的栽培室潔凈土壤中，通過自動化控制栽培室的波動溫度保持在夜5℃～晝22℃，空氣濕度保持在65～85％，離體組培快繁植物苗接受的光照強度為800～1600lx，光照時間10～14小時，使組培苗旺盛生長并獲得高寒植物苗。3.將室內(nèi)栽培獲得的潔凈冬蟲夏草噴發(fā)的子囊孢子套袋收集，直接用無菌生理鹽水稀釋制成子囊孢子懸浮液，通過顯微鏡計數(shù)使每毫升懸浮液中含有1000個子囊孢子，作為冬蟲夏草菌源。4.將制備的冬蟲夏草菌源，用消毒過的噴霧器均勻噴淋接種到栽培室滅菌土壤中的高寒植物組培苗上，每平方米噴50ml菌懸液，在1天內(nèi)噴施接種1次，噴施后利用30～50lx的低強度散射光進(jìn)行光照，通過人工或自動化控制栽培室內(nèi)溫度在13±5℃，空氣濕度保持在70～90％，共生培育15天后，激活冬蟲夏草菌中國被毛孢的侵染活性；經(jīng)顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成大量共生體，經(jīng)分子檢驗為中國被毛孢后，可直接作為對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的菌種材料。5.寄主色季拉鉤蝠蛾(Thitarodessejilaensis)幼蟲投置到冬蟲夏草菌中國被毛孢與高寒植物組培苗形成共生體的滅菌土壤培育區(qū)，每平方米約控釋100頭，使色季拉鉤蝠蛾幼蟲取食并充分接觸高侵染活性的共生體菌種材料，12天后將色季拉鉤蝠蛾幼蟲從土壤中挖出采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測色季拉鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計，色季拉鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為97.9％。實施例五1.選擇氣候條件夏季最高氣溫30℃左右冬季最低溫度-10℃左右的電網(wǎng)水運交通便利的地區(qū)，以15m×10m為一個建設(shè)單位，建造自動化控制氣候條件的高寒植物栽培室，栽培室內(nèi)設(shè)置5層滅菌土壤培養(yǎng)架；栽培室內(nèi)安裝常規(guī)工業(yè)冷庫用中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣溫度；安裝噴霧式管路與中央空調(diào)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣濕度；培養(yǎng)架安裝日光燈光照系統(tǒng)，對栽培植物提供光照；利用活性炭微濾膜空氣過濾系統(tǒng)，保持栽培室內(nèi)無塵、清潔狀態(tài)；栽培室內(nèi)安裝紫外燈，定期消毒，工作人員進(jìn)入栽培室前，在更衣室更換消毒過的工作服、鞋、帽等。2.在在海拔2500～5000m的冬蟲夏草適生地區(qū)域采集高山嵩草(Kobresiapygmaea)、大花嵩草(K.macrantha)、西藏嵩草(K.Schoenoides)、矮生嵩草(K.humilis)、線葉嵩草(K.capollifolia)、楔葉委陵菜(Potentillacuneata)、纖細(xì)委陵菜(P.gracillima)、多頭委陵菜(P.multiceps)、大萼委陵菜(P.conferta)、多裂委陵菜(P.multifida)、西藏委陵菜(P.xizangensis)的植株或種子，通過常規(guī)植物離體組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，在栽培室培養(yǎng)瓶內(nèi)用MS培養(yǎng)基及植物激素NAA(0.2mg/L)、2，4-D(0.05mg/L)、ZT(1mg/L)及ABA(0.5mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物組培苗，然后將組培苗移栽到殺菌處理過的栽培室潔凈土壤中，通過自動化控制栽培室的波動溫度保持在夜5℃～晝21℃，空氣濕度保持在65～85％，離體組培快繁植物苗接受的光照強度為500～1000lx，光照時間10～16小時，使組培苗旺盛生長并獲得高寒植物苗。3.從青海玉樹地區(qū)的冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)肉湯培養(yǎng)基分離純化菌種，經(jīng)分子生物學(xué)方法或形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，進(jìn)一步經(jīng)通常普通肉湯液體培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵21天，然后置于小麥為底物的固體培養(yǎng)基上再繼續(xù)發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并將發(fā)酵獲得菌團用攪拌器均勻打碎，按發(fā)酵物重量與水體積比1∶200進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，將培養(yǎng)基顆粒物用孔徑1.5mm的滅菌紗布粗過濾后，作為冬蟲夏草菌菌源。4.將制備的冬蟲夏草菌菌源，用消毒過的噴霧器均勻噴淋接種到栽培室滅菌土壤中的高寒植物組培苗上，每平方米噴75ml懸浮液，在1天內(nèi)噴施接種1次，噴施后利用5～20lx的低強度散射光進(jìn)行光照，通過人工或自動化控制栽培室內(nèi)溫度在13±5℃，空氣濕度保持在70～90％，共生培育10天后，激活冬蟲夏草菌中國被毛孢的侵染活性；經(jīng)顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成大量共生體，經(jīng)分子檢驗為中國被毛孢后，將共生體地上部分割回，將共生體組織切成5～20mm小段，制備成對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的菌種材料，用遮陰保水保鮮方法存放于2℃，保存?zhèn)溆谩?.將制備的高侵染活性菌種材料投喂冬蟲夏草寄主比如鉤蝠蛾(Thitarodesbiruens)幼蟲，每頭投入5g高侵染活性物料，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種材料，7天后將比如鉤蝠蛾幼蟲從土壤中挖出，采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測比如鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計，比如鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為98.8％。實施例六(反向例)1.選擇交通便利、電能便宜的地區(qū)，以10m×10m為一個房間單位，建造自動化控制氣候條件的高寒植物栽培室，栽培室內(nèi)設(shè)置5層培養(yǎng)架用于放置植物苗培養(yǎng)瓶；栽培室內(nèi)安裝常規(guī)工業(yè)冷庫用中央空調(diào)系統(tǒng)調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣溫度；安裝噴霧式管路與中央空調(diào)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)栽培室內(nèi)空氣濕度；培養(yǎng)架安裝日光燈光照系統(tǒng)，對栽培植物提供光照；利用活性炭微濾膜空氣過濾系統(tǒng)，保持栽培室內(nèi)無塵、清潔狀態(tài)；栽培室內(nèi)安裝紫外燈，定期消毒，工作人員進(jìn)入栽培室前，在更衣室更換消毒過的工作服、鞋、帽等。2.在青海玉樹冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)海拔4700米的高寒草甸采集高山嵩草(Kobresiapygmaea)、一歲苔草(Carexheterostachya)、禾葉風(fēng)毛菊(Saussureagraminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、高山唐松草(Thalictrumalpinum)、火絨草(Leontopodiumhastioides)、頭花蓼(Polygonummacrophytum)的嫩苗或種子，通過常規(guī)植物離體組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)，在栽培室內(nèi)用MS培養(yǎng)基及植物激素IAA(0.4mg/L)、6-BA(0.5mg/L)及GA3(0.4mg/L)快速繁殖和栽培高寒植物組培苗，通過自動化控制栽培室的波動溫度保持在夜5℃～晝23℃，空氣濕度保持在65～85％，離體組培快繁植物苗接受的光照強度為4000～8000lx，光照時間10～16小時，使組培苗旺盛生長并獲得高寒植物苗。3.從青海玉樹地區(qū)冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)察氏培養(yǎng)基分離純化菌種，經(jīng)分子生物學(xué)方法或形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，經(jīng)通常蛋白胨水液體培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并將發(fā)酵獲得的菌球用攪拌器均勻打碎，最后按發(fā)酵液與水體積比1∶100進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，作為冬蟲夏草菌源。4.將獲得的高寒植物組培苗組織切成5～20mm小段作為玉樹鉤蝠蛾幼蟲的飼料，同時將冬蟲夏草菌源噴淋到高寒植物飼料表面，直接投喂冬蟲夏草寄主玉樹鉤蝠蛾Thitarodesyushuensi幼蟲，每頭幼蟲投放5～10克，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計，玉樹鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率只有23.4％。實施例七(反向例)1.從西藏那曲冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)馬鈴薯培養(yǎng)基分離純化菌種，經(jīng)分子生物學(xué)方法及形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，進(jìn)一步經(jīng)通常的大麥固態(tài)培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，將發(fā)酵獲得的菌球用攪拌器均勻打碎，并按發(fā)酵物重量與水體積比1∶100進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，將培養(yǎng)基顆粒物用孔徑2mm的紗布粗過濾后，作為冬蟲夏草菌源。2.將制備的冬蟲夏草菌源直接噴淋到冬蟲夏草寄主比如鉤蝠蛾Thitarodesbiruens幼蟲，使寄主幼蟲充分接觸菌種，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計，中國被毛孢侵染比如鉤蝠蛾幼蟲的侵染率只有18.7％。實施例八(反向例)1.在每年6～8月在青海玉樹的冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草子囊孢子，直接稀釋制成懸浮液，通過顯微鏡計數(shù)使每毫升懸浮液中含有1000個子囊孢子，作為冬蟲夏草菌源。2.將冬蟲夏草菌源直接噴淋到冬蟲夏草寄主玉樹鉤蝠蛾Thitarodesyushuensi幼蟲，使寄主幼蟲充分接觸菌種，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計，玉樹鉤蝠蛾幼蟲被冬蟲夏草子囊孢子的侵染率只有10.8％。