本發(fā)明涉及一種利用青藏高原高寒草甸原有生態(tài)條件制備冬蟲夏草菌種材料的方法。

背景技術(shù)：
冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis(Berk.)Sung，Sung，Hywel-Jones&Spatafora是一種蟲生子囊真菌，寄生于鱗翅目Lepidoptera蝠蛾科Hepialidae鉤蝠蛾屬Thitarodes昆蟲的幼蟲，其無性型為中國被毛孢HirsutellasinensisLiu，Guo，Yu&Zeng。冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾屬Thitarodes昆蟲的一個(gè)世代包括卵、幼蟲、蛹和成蟲四個(gè)發(fā)育階段，幼蟲營地下隧道式穴居生活，雜食性，喜食圓穗蓼、頭花蓼、小大黃和珠芽蓼等高寒植物的幼嫩根莖。冬蟲夏草分布于青藏高原高海拔區(qū)域，該區(qū)域高寒缺氧，其氣溫常年具有高山低溫的特點(diǎn)。利用青藏高原高寒草甸原有生態(tài)環(huán)境條件進(jìn)行原生態(tài)冬蟲夏草道地藥材產(chǎn)業(yè)化研究，可有效保持冬蟲夏草道地產(chǎn)區(qū)的原生態(tài)屬性，同時(shí)也可以最大程度節(jié)省能源消耗，達(dá)到清潔生產(chǎn)的目的。目前采用常規(guī)冬蟲夏草菌種侵染寄主鉤蝠蛾昆蟲幼蟲仍存在侵染率低、耗費(fèi)時(shí)間長等問題。中國發(fā)明專利申請(公開號(hào)：CN102696555A)公開了一種半野生人工培殖冬蟲夏草的方法，中國發(fā)明專利申請(公開號(hào)：CN102405763A)公開了一種冬蟲夏草的培育方法，上述2個(gè)專利申請均采用含有中國被毛孢的菌液連續(xù)噴灑寄主幼蟲體表的方法進(jìn)行接種侵染；中國發(fā)明專利申請(公開號(hào)：CN102696392A)公開了天然冬蟲夏草的增產(chǎn)方法，其中采用誘集液誘集蝙蝠蛾幼蟲后，向幼蟲噴灑蝙蝠蛾被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉兩種菌種液體種；中國發(fā)明專利申請(公開號(hào)：CN102106235A)公開了一種全人工培養(yǎng)冬蟲夏草的方法，其中采用一端直徑小于0.2mm的不銹鋼實(shí)心針或空心針的針狀器具，沾取中國被毛孢菌體和孢子混懸液刺傷寄主幼蟲的方法進(jìn)行接種侵染；中國發(fā)明專利申請(公開號(hào)：CN102792855A)公開了一種用于冬蟲夏草寄主感染的菌種材料及寄主感染方法，采用冬蟲夏草菌皮作為菌種材料灌注、或拌入飼料喂食、或注射、或噴淋侵染寄主幼蟲。但上述方法存在侵染活性低、或損傷后存活率低、或耗費(fèi)時(shí)間過長、或菌種材料產(chǎn)量有限等問題，是制約原生態(tài)冬蟲夏草道地藥材產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種利用高寒草甸原有生態(tài)條件制備具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料的方法。該方法利用青藏高原高寒草甸原有植被及生態(tài)條件，通過構(gòu)建冬蟲夏草菌中國被毛孢與活體高寒植物組織的共生體，增大高寒植物組織中國被毛孢的共生量，激活中國被毛孢的侵染活性，得到對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料，達(dá)到高效侵染寄主鉤蝠蛾幼蟲的目的。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢在自然界中與其適生地中的多種高寒植物的根、莖、葉等組織存在共生現(xiàn)象。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高寒植物組織根、莖、葉等組織共生，共生后要比未共生的冬蟲夏草菌的侵染活性高數(shù)十至數(shù)百倍，基于這一原理發(fā)明本方法。本發(fā)明制備具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料的方法包括：在青藏高原冬蟲夏草適生的高寒草甸原有植被及生態(tài)環(huán)境下，建立高寒植物苗培育園，利用原生態(tài)溫濕度及光照條件，通過適合高原的農(nóng)業(yè)園藝栽培技術(shù)進(jìn)行水肥管理，栽培并獲得冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲取食的高寒植物苗；將冬蟲夏草菌源接種到培育園栽培的高寒植物苗組織上，根據(jù)不同海拔的氣候規(guī)律情況，利用每年5～11月原生態(tài)溫濕度條件，遮陰營造適宜的條件，使冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢與活體高寒植物共生培育形成菌物-植物共生體，將菌絲檢測結(jié)果為中國被毛孢的菌物-植物共生體作為對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的冬蟲夏草菌種材料。本發(fā)明的具體步驟包括：1.在海拔2500～5200米的青藏高原冬蟲夏草適生地區(qū)域的高寒草甸，利用其原有高寒植被植株，以10～20m×10～20m大小為建設(shè)單位，建立冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲食料植物的高寒植物苗培育園；采用通常農(nóng)業(yè)園藝規(guī)劃方法進(jìn)行分區(qū)建壟，壟面大小為50～90cm×450～1920cm，在壟面中間上方高30～100cm處鋪設(shè)水肥管理管路，壟間設(shè)立寬20～30cm深5～10cm的區(qū)域便于排水和管理人員行走，培育園四周留下約35～50cm的空區(qū)；2.應(yīng)用適合高原的農(nóng)業(yè)園藝栽培技術(shù)對高寒植物苗進(jìn)行水肥管理，視當(dāng)月降水量情況每年5～11月，每個(gè)月噴淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在25～45％左右，每1至2個(gè)月在一次噴水中水：尿體積比為100∶5～100∶20濃度加入牛羊尿或人尿；每年5月施放一次有機(jī)牛糞肥或羊糞肥，施放量為干重每平方米約150～250g；3.利用原生態(tài)溫濕度及光照條件，促進(jìn)培育園內(nèi)原有的高寒植物苗旺盛生長；或者再將培育園以外的鉤蝠蛾幼蟲食料植物和/或其種子移栽補(bǔ)充到培育園中栽培，或者再將快速擴(kuò)繁的高寒植物組培苗移栽到培育園中，使之與培育園內(nèi)原有植被一同旺盛生長獲得高寒植物苗；4.從冬蟲夏草適生地采集新鮮冬蟲夏草或其子囊孢子，采用合適嗜低溫菌物的工業(yè)微生物方法進(jìn)行分離純化，經(jīng)分子生物學(xué)方法或形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，通過常規(guī)低溫發(fā)酵法在13±5℃條件下發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子按發(fā)酵物與水體積比1∶100～1∶1000稀釋成懸浮液，作為冬蟲夏草菌源；或直接采用冬蟲夏草的新鮮子囊孢子稀釋制成每毫升含有100～1000個(gè)子囊孢子的懸浮液，作為冬蟲夏草菌源；5.將制備冬蟲夏草菌源噴淋接種到培育園栽培的高寒植物苗上，每平方米噴施300～500ml菌懸液，連續(xù)噴施1～7天，每天噴施1～3次，噴施后遮陰，根據(jù)不同海拔的氣候規(guī)律情況，利用每年5～11月原生態(tài)溫濕度條件，共生培育7～30天，增大高寒植物組織中中國被毛孢的共生量，激活冬蟲夏草菌中國被毛孢的侵染活性；采用顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成共生體，經(jīng)分子檢驗(yàn)為中國被毛孢后，將共生體組織直接作為具有高侵染活性的菌種材料；亦可是將獲得的共生體組織切成5～20mm小段，制備成具有高侵染活性的菌種材料，用遮陰保水保鮮方法于2～4℃保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明方法獲得的具有高侵染活性的菌種材料可用于高效侵染鉤蝠蛾幼蟲。使用時(shí)，可直接冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲投置到冬蟲夏草菌中國被毛孢與高寒植物苗形成共生體的培育區(qū)，亦可將制備的高侵染活性菌種材料投喂冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾幼蟲，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種材料，從而被高效侵染。在寄主鉤蝠蛾幼蟲取食接觸菌種材料7～15天后，采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為85.9～91.2％。本發(fā)明所述的采用合適嗜低溫菌物的工業(yè)微生物方法進(jìn)行分離純化所用的分離培養(yǎng)基可以是察氏培養(yǎng)基、或馬鈴薯培養(yǎng)基、或肉湯培養(yǎng)基、或酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基、或高氏一號(hào)培養(yǎng)基中的一種。所述的通常發(fā)酵方法可以是固體發(fā)酵，或是液體發(fā)酵，或是固液雙相發(fā)酵。所述固體發(fā)酵可以是大麥、小麥、大米、玉米等常規(guī)農(nóng)作谷物中的一種或多種作為固體培養(yǎng)基。所述液體發(fā)酵可以是普通肉湯、或蛋白胨水、或酵母提取物等常規(guī)底料中的一種或多種作為液體培養(yǎng)基。所述固液雙相發(fā)酵可采用深層發(fā)酵產(chǎn)生菌絲或芽生孢子后，在固體培養(yǎng)基上再繼續(xù)發(fā)酵的方法，其培養(yǎng)基可以是上述固體發(fā)酵培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的一種。本發(fā)明所述的高寒植物苗可以是培育園內(nèi)高寒草甸原有植被，亦可是將采集的高寒植物和/或種子移栽在培育園內(nèi)；所述高寒植物的種類包括柔軟點(diǎn)地梅(Androsacemollis)、東俄洛紫菀(Astertongolensis)、川滇苔草(Carexschneideri)、膨囊苔草(C.lehmanii)、青綠苔草(C.breviculmis)、黑褐苔草(C.atrofusca)、一歲苔草(C.heterostachya)、薩嘎苔草(C.sagaensis)、舌葉垂頭菊(Cremanthodiumlinguiatum)、裂葉藍(lán)鐘花(Cyananthuslobatus)、麗江藍(lán)鐘花(C.lichiangensis)、大萼藍(lán)鐘花(C.macrocalyx)、發(fā)草(Deschampsiacaespitosa)、錫金柳葉菜(Epilobiumsikkimense)、高山嵩草(Kobresiapygmaea)、大花嵩草(K.macrantha)、西藏嵩草(K.Schoenoides)、矮生嵩草(K.humilis)、線葉嵩草(K.capollifolia)、林芝橐吾(Ligularianyingchiensis)、聶拉木厚棱芹(Pachypleurumnyalamense)、西藏厚棱芹(P.xizangense)、斑唇馬先蒿(Pedicularislongifora)、昌都馬先蒿(P.sherriffii)、草甸馬先蒿(P.roylei)、西藏糙蘇(Phlomistibetica)、長果車前(Plantagoasiatica)、細(xì)莖蓼(Polygonumfilicaule)、叉枝蓼(P.tortuonum)、珠芽蓼(P.viviparum)、圓穗蓼(P.macrophyllum)、狹葉圓穗蓼(P.macrophyllum)、頭花蓼(P.capitatum)、穆坪耳蕨(Polystichummoupinense)、楔葉委陵菜(Potentillacuneata)、纖細(xì)委陵菜(P.gracillima)、多頭委陵菜(P.multiceps)、大萼委陵菜(P.conferta)、多裂委陵菜(P.multifida)、西藏委陵菜(P.xizangensis)、雜色鐘報(bào)春(Primulaalpicola)、高原毛茛(Ranunculustanguticus)、云生毛茛(R.nephelogens)、西藏大黃(Rheumtibeticum)、小大黃(R.pumilum)、尼泊爾酸模(Rumexnepalensis)、雙齒風(fēng)毛菊(Saussurealavrenkoana)、禾葉風(fēng)毛菊(S.graminea)、星狀鳳毛菊(S.stella)、卵葉風(fēng)毛菊(S.ovatifolia)、鉤柱唐松草(Thalictrumuncatum)、高山唐松草(T.alpinun)和長果婆婆娜(Veronicachayuensis)中的一種或多種。本發(fā)明所述的冬蟲夏草寄主鉤蝠蛾包括曲線鉤蝠蛾T.fusconebulosa(DeGeer，1778)(Hepialus)comb.n.、赭褐鉤蝠蛾T.gallicus(Lederer，1852)(Hepialus)comb.n.、白線鉤蝠蛾T.nubifer(Lederer，1853)(Hepialus)comb.n.、德氏鉤蝠蛾T.davidi(Poujade，1886)(Hepialus)comb.n.、蟲草鉤蝠蛾Thitarodesarmoricanus(Oberthür，1909)(Hepialus)、斜脈鉤蝠蛾T.oblifurcus(ChuetWang，1985)(Hepialus)、樟木鉤蝠蛾T.zhangmoensis(ChuetWang，1985)(Hepialus)、康姬鉤蝠蛾T.kangdingroides(ChuetWang，1985)(Hepialus)、康定鉤蝠蛾T.kangdingensis(ChuetWang，1985)(Hepialus)、德欽鉤蝠蛾T.deqingensis(Liang，1988)(Hepialus)、白馬鉤蝠蛾T.baimaensis(Liang，1988)(Hepialus)、梅里鉤蝠蛾T.meiliensis(Liang，1988)(Hepialus)、貢嘎鉤蝠蛾T.gonggaensis(FuetHuang，1991)(Hepialus)、人支鉤蝠蛾T.renzhiensis(Yang，1991)(Hepialus)、芒康鉤蝠蛾T.markamensis(Yangetal.，1992)(Hepialus)、草地鉤蝠蛾T.pratensis(Yangetal.，1992)(Hepialus)、銹色鉤蝠蛾T.ferrugineus(Yangetal.，1993)(Hepialus)、金沙鉤蝠蛾T.jinshaensis(Yang，1993)(Hepialus)、白紋鉤蝠蛾T.albipictus(Yang，1993)(Hepialus)、甲郎鉤蝠蛾T.jialangensis(Yang，1994)(Hepialus)、察里鉤蝠蛾T.zaliensis(Yang，1994)(Hepialus)、中支鉤蝠蛾T.zhongzhiensis(Liang，1995)(Hepialus)、葉日鉤蝠蛾T.yeriensis(Liang，1995)(Hepialus)、美麗鉤蝠蛾T.callinivalis(Liang，1995)(Hepialus)、里塘鉤蝠蛾T.litangensis(Liang，1995)(Hepialus)、循化鉤蝠蛾T.xunhuaensis(YangetYang，1995)(Hepialus)、白帶鉤蝠蛾T.cingulatus(YangetZhang，1995)(Hepialus)、巴青鉤蝠蛾T.baqingensis(YangetJiang，1995)(Hepialus)、當(dāng)雄鉤蝠蛾T.damxungensis(Yang，1995)(Hepialus)、玉樹鉤蝠蛾T.yushuensis(Wangetal.，1995)(Hepialus)、寬兜鉤蝠蛾T.latitegumenus(Shenetal.，1997)(Hepialus)comb.n.、雙帶鉤蝠蛾T.bibelteus(Shenetal.，1997)(Hepialus)comb.n.、拉脊蝠蛾T.lagii(Yan，2001)(Hepialus)comb.n.、比如鉤蝠蛾T.biruens(Fu，2002)(Hepialus)comb.n.、海南鉤蝠蛾T.hainanensis(ChuetWang，2004)(Hepialus)comb.n.、納木鉤蝠蛾T.namensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、日喀則鉤蝠蛾T.xigazeensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、永勝鉤蝠蛾T.yongshengensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、定結(jié)鉤蝠蛾T.dinggyeensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、南木林鉤蝠蛾T.nanmlinensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、亞東鉤蝠蛾T.yadongensis(Chuetal.，2004)(Hepialus)comb.n.、蒲氏鉤蝠蛾T.pui(Zhangetal.，2007)(Hepialus)comb.n.、小金鉤蝠蛾T.xiaojinensis(Tuetal.，2009)(Hepialus)comb.n.、色季拉鉤蝠蛾T.sejilaensis(Zouetal.，2011)、加查鉤蝠蛾T.jiachaensis(Zouetal.，2011)中的一種或多種。具體實(shí)施方式實(shí)施例一1.在青藏高原海拔4300米的冬蟲夏草適生地區(qū)域的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，保留原有草甸植被，以10m×10m為一個(gè)單位建設(shè)培育園，培育園內(nèi)規(guī)劃建設(shè)成8個(gè)90cm×900cm的高寒植物原生態(tài)草甸培育壟區(qū)，在每個(gè)壟面上方高100cm處鋪設(shè)一條噴淋管及配套水泵設(shè)施，壟間挖開寬、深分別為25cm×5cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，培植園四周分別留下約50cm的工作區(qū)。2.每年5～11月視當(dāng)月降水量情況，每個(gè)月噴淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在38％左右，在一次噴水中加入水：尿體積比為100∶5濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機(jī)牛糞肥或羊糞肥干重每平方米約250g。3.將培育園附近珠芽蓼(Polygonumviviparum)、大萼委陵菜(Potentillaconferta)、雜色鐘報(bào)春(Primulaalpicola)、大萼藍(lán)鐘花(Cyananthusmacrocalyx)、舌葉垂頭菊(Cremanthodiumlinguiatum)、錫金柳葉菜(Epilobiumsikkimense)等植物苗及種子移栽至培育園內(nèi)，使之與培育園內(nèi)原有植被一同旺盛生長獲得高寒植物苗。4.從培育園附近冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)馬鈴薯培養(yǎng)基分離純化菌種，經(jīng)分子生物學(xué)方法及形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，進(jìn)一步經(jīng)大麥固態(tài)培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，將發(fā)酵獲得的菌團(tuán)用攪拌器均勻打碎，并按發(fā)酵物重量與水體積比1∶1000進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，將培養(yǎng)基顆粒物用孔徑2mm的紗布粗過濾后，作為冬蟲夏草菌源。5.每年5～11月，選擇白天溫度不超過18℃，晚上溫度不低于4℃的陰云天氣，將制備的冬蟲夏草菌源利用灌溉管路或加壓噴槍均勻噴淋接種到培育園高寒植物苗上，每平方米噴入450ml懸浮液，1天內(nèi)分早中晚3次噴施，噴施后用黑色遮陰網(wǎng)遮陰共生培育7天后，采用顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成大量共生體，經(jīng)分子檢驗(yàn)菌絲為中國被毛孢后，可直接作為具有高侵染活性的菌種材料。6.選擇白天溫度不超過20℃，晚上溫度不低于0℃的陰云天氣，在中午氣溫較高時(shí)寄主蒲氏鉤蝠蛾(Thitarodespui)幼蟲投置到冬蟲夏草菌中國被毛孢與高寒植物苗形成共生體的培育區(qū)，每平方米約控釋50頭，使蒲氏鉤蝠蛾幼蟲取食并充分接觸高侵染活性的共生體菌種材料，14天后將蒲氏鉤蝠蛾幼蟲從土壤中挖出采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測蒲氏鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，蒲氏鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為86.7％。實(shí)施例二1.在青藏高原海拔4600米的冬蟲夏草適生地區(qū)域的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，保留原有草甸植被，以20m×20m為一個(gè)單位建設(shè)培育園，培育園內(nèi)規(guī)劃建設(shè)成19個(gè)75cm×1920cm的高寒植物原生態(tài)草甸培育壟區(qū)，在每個(gè)壟面上方80cm處鋪設(shè)一條噴淋管及配套水泵設(shè)施，用于噴施水肥管理，壟間挖開寬、深分別為27.5cm×10cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，培植園四周分別留下約40cm的工作區(qū)。2.每年5～11月視當(dāng)月降水量情況每個(gè)月噴淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在45％左右，在第一次噴水中加入水：尿體積比為100∶20濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機(jī)牛糞肥或羊糞肥干重每平方米約150g。3.利用原生態(tài)溫濕度及光照條件，促進(jìn)培育園內(nèi)原有的柔軟點(diǎn)地梅(Androsacemollis)、纖細(xì)委陵菜(Potentillagracillima)、狹葉圓穗蓼(Polygonummacrophyllum)和薩嘎苔草(Carexsagaensis)等植物旺盛生長；同時(shí)在高寒草甸采集上述植物的幼苗及種子，通過離體組織快速繁殖技術(shù)獲得組培苗，并將組培苗移栽至壟內(nèi)，促進(jìn)其旺盛生長獲得高寒植物苗。4.在每年6～10月在培育園附近的冬蟲夏草適生地采集新鮮冬蟲夏草子囊孢子，直接稀釋制成懸浮液，通過顯微鏡計(jì)數(shù)使每毫升懸浮液中含有1000個(gè)子囊孢子，作為冬蟲夏草菌源。5.每年6～10月，選擇白天溫度不超過18℃，晚上溫度不低于4℃，將制備的冬蟲夏草菌源，噴淋接種到高寒植物苗上，每平方米噴淋350ml菌懸液，連續(xù)噴施7天，每天1次，午后噴施，噴施后用黑色遮陰網(wǎng)遮陰共生培育30天后，采用顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物組培組織纏繞形成大量共生體，經(jīng)分子檢驗(yàn)菌絲為中國被毛孢后，可直接作為對寄主鉤蝠蛾幼蟲具有高侵染活性的菌種材料。6.選擇白天溫度不超過18℃，晚上溫度不低于0℃，在中午氣溫較高時(shí)寄主色季拉鉤蝠蛾(Thitarodessejilaensis)幼蟲投置到冬蟲夏草菌的無性階段中國被毛孢與高寒植物苗形成共生體的培育區(qū)，每平方米約控釋100頭，使色季拉鉤蝠蛾幼蟲取食并充分接觸高侵染活性的共生體菌種材料，15天后將色季拉鉤蝠蛾幼蟲從土壤中挖出采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測色季拉鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，色季拉鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為89.3％。實(shí)施例三1.在青藏高原海拔3700米的冬蟲夏草適生地區(qū)域的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，保留原有草甸植被，以20m×10m為一個(gè)單位建設(shè)培育園，培育園內(nèi)規(guī)劃建設(shè)成19個(gè)75cm×920cm的高寒植物原生態(tài)草甸培育壟區(qū)，在每個(gè)壟面上方50cm處鋪設(shè)一條噴淋管及配套水泵設(shè)施，用于噴施水肥管理，壟間挖開寬、深分別為27cm×10cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，培植園四周分別留下約45cm的工作區(qū)。2.每年5～11月視當(dāng)月降水量情況每個(gè)月噴淋水一至四次，使15cm深度的土壤含水量保持在35％左右，在一次噴水中加入水：尿體積比為100∶10濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機(jī)牛糞肥或羊糞肥干重每平方米約175g。3.利用原生態(tài)溫濕度及光照條件，促進(jìn)培育園內(nèi)原有的珠芽蓼(Polygonumviviparum)、禾葉風(fēng)毛菊(Saussureagraminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifiaa)、高山唐松草(Thalictrumalpinum)、火絨草(Leontopodiumhastioides)、頭花蓼(Polygonummacrophytum)等植物旺盛生長。4.在每年5～9月在培育園附近的冬蟲夏草適生地采集新鮮冬蟲夏草子囊孢子，直接稀釋制成懸浮液，通過顯微鏡計(jì)數(shù)使每毫升懸浮液中含有100個(gè)子囊孢子，作為冬蟲夏草菌源。5.每年5～9月，選擇白天溫度不超過18℃，晚上溫度不低于4℃，將制備的冬蟲夏草菌源，噴淋接種到高寒植物苗上，每平方米噴淋500ml菌懸液，連續(xù)噴施5天，每天1次，午后噴施，噴施后用黑色遮陰網(wǎng)遮陰共生培育20天后，采用顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物組培組織纏繞形成大量共生體，經(jīng)分子檢驗(yàn)菌絲為中國被毛孢后，可直接作為具有高侵染活性的菌種材料。6.選擇白天溫度不超過18℃，晚上溫度不低于0℃，在中午氣溫較高時(shí)寄主蟲草鉤蝠蛾(Thitarodesarmoricanus)幼蟲投置到冬蟲夏草菌中國被毛孢與高寒植物苗形成共生體的培育區(qū)，每平方米約控釋100頭，使蟲草鉤蝠蛾幼蟲取食并充分接觸高侵染活性的共生體菌種材料，12天后將蟲草鉤蝠蛾幼蟲從土壤中挖出采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測蟲草鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，蟲草鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為85.9％。實(shí)施例四1.在青藏高原海拔5200米的冬蟲夏草適生地區(qū)域的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，保留原有草甸植被，以15m×10m為一個(gè)培育園建設(shè)單位，培育園內(nèi)規(guī)劃建設(shè)2排50cm×450cm的高寒植物原生態(tài)草甸培育壟區(qū)，在每個(gè)壟面上方30cm處鋪設(shè)一條噴淋管及配套水泵設(shè)施，用于噴施水肥管理，壟間挖開寬、深分別為20cm×5cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，培植園四周及排間分別留下約35cm的工作區(qū)。2.每年5～11月視當(dāng)月降水量情況每個(gè)月噴淋水一至四次，使深度為15cm的土壤含水量保持在25％左右，在第一次噴水中加入水：尿體積比為100∶13濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機(jī)牛糞肥或羊糞肥干重每平方米約200g。3.采集培育園附近的圓穗蓼(Polygonummacrophyrum)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、高山唐松草(Thactriunalpinun)、矮火絨草(Leontopodiumalpinumm)、委陵菜(Potentillaanserine)、高山嵩草(Kobrasiapygmaea)、黑褐苔草(Carexatrofusca)等植物的種子收集后撒入培育園內(nèi)，利用原生態(tài)溫濕度及光照條件，并使之旺盛生長。4.從青海玉樹地區(qū)的冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)肉湯培養(yǎng)基分離純化菌種，經(jīng)分子生物學(xué)方法或形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，進(jìn)一步經(jīng)通常普通肉湯液體培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵25天，然后置于小麥為底物的固體培養(yǎng)基上再繼續(xù)發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并將發(fā)酵獲得菌團(tuán)用攪拌器均勻打碎，按發(fā)酵物重量與水體積比1∶500進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，將培養(yǎng)基顆粒物用孔徑1.5mm的紗布粗過濾后，作為冬蟲夏草菌源；5.每年7～9月，選擇白天溫度不超過18℃，晚上溫度不低于4℃，將制備的冬蟲夏草菌源均勻噴淋接種到培育園高寒植物苗上，每平方米噴入300ml菌懸液，噴完后用黑色遮陰網(wǎng)遮陰，連續(xù)噴施3天，每天噴施2次，早晚各一次，遮陰共生培育15天后，采用顯微鏡檢查共培養(yǎng)的冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成大量共生體；經(jīng)分子檢驗(yàn)菌絲為中國被毛孢后，將共生體地上部分割回，將共生體組織切成5～20mm小段，制備成具有高侵染活性的菌種材料，用遮陰保水保鮮方法存放于2℃，保存?zhèn)溆茫?.將制備的高侵染活性菌種材料投喂冬蟲夏草寄主比如鉤蝠蛾(Thitarodesbiruens)幼蟲，每頭投入5g高侵染活性菌種材料，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種材料，7天后將比如鉤蝠蛾幼蟲從飼養(yǎng)盒中挖出，采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測比如鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，比如鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為91.2％。實(shí)施例五1.在青藏高原海拔2500米的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，以10m×20m為一個(gè)單位建設(shè)培育園，將培育園內(nèi)原有草甸植被除去并將土壤平整，在培育園內(nèi)規(guī)劃建設(shè)成8個(gè)90cm×1900cm的高寒植物原生態(tài)草甸培育壟區(qū)，在每個(gè)壟面上方75cm處鋪設(shè)一條噴淋管及配套水泵設(shè)施，用于噴施水肥管理，壟間挖開寬、深分別為30cm×8cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，培植園四周分別留下約50cm的工作區(qū)。2.每年5～11月視當(dāng)月降水量情況每個(gè)月噴淋水一至四次，使土壤15cm深處的含水量保持在33％左右，每月在一次噴水中加入水：尿體積比為100∶15濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機(jī)牛糞肥或羊糞肥干重每平方米約210g。3.采集高山嵩草(Kobresiapygmaea)、一歲苔草(Carexheterostachya)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、禾葉風(fēng)毛菊(Saussureagraminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、高山唐松草(Thalictrumalpinum)、火絨草(Leontopodiumhastioides)、頭花蓼(Polygonummacrophytum)等植物及種子移栽至培育園中，利用原生態(tài)溫濕度及光照條件，并使之旺盛生長獲得高寒植物苗。4.從青海玉樹地區(qū)冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)察氏培養(yǎng)基分離純化菌種，經(jīng)分子生物學(xué)方法或形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，經(jīng)通常蛋白胨水液體培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并將發(fā)酵獲得的菌球用攪拌器均勻打碎，最后按發(fā)酵液與水體積比1∶100進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，作為冬蟲夏草菌源。5.每年9～10月，選擇白天溫度不超過20℃，晚上溫度不低于4℃的陰云天氣，將制備的冬蟲夏草菌源，利用灌溉管路或加壓噴槍均勻噴淋接種到培育園高寒植物苗上，每平方米噴入400ml懸浮液，連續(xù)噴施4天，每天噴施2次，早晚各1次，噴完后用黑色遮陰網(wǎng)遮陰共生培育25天后，采用顯微鏡檢查冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲與高寒植物根、葉、莖組織纏繞形成共生體，經(jīng)分子檢驗(yàn)菌絲為中國被毛孢后，將獲得的共生體組織切成5～20mm小段，制備成具有高侵染活性的菌種材料，用遮陰保水保鮮方法存放于4℃，保存?zhèn)溆谩?.將制備的高侵染活性菌種材料投喂冬蟲夏草寄主玉樹鉤蝠蛾Thitarodesyushuensi幼蟲，每頭幼蟲投放5～10克，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種材料，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，玉樹鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率約為90.8％。實(shí)施例六(反向例)1.在青藏高原海拔2500米的高寒草甸區(qū)，選取地勢排水較好的區(qū)域，以10m×20m為一個(gè)單位建設(shè)培育園，將培育園內(nèi)原有草甸植被除去并將土壤平整，在培育園內(nèi)規(guī)劃建設(shè)成8個(gè)90cm×1900cm的高寒植物原生態(tài)草甸培育壟區(qū)，在每個(gè)壟中間高75cm處鋪設(shè)一條噴淋管及配套水泵設(shè)施，用于噴施水肥管理，壟間挖開寬、深分別為30cm×8cm的區(qū)域便于排水及管理人員行走，培植園四周分別留下約50cm的工作區(qū)。2.每年5～11月視當(dāng)月降水量情況每個(gè)月噴淋水一至四次，使土壤15cm深處的含水量保持在33％左右，每月在一次噴水中加入水：尿體積比為100∶15濃度的牛羊尿或人尿，每年5月施放一次有機(jī)牛糞肥或羊糞肥干重每平方米約210g，采集高山嵩草(Kobresiapygmaea)、一歲苔草(Carexheterostachya)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)、禾葉風(fēng)毛菊(Saussureagraminea)、多裂委陵菜(Potentillamultifida)、高山唐松草(Thalictrumalpinum)、火絨草(Leontopodiumhastioides)、頭花蓼(Polygonummacrophytum)等植物及種子移栽至培育園中，并使之旺盛生長獲得高寒植物苗。3.從青海玉樹地區(qū)冬蟲夏草主產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)察氏培養(yǎng)基分離純化菌種，經(jīng)分子生物學(xué)方法或形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，經(jīng)通常蛋白胨水液體培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，并將發(fā)酵獲得的菌球用攪拌器均勻打碎，最后按發(fā)酵液與水體積比1∶100進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，作為冬蟲夏草菌源。4.將獲得的高寒植物苗地上及地下部分組織切成5～20mm小段作為鉤蝠蛾幼蟲的飼料，同時(shí)將冬蟲夏草菌源噴淋到高寒植物飼料表面或噴淋到替代飼料如胡蘿卜表面，直接投喂冬蟲夏草寄主玉樹鉤蝠蛾Thitarodesyushuensi幼蟲，每頭幼蟲投放5～10克，使寄主幼蟲取食并充分接觸菌種，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，玉樹鉤蝠蛾幼蟲被中國被毛孢侵染率只有29.4％。實(shí)施例七(反向例)1.從西藏那曲冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草，采用常規(guī)馬鈴薯培養(yǎng)基分離純化菌種，經(jīng)分子生物學(xué)方法及形態(tài)學(xué)方法鑒定為中國被毛孢(Hirsutellasinensis)，進(jìn)一步經(jīng)大麥固態(tài)培養(yǎng)基在13±5℃發(fā)酵為冬蟲夏草菌中國被毛孢菌絲體及分生孢子或芽生孢子，將發(fā)酵獲得的菌球用攪拌器均勻打碎，并按發(fā)酵物重量與水體積比1∶100進(jìn)一步將菌絲體及分生孢子或芽生孢子稀釋攪勻成的懸浮液，將培養(yǎng)基顆粒物用孔徑2mm的紗布粗過濾后，作為冬蟲夏草菌源；2.將制備的冬蟲夏草菌源直接噴淋到冬蟲夏草寄主比如鉤蝠蛾Thitarodesbiruens幼蟲，使寄主幼蟲充分接觸菌種，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，中國被毛孢侵染比如鉤蝠蛾幼蟲的侵染率只有21.7％。實(shí)施例八(反向例)1.在每年的6～8月在青海玉樹的冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)采集新鮮冬蟲夏草子囊孢子，直接稀釋制成懸浮液，通過顯微鏡計(jì)數(shù)使每毫升懸浮液中含有1000個(gè)子囊孢子，作為冬蟲夏草菌源。2.將冬蟲夏草菌源直接噴淋到冬蟲夏草寄主玉樹鉤蝠蛾Thitarodesyushuensi幼蟲，使寄主幼蟲充分接觸菌種，10天后采用顯微鏡檢查及分子生物方法檢測玉樹鉤蝠蛾幼蟲血淋巴中的中國被毛孢蟲菌體。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，玉樹鉤蝠蛾幼蟲被冬蟲夏草子囊孢子的侵染率只有10.8％。