国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      一種高效率、高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)1,3?丙二醇的方法與流程

      文檔序號(hào):11293684閱讀:751來(lái)源:國(guó)知局
      一種高效率、高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域,具體地說(shuō),是關(guān)于一種通過(guò)克雷伯氏肺炎桿菌,并適度強(qiáng)化克雷伯氏肺炎桿菌的3-羥基丙酸代謝途徑高效率、高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法。

      背景技術(shù):
      1,3-丙二醇(1,3-porpanediol,簡(jiǎn)稱(chēng)1,3-PD)是一種重要的化工原料,可用作溶劑、抗凍劑或保護(hù)劑、精細(xì)化工原料以及新型聚醋——聚對(duì)苯二甲酸丙二醇醋(PTT)和聚氨醋的單體。PTT已被證明是一種性能優(yōu)異的新型聚酯材料。目前1,3-PD生產(chǎn)主要采用生物合成。生物合成法的主要路線是在微生物的作用下將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD。目前,自然界中能將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD的微生物大致包括:克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsielapneumoniae)、弗氏檸檬菌(Citrobacterfreundi)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)等。研究表明克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)1,3-PD的能力最強(qiáng),國(guó)內(nèi)也有一些相關(guān)的生產(chǎn)菌種專(zhuān)利,如:1、周勝等,一種紅樹(shù)林克雷伯氏菌及其在生產(chǎn)1,3-丙二醇中的應(yīng)用(授權(quán)號(hào):CN102604863);2、劉德華等,一株高產(chǎn)1,3-丙二醇的微生物(公開(kāi)號(hào):CN103740609A)。但是缺少高轉(zhuǎn)化率高效率的生產(chǎn)菌種依然是制約1,3-PD產(chǎn)業(yè)化的主要障礙。克雷伯氏肺炎桿菌中,1,3-PD在的生物合成代謝途徑研究表明:①其甘油第一個(gè)氧化與還原途徑與分配節(jié)點(diǎn)具有剛性,這種剛性調(diào)節(jié)很大程度上和菌種的本身的特性有關(guān);②還原途徑上的中間產(chǎn)物3-羥基丙醛的積累是影響1,3-PD的重要因數(shù)。目前也有一些解除中間產(chǎn)物3-羥基丙醛積累的研究,如:①過(guò)表達(dá)1,3-PD氧化還原酶;②過(guò)表達(dá)3-羥基丙醛脫氫酶等。但是過(guò)表達(dá)1,3-氧化還原酶對(duì)1,3-PD的生產(chǎn)促進(jìn)作用很小,過(guò)表達(dá)3-醛基丙醛脫氫酶又會(huì)造成3-羥基丙酸(3-HP)的積累,這樣很難獲高的1,3-PD產(chǎn)量。

      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
      本申請(qǐng)的發(fā)明人在研究中通過(guò)選育,獲得了一株高產(chǎn)1,3-PD的克雷伯氏肺炎桿菌KlebsielapneumoniaeKG。KlebsielapneumoniaeKG于2014年11月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址:湖北省武漢市洪山區(qū)八一路,武漢大學(xué),中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心郵政編碼:430072),保藏號(hào)CCTCCM2014574。該克雷伯氏肺炎桿菌用于轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇時(shí)相比其他的克雷伯氏菌具有更高的轉(zhuǎn)化效率。進(jìn)一步適度強(qiáng)化克雷伯氏肺炎桿菌的3-HP代謝途徑,適度強(qiáng)化3-HP代謝途徑既解決了3-羥基丙醛的積累又避免了過(guò)多副產(chǎn)物3-HP的抑制,克服了以往過(guò)度表達(dá)的缺點(diǎn)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法,包括種子培養(yǎng)以及發(fā)酵罐發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘油生成1,3-丙二醇,該方法通過(guò)克雷伯氏肺炎桿菌CCTCCM2014574,并在克雷伯氏肺炎桿菌中適度強(qiáng)化表達(dá)3-羥基丙醛脫氫酶,實(shí)現(xiàn)了高效率、高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)1,3-PD。根據(jù)本發(fā)明,所述適度強(qiáng)化表達(dá)是通過(guò)Tac啟動(dòng)子的滲漏表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明,所述的3-羥基丙醛脫氫酶基因可以來(lái)源于克雷伯氏肺炎桿菌,大腸桿菌。相比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-PD的方法,本發(fā)明的方法的主要優(yōu)點(diǎn)包括:產(chǎn)物濃度高,生產(chǎn)強(qiáng)度大,轉(zhuǎn)化率高。附圖說(shuō)明圖1:KG菌株的16srDNA的同源性分析具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解,以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明,而非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)例中:LB培養(yǎng)基為:0.5%酵母提取物,1%胰蛋白胨,1%NaCl,pH7.0;固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入1.2%-1.5%的瓊脂。斜面培養(yǎng)基為:K2HPO43H2O7g/L,(NH4)2SO41g/L,KH2PO42g/L,MgCl27H2O0.1g/L,酵母膏7g/L,微量元素各0.3mL,調(diào)整pH7.0,瓊脂2g/L。種子培養(yǎng)基為:K2HPO43H2O7g/L,(NH4)2SO41g/L,KH2PO42g/L,MgCl27H2O0.1g/L,酵母膏7g/L,微量元素各0.3mL,調(diào)整pH7.0后加入NaCl調(diào)節(jié)滲透壓。發(fā)酵罐培養(yǎng)基為:KCl0.75g/L,NaH2PO41.38g/L,(NH4)2SO45.35g/L,Na2SO40.28g/L,MgSO46H2O0.26g/L,檸檬酸0.42g/L,酵母粉2g/L,微量元素各0.3mL,調(diào)整pH7.0。微量元素的配方如下:ZnCl234.2g/L,F(xiàn)eCl36H2O2.7g/L,MnCl24H2O10g/L,CuCl22H2O0.85g/L,CoCl22H2O23.8g/L,H3BO30.31g/L,Na2MoO40.25g/L實(shí)施例中,測(cè)定發(fā)酵液中菌體干重的方法如下:取1.0mL發(fā)酵液稀釋7~10倍,以去離子水為對(duì)照,在721分光光度計(jì)上于620nm讀取OD。取不同菌濃(即不同620nm吸光值)的菌液10mL,經(jīng)離心收集菌體,并用去離子水洗滌二遍洗滌,將再次離心收集后的菌體于80℃烘箱中干燥至恒重。稱(chēng)量菌體作出菌體干重與OD620的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并回歸出關(guān)系式。以后菌體的干重根據(jù)測(cè)定的菌液的OD620值由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸關(guān)系式計(jì)算得出。1,3-丙二醇的生成速率定義為:每小時(shí)每升發(fā)酵液生成的1,3-丙二醇克數(shù)單位為g/L·h。1,3-丙二醇的轉(zhuǎn)化率定義為:消耗每摩爾甘油原料生產(chǎn)的1,3-丙二醇摩爾數(shù)。實(shí)例中,β-半乳糖糖苷酶的酶活定義為:1U為37℃條件下1分鐘催化1nmolONPG的酶量。比酶活單位(U/mg)定義為單位菌體干重(mg)所含有的酶量(U)。實(shí)施例1、KG的鑒定用革蘭氏陰性腸道微生物理化試劑盒API20E(法國(guó)梅里埃)對(duì)KG的各項(xiàng)理化指標(biāo)進(jìn)行分析。理化鑒定步驟根據(jù)API20E操作手冊(cè),鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)照API20E手冊(cè),表明KG屬于克雷伯氏肺炎桿菌。表1:API20E理化鑒定結(jié)果用細(xì)菌16srDNA通用引物27f(AGAGTTTGATCCTGGCTCA)與1394r(TACGGCTACCTTGTTACGAGTT)以KG基因組為模板PCR擴(kuò)增KG的16srNDA基因,膠回收目的條帶,測(cè)序后得到KG的16sNDA序列(SEQIDNO.1)。16srNDA的同源比對(duì)結(jié)果表明KG屬于克雷伯氏肺炎桿菌(附圖1)。實(shí)施例2、KG能高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)1,3-PD將KG與對(duì)照菌K.pneumoniaeATCC49790,接入250ml的搖瓶(裝液量50ml)進(jìn)行種子培養(yǎng)20小時(shí),后接入5L發(fā)酵罐中(發(fā)酵液裝液量2L),按照如下所示的工藝條件控制發(fā)酵過(guò)程。初始甘油濃度60g/L,發(fā)酵溫度35℃;通氣量1.0vvm;攪拌轉(zhuǎn)速20rpm;在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)加入NaOH溶液控制pH值為5.5~7.5。在發(fā)酵的各個(gè)時(shí)期通過(guò)補(bǔ)入不同濃度甘油溶液控制甘油濃度在10~60g/L,發(fā)酵30小時(shí)結(jié)束。發(fā)酵結(jié)果表2所示:表2:KG與ATCC49790的發(fā)酵比較從表2中可以看出,同其他1,3-PD生產(chǎn)菌如ATCC49790相比,KG菌株1,3-PD的轉(zhuǎn)化效率明顯高,轉(zhuǎn)化率超過(guò)0.6。實(shí)施例3、構(gòu)建含適度表達(dá)啟動(dòng)子Tac的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)載體骨架選用pET28a,Tac啟動(dòng)子序列取之pGEX-4T-1。用一對(duì)含有BglII-EcoRI酶切位點(diǎn)的引物(GGAagatctACGTTATCGACTGCACGG,GGCgaattcCATGAATACTGTTTCCTGT),將pGEX-4T-1上的Tac啟動(dòng)區(qū)域260bp(SEQIDNO.2)擴(kuò)增出來(lái),并插入到pET28a的BglII-EcoRI酶切位點(diǎn),替換掉pET28a原有的T7啟動(dòng)子區(qū)域構(gòu)建可在克雷伯氏菌中能適度基因表達(dá)的表達(dá)載體pETac。為了證明pETac能在克雷伯氏肺炎桿菌中能適度表達(dá)基因,用報(bào)告基因(lacZ),對(duì)啟動(dòng)子Tac進(jìn)行分析。lacZ(編碼半乳苷酶的基因)來(lái)源于大腸桿菌。用含HindIII-XhoI的一對(duì)引物(CACaagcttGCGTTTTACAACGTCGTGAC,CCGctcgagTTATTTTTGACACCAGACCA)從大腸桿菌BL21的基因組上pcr擴(kuò)增出3075bp的lacZ基因并插入到pETac表達(dá)載體Tac啟動(dòng)子的下游,構(gòu)建重組質(zhì)粒pETac::lacZ,并繼續(xù)將pETac::lacZ電轉(zhuǎn)至KG中,同時(shí)將pET28a電轉(zhuǎn)至KG中作為對(duì)照。將獲得的轉(zhuǎn)化株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)后收集菌體測(cè)定β-半乳糖糖苷酶活,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所以。表3:各轉(zhuǎn)化株β-半乳糖糖苷酶表達(dá)情況Tac啟動(dòng)子是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中常用的誘導(dǎo)性強(qiáng)啟動(dòng)子,其啟動(dòng)需要IPTG的誘導(dǎo)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Tac啟動(dòng)子在克雷伯肺炎桿菌中雖然也能在IPTG誘導(dǎo)下高效表達(dá),但是Tac啟動(dòng)子在克雷伯氏肺炎桿菌中有較大的滲漏表達(dá)。在沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)的條件下也能有不錯(cuò)的表達(dá),能作為克雷伯氏菌中適度表達(dá)的“組成型”啟動(dòng)子。實(shí)施例4、在KG中適度增強(qiáng)3-羥基丙醛脫氫酶高效率的生產(chǎn)1,3-PD克雷伯氏肺炎桿菌中能轉(zhuǎn)化3-羥基丙醛到3-HP的3-羥基丙酸脫氫酶可由來(lái)源于克雷伯菌的aldA(SEQIDNO.3),puuC(SEQIDNO.4),ydcW(SEQIDNO.5);以及來(lái)源于大腸桿菌的aldH(SEQIDNO.6),ydcW(SEQIDNO.7)的基因編碼。以利用肺炎桿菌的puuC基因適度增強(qiáng)3-羥基丙醛脫氫酶為例。用一對(duì)含有HindIII-XhoI酶切位點(diǎn)的引物(CCCaagcttGCATGATGAATTTTCAGCACCT,CCGctcgagGTCAAGACTCCAGGGCAATCC)以KG基因組為模板,pcr擴(kuò)增puuC基因,并插入到pETac的Tac啟動(dòng)子下游的HindIII-XhoI位點(diǎn),構(gòu)建重組質(zhì)粒pETac::puuC,并進(jìn)一步將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至KG中,并篩選獲得轉(zhuǎn)化菌株KG/pETac::puuC。以實(shí)例2的發(fā)酵條件,采用重組菌KG/pETac::puuC進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。表4:適度表達(dá)3-羥基丙酸脫氫酶的發(fā)酵結(jié)果從表3中可以看出,適度強(qiáng)化3-羥基丙酸脫氫酶后(KG/pETac::lacZ,不誘導(dǎo)),1,3-PD發(fā)酵不僅獲得了高的轉(zhuǎn)化率,而且生產(chǎn)速度更快、效率更高。過(guò)表達(dá)3-羥基丙酸脫氫酶會(huì)造成3-HP的積累,反而不利于1,3-PD的發(fā)酵。<110>華東理工大學(xué)<120>一種高效率、高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法<130>2014<160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1551<212>DNA<213>K.pneumoniaeKG<400>1acttaaattgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacat60gcaagtcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagt120aatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgc180ataatgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccaga240tgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctga300gaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagt360ggggaata...
      當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 
      網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
      • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
      1