新型硝基還原酶底物本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00880018139.1申請(qǐng)日為2008年5月29日的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及用于檢測(cè)硝基還原酶活性的新型酶底物。這些底物可用于包括產(chǎn)生物理化學(xué)信號(hào)的酶水解步驟的應(yīng)用，尤其用于微生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、組織學(xué)等中。當(dāng)前存在非常多的檢測(cè)微生物的介質(zhì)。該檢測(cè)可以尤其基于使用特別的底物，所述底物對(duì)需要檢測(cè)的微生物酶具有特異性。通常而言，合成的酶底物由對(duì)待發(fā)現(xiàn)的酶活性具有特異性的第一部分和用作標(biāo)簽(通常為發(fā)色或熒光標(biāo)記)的第二部分。因此，在細(xì)菌的情況下，取決于是否有反應(yīng)來(lái)選擇底物，可以表征微生物的性質(zhì)。硝基還原酶活性可以尤其用于發(fā)現(xiàn)一組、一種或一類(lèi)細(xì)菌。還可以用于監(jiān)控微生物的還原新陳代謝，例如與其生長(zhǎng)或抑制該生長(zhǎng)相關(guān)的還原新陳代謝。某些細(xì)菌還原硝基芳族化合物的能力為人所知已經(jīng)許多年。Asnis(1957)報(bào)導(dǎo)了由大腸桿菌萃取物中分離能夠還原對(duì)硝基苯甲酸的黃素蛋白。自從該報(bào)導(dǎo)之后，在多種生物體中已經(jīng)鑒別出硝基芳基還原酶活性。這包括嚴(yán)格的需氧微生物，例如假單胞菌(Won等，1974)和諾卡氏菌(Villanueva，1964)，嚴(yán)格的厭氧微生物，例如梭菌(Ancermaier和Simon，1983)和韋榮氏球菌(McCormick等，1976)，或者真菌類(lèi)(Masuda和Ozaki，1993)以及真核寄生蟲(chóng)(Douch，1975)。存在著據(jù)認(rèn)為能夠通過(guò)細(xì)菌硝基芳基還原酶而被還原的大范圍的底物。它們尤其為硝基芳族化合物，例如對(duì)硝基苯甲酸、對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯胺及2,4,6-三硝基甲苯(McCormick等，1976)。通常而言，硝基還原酶的酶活性的檢測(cè)是通過(guò)間接的方法，例如通過(guò)監(jiān)控底物或輔助因子的消失而進(jìn)行。例如，Kitamura等(1983)研究了對(duì)硝基苯甲酸甲酯及一系列其他的硝基芳族化合物與大腸桿菌萃取物的還原。然而，該方法并不非常靈敏且不適合用于在多相介質(zhì)中進(jìn)行檢測(cè)。還可以提及申請(qǐng)WO00/28073，其描述了基于硝基香豆素的熒光底物用于直接檢測(cè)硝基芳基還原酶的活性。該類(lèi)硝基芳族化合物能夠在還原后形成高度熒光的化合物，因而易于被檢測(cè)。然而，該底物并不適合用于在多相介質(zhì)中的檢測(cè)。因而，本發(fā)明建議改進(jìn)用于檢測(cè)微生物的硝基還原酶底物。與現(xiàn)有的底物相比，這些新型的底物易于合成且由于其形成一種不在反應(yīng)介質(zhì)中擴(kuò)散的顏色而可以尤其用于在膠體介質(zhì)中以檢測(cè)微生物。在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述之前，給出如下定義以便于本發(fā)明的公開(kāi)。術(shù)語(yǔ)“酶底物”用于指可以通過(guò)酶進(jìn)行水解以形成產(chǎn)物，從而允許微生物細(xì)胞或細(xì)胞器的直接或間接檢測(cè)的底物。在硝基還原酶底物的情況下，該底物尤其包含硝酸鹽官能團(tuán)，其通過(guò)待發(fā)現(xiàn)的酶活性而被部分或全部還原，該硝基官能團(tuán)的還原改變使分子的某些物理化學(xué)性質(zhì)，使該還原反應(yīng)得以跟蹤。本發(fā)明的底物尤其適用于流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry)，這是因?yàn)檫€原產(chǎn)物主要保留在表達(dá)酶活性的細(xì)胞中，所以可以具體數(shù)出表達(dá)該活性的細(xì)胞或甚至將其與其他樣品分開(kāi)。本發(fā)明的底物還適用于組織酶學(xué)，這是因?yàn)檫€原產(chǎn)物主要保留在還原點(diǎn)上，所以可以具體識(shí)別出在組織中表達(dá)該活性的細(xì)胞或細(xì)胞器。由于其具有低毒性，本發(fā)明的底物適于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)硝基還原酶活性。本發(fā)明的底物還非常適合用于檢測(cè)和/或識(shí)別介質(zhì)中，這是因?yàn)樗鼈冃纬稍诜磻?yīng)介質(zhì)中不擴(kuò)散的顏色或熒光。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“顏色”包括可見(jiàn)光譜中的顏色，其吸收可見(jiàn)光譜中的光或熒光，其在一個(gè)波長(zhǎng)(λex)吸收且在較高的波長(zhǎng)(λem)發(fā)光。本發(fā)明的底物可以成鹽，即呈諸如為氯化物、溴化物、鉀鹽或三氟乙酸鹽的鹽的形式。術(shù)語(yǔ)“硝基還原酶”用于指可以完全或部分還原NO2基團(tuán)的酶。術(shù)語(yǔ)“烷基”用于指基于飽和烴基團(tuán)的鏈，尤其例如C1-C6烷基，即含有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。例如可以提及甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、異戊基及己基。術(shù)語(yǔ)“芳基”用于指由芳環(huán)衍生的官能團(tuán)(或取代基)，例如C6-C10芳環(huán)，尤其為苯基、芐基、1-萘基或2-萘基。術(shù)語(yǔ)“羧基”用于尤其指由經(jīng)由一個(gè)雙鍵而與第一個(gè)氧原子連接且經(jīng)由一個(gè)單鍵而與第二個(gè)氧原子相連的碳原子組成的官能團(tuán)，其中所述第二個(gè)氧原子為電負(fù)性或者與氫原子相連接。取決于分子的pKa以及介質(zhì)的pH，所述羧基可以呈離子化的形式，即第二個(gè)氧原子未連接H，則其為電負(fù)性。術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)介質(zhì)”用于指包含表達(dá)細(xì)胞或細(xì)胞器的新陳代謝和/或微生物生長(zhǎng)所需所有成分的介質(zhì)。該反應(yīng)介質(zhì)可以用于流式細(xì)胞術(shù)、組織酶學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)等，或者用作微生物檢測(cè)和/或識(shí)別介質(zhì)。所述反應(yīng)介質(zhì)可以為固體、半固體或液體。術(shù)語(yǔ)“固體介質(zhì)”用于例如指凝膠化的介質(zhì)。瓊脂在微生物學(xué)中為用于培養(yǎng)微生物的常規(guī)凝膠劑，但是可以使用明膠或瓊脂糖。有些制品是可商購(gòu)獲得的，例如哥倫比亞瓊脂、胰酪蛋白胨大豆瓊脂、麥康基瓊脂、沙鮑洛瓊脂，或者更通常而言描述于MicrobiologicalMedia(CRCPress)手冊(cè)中的那些。反應(yīng)介質(zhì)可以包含一種成分或多種組合成分，例如氨基酸類(lèi)、蛋白胨、烴、核苷酸、礦物質(zhì)、維生素、抗體、表面活性劑、緩沖溶液、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽或金屬鹽類(lèi)。所述介質(zhì)還可以包含著色劑。例如作為著色劑可以提及伊文思藍(lán)、中性紅、羊血、馬血、遮光劑例如氧化鈦、硝基苯胺、孔雀綠、亮綠等。所述反應(yīng)介質(zhì)可以為“檢測(cè)和/或識(shí)別介質(zhì)”，即顯影介質(zhì)或培養(yǎng)及顯影介質(zhì)。在第一種情況下，在接種之前培養(yǎng)微生物，并且在第二種情況下，檢測(cè)和/或識(shí)別介質(zhì)還構(gòu)成培養(yǎng)介質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“生物樣品”用于指由生物流體試樣衍生的臨床樣品，或者由任何類(lèi)型食品衍生的食品樣品。該樣品因此可以為液體或者固體，而且可以沒(méi)有限制性地提及血液、血漿、尿液或糞便的臨床樣品，或者來(lái)自鼻子、喉嚨、皮膚、傷口或腦脊髓液的試樣，來(lái)自水或諸如奶或果汁的飲料、酸奶、肉類(lèi)、蛋類(lèi)、蔬菜、蛋黃醬、奶酪、魚(yú)類(lèi)等的食品樣品，或者由動(dòng)物飼料例如尤其由動(dòng)物飲食而衍生的食品樣品。所述樣品還可以為來(lái)自臨床環(huán)境的試樣、家畜試樣、來(lái)自食品、化妝品或醫(yī)藥產(chǎn)品的試樣。術(shù)語(yǔ)“環(huán)境試樣”用于尤其指由表面、液體、原料或由產(chǎn)物提取的試樣。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“微生物”涵蓋細(xì)菌、尤其為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、酵母、寄生蟲(chóng)、真菌，并且更通常而言為通常為單細(xì)胞、人眼看不見(jiàn)且可以在實(shí)驗(yàn)室復(fù)制且操作的生物體。作為革蘭氏陰性菌，可以提及如下屬的細(xì)菌：假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷白氏桿菌(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、摩根(氏)菌屬(Morganella)、弧菌(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、布蘭漢氏球菌屬(Branhamella)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、檸檬酸細(xì)菌屬(Citrobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、愛(ài)德華氏菌屬(Edwardsiella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、普羅威登斯菌(Providencia)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、博德特氏菌(Bordetella)、西地西菌屬(Cedecea)、歐文氏菌(Erwinia)、泛生菌屬(Pantoea)、勞爾氏菌屬(Ralstonia)、狹長(zhǎng)平胞菌(Stenotrophomonas)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)和軍團(tuán)菌屬(Legionella)。作為革蘭氏陽(yáng)性菌，可以提及如下屬的細(xì)菌：氣球菌屬(Aerococcus)、腸球菌(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢桿菌(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、利斯塔氏菌屬(Listeria)、梭菌屬(Clostridium)、加德納菌屬(Gardnerella)、考克斯菌屬(Kocuria)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、微球菌(Micrococcus)、Falkamia、兼性雙球菌屬(Gemella)、小球菌屬(Pediococcus)、分支桿菌屬(Mycobacterium)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)。作為酵母，可以提及如下屬的酵母：假絲酵母(Candida)、隱球酵母(Cryptococcus)、糖酵母(Saccharomyces)和毛孢子菌屬(Trichosporon)。對(duì)此，本發(fā)明涉及下式(I)的用于檢測(cè)硝基還原酶活性的酶底物：其中：·X為S、NX1、O或NX1-CO；·R1不存在或者為選自Cl、CH3、Br、F、I、烷基、芳基和羧基的取代基；·R2不存在或者為選自Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亞乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、烷基、芳基、羧基、NO2和的取代基；·R3和R4獨(dú)立地為H或者含有1-4個(gè)碳原子的烷基；·X1選自H、CH3、C2H4Ph、OH、烷基和芳基。在雜環(huán)上的1位氮與2位碳之間的鍵可以為單鍵(1,2-二氫)或雙鍵，優(yōu)選雙鍵。當(dāng)然，本發(fā)明的底物可以包含幾個(gè)取代基，即在環(huán)的多個(gè)位置上具有幾個(gè)基團(tuán)R1、R2。當(dāng)R2為O-CH2-O時(shí)，R2為與硝基苯酚稠合的環(huán)，其中兩個(gè)環(huán)原子是共用的。當(dāng)R1和/或R2為烷基或芳基時(shí)，還可以用一個(gè)或多個(gè)諸如OH、羧基、Br、Cl、F或I的取代基將其取代。當(dāng)X為NX1-CO時(shí)，包含X的環(huán)優(yōu)選為6元環(huán)，其在所述6元環(huán)的3位上包含NX1，并且一個(gè)C經(jīng)由雙鍵與所述6元環(huán)4位上的O連接。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，X為S。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，X為NX1。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，X為O。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，X為NX1-CO。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，R1在5位上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，R2在4’位上。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，R2在5’位上。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，R2在4’位和5’位上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為O，·R1和R2不存在。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為O；·R1為Cl，優(yōu)選在5位上；·R2不存在。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為O；·R1為CH3，優(yōu)選在5位上；·R2不存在。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為O；·R1不存在；·R2為Cl，優(yōu)選在5’位上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為O；·R1不存在；·R2為O-CH2-O，優(yōu)選與4’和5’位上的硝基苯酚稠合。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為O；·R1不存在；·R2為O-CH3，優(yōu)選在4’和5’位。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為O；·R1不存在；·R2為F，優(yōu)選在5’位。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為O；·R1不存在；·R2為二亞乙基二胺-CH3，優(yōu)選5’位。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1；·X1為CH3，優(yōu)選在3位；·R1不存在；·R2不存在。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1；·X1為CH3；·R1不存在；·R2為Cl，優(yōu)選在5’位。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1；·X1為CH3；·R1不存在；·R2為O-CH2-O，優(yōu)選與4’位和5’位上的硝基苯酚稠合。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1；·X1為C2H4Ph；·R1不存在；·R2不存在。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1；·X1為C2H4Ph；·R1不存在；·R2為Cl，優(yōu)選在5’位上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1；·X1為C2H4Ph；·R1不存在；·R2為O-CH2-O，優(yōu)選與4’位和5’位上的硝基苯酚稠合。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為S；·R1不存在；·R2為F，優(yōu)選在5’位上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1-CO；·X1為H；·R1和R2不存在。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1-CO；·X1為CH3；·R1和R2不存在。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1-CO；·X1為CH3；·R1不存在；·R2為Cl，優(yōu)選在5’位上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1；·X1為H；·R1和R2不存在。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為NX1-CO；·X1為H；·R1不存在；·R2為在5’位上的Cl。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為S；·R1不存在；·R2為二亞乙基二胺-CH3，優(yōu)選在5’位上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為S；·R1不存在；·R2為優(yōu)選在5’位上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為O；·R1不存在；·R2為NO2，優(yōu)選在4’位上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為S；·R1不存在；·R2不存在。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述酶底物相應(yīng)于上式(I)，其中：·X為S；·R1不存在；·R2為F，優(yōu)選在5’位上；·在雜環(huán)上的1位上的氮與2位上的碳之間的鍵為單鍵(1,2-二氫)。優(yōu)選，本發(fā)明的底物選自表1中所述的底物。表1–本發(fā)明底物的實(shí)例本發(fā)明還涉及包含至少一種上述酶底物的反應(yīng)介質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含至少一種上述酶底物的微生物檢測(cè)和/或識(shí)別介質(zhì)。優(yōu)選所述底物的濃度為1-1000mg/l，優(yōu)選為10-500mg/l。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述介質(zhì)還包含至少一種其他的酶底物，其對(duì)與通過(guò)本發(fā)明底物檢測(cè)到的酶活性不同的酶活性具有特異性。所述其他底物的酶水解產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，其與通過(guò)本發(fā)明底物而檢測(cè)的信號(hào)不同，例如不同顏色或熒光的產(chǎn)物，以允許諸如證實(shí)一種或多種微生物的檢測(cè)和/或識(shí)別和/或定量。對(duì)于其他特定的底物，可以使用常用于檢測(cè)微生物的其他底物。其他的特定酶底物的濃度通常為0.01-1g/l。本領(lǐng)域技術(shù)人員將可以容易地根據(jù)所用的底物而決定該濃度。作為示例，可以將本發(fā)明的底物與肽酶、Osidase、酯酶或還原酶底物結(jié)合使用。具體而言，可以將本發(fā)明底物與Osidase底物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-配糖體或茜素-β-半乳糖苷，或者與酯酶底物，例如辛酸5-溴-6-氯-3-吲哚基酯或磷酸5-溴-3-吲哚基酯而結(jié)合使用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述介質(zhì)還包含至少一種對(duì)通過(guò)本發(fā)明底物所檢測(cè)到的酶活性具有特異性的其他酶底物。通過(guò)對(duì)底物的具體選擇，可以識(shí)別表示相同酶活性的微生物組。其他具體酶底物的濃度通常為0.01-1g/l。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可以根據(jù)所用的底物來(lái)決定該濃度。具體而言，可以將本發(fā)明底物與如申請(qǐng)WO00/28073所述的基于硝基香豆素的熒光底物結(jié)合使用。本發(fā)明還涉及上述酶底物或者上述檢測(cè)和/或識(shí)別介質(zhì)用于檢測(cè)微生物中至少一種硝基還原酶活性的用途。本發(fā)明還涉及檢測(cè)微生物中至少一種硝基還原酶活性的方法，其特征在于其包含如下步驟或者由如下步驟組成：a)提供上述檢測(cè)和/或識(shí)別介質(zhì)，b)以待測(cè)試的生物樣品接種所述介質(zhì)，c)對(duì)其進(jìn)行溫育，并且d)發(fā)現(xiàn)至少一種硝基還原酶活性的存在。所述微生物的接種可以通過(guò)任何一種為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的接種技術(shù)而進(jìn)行。溫育步驟可以在使需要檢測(cè)的酶活性的表達(dá)為最佳且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)酶活性及待檢測(cè)的微生物而易于選擇的溫度下而進(jìn)行。步驟d)可以通過(guò)視覺(jué)檢測(cè)、通過(guò)比色計(jì)或熒光計(jì)而進(jìn)行。在步驟d)中，硝基還原酶活性的存在可以單獨(dú)顯露，或者與其他酶活性一起顯露。為了說(shuō)明而給出以下沒(méi)有限制性的實(shí)施例。通過(guò)它們可以更加清楚地理解本發(fā)明。實(shí)施例1-合成底物·X為S底物22：2-(2'-硝基苯基)苯并噻唑使用油浴，將1eq的2-氨基苯酚、乙醇和1eq的2-硝基苯甲醛的混合物在110℃下回流1小時(shí)。將該混合物冷卻至室溫并且通過(guò)過(guò)濾而得到沉淀。為了回收最大量的產(chǎn)物，將圓底燒瓶用濾液洗滌以通過(guò)蒸餾回收大部分。在減壓下將固體在干燥器中干燥以得到中間產(chǎn)物。將以上得到的固體溶解于100ml二氯甲烷中，然后將1eq的2,3-二氰基-5,6-二氯-對(duì)苯醌在室溫下以小份加入。使反應(yīng)過(guò)夜，在過(guò)濾后，由于產(chǎn)物溶解于DCM而將玻璃器皿用DCM洗滌以回收最大量的產(chǎn)物。在減壓下將溶劑蒸出以得到產(chǎn)物。底物15:2-(2'-硝基-5'-氟苯基)苯并噻唑?qū)?.00g(0.024mol)的2-氨基苯硫酚和4.05g(0.024mol)的5-硝基-3-氟苯甲醛在乙醇(150ml)中的混合物回流2小時(shí)。在冷卻至室溫之后，將溶液在減壓下濃縮。將剩余固體稀釋于水和乙酸乙酯的混合物(500ml)中，將水相用乙酸乙酯(2×50ml)再萃取兩次。將合并的有機(jī)相干燥(MgSO4)、過(guò)濾并濃縮以得到粗產(chǎn)物，將其由乙醇中重結(jié)晶。得到質(zhì)量為1.28g的小紅色結(jié)晶OF54A2，產(chǎn)率47％，并且所測(cè)的熔點(diǎn)為156-158℃。由NMR所得的數(shù)據(jù)如下所示：1HNMR(270MHz,CDCl3)：δ＝6.87(1H,t,J＝4Hz,Ar-H),6.89(1H,s,Ar-H),7.05(1H,t,J＝4Hz,Ar-H),7.11(1H,d,J＝3Hz,Ar-H),7.13(1H,d,J＝3Hz,Ar-H),7.69(1H,dd,J＝9Hz,Ar-H),8.17(1H,dd,J＝9Hz,Ar-H)。底物23:2-(2'-硝基5'-(N-甲基哌嗪基)苯基)苯并噻唑(OF80A)將0.31g(0.0030mol)N-甲基哌嗪加入0.41g(0.015mol)2-(2’-硝基-5’-氟苯基)苯并噻唑和0.32g(0.0023mol)K2CO3在5ml二甲亞砜的混合物中。將反應(yīng)進(jìn)行磁力攪拌且加熱至90℃，通過(guò)TLC驗(yàn)證其進(jìn)度。在反應(yīng)結(jié)束后(至少8小時(shí))，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(77ml)進(jìn)行稀釋?zhuān)⑶覍⒂纱说玫降挠袡C(jī)相用2×65ml水仔細(xì)洗滌，然后用65ml鹽水洗滌，并使用硫酸鈉干燥以得到0.36g高度靜電的橙-黃色固體OF80A，產(chǎn)率68％。若需要的話，可以通過(guò)柱色譜進(jìn)行純化，但我們這里不需要。1HNMR(270MHz,CDCl3)：δ＝2.35(3H,s,CH3),2.45(2H,t,J＝7Hz,CH2-CH2),3.49(2H,t,J＝7Hz,CH2-CH2),6.85(1H,d,J＝7Hz,Ar-H),6.90(1H,t,J＝7Hz,Ar-H),7.41(1H,d,J＝7Hz,Ar-H),7.43(1H,d,J＝7Hz,Ar-H),7.85(1H,d,J＝7Hz,Ar-H),8.05(1H,t,J＝7Hz,Ar-H)。.LC-MS-DIm/z實(shí)測(cè)質(zhì)量：355.57(C18H18N4O2S)(M+H)：M計(jì)算值：354.43。底物21；2-(2'-硝基-5'-氯苯基)苯并噻唑底物21以與合成2-(2'-硝基-5'-氟苯基)苯并噻唑(底物15)的類(lèi)似方式來(lái)合成?！為O底物1-2-(2'-硝基苯基)苯并唑?qū)?.73g(0.0800mol)2-氨基苯酚、20ml乙醇和12.09g(0.0800mol)2-硝基苯甲醛的混合物使用油浴在110℃下回流一小時(shí)。將該混合物冷卻至室溫并且通過(guò)過(guò)濾而得到沉淀。為了回收最大量的產(chǎn)物，將圓底燒瓶用濾液洗滌以通過(guò)蒸餾而得到大部分。在減壓下將固體在干燥器中干燥以得到13.25g2-(2’-硝基苯亞甲基氨基)苯酚，產(chǎn)率為69％。將以上得到的固體溶解于100ml二氯甲烷中，然后將12.43g(0.0547mol)2,3-二氰基-5,6-二氯-對(duì)苯醌在室溫下以小份加入。使反應(yīng)過(guò)夜，在過(guò)濾后，由于產(chǎn)物溶解于DCM而將玻璃器皿用DCM洗滌以回收最大量的產(chǎn)物。在減壓下將溶劑蒸除以得到8.39g2-(2-硝基苯基)苯并唑，淺褐色固體，產(chǎn)率64％。由NMR所得的數(shù)據(jù)如下所示：1HNMR(270MHz,CDCl3)：δ＝7.40(1H,t,J＝5Hz,Ar-H),7.42(1H,t,J＝5Hz,Ar-H),7.50(1H,d,J＝7Hz,Ar-H),7.72(1H,t,J＝5Hz,Ar-H),7.73(1H,t,J＝5Hz,Ar-H),7.80(1H,d,J＝7Hz,Ar-H),7.89(1H,d,J＝7Hz,Ar-H),8.15(1H,d,J＝7Hz,Ar-H)。底物2-2-(2'-硝基苯基)-5-氯苯并唑-VLS259底物2以與合成2-(2'-硝基苯基)苯并唑(底物1)的類(lèi)似方式來(lái)合成。底物6-2-(2'-硝基-4',5'-二甲氧基苯基)苯并唑-VLS2611.合成2-((3’-氯-6’-硝基苯亞甲基)氨基)苯酚(VLS263)將2.18g(0.02mol)2-羥基苯胺和3.73g(0.02mol)2-硝基-5-氯苯甲醛在乙醇中的混合物回流3-4小時(shí)。收集由此所得的晶體沉淀并將其在減壓下在干燥器中干燥。得到質(zhì)量為1.98g的細(xì)小晶體，產(chǎn)率為80％，測(cè)量的熔點(diǎn)為144-146℃。通過(guò)NMR得到的數(shù)據(jù)如下所示：1H-NMR(CDCl3)：δ6.95(1H,t,J＝8Hz,Ph-H),7.05(1H,dd,J＝8Hz,J＝1.2Hz,Ph-H),7.10(1H,s(寬峰),OH),7.28(1H,t,J＝8Hz,Ph-H),7.33(1H,dd,J＝8Hz,J＝1.4Hz,Ph-H),7.60(1H,dd,J＝8.66Hz,J＝2.2Hz,4’H),8.05(1H,d,J＝8.66Hz,5’H),8.23(1H,d,J＝2.4Hz,2’H),9.27(1H,s,＝CH-)。υmaxcm-13442(OH),1558(NO2),1376(NO2),1521(C＝N),1341(OH),1301(OH),1143(C-N),1176(C-O),1461(Ar-H),756(C-Cl)。2.合成2-(2’-硝基-5’-氯苯基)苯并唑(VLS269)在室溫下，將1.14g(0.005mol)的2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)在5分鐘之內(nèi)加入在二氯甲烷中攪拌的2-((3’-氯-6’-硝基苯亞甲基)氨基)苯酚中。將該混合物攪拌2天，過(guò)濾并蒸發(fā)以得到產(chǎn)物。得到質(zhì)量為0.97g的綠-褐色粉末，產(chǎn)率為70％，測(cè)量的熔點(diǎn)為130-132℃。由NMR所得的數(shù)據(jù)如下所示：C13H7ClN2O3的高分辨M.S.E.I：分子離子的計(jì)算質(zhì)量為274.0140(M+H)+，實(shí)測(cè)質(zhì)量：274.0141.1H-NMR：(CDCl3)δ7.40-7.45(2H,m,Ph-H),7.56-7.61(1H,m,Ph-H),7.65(1H,dd,J＝8.66Hz,J＝2.23Hz,4’H),7.80-7.85(1H,m,Ph-H),7.87(1H,d,J＝8.66Hz,5’H),8.16(1H,d,J＝2.23Hz,2’H)。υmaxcm-11534(NO2),1371(NO2),1572(C＝N),1616(C＝N),1182(C-O),1236(C-O),1153(C-N),1461(Ar-H),743(C-Cl)。3.合成2-(3’,4’-二甲氧基-6’-苯亞甲基)氨基)苯酚(VLS260)將3.27g(0.03mol)2-羥基苯胺和6.33g(0.03mol)6-硝基藜蘆醛在乙醇中的混合物回流3-4小時(shí)。收集由此得到的晶體沉淀并在減壓下在干燥器中進(jìn)行干燥。得到質(zhì)量為8.20g的細(xì)小橙色晶體，產(chǎn)率為90％，測(cè)量的熔點(diǎn)為196-198℃。由NMR得到的數(shù)據(jù)如下所示：1H-NMR(CDCl3)：δ4.00(3H,s,CH3O),6.92(1H,t,J＝7Hz,Ph-H),7.01(1H,dd,J＝7Hz,J＝1.4Hz,Ph-H),7.12(1H,s(寬峰),OH),7.22(1H,t,J＝7Hz,Ph-H),7.32(1H,dd,J＝7Hz,J＝1.4Hz,Ph-H),7.62(1H,s,5’H),7.69(1H,s,3’H),9.25(1H,s,＝CH-)。υmaxcm-13416(OH),1566(NO2),1384(NO2),1589(C＝N),1344(OH),1317(OH),1181(C-N),1149(C-O),1461(Ar-H),2838(OMe)。4.合成2-(2’-硝基-4’,5’-二甲氧基苯基)苯并唑(VLS261)室溫下，將2.27g(0.01mol)的2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)在5分鐘之內(nèi)加入在二氯甲烷中攪拌的3.04g(0.01mol)2-((3’,4’-二甲氧基-6’-苯亞甲基)氨基)苯酚中。將該混合物攪拌2天，過(guò)濾并蒸發(fā)以得到產(chǎn)物。得到質(zhì)量為2.76g的橙-褐色粉末，產(chǎn)率為90％，測(cè)量的熔點(diǎn)為148-146℃。由NMR所得的數(shù)據(jù)如下所示：C15H12N2O5的高分辨M.S.E.I：分子離子的計(jì)算質(zhì)量為301.0819(M+H)+，實(shí)測(cè)質(zhì)量：301.0819。1H-NMR：(CDCl3)δ4.00(6H,d,J＝2.7Hz,(OCH3)2),7.37-7.41(2H,m,Ph-H),7.43(1H,s,5’H),7.52(1H,s,2’H),7.53-7.57(1H,m,Ph-H),7.78-7.82(1H,m,Ph-H)。υmaxcm-11519(NO2),1378(NO2),1582(C＝N),1189(C-N),1177(C-O),1448(Ar-H),2850(OMe)。底物7-2-(2'-硝基-5'-氟苯基)苯并唑-OF20B使用油浴將10.91g(0.100mol)的2-氨基苯酚、200ml乙醇和16.91g(0.100mol)2-硝基-5-氟苯甲醛的混合物在110℃下回流1小時(shí)。將該混合物冷卻至室溫并且通過(guò)過(guò)濾而得到沉淀。為了回收最大量的產(chǎn)物，將圓底燒瓶用濾液洗滌以通過(guò)蒸餾而得到大量產(chǎn)物。在減壓下將固體在干燥器中干燥以得到24.09g的OF20A，產(chǎn)率為93％。將以上得到的固體溶解于100ml二氯甲烷中，然后將21.04g(0.0927mol)2,3-二氰基-5,6-二氯-對(duì)苯醌在室溫下以小份加入。使反應(yīng)過(guò)夜，在過(guò)濾后，由于產(chǎn)物溶解于DCM而將玻璃器皿用DCM洗滌以回收最大量的產(chǎn)物。在減壓下將溶劑蒸除以得到14.49g的OF20B，淺褐色固體，產(chǎn)率61％。由NMR所得的數(shù)據(jù)如下所示：1HNMR(270MHz,CDCl3)：δ＝7.37(1H,d,J＝3Hz,Ar-H),7.43(1H,t,J＝5Hz,Ar-H),7.45(1H,s,Ar-H),7.59(1H,t,J＝5Hz,Ar-H),7.82(1H,d,J＝3Hz,Ar-H),7.85(1H,d,J＝3Hz,Ar-H),7.96(1H,dd,J＝9Hz,Ar-H),8.15(1H,d,J＝7Hz,Ar-H)。底物3：2-(2'-硝基苯基)-5-甲基苯并唑底物3以與合成2-(2'-硝基苯基)苯并唑(底物1)的類(lèi)似方式來(lái)合成。底物4：2-(2'-硝基-5'-氯苯基)苯并唑底物4以與合成2-(2'-硝基苯基)苯并唑(底物1)的類(lèi)似方式來(lái)合成。底物5：2-(2’-硝基-4’,5’-二亞甲基二氧苯基)苯并唑底物5以與合成2-(2'-硝基苯基)苯并唑(底物1)的類(lèi)似方式來(lái)合成。底物8：2-(2'-硝基-5'-(N-甲基哌嗪基)苯基)苯并唑(OF29A)將1.01g(0.010mol)的N-甲基哌嗪加入1.29g(0.005mol)的2-(2’-硝基-5’-氟苯基)苯并唑和1.04g(0.0075mol)的K2CO3在9ml的二甲亞砜中的混合物中。對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行磁力攪拌，并加熱至90℃，通過(guò)TLC驗(yàn)證反應(yīng)進(jìn)度。一旦反應(yīng)完成(至少8小時(shí))，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(77ml)進(jìn)行稀釋?zhuān)⒂纱说玫降挠袡C(jī)相用2×65ml水仔細(xì)洗滌，然后用65ml鹽水洗滌，并使用硫酸鈉干燥以得到1.23g黃色/金色的OF29A瓣，產(chǎn)率為73％。若需要的話，可以通過(guò)柱色譜進(jìn)行純化，但我們這里不需要。1HNMR(270MHz,CDCl3)：δ＝2.35(3H,s,CH3),2.57(2H,t,J＝7Hz,CH2-CH),3.48(2H,t,J＝7Hz,CH2-CH),6.95(1H,d,J＝7Hz,Ar-H),6.98(1H,d,J＝7Hz,Ar-H),7.21(1H,d,J＝7Hz,Ar-H),7.28(1H,s,Ar-H),7.39(1H,t,J＝9Hz,Ar-H),7.41(1H,t,J＝7Hz,Ar-H),7.55(1H,t,J＝7Hz,Ar-H),7.61(1H,t,J＝7Hz,Ar-H),8.1(1H,d,J＝7Hz,Ar-H)。m.p.：122-126LC-MS-DIm/z實(shí)測(cè)質(zhì)量：339.54(C18H18N4O3)(M+H)：M計(jì)算值338.37?！為NX1-CO底物20–2-(2'-硝基-5'-氯苯基)-4-喹唑酮1.合成1,2-二氫-2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-4-喹唑烷酮(VLS276)將質(zhì)量為2.31g(0.017mol)的2-氨基苯甲酰胺和3.14g(0.017mol)3-氯-6-硝基苯甲醛在乙醇中回流1小時(shí)。然后將該混合物冷卻，收集所得的橙色晶體并在減壓下在干燥器中干燥。得到質(zhì)量為3.97g的淺橙色晶體，產(chǎn)率為76％，測(cè)量的熔點(diǎn)為234-236℃。由NMR所得的數(shù)據(jù)如下所示：1H-NMR(DMSO)：δ6.35(1H,t,J＝2Hz,CH),6.70(1H,d,J＝1Hz,Ph-H(8H)),6.80(1H,t,J＝7Hz,Ph-H(6H)),7.05(1H,s(寬峰),NH),7.25(1H,t,J＝7Hz,Ph-H(7H)),7.65(1H,d,d,J＝6Hz,J＝1.5Hz,Ph-H(5H)),7.75(1H,d,d,J＝9Hz,J＝3Hz,Ph-H(4’H)),7.85(1H,d,J＝3Hz,Ph-H(6’H)),8.15(1H,d,J＝9Hz,Ph-H(3’H)),8.30(1H,d(寬峰),NH-CO)，C14H10ClN3O3的高分辨M.S.E.I：分子離子的計(jì)算質(zhì)量304.0483(M+H)+，實(shí)測(cè)質(zhì)量：304.0482。υmaxcm-11661(C＝ONH),1564(NO2),1358(NO2),1602(C＝N),774(C-Cl)。2.2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-4-喹唑烷酮的氧化(VLS278)將質(zhì)量為9.10g(0.03mol)的2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-4-喹唑烷酮溶解于40ml丙酮中，并用4.74g(0.03mol)的高錳酸鉀在無(wú)水丙酮中的溶液進(jìn)行處理。在室溫下將該溶液在2-3小時(shí)內(nèi)滴入混合物中。然后將反應(yīng)攪拌過(guò)夜。通過(guò)加入過(guò)量的固體重亞硫酸鈉而除去過(guò)剩的KMnO4。然后將溶液過(guò)濾并蒸發(fā)。得到質(zhì)量為2.26g的灰白色粉末，產(chǎn)率為25％，測(cè)量的熔點(diǎn)為276-278℃。由NMR得到的數(shù)據(jù)如下所示：C14H8ClN3O3的高分辨M.S.E.I，分子離子的計(jì)算質(zhì)量：302.0327(M+H)+。實(shí)測(cè)質(zhì)量：304.0327。1H-NMR(DMSO)：δ7.55(1H,t,J＝7Hz,Ph-H(7H)),7.65(1H,d,J＝8Hz,Ph-H(4’H)),7.85(1H,t,J＝7Hz,Ph-H(6H)),7.90(1H,d,d,J＝8Hz,J＝2Hz,Ph-H(5H)),8.05(1H,d,J＝2Hz,Ph-H(6’H),8.25(1H,d,J＝8Hz,Ph-H(3’H)。υmaxcm-13132(NH2),3070(NH2),1578(NO2),1368(NO2),1603(NH),1660(CONH),1531(C＝N),772(C-Cl)。底物17–2-(2'硝基苯基)-3-甲基-4-喹唑酮1.合成2-氨基-N-甲基苯甲酰胺(VLS291)在控制釋放CO2的同時(shí)，將25ml40％甲胺在攪拌下以小份加入16.20g(0.099mol)的靛紅酸酐(isotoicanhydride)中。使該混合物在室溫下保持1小時(shí)。然后將混合物用2M的HCl溶液中和，在減壓下用Buchi漏斗過(guò)濾，用水洗滌數(shù)次，并在減壓下使用干燥器進(jìn)行干燥。得到質(zhì)量為11.61g的灰色粉末，產(chǎn)率為78％。2.合成2-(2’-硝基-5’-氯苯基)-3-甲基-4-喹唑烷酮(VLS292)將質(zhì)量為7.5g(0.05mol)的2-氨基-N-甲基苯甲酰胺和9.30g(0.05mol)3-氯-6-硝基苯甲醛進(jìn)行磁力攪拌，并且回流2-3小時(shí)。在減壓下用Buchi漏斗過(guò)濾由此得到的橙色晶體，并在減壓下用干燥器進(jìn)行干燥。得到質(zhì)量10.38g針狀的細(xì)小橙色晶體，產(chǎn)率為66％。3.VLS292的氧化(VLS295b)將質(zhì)量為3.17g(0.01mol)的VLS292b溶解于無(wú)水丙酮中。將6.32g(0.04mol)KMnO4溶解于無(wú)水丙酮中，并在1-2小時(shí)內(nèi)滴入前述混合物中。然后將反應(yīng)攪拌過(guò)夜。此后，將混合物用焦亞硫酸鈉中和，過(guò)濾并蒸發(fā)以除去過(guò)量丙酮。得到質(zhì)量為2.60g的白色粉末，產(chǎn)率為80％?！為NX1底物14-2-(2’-硝基-4',5'-環(huán)亞甲而氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(或2-(2’-硝基-4',5'-亞甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑)1.N-苯乙基-2-硝基苯胺(VLS209)在室溫下，將質(zhì)量為4.8g(0.04mol)的2-苯乙基胺滴入5.6g(0.04mol)的2-氟硝基苯和11.06g(0.08mol)無(wú)水碳酸鈉在30mlDMSO中的混合物中。將該混合物在100℃下加熱3小時(shí)。然后將該混合物冷卻至室溫并加入100ml水中，得到淺橙色化合物的沉淀。通過(guò)過(guò)濾回收固體并在減壓下用干燥器進(jìn)行干燥。得到質(zhì)量為9.4g的橙色晶體，產(chǎn)率98％。測(cè)量的熔點(diǎn)與理論值相符，即64-66℃。由NMR所得的數(shù)據(jù)如下所示：1H-NMR(CDCl3)：δ3.00(2H,t,J＝7Hz,-CH2-),δ3.55(2H,t,J＝7Hz,-CH2-),δ6.65(1H,m,Ph-H),δ6.85(1H,dd,J＝8Hz,J＝2Hz,Ph-H),δ7.20-7.50(6H,m,Ph-H),δ8.10(1H,s(寬峰),NH),δ8.20(1H,dd,J＝8Hz,J＝2Hz,Ph-H)。2.N-苯乙基-1,2-二氨基苯(VLS210)室溫下，在氮?dú)庀聦?.38g(0.01mol)硼氫化鈉溶液在磁力攪拌下加入0.52g(0.002mol)乙酰丙酮化銅在乙醇中的懸浮液中。將在乙醇中的2.42g(0.01mol)的硝基化合物VLS209加入該溶液中，然后加入在乙醇中的0.76g(0.02mol)硼氫化鈉。在室溫下，將該混合物在氮?dú)庀聰嚢柽^(guò)夜。然后，將混合物濃縮以除去過(guò)剩的乙醇并加入水。然后用2×20mlDCM進(jìn)行萃取，并將有機(jī)相用水洗滌數(shù)次，用碳酸鉀干燥并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮。得到質(zhì)量為1.69g的黑色油狀液體，然后將其固化，產(chǎn)率為80％。測(cè)得的熔點(diǎn)與理論值相符，即42-44℃。由NMR得到的數(shù)據(jù)如下所示：1H-NMR(CDCl3)：δ2.95(2H,t,J＝7Hz,-CH2-),δ3.27(2H,s(寬峰),NH2),δ3.38(2H,t,J＝7Hz,-CH2),δ6.69(3H,m,Ph-H),δ6.82(1H,m,Ph-H),δ7.10-7.40(5H,m,Ph-H)。3.2-(2’-硝基-4',5'-環(huán)亞甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(VLS213)(或2-(2’-硝基-4',5'-亞甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑)在室溫下，將8.60g(0.014mol)過(guò)硫酸氫鉀(過(guò)一硫酸鉀)在15分鐘內(nèi)及磁力攪拌下加入5.08g(0.024mol)的N-苯乙基-1,2-二氨基苯、4.8g(0.024mol)的6-硝基胡椒醛在25mlDMF和1ml水中的溶液中。由于反應(yīng)為放熱反應(yīng)，將混合物用水浴冷卻并攪拌過(guò)夜。然后將水加入混合物中，并用DCM連續(xù)進(jìn)行兩次萃取。將合并的有機(jī)相用水洗滌數(shù)次，干燥(MgSO4)并濃縮以形成黃色/褐色的粗產(chǎn)物。用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶以純化該化合物。得到質(zhì)量為6.19g的褐色晶體，產(chǎn)率為67％，測(cè)量的熔點(diǎn)為162-164℃。由NMR得到的數(shù)據(jù)如下所示：C22H17N3O4的高分辨M.S.E.I，分子離子的計(jì)算質(zhì)量：388.1292(M+H)+。實(shí)測(cè)質(zhì)量：388.1297。1H-NMR：(CDCl3)δ3.10(2H,t,J＝7Hz,-CH2-),δ4.20(2H,t,J＝7Hz,-CH2-),δ6.02(1H,s,Ph-H),δ6.18(2H,s,O-CH2-O),δ6.80(2H,dd,J＝8Hz,J＝2Hz,Ph-H),δ7.10-7.40(5H,m,Ph-H),δ7.48(1H,m,Ph-H),δ7.65(1H,s,Ph-H),δ7.80(1H,m,Ph-H)。υmaxcm-11364(NO2),1523(NO2),1610(C＝N),1152(C-N),1207(C-N),1089(C-O),1473(C-H),728(-CH2)。底物12-2-(2'-硝基苯基)-3-苯乙基苯并咪唑-54底物12以與合成2-(2’-硝基-4',5'-環(huán)亞甲二氧苯基)-3-苯乙基苯并咪唑(底物14)類(lèi)似的方式進(jìn)行合成。2-本發(fā)明底物在檢測(cè)硝基還原酶活性中的用途(底物1；2；3；4；5；6；7；8；15；12；21；23)a)制備介質(zhì)將質(zhì)量為40mg的各種底物溶解于4ml的二甲基甲酰胺(DMF)中。將該溶液整個(gè)倒入400ml預(yù)先高壓處理過(guò)的哥倫比亞瓊脂中并在50℃下保持融化。各底物的最終濃度為100mg/l。將各介質(zhì)分配到直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿為20ml。b)接種和溫育將18種來(lái)自各個(gè)收集(collections)和屬于不同種的細(xì)菌和酵母的微生物菌種通過(guò)半定量分離10μl稀釋至1/20的0.5McFarland的懸浮液而接種到這些介質(zhì)上。將該介質(zhì)在37℃下溫育24小時(shí)，然后將所形成的菌落在360-365nm的UV輻照下目測(cè)。c)讀出結(jié)果所得結(jié)果在表2-5中給出。表2：在本發(fā)明的底物存在下由不同微生物菌種形成的熒光的強(qiáng)度和顏色1：熒光強(qiáng)度，-＝未檢測(cè)到熒光，+/-＝弱熒光，+＝中等熒光，++＝強(qiáng)熒光表3：在本發(fā)明底物存在下由不同微生物菌種形成的生長(zhǎng)、顏色和熒光G：生長(zhǎng)–F：熒光表4–在本發(fā)明底物存在下由不同微生物菌種形成的熒光的強(qiáng)度和顏色1：熒光強(qiáng)度，-＝為檢測(cè)到熒光，+/-＝弱熒光，+＝中等熒光，++＝強(qiáng)熒光與使用基于7-硝基香豆素(AMC)的底物所觀測(cè)到的相反，對(duì)于所有測(cè)試的本發(fā)明底物，熒光僅出現(xiàn)在菌落中或在鄰近處，其中所述基于7-硝基香豆素(AMC)的底物例如未7-硝基香豆素-3-羧酸。這些結(jié)果表明底物2、3、4、6、7、8、15和21可以區(qū)分或識(shí)別金黃色釀膿葡萄球(Staphylococcusaureus)菌種，尤其是MRSA(抗甲氧西林的金黃色釀膿葡萄球菌)菌種與大多數(shù)其他的革蘭氏陽(yáng)性菌菌種。由于該菌種的醫(yī)藥重要性，這可以特別用于在臨床試樣以及食品試樣中快速而特異地檢測(cè)金黃色釀膿葡萄球。此外，取決于芳環(huán)上的取代基，本發(fā)明底物對(duì)于革蘭氏陰性菌的特異性是可變的。例如，底物2、7和15可以區(qū)分銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumanii)；沙門(mén)氏桿菌(Salmonellatyphimurium)對(duì)底物7和15是呈強(qiáng)陽(yáng)性的，而對(duì)底物2、6和12是呈陰性的。底物12對(duì)摩氏摩根菌(Morganellamorganii)具有特異性。d)結(jié)論借助本發(fā)明底物可以將許多反應(yīng)介質(zhì)用于微生物學(xué)中。這些介質(zhì)對(duì)于醫(yī)藥、工業(yè)或環(huán)境領(lǐng)域中有意義的微生物的檢測(cè)、計(jì)數(shù)和/或識(shí)別非常有用。