本發(fā)明涉及抗癌治療領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及微生物群在癌癥治療效力中的作用，并提供用于確定患者是否可能從癌癥治療受益的方法，以及提高這樣的治療在有此需要的患者中的效力的益生菌。背景和現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)的癌癥治療包括化療、手術(shù)、激素療法和/或放射治療的組合，以根除患者的腫瘤細胞。癌癥化療基于以下藥物的使用，該藥物有望以比殺死患者的正常細胞的速度更快的速度殺死復(fù)制細胞。手術(shù)被用來減小腫瘤主體，但一旦癌癥已經(jīng)轉(zhuǎn)移，則手術(shù)幾無影響。輻照只在局部區(qū)域是有效的。所有這些方法具有顯著的缺點，并且造成額外的風(fēng)險諸如增加的感染易感性。另一種癌癥治療方法是靶向免疫系統(tǒng)(“免疫療法”)，而非靶向腫瘤本身或除了靶向腫瘤本身以外。然而，盡管在檢測和治療中取得了進展，但許多治療方案僅僅對存活率做出微小貢獻，因此提出了此類治療的成本效率和對生活質(zhì)量的影響的問題。最近，已描述了固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對基于化療和基于放射療法的常規(guī)癌癥治療的抗腫瘤作用的重要貢獻(Kroemer等人，2013；Zitvogel等人，2008)。現(xiàn)已公認的是腸道共生菌深深地影響著哺乳動物的免疫(Hooper等人，20112)。構(gòu)成細菌生態(tài)系統(tǒng)中的不平衡的腸道生態(tài)失調(diào)可通過有利于慢性炎癥或局部免疫抑制而導(dǎo)致一些能夠促進結(jié)腸致癌作用的細菌的比例過高(Grivennikov等人，2012；Wu等人，2009年)。然而，微生物生態(tài)失調(diào)對非胃腸道癌癥的影響是未知的?？拱┗熕幬锍３Ｒ鹫衬ぱ?與細菌移位相關(guān)的致衰弱粘膜屏障損傷)和中性粒細胞減少癥(需要用抗生素治療的兩種并發(fā)癥)，其進而可能導(dǎo)致生態(tài)失調(diào)(Ubeda等人，2010；vanVliet等人，2010)。因此，存在對有利于治療諸如化療和/或輻射與免疫之間的建設(shè)性相互作用(如果不是協(xié)同作用的話)的改進的癌癥治療的開發(fā)的迫切需要。發(fā)明概述在這種情形下，本發(fā)明人觀察到環(huán)磷酰胺(CTX)改變小鼠的小腸微生物群的組成并引發(fā)革蘭氏陽性細菌選定的種至周圍淋巴器官內(nèi)的移位。這些細菌在周圍淋巴器官中刺激特定亞群的“致病性”T輔助17(pTh17)細胞的產(chǎn)生并記憶Th1免疫應(yīng)答。本發(fā)明人還證明，如果不用pTh17過繼轉(zhuǎn)移，則利用殺死革蘭氏陽性細菌的抗生素處理的無菌小鼠或宿主表現(xiàn)出減弱的pTh17應(yīng)答和針對CTX的相對耐藥性(chemoresistance)。此外，生態(tài)失調(diào)干擾其它抗癌化療藥物(諸如蒽環(huán)類和奧沙利鉑)的活性。這些結(jié)果揭示了腸道微生物群在塑造抗癌免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用。這些結(jié)果以及與腸道微生物群與抗腫瘤治療之間的相互作用相關(guān)的其它結(jié)果綜述于最近的若干出版物中(Dzutsev等人，2014；Viaud等，CancerRes.,2014；Viaud等，CellDeathDiffer.,2014和Viaud等，Oncoimmunology,2014)。本發(fā)明提供了可用作向癌癥患者施用的抗腫瘤治療的佐劑的益生菌組合物，其中所述益生菌組合物包含選自海氏腸球菌(Enterococcushirae)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)、分節(jié)絲狀菌(segmentedfilamentousbacteria)(SFB)、紫單胞菌屬(Porphyromonas)、厭氧桿菌屬(Barnesiella)、霍爾德曼氏菌屬(Holdemania)及其混合物的細菌。本發(fā)明的另一個方面是化療劑和抗生素組合物用于治療癌癥患者的用途，當向個體施用所述組合時，所述組合在所述個體的腸道微生物群中降低厚壁菌門(firmicutes)/擬桿菌門(bacteroidetes)的比，或者特異性增加SFB和/或紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)，和/或減少梭菌屬(Clostridium)IV群。本發(fā)明還涉及抗生素組合物諸如上述那些組合物用于調(diào)節(jié)患者的腸道微生物群以加強向所述患者施用的化療劑的抗癌作用的用途。包含選自海氏腸球菌、約氏乳桿菌、分節(jié)絲狀菌(SFB)、紫單胞菌屬、厭氧桿菌屬、霍爾德曼氏菌屬及其混合物的細菌的片段的免疫原性組合物，以及其作為向癌癥患者施用的抗腫瘤治療的佐劑的用途也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還涉及細胞組合物和它們與化療劑組合在過繼細胞轉(zhuǎn)移中的用途。第一細胞組合物包含已用上述益生菌組合物或免疫原性組合物離體脈沖的抗原提呈細胞(APC)，并且第二細胞組合物包含記憶T細胞，所述記憶T細胞是通過包括將癌癥患者的T細胞與如上定義的第一細胞組合物離體接觸的方法獲得的。本發(fā)明還提供鑒定可能為好的化療應(yīng)答者的患者的體外方法，所述方法包括測定所述患者中TLR4、NOD1和NOD2的功能性，其中如果所述患者缺乏功能性TLR4和/或NOD1和/或NOD2，則所述患者被鑒定為好的化療應(yīng)答者。本發(fā)明還提供了用于體外確定癌癥患者是否可從抗腫瘤治療受益的方法，其包括以下步驟：(i)從來自所述患者，例如從十二指腸或回腸粘膜的活組織檢查獲得的適當生物樣品，或從患者的糞便樣品測定癌癥治療的特定背景中“不利”細菌，例如來自包含以下種：吉氏副擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)和Faecalibacteriumprausnitzii以及來自包含以下屬：吉米菌屬(Gemmiger)、Alistipes和梭菌屬IV簇或由所述種或?qū)俳M成的組的細菌在所述患者的腸道微生物群中的相對豐度；(ii)確定腸道生態(tài)失調(diào)的存在與否；其中具有過量的“不利”細菌的腸道生態(tài)失調(diào)表明患者將不是好的抗腫瘤治療應(yīng)答者。本發(fā)明還提供了用于體外確定對于癌癥患者是繼續(xù)進行還是停止抗腫瘤治療的方法，其包括以下步驟：(i)從所述患者的生物樣品，諸如在開始所述抗腫瘤治療后3至9周、優(yōu)選6-9周獲得的血液樣品，分析針對至少一種共生細菌種，例如針對約氏乳桿菌(L.johnsonii)、海氏腸球菌(E.hirae)和/或糞腸球菌(E.Faecalis)的記憶CD4+T細胞應(yīng)答；(ii)對于每一個針對其分析CD4+T細胞應(yīng)答的共生種，將應(yīng)答分類至以下分類之一：-無記憶CD4+T細胞應(yīng)答；-Th10表型的記憶應(yīng)答；-Th1表型的記憶應(yīng)答，其中如果觀察到至少一個共生種的Th1表型的記憶應(yīng)答，則繼續(xù)抗腫瘤治療，并且在此種應(yīng)答不存在的情況下，停止抗腫瘤治療?？梢岳缤ㄟ^在離體再刺激測定中比較治療前與治療后細胞因子的分泌來進行應(yīng)答的分類。本發(fā)明還涉及用于體外確定已被施用于患者的新輔助抗腫瘤治療的生物學(xué)作用的方法，其包括以下步驟：(i)從所述患者的適當生物樣品(例如從患者的十二指腸或回腸粘膜的活組織檢查獲得的)測定來自包含乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的第一組細菌在所述微生物群中的相對豐度；(ii)從同樣的生物樣品測定來自包含吉氏副擬桿菌、Faecalibacteriumprausnitzii、吉米菌屬、Alistipes和梭菌屬IV簇的第二組細菌在所述腸道微生物群中的相對豐度；(iii)計算來自第一組細菌的豐度與來自第二組細菌的豐度之比，其中如果所述比高于預(yù)定閾值，則該結(jié)果表明新輔助抗腫瘤治療誘導(dǎo)T-bet/Th1局部和全身性免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一個目的是選自約氏乳桿菌(尤其是CNCMI-4823菌株)、海氏腸球菌(尤其是CNCMI-4815菌株)和/或糞腸球菌的益生菌菌株以及包含所述益生菌菌株的組合物，其用于與抗腫瘤劑組合以誘導(dǎo)T-bet/Th1局部和全身性免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及與抗腫瘤治療組合以治療癌癥的細胞(通過在IL-1β、IL-6和IL23的混合物存在的情況下刺激癌癥患者的首次接觸實驗的(naive)CD4+T細胞獲得)在所述癌癥患者中的過繼細胞轉(zhuǎn)移。附圖說明圖1:環(huán)磷酰胺破壞腸道粘膜完整性。(A-B).首次接觸實驗的C57BL/6小鼠中的小腸上皮在NaCl(Co)或CTX或多柔比星(Doxo)處理(therapy)后48小時的蘇木精-伊紅染色(A)。在來自CTX或Doxo處理的小鼠的100個絨毛/回腸上的5個回腸中測量所描繪的炎癥病灶數(shù)/mm(B，左圖，A上以箭頭指示的)、反映水腫的固有層厚度(B，中圖，A上以#指示的)和減少的絨毛長度(B，右圖，A中以箭頭指示的)。(C).含有典型的含粘蛋白杯狀細胞的回腸絨毛的代表性顯微照片示于媒介物或CTX或Doxo處理的小鼠中(左圖)。在右圖中針對兩種化療劑對杯狀細胞數(shù)/絨毛進行計數(shù)。(D).帕內(nèi)特細胞的特定染色示于兩幅代表性免疫熒光顯微照片(D，左圖)。進行帕內(nèi)特細胞的定量，測量從用NaCl(Co)或CTX處理小鼠24-48小時所收集6個回腸的溶菌酶陽性簇的平均面積。(E).來自用CTX處理小鼠18小時的十二指腸和回腸固有層細胞中的溶菌酶M和RegIIIγ轉(zhuǎn)錄水平的定量PCR(qPCR)分析。由三個獨立實驗聯(lián)系在一起(concatenate)的3-4只小鼠/組的標準化ΔCT的平均值±SEM。(F).體內(nèi)腸通透性測定，測量兩個CTX劑量處理后18小時的4kDa異硫氰酸熒光素(FITC)-葡聚糖(dextran)的血漿積累。該圖顯示來自四個獨立實驗的所有數(shù)據(jù)，每一個點代表一只小鼠(n＝13-15)。利用t-檢驗分析數(shù)據(jù)。*,p<0.05,**,p<0.01,***,p<0.001。圖2:環(huán)磷酰胺在外周淋巴器官中誘導(dǎo)粘膜相關(guān)微生物生態(tài)失調(diào)和細菌移位。(A-B).在CTX或Doxo后48小時，在需氧和厭氧條件下培養(yǎng)來自首次接觸實驗的小鼠的腸系膜淋巴結(jié)(mLN)和脾細胞，并對來自用NaCl(Co)(n＝10-16)、CTX(n＝12-27)或Doxo(n＝3-17)(3-4個實驗)處理的每一只小鼠的集落進行計數(shù)(A)，以及通過質(zhì)譜法鑒定所述集落(B)。在NaCl對照中，細菌鑒定的嘗試大部分失敗并且得到67％鼠乳桿菌(Lactobacillus.Murinus)(未顯示)。利用t-檢驗分析數(shù)據(jù)。(C).通過來自首次接觸實驗的小鼠和B16F10荷瘤者的回腸和盲腸的16SrRNA的454焦磷酸測序分析微生物組成(屬水平)。主成分分析(PCA)突出顯示了取決于處理(NaCl:Co，灰色點；CTX-處理的，黑色點)的小鼠微生物群(每一個點代表一只小鼠)的特定群集。將MonteCarlo秩檢驗用于評估這些群集的顯著性。(D).對CTX或NaCl(Co)-處理的首次接觸實驗的小鼠或MCA205荷瘤小鼠進行與小腸粘膜相關(guān)的各種菌群的定量PCR(qPCR)分析。計算總細菌、乳桿菌屬、腸球菌屬和梭菌屬IV群的絕對值，以及根據(jù)樣品的稀釋度和重量將其進行標準化。從每一個菌群的已知濃度的基因組DNA的系列稀釋并通過將閾值循環(huán)(Ct)對細菌數(shù)量(CFU)進行繪圖產(chǎn)生標準曲線。虛線下方的點在檢測閾以下。利用線性模型或廣義線性模型分析數(shù)據(jù)。*,p<0.5,**,p<0.1,***,p<0.001,ns，不顯著。圖3:CTX-誘導(dǎo)的pTh17效應(yīng)子和記憶Th1應(yīng)答取決于腸道微生物群。(A).使用抗-CD3+抗-CD28Ab交聯(lián)在無菌(GF)或常規(guī)無特定病原體(SPF)條件(左圖)下飼養(yǎng)的并用或不用ATB或萬古霉素(Vanco)(右圖)處理的來自CTX對NaCl處理的動物的脾細胞，持續(xù)48小時。通過ELISA測量IL-17。呈現(xiàn)的是2至3個含有2-9只小鼠/組的實驗，每一個點代表一只小鼠。(B).特定粘膜菌群的數(shù)量與脾Th17特征之間的相關(guān)性。每一個點代表一只沒有荷腫瘤(圓點)、荷B16F10黑素瘤(菱形點)或MCA205肉瘤(方形點)的小鼠，空心點表征NaCl-處理的小鼠，實心點表示CTX-處理的動物。(C).在ATB或水的方案(作為對照)下，在7天的NaCl或CTX處理后從非荷瘤小鼠收集的脾細胞的細胞內(nèi)分析。2-8個獨立實驗中的RORγt+CD4+T細胞中的IFNγ+Th17細胞、T-bet+細胞以及CCR6+CD4+T細胞中的CXCR3+細胞的百分比的平均值±SEM，每一個點代表一只小鼠。(D)在CTX處理后7天，從在ATB處理后利用指定的細菌種類口服重建的首次接觸實驗的小鼠收集的總的脾細胞的細胞內(nèi)染色。(E).CTX或NaCl(Co)處理后7天，利用加載有遞減量的細菌的骨髓樹突狀細胞(BM-DC)離體再刺激脾CD4+T細胞，持續(xù)24小時。顯示了通過ELISA監(jiān)測的IFNγ釋放。表示了所測試小鼠的總數(shù)中的應(yīng)答小鼠(基于NaCl基線閾值)的數(shù)目(n)。統(tǒng)計比較基于配對t-檢驗。利用β回歸或線性模型以及來自改進的Kendalltau的相關(guān)性分析對數(shù)據(jù)進行分析。*,p<0.05,***,p<0.001,ns，不顯著。圖4:萬古霉素鈍化CTX-誘導(dǎo)的pTh17分化，所述分化對于化療的殺腫瘤活性是必不可少的。(A).用廣譜ATB進行3周長的預(yù)處理后，用P815肥大細胞瘤(第0天)接種DBA2小鼠，在第6天利用CTX(箭頭)處理所述小鼠，并監(jiān)測腫瘤生長。腫瘤生長動力學(xué)示于圖13A中，并且針對11-14只小鼠/組的兩個實驗描述處死時無腫瘤小鼠的百分比。(B).第0天在任選地與分節(jié)絲狀菌(SFB)單一結(jié)合的無特定病原體(SPF)或無菌(GF)小鼠中接種MCA205肉瘤，利用CTX(箭頭)處理所述小鼠，并監(jiān)測其生長動力學(xué)(平均值±SEM)。對于GF小鼠顯示了2至3個實驗中的一個代表性實驗(n＝5-8只小鼠/組)，并且對于SPF小鼠顯示了兩個合并的實驗(n＝14只小鼠/組)(C)。在利用萬古霉素或粘菌素進行3周條件化后，用MCA205肉瘤(第0天)接種C57BL/6小鼠，在第12-15天時用CTX(箭頭)處理所述小鼠，并監(jiān)測腫瘤生長。對于粘菌素處理顯示了來自兩個獨立實驗(n＝15-20只小鼠/組)的聯(lián)系在一起的數(shù)據(jù)，對于萬古霉素處理顯示了一個代表性實驗的數(shù)據(jù)(n＝6只小鼠/組)。(D).8周齡KP(KrasLSL-G12D/WT；p53Flox/Flox)小鼠通過鼻內(nèi)滴注接受表達Cre重組酶的腺病毒(AdCre)以引發(fā)肺腺癌(第0天)。在AdCre后第77天開始對一個亞組的小鼠(“化療+萬古霉素”)進行萬古霉素處理。在萬古霉素開始后一周，對僅接受化療(“化療”)的小鼠或平行地接受萬古霉素(“化療+萬古霉素”)的那些小鼠腹膜內(nèi)施用基于CTX的化療。小鼠在第84天、第91天和第98天接受化療。不處理對照組("Co")。數(shù)據(jù)顯示通過6-12只小鼠/組中的第73天與在100天之間的非侵入性成像評估的肺腫瘤總體積(平均值±SEM)的演進。(E).如圖3C中一樣，在CTX處理后7天，測定未處理的或萬古霉素處理的具有已建立的(15-17天)MCA205腫瘤的小鼠的脾中的pTh17細胞數(shù)。每一個點代表來自2個合并的實驗的一只小鼠。(F).通過對從水或萬古霉素處理的小鼠中的第18天建立的MCA205腫瘤(CTX后8天)提取的活的CD45+腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)進行門控來進行CD3+和CD4+IFNγ+T細胞的流式細胞術(shù)分析。每一個點代表來自多至4個合并的實驗的一只小鼠。(G).用CTX(箭頭)注射以水或萬古霉素預(yù)處理3周的WT小鼠中建立的MCA205腫瘤，并監(jiān)測腫瘤生長。在CTX后7天，靜脈內(nèi)注射300萬個離體產(chǎn)生的Th17或pTh17CD4+T細胞。合并多至3個包含2-10只小鼠/組的實驗。利用t-檢驗、線性模型或廣義線性模型分析數(shù)據(jù)。*,p<0.5,**,p<0.1,***,p<0.001,ns，不顯著。圖5:CTX后24或48小時生態(tài)失調(diào)的缺乏。(A).如在不同時間點(CTX后0、24、48小時)、通過16SrRNA基因的高通量454焦磷酸測序評估的腸道微生物群的總體組成。每一列代表來自t0(CTX注射前)、t24和t48(CTX后24和48小時)時的一只小鼠的小腸粘膜微生物群的數(shù)據(jù)。指示了不同屬的代表性的陽性梯度(positivegradient)(Log10-轉(zhuǎn)化的熱圖)。統(tǒng)計分析：t0與t24或t48小時之間的ns。(B-C).梭菌屬的一個種的克隆40和羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)的焦磷酸測序數(shù)據(jù)的詳細實例。隨時間推移的乳酸菌的量的qPCR分析，如在材料和方法中詳細描述的。圖6:用CTX處理的小鼠的回腸中的細菌屬的分布。來自NaCl(Co)和CTX-處理的動物的小腸中的屬的相對豐度的Log10-轉(zhuǎn)化的熱圖。在CTX治療之前，在一個亞組的動物中接種腫瘤(TB+)。僅呈現(xiàn)了代表整個微生物群的超過0.05％的細菌屬。已在微生物群的材料和方法部分解釋了針對相對豐度數(shù)據(jù)的應(yīng)用的log10-轉(zhuǎn)化。已將非特定聚類法應(yīng)用于熱圖構(gòu)建。計算每一個屬的Co與CTX之間的百分比的平均Δ以將細菌屬重新排序。CTX誘導(dǎo)CTX-處理的動物的粘膜中的分布在4個屬和群(梭菌屬XIVa簇、羅斯氏菌屬(Roseburia)、未分類的毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、糞球菌屬，表2)內(nèi)的來自厚壁菌門(Firmicutes)的菌群的減少。CTX也與螺旋體門(Spirochaetesphylum)(p＝0.016)，尤其是密螺旋體(Treponema)屬(0.025％(于NaCl中)對0％(于CTX組中)；p＝0.016)的比例的減少相關(guān)。在種的水平上，在CTX后，一些細菌過量(諸如羅伊乳桿菌)或不足量(諸如梭菌屬的一個種克隆40以及來自毛螺菌科(Lachnospiraceae)和來自梭菌XIVa簇的幾種其它丁酸生產(chǎn)者)(圖2B)。分節(jié)絲狀菌X77814(SFB)在CTX-處理的小鼠中相較于對照(7.95％SFB(于CTX中)對0.83％(于媒介物對照中)，p＝0.08，表2)未顯示一致的富集。Wilcoxon檢驗：*,p<0.05為TB-組中Co對CTX；p<0.05為TB+組中Co對CTX。圖7:十二指腸固有層中的CD103+CD11b+和Th17細胞的損失和脾細胞的Th1極化與小腸細菌種類相關(guān)。(A).小腸的LP中的樹突狀細胞(DC)亞類。CTX注射后第0天、第3天和第7天留在小腸和大腸LP中的各種DC亞類的流式細胞術(shù)分析和定量。該圖描繪了兩個聯(lián)系在一起的實驗中的7只小鼠/時間點中的DC的百分比的平均值+SEM。大腸DC亞類不受CTX影響(未顯示)。利用MannWhitneyt-檢驗分析數(shù)據(jù)。(B-C).CTX后7天Th17細胞的調(diào)節(jié)。(B)從NaCl對CTX-處理的小鼠收集的十二指腸和回腸的LP分離的淋巴細胞的流式細胞術(shù)分析。該圖描繪了來自8個獨立實驗的聯(lián)系在一起的數(shù)據(jù)，每一個點代表一個實驗。統(tǒng)計比較基于Wilcoxon檢驗。(C).左圖：NaCl對CTX-處理的小鼠中的回腸的免疫熒光染色的顯微照片。使用抗-γδ□TCRAb將γδTCR+細胞染成綠色(AlexaFluor488)，以及使用抗-CD3Ab將CD3+T細胞染成藍色(AlexaFluor647)。右圖：由兩個獨立的研究者對3個回腸中的100個絨毛進行陽性細胞的計數(shù)。(D).CTX注射后第7天的脾細胞的Th1極化。使用抗-CD3±抗-CD28Ab交聯(lián)在GF或常規(guī)SPF條件(左圖)中飼養(yǎng)的并用或不用ATB或萬古霉素(右圖)處理的來自CTX對NaCl處理的小鼠的脾細胞，持續(xù)48小時。通過ELISA在48小時-上清液中監(jiān)測IFNγ的水平。提供含有2-9只小鼠/組的3個實驗，每一個點代表一只小鼠。利用t-檢驗分析來自(C)和(D)的數(shù)據(jù)。(E).同上如圖3C所示，但分析首次接觸實驗的小鼠、B16F10或MCA205荷瘤者中的每一個菌群與IFNγ□分泌譜(如圖6(C)中所示的)之間的相關(guān)性。(F).CTX后第7天如圖3C中計數(shù)的脾pTh17細胞的代表性點圖流式細胞術(shù)分析。*,p<0.05,**,p<0.01,ns，不顯著。圖8:多柔比星不能誘導(dǎo)脾中的pTh17細胞，并且不需要腸共生菌叢來減少腫瘤生長。(A-B).多柔比星(Doxo)不能誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17的脾CD4+T細胞。以指定的劑量(A)或以50μl、2mM的固定劑量(對于重量為20g的小鼠，3mg/kg)(B)將Doxo腹膜內(nèi)注射入小鼠，并在7天后回收脾細胞以評估響應(yīng)48小時的抗-CD3/抗-CD28交聯(lián)(A,B)的IL-17的產(chǎn)生，或通過流式細胞術(shù)測定具有CD4+T-bet+RORγt+表型的細胞的頻率(B)。以100mg/kg的劑量使用的環(huán)磷酰胺(CTX)用作陽性對照。任選地，通過抗-CD25Ab的注射(250μg，Doxo施用前1和3天)耗盡調(diào)節(jié)性T細胞，并將無關(guān)同種型匹配的對照Ab用作對照。(C).多柔比星針對無特定病原體(SPF)的小鼠、抗生素(ATB)-處理的小鼠和無菌小鼠中的已建立的MCA205的抗腫瘤作用。在2至3個合并實驗(包括4-6只動物/組)中描繪腫瘤生長的動力學(xué)(平均尺寸±SEM)。利用t-檢驗、線性模型或廣義線性模型分析數(shù)據(jù)。*,p<0.05,**,p<0.01,***,p<0.001,ns，不顯著。圖9:廣譜ATB在來自首次接觸實驗的小鼠或荷瘤小鼠的糞便的細菌耗盡中的效力。從未處理的或在不同時間點用廣譜ATB處理的小鼠收集新鮮糞便，并將其涂板在血液瓊脂平板上(對于需氧和厭氧條件)以及涂板在DCO瓊脂平板(BioMérieux)上(對于腸球菌的特定生長)。在48小時的培養(yǎng)后，對分離的集落進行計數(shù)。以該方式監(jiān)測每一個不同實驗的所有小鼠并進行評分。顯示了一個代表性監(jiān)測。圖10:CTX-誘導(dǎo)的pTh17分化取決于Myd88而非Nod1/2。(A).利用PMA/離子霉素(使用以抗-CD3、CD8、IFNγ和IL-17Ab進行的細胞內(nèi)和細胞外染色)再刺激4小時的從NaCl對CTX-處理的WT(如在圖3C中)或Nod2-/-對Myd88-/-小鼠收集的淋巴細胞的流式細胞術(shù)分析。該圖描繪了來自兩個獨立實驗的IL-17+CD4+T細胞中的IFNγ+陽性細胞的平均百分比，每一個點代表一只小鼠。(B).Nod1和Nod2對于通過CTX誘導(dǎo)的腫瘤生長的減少不是必需的。在CTX施用前、CTX施用后第5和12天在WT或Nod1-/-Nod2-/-小鼠中建立MCA205腫瘤。在5只動物/組中監(jiān)測腫瘤生長動力學(xué)(平均值±SEM)。兩個獨立的實驗得到相似的結(jié)果。利用t-檢驗、線性模型或廣義線性模型分析數(shù)據(jù)。***,p<0.001,ns，不顯著。圖11:針對CTX后共生細菌的免疫。(A-C).CTX后同基因型小鼠中的CBirTgT細胞的回收。在首次接觸實驗的CD45.2WT受體同基因型小鼠中靜脈內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移100萬個首次接觸實驗的B6.CD45.1+CBir1TCRTgCD4+T細胞，一天后用NaCl或CTX處理所述小鼠，7天后處死小鼠以進行脾細胞的FACS分析和用CBir1特異性肽的離體再刺激。CD45.1細胞的門控允許分析CBir1TgT細胞的回收或增殖的百分比(A，5只動物的平均值±SEM)和在6小時的PMA/離子霉素活化后使用細胞內(nèi)染色分析IL-17和IFNγ的產(chǎn)生。B中顯示了一只動物的代表性點圖。用CBir1特異性肽或?qū)φ諢o關(guān)肽再刺激脾細胞24小時。共生ELISA監(jiān)測上清液中的IFNγ的濃度(C)。進行包含4-5只動物/組的3個實驗。MannWhitneyt-檢驗:**,p<0.01。圖12:由樹突狀細胞加工和提呈的移位的細菌在體外導(dǎo)致首次接觸實驗的CD4+T細胞的極化。具有移位的細菌的Th17/Th1細胞的離體分化。持續(xù)4天的載有不同的細菌的BMDC與首次接觸實驗的CD4+T細胞之間的串流。通過共生ELISA進行的IL-17(左)或IFNγ(右)細胞因子濃度的監(jiān)測。每一個點代表在一式三份孔中進行的一個體外實驗。進行11個實驗，并描述所述實驗。t-檢驗:*,p<0.5,**,p<0.01,ns，不顯著。圖13:腸道微生物群影響化療的效力。(A).通過ATB進行的細菌耗盡減小所建立的肥大細胞瘤的化學(xué)敏感性。第6天，利用100mg/kg的CTX腹膜內(nèi)接種利用廣譜ATB預(yù)處理3周或未預(yù)處理的具有P815的DBA2小鼠，并監(jiān)測腫瘤生長直至處死。在3個實驗中的一個代表性實驗中顯示了水對ATB-處理的小鼠中的每一只單個小鼠的生長動力學(xué)。(B).萬古霉素減小CTX對抗MCA205肉瘤的效力。第10天，利用100mg/kg的CTX腹膜內(nèi)接種以萬古霉素預(yù)處理3周或未預(yù)處理的荷MCA205的C57BL/6小鼠，并監(jiān)測一個多月的腫瘤表面以及腫瘤排斥率。在2個實驗中的一個代表性實驗中顯示了水對萬古霉素-處理的小鼠中的每一只單個小鼠的生長動力學(xué)，同時在括號中指示了無腫瘤小鼠的百分比。圖14:吉氏副擬桿菌和耐藥性。(A).與吉氏副擬桿菌的單一結(jié)合(Monoassociation)誘導(dǎo)建立的肉瘤的耐藥性。用廣譜抗生素(ATB)處理常規(guī)飼養(yǎng)的小鼠2周，用MCA205接種7天，隨后用多柔比星處理。在該特定的實驗中，糞便被一種單一細菌種(通過自動化系統(tǒng)和MALDI-TOF鑒定為吉氏副擬桿菌)污染。腫瘤生長動力學(xué)(平均值±SEM)顯示與吉氏副擬桿菌污染組合的ATB在體內(nèi)誘導(dǎo)癌癥耐藥性狀態(tài)(n＝4-5只小鼠/組)。(B).用ATB處理常規(guī)飼養(yǎng)的小鼠3-4周，用MCA205植入4天，隨后用單一定殖在糞便中的吉氏副擬桿菌口服接種所述小鼠。在腫瘤接種后第6天，用多柔比星處理小鼠。在8-12只小鼠/組中監(jiān)測多柔比星后的用吉氏副擬桿菌重建的或未用吉氏副擬桿菌重建的ATB處理的小鼠之間的腫瘤生長動力學(xué)(平均值±SEM)。利用線性模型或廣義線性模型分析數(shù)據(jù)。*p<0.05,***p<0.001。圖15:離體產(chǎn)生的Th17和pTh17相較于CTX-誘導(dǎo)的脾CD4+T細胞的轉(zhuǎn)錄譜在重組小鼠IL-1β(10ng/ml)+IL-6(10ng/ml)+IL-23(20ng/ml)(表示為“pTh17”細胞)或用rTGF-β(2.5ng/ml)+IL-6(表示為“Th17”細胞)不存在(Th0)或不存在的情況下利用針對抗-CD3和抗-CD28Ab的板結(jié)合的抗體刺激首次接觸實驗的T細胞。顯示了體外產(chǎn)生的pTh17、Th17細胞(A)以及NaCl或CTX后離體收集的脾來源的CD4+T細胞(B)的轉(zhuǎn)錄譜。利用檢測轉(zhuǎn)錄因子和定義Th1對Th17極化的細胞因子的特異性探針進行定量RT-PCR。圖16:耐受萬古霉素的微生物群。如材料和方法中指定的，將來自未處理的或用萬古霉素處理的荷瘤者的糞便共生菌進行涂板、計數(shù)和鑒定，以分析耐受性集落數(shù)。描繪了在兩個不同動物設(shè)施(CGFL,Dijon對比IGR,Villejuif)中進行的兩個獨立實驗的結(jié)果。圖17.抗生素影響化療誘導(dǎo)的γδT17腫瘤浸潤淋巴細胞的積累。在第10天利用化療處理MCA205肉瘤，第18天收集所述肉瘤以進行產(chǎn)生IL-17的腫瘤浸潤γγT細胞的流式細胞術(shù)表型分型。描述用或不用萬古霉素或廣譜ATB處理的每一個組中的活的CD45+白細胞中的TCRγδ+IL-17+的百分比。每一個組含有6-21只小鼠。Studentt檢驗：**,p<0.01,***,p<0.001。圖18:在野生型首次接觸實驗的小鼠中，針對雞OVA的細胞Th1和Tc1初次免疫應(yīng)答不受抗生素方案影響。用各種抗生素方案(包括廣譜抗生素(ATB)、粘菌素(Coli)或萬古霉素(Vanco))預(yù)處理C57Bl/6小鼠8-10天，在不同時間點通過培養(yǎng)糞便進行監(jiān)測，在腹膜內(nèi)CTX施用后3天，用與50μg的多聚(I:C)混合的1mgOVA于足墊中免疫所述小鼠。在接種后第5天，收集腘和腹股溝引流淋巴結(jié)，并用分別為1mg和10μg/ml的OVA蛋白(左圖)或SIINFEKL肽(右圖)進行再刺激。通過ELISA在72小時時監(jiān)測上清液中的IFNγ釋放。每一個點代表一只小鼠，和體外再刺激的一式三份孔的平均值。已以配對t檢驗進行統(tǒng)計分析，將利用抗原再刺激對不利用抗原再刺激以捕獲Ag特異性效應(yīng)子/記憶應(yīng)答。**,p<0.01,***,p<0.001,ns：不顯著。圖19:使用化療進行的荷肺腺癌KP小鼠的治療。8周齡KP(KrasLSL-G12D/WT；p53Flox/Flox)小鼠通過鼻內(nèi)滴注接受表達Cre重組酶的腺病毒(Ad-cre)以引發(fā)肺腺癌(第0天)。在0.25mg/ml萬古霉素(《化療+萬古霉素》)(混合至飲水中，始于Ad-cre后第77天，直至實驗結(jié)束，每兩周更換含抗生素的水一次)不存在(《化療》)或存在的情況下，使小鼠不接受治療(《Co》)或接受化療(第84天、第91天和第98天)。A.通過如先前所述的(Cortez-Retamozo等，Immunity,2012)非侵入性成像在第73天和第100天(等同于化療‘前’和‘后’)定量被麻醉的小鼠中的腫瘤體積。數(shù)據(jù)顯示兩個時間點之間的肺腫瘤總體積的絕對變化(平均值±SEM)。值得注意的是，抗生素對該疾病的自然進展沒有影響(未顯示)。B.通過對來源于各自組的分離的肺組織樣品的流式細胞術(shù)測量來測定CD8/Treg的比。還研究了一組無腫瘤小鼠(《無腫瘤》)。對于每一組，n≥6小鼠；*,p<0.05,**,p<0.01(雙側(cè)非配對t檢驗)。圖20:CTX-誘導(dǎo)的癌癥患者中的Th1和Th10免疫應(yīng)答針對共生菌。使用載有確定的細菌的患者的自體單體核細胞進行離體再刺激測定，持續(xù)3小時，用抗生素進行中和，隨后在GM-CSF+IL-4中進行培養(yǎng)(以分化成DC)，并用在不同時間點(第0天：CTX之前，第12-46天：CTX之后，NSCLC：非小細胞肺癌)從自體血液純化的CD4+CD45RO+T細胞(以1:2的比率)溫育3天。A.使用ELISA監(jiān)測細胞因子的釋放(IFNγ、TNF、IL-10)。表現(xiàn)出CTX之前和之后的時間點之間的IFNγ分泌的至少2倍增加的患者數(shù)(A，左圖)和患者百分比(A，右圖)。B.具有發(fā)展中的Th1免疫應(yīng)答的3個案例的范例；患者3發(fā)展針對約氏乳桿菌+海氏腸球菌引發(fā)的強Th1免疫。C.具有針對糞腸球菌的強Th1免疫。D.具有對比Th1/TH10特異性應(yīng)答的兩個案例。B-D顯示CTX施用之前和之后每一個單個患者的250.000個記憶CD4+T細胞的40小時上清液中的細胞因子水平。圖21:16SrRNA焦磷酸測序后對所有患者的回腸的分離株水平的主成分分析，比較對照(無化療)對新輔助化療后。圖22:隨機森林分析：接受或不接受化療并患有結(jié)腸癌的患者之間的主要判別屬。來自基于新輔助奧沙利鉑的化療的6個患者和治療前的7個患者的分析。圖23:在對照(無化療)對新輔助化療后之間顯著不同的主要屬。圖24:乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和梭菌屬IV群的分布。在用或不用化療治療的結(jié)腸癌患者中的回腸中。圖25:在與海氏腸球菌單一結(jié)合后的TH1和pTH17免疫應(yīng)答。用萬古霉素、鏈霉素、氨芐青霉素和粘菌素(廣譜ATB方案)處理C57BL/6小鼠14天，隨后在第15天進行一次100mg/kg的CTX的ip注射，并在第16天口服喂食109個細菌(如該圖中舉例說明的)，隨后在第22天對脾細胞進行流式細胞術(shù)分析。A-C.pTH17細胞的流式細胞術(shù)分析?；畹钠⒓毎拈T控中的表達或共表達IFNγ和IL-17(左圖)或CXCR3和CCR6(右圖)的CD4+T細胞。來自3個單獨的實驗(包括5只小鼠/組)的聯(lián)系在一起的數(shù)據(jù)。Anova分析統(tǒng)計分析：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。圖26:針對利用CTX處理的MCA205的抗癌益生菌活性。用萬古霉素、鏈霉素、氨芐青霉素和粘菌素(廣譜ATB方案)處理C57BL/6小鼠14天，隨后用MCA205肉瘤皮下接種，然后在第21天利用一次100mg/kg的CTX腹膜內(nèi)注射進行處理，以及在第22天口服喂食109個細菌(如該圖中舉例說明的)。每二周一次監(jiān)測腫瘤生長動力學(xué)，持續(xù)1個月。A.實驗設(shè)置。B.陽性(CTX而無ATB)和陰性對照(CTX和ATB)組的腫瘤生長。C-F.在利用海氏腸球菌，或約氏乳桿菌或它們兩者(混合物)的口服管飼法存在的情況下的腫瘤生長動力學(xué)。F.來自3個實驗(包括5只小鼠/組)的聯(lián)系在一起的數(shù)據(jù)。Anova分析統(tǒng)計分析：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。圖27:海氏腸球菌誘導(dǎo)OVA-特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。用萬古霉素、鏈霉素、氨芐青霉素和粘菌素(廣譜ATB方案)處理CD45.1+C57BL/6小鼠14天，隨后用MCA205-OVA肉瘤皮下接種，隨后在第21天利用一次100mg/kg的CTX的腹膜內(nèi)注射進行處理，以及在第22天口服喂食109個海氏腸球菌(如圖A上舉例說明的)。在第24天，靜脈內(nèi)轉(zhuǎn)移106個CD45.2+OTII轉(zhuǎn)基因T細胞，8天后處死小鼠以用于受體(CD45.1,B)或供體(CD45.2)CD4+T淋巴細胞的流式細胞術(shù)分析。B.脾細胞計數(shù)(左圖)、Ki67+CD4+T細胞的百分比的測定(中圖)和利用或不用ATB的CTX后宿主中的pTH17。C.通過脾中的CD45.2+、Ki67+或CD44+表達檢查供體T細胞的回收。D.同上如C所示，但在瘤床中，通過計數(shù)絕對數(shù)目。顯示了代表性實驗，利用Studentt檢驗進行統(tǒng)計分析。*p<0.05。圖28:海氏腸球菌誘導(dǎo)E7-特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。A.實驗設(shè)置。利用廣譜ATB預(yù)處理的小鼠中的皮下TC1接種，并在腫瘤植入后第7天使用SBxT-E7與CTX的組合(+/-與海氏腸球菌的單一結(jié)合)進行治療。B-C.兩個實驗中的代表性腫瘤生長動力學(xué)和完全腫瘤根除的百分比。D.脾中的Db-E739-47四聚體結(jié)合CD8+T細胞的監(jiān)測。呈現(xiàn)的是來自兩個實驗的結(jié)果。Anova檢驗用于統(tǒng)計分析。*p<0.05。圖29:來自不同公共文庫的一系列海氏腸球菌分離株的脈沖場凝膠電泳。這些克隆間的序列相似性的無參照分級聚類。已在GustaveRoussy動物設(shè)施中在不同種類的療法(CTLA4阻斷，CTX)后從小鼠脾細胞分離克隆13144-13147。已在下文或上文中使用的一個分離株在本圖中表示為“13144Villejuif”，并且對應(yīng)于在2013年11月7日以編號I-4815保藏于法國國立微生物保藏中心CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)的海氏腸球菌菌株。圖30:各種海氏腸球菌分離株在體內(nèi)的差異免疫原性。用萬古霉素、鏈霉素、氨芐青霉素和粘菌素(廣譜ATB方案)處理C57BL/6小鼠14天，隨后在第15天，進行一次100mg/kg的CTX的腹膜內(nèi)注射，并在第16天口服喂食109個細菌(克隆708對克隆CNCMI-4815)，隨后在第22天進行脾細胞的流式細胞術(shù)分析。陽性對照通過利用CTX(無先前的ATB)處理的小鼠來表示。A-C.TH1、Tc1或pTH17細胞的流式細胞術(shù)分析。表達IFNγ或CXCR3的CD4+TH1細胞(A，左和右圖)、表達IFNγ的CD8+Tc1(B)或活的CCR6+CD4+T淋巴細胞的門控中的表達CXCR3的CD4+pTH17細胞(C)。來自3個單獨的實驗(包括5只小鼠/組)的聯(lián)系在一起的數(shù)據(jù)。Anova統(tǒng)計分析：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。圖31:NOD受體的觸發(fā)阻礙細菌移位和通過促進抗微生物肽的釋放進行的pTH17細胞的引發(fā)。A.各種小鼠背景中的CTX治療后48小時的脾細胞中的細菌集落的計數(shù)。將從C57BL/6WT或NOD1-/-xNOD2-/-小鼠收集的脾細胞(左圖)和腸系膜LN(中圖)在厭氧條件中培養(yǎng)48小時。計數(shù)細菌的長出(集落數(shù)/平板和陽性板的頻率/只動物(右圖))，最終通過質(zhì)譜表征細菌的長度以用于細菌鑒定。B.pTH17細胞的流式細胞術(shù)分析。WT對NOD1或NOD2缺陷型小鼠中的活的IL-17+T脾細胞的門控中的共表達IFN□γ的CD4+T細胞。C.同上如B所示，但在根據(jù)該圖的上部分中對齊的實驗設(shè)置，在利用NOD激動劑(MDP和TriDAP)處理的WT動物中進行實驗。D.根據(jù)C中對齊的實驗設(shè)置的小鼠的糞便中的脂質(zhì)運載蛋白-2的ELISA監(jiān)測。顯示A和D的代表性實驗。在B-C中描繪了2-3個單獨的實驗(包括3只小鼠/組)的聯(lián)系在一起的數(shù)據(jù)。Anova統(tǒng)計分析：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。圖32:LPS對海氏腸球菌+約氏乳桿菌誘發(fā)pTH17細胞的能力起著抑制作用。A-C.TLR4激動劑與革蘭氏陽性細菌之間就在脾中誘發(fā)TH1(A)、Tc1(B)和pTH17(C)細胞的比較。實驗設(shè)置描述于圖25中。但以500ug/只小鼠的劑量重復(fù)LPS的添加2次或不進行LPS的口服施用?；畹钠⒓毎拈T控中的共表達IFNγ和IL-17的CD4+T細胞的流式細胞術(shù)分析。來自3個單獨的實驗(包括5只小鼠/組)的聯(lián)系在一起的數(shù)據(jù)。Anova統(tǒng)計分析：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。圖33:CTX對抗各種基因缺陷型宿主中生長的肉瘤的相對效力。每隔7天以100mg/kg在WT(A)、NOD1(B)、NOD2(C，左圖)、CARD9(C，中圖)、RIP2(C，右圖)、NOD1xNOD2(D，左圖和右圖)-缺陷型小鼠中腹膜內(nèi)施用CTX。每一幅圖在一個代表性生長動力學(xué)中描繪了5個腫瘤的平均值/組。Studentt檢驗：*p<0.05。圖34:TLR4激動劑在海氏腸球菌+約氏乳桿菌的結(jié)合的抗癌益生菌活性中的抑制作用。利用萬古霉素、鏈霉素、氨芐青霉素和粘菌素(廣譜ATB方案)處理C57BL/6小鼠14天，隨后利用MCA205肉瘤皮下接種，隨后在第21天(和第29天)中通過一次100mg/kg的CTX的一次腹膜內(nèi)注射進行處理，以及在第22天口服喂食LPS(A)500ug/只小鼠或109個細菌(大腸桿菌(E.coli))(B)。每兩周監(jiān)測腫瘤生長動力學(xué)1次，持續(xù)1個月。指示了陽性(CTX而無ATB)和陰性(PBS，于ATB中)對照。在利用海氏腸球菌+約氏乳桿菌+/-大腸桿菌或LPS的口服管飼法存在的情況下腫瘤生長動力學(xué)的平均值/5只小鼠/組。代表性圖示于A和B中，并且來自2個實驗(包括5只小鼠/組)的大腸桿菌+LPS的聯(lián)系在一起的數(shù)據(jù)示于C中。Studentt檢驗：*p<0.05。圖35:來自用或未用CTX處理的WT對NOD1xNOD2缺陷型小鼠的大便的基因擴增子的16srRNA的焦磷酸測序的主成分分析。A.PCA.已于首次接觸實驗的C57BL/6非荷瘤者中的CTX接種后第7天收集大便。已對來自4-5只動物/組的糞便進行測序。在該圖上指示了顯示基因缺陷型小鼠的PBS與CTX療法之間的顯著結(jié)果的p值。B.雙敲除小鼠中CTX治療后過量的科的詳細內(nèi)容。擬桿菌門中的大多數(shù)科成員的分析。突出顯示通過CTX治療產(chǎn)生的以毛螺菌科(Lachnospiraceae)的減少為代價的紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)的富集的4個群(左圖)之間的多樣性和差異的熱圖圖示，如右圖上顯示的統(tǒng)計分析中顯示的。C.針對厭氧桿菌屬、霍爾德曼氏菌屬和紫單胞菌屬的雙敲除小鼠中的CTX治療后OTU的詳細內(nèi)容。圖36:來自利用CTX處理的或未用CTX處理的WT對NOD1xNOD2缺陷型小鼠的小腸生物膜的基因擴增子的16srRNA的焦磷酸測序的主成分分析。A.PCA.已在首次接觸實驗的C57BL/6非荷瘤者的CTX接種后第7天收集了回腸的生物膜。已對來自4-5只動物/組的小腸進行了測序。該圖中指示了顯示基因缺陷型小鼠的PBS與CTX治療之間的顯著結(jié)果的p值。B.突出顯示通過CTX治療產(chǎn)生的以丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)的減少為代價的梭菌科(主要是SFB，表4)的富集的4個群之間的多樣性和差異的熱圖圖示，如表1中顯示的統(tǒng)計分析中顯示的。圖37:共生海氏腸球菌與潛在致病性生物(pathobiont)產(chǎn)氣莢膜桿菌(Clostridiumperfringens)的組合。如圖26中的相同實驗設(shè)置，但已同樣地通過口服管飼法引入了產(chǎn)生莢膜桿菌。每兩周監(jiān)測腫瘤生長動力學(xué)一次，持續(xù)1個月。A.兩組的腫瘤生長：海氏腸球菌對產(chǎn)氣莢膜桿菌。B.在利用海氏腸球菌+植物乳桿菌對海氏腸球菌+產(chǎn)生莢膜桿菌的口服管飼法存在的情況下的腫瘤生長動力學(xué)。顯示了兩個實驗(包括5只小鼠/組)。Anova統(tǒng)計分析：*p<0.05。圖38:與CTX組合的抗癌疫苗促進長效抗癌免疫，所述免疫取決于腸道革蘭陰性細菌。A.實驗設(shè)置。用廣譜ATB(氨芐青霉素、粘菌素、鏈霉素)或萬古霉素(其只殺死革蘭氏陽性細菌)或粘菌素(其只殺死革蘭陰性細菌)處理C56BL/6小鼠9天，隨后接受一次CTX(100mg/kg)的腹膜內(nèi)注射，3天后用CpG佐劑中的OVA蛋白(或模擬疫苗)進行接種。20天后停止ATB，并且不對動物進行處理，觀察1個月。在第50天，用10x倍于MTD的致死劑量的MC38-OVAdim腫瘤細胞皮下再攻擊所有小鼠。B.基于腫瘤長出(表征無或弱記憶T細胞應(yīng)答)對動物進行評分。記錄2個實驗(包含5只小鼠/組)的無腫瘤小鼠的百分比。*Anova檢驗：p<0.05。圖39:ATB方案對CTX的效力的影響。施用不同的ATB方案(ZhangY等人，ToxicologyandAppliedPharmacology277(2014)138-145)持續(xù)15天，隨后進行腫瘤接種和每隔13天進行CTX治療。每周2次用測徑器監(jiān)測腫瘤長出。據(jù)報導(dǎo)減少厚壁菌門、最特別地梭菌科最終減小厚壁菌門/擬桿菌屬之比的方案(諸如新霉素+頭孢噻吩或萬古霉素+亞胺培南的組合)(圖C-D)可提高CTX-誘導(dǎo)的抗腫瘤作用，然而環(huán)丙沙星(cifloxacin)(其相反誘導(dǎo)顯著抑制擬桿菌門)是低效的(圖B)。值得注意的是，新霉素+頭孢噻吩的組合可增強SFB代表性，而萬古霉素+亞胺培南增加紫單胞菌屬的代表性。每一個實驗含有數(shù)組的5只小鼠。*Anova檢驗：p<0.05。優(yōu)選實施方案的詳述在本說明書中，使用以下一般定義：腸道微生物群“腸道微生物群”(以前稱為腸道菌群或微生物群落)表示屬于動物界的任何生物(人、動物、昆蟲等)的腸中的微生物的群體。雖然每一個個體具有獨特的微生物群組成(在總共400-500個不同的細菌種/個體中，60至80個細菌種由超過50％的采樣人群所共有)，但它總是實現(xiàn)相似的主要生理功能并且對個體的健康具有直接影響：·它促成胃和小腸不能消化的某些食物(主要是不可消化的纖維)的消化；·它促成一些維生素(B和K)的產(chǎn)生；·它保護免受來自其它微生物的侵害，維持小腸粘膜的完整性；·它在適當?shù)拿庖呦到y(tǒng)的發(fā)育中起著重要作用；·健康、多種多樣和平衡的腸道微生物群是確保腸發(fā)揮恰當功能的關(guān)鍵?？紤]到腸道微生物群在身體的正常功能中所起的主要作用和其實現(xiàn)的不同功能，它現(xiàn)今被當作“器官”。然而，因為嬰兒生來無菌，因此它是“獲得性”器官；也就是說，腸道定殖在出生后立即啟動，并在之后演化。腸道微生物群的發(fā)展始于出生。子宮內(nèi)部的無菌、新生兒的消化道被來自母親(陰道、皮膚、乳房等)、其中發(fā)生遞送的環(huán)境、空氣等的微生物迅速定殖。從第3天開始，腸道微生物群的組成直接取決于嬰兒如果被喂養(yǎng)：相較于用嬰兒配方奶哺育的嬰兒，以母乳喂養(yǎng)的嬰兒的腸道微生物群例如主要由雙歧桿菌屬主導(dǎo)。腸道微生物群組成的演化遍及整個生命，從出生至老年，并且是不同環(huán)境影響的結(jié)果。腸道微生物群的平衡可在老化過程中受到影響，因此，老年人具有與年輕成人顯著不同的微生物群。雖然主導(dǎo)腸道微生物群的一般組成在大多數(shù)健康人中是相似的(4個主要的門，即厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門)，但種水平上的組成是高度個性化的，并且主要由個體的遺傳、環(huán)境和飲食決定。腸道微生物群的組成可變得習(xí)慣于飲食成分(暫時地或永久地)。例如，日本人可因他們的微生物群已從海洋細菌獲得的特殊酶而能消化海藻類(他們?nèi)粘ｏ嬍车囊徊糠?。生態(tài)失調(diào)雖然它可適應(yīng)變化并具有高彈性容量，但腸道微生物群組成失去平衡可在某些特定情況下出現(xiàn)。這被稱為“生態(tài)失調(diào)”，腸道中潛在地“有害”細菌與已知的“有益”細菌之間的不平衡或?qū)椭饕旱慕M成和多樣性而言被認為是“健康”微生物群的微生物群的任何偏差。生態(tài)失調(diào)可與健康問題諸如功能性腸病、炎性腸病、變態(tài)反應(yīng)、肥胖和糖尿病相關(guān)。它也可以是治療(諸如細胞毒性治療或抗生素治療)的結(jié)果。取決于致病條件，可突顯特定的生態(tài)失調(diào)。例如，克羅恩病、慢性炎性腸病患者呈現(xiàn)具有減少的百分比和多樣性的屬于厚壁菌門并且主要來自柔嫩梭菌(Clostridiumleptum)(IV簇)群的細菌的微生物群(Manichanh等人，2006；Sokol等人，2006)。一般地，可觀察到來自毛螺菌科的細菌百分比降低。此外，這些患者的粘膜相關(guān)微生物群中的來自雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的細菌被耗盡，朝向病原性細菌(諸如具有粘附和侵襲性表型(AIEC)的大腸桿菌(Escherichiacoli)的特定菌株)的水平潛在地升高(Darfeuille-Michaud等人，2011,2004；Joossens等人，2011)。相反，肥胖和代謝紊亂患者在他們的糞便中具有較高比例的屬于厚壁菌門的細菌和較低水平的大腸桿菌(Ley等人，2005；Turnbaugh等人，2009)。這些患者中的大腸桿菌的比例的增加與減肥手術(shù)后體重減輕以及較低的血清瘦蛋白水平相關(guān)聯(lián)(Furet等人，2010)。然而，在結(jié)直腸癌(CRC)患者中，腸道微生物生態(tài)失調(diào)涉及來自擬桿菌屬的細菌種的富集和屬于Faecalibacterium和羅斯氏菌屬(Roseburia)的種的減少(Sobhani等人，2011；Wu等人，2013)。具體而言，發(fā)現(xiàn)梭桿菌屬(Fusobacterium)和彎曲桿菌屬(Campylobacter)在CRC患者的糞便和粘膜二者中一致增加。在癌癥的情況下，“有益的”或“有利的”細菌基本上是乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，而“有害的”或“不利的”細菌基本上是以下種：吉氏副擬桿菌和Faecalibacteriumprausnitzii，和以下屬：吉米菌屬、Alistipes和梭菌屬IV簇(柔嫩梭菌群)?？鼓[瘤治療“抗腫瘤治療”在本文中指除手術(shù)外用于癌癥的任何治療。它們包括化療、激素療法和生物療法以及放射療法?；煛盎煛痹诒疚闹斜欢x為用一種或多種“化療劑”治療癌癥。化療劑是通過殺死快速分裂的細胞(大多數(shù)癌細胞的主要特性之一)起作用的化學(xué)分子。存在幾類化學(xué)劑：-烷化劑(在下文進一步定義)；-紡錘體毒劑，諸如甲苯達唑、秋水仙堿；-有絲分裂抑制劑(包括紫杉烷類(紫杉醇多西他賽)和長春花生物堿(例如：長春花新堿、長春花堿、長春瑞濱、長春地辛))，-細胞毒性/抗腫瘤抗生素：諸如蒽環(huán)類(例如：多柔比星、柔紅霉素、阿霉素、伊達比星、表柔比星和米托蒽醌、戊柔比星(valrubicin))、鏈霉菌素(例如：放線菌素、博萊霉素、絲裂霉素、普卡霉素)-抗-代謝物(諸如嘧啶類似物(例如：氟嘧啶類似物、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿核苷(floxuridine)(FUDR)、阿糖胞苷(Cytarabine)、吉西他濱卡培他濱；嘌呤類似物(例如：硫唑嘌呤、巰基嘌呤、硫代鳥嘌呤、氟達拉濱、噴司他丁(pentostatin)、克拉屈濱、卡培他濱、氯法拉濱(clofarabine))；葉酸類似物(例如：氨甲蝶呤、葉酸、培美曲塞、氨基蝶呤、雷替曲塞(raltitrexed)、甲氧芐啶、乙胺嘧啶)，-拓撲異構(gòu)酶抑制劑(例如：喜樹堿：伊立替康、拓撲替康、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷)；-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑：2'-脫氧-5-氮雜胞苷(DAC)、5-氮雜胞苷、5-氮雜-2'-脫氧胞苷、1-[β]-D-阿糖呋喃基-5-氮雜胞苷、二氫-5-氮雜胞苷；-血管破壞劑，諸如黃酮乙酸衍生物、5,6-二甲基呫噸酮-4-乙酸(DMXAA)和黃酮乙酸(FAA)；-還有其它化療藥物諸如阿瑞匹坦(aprepitant)、硼替佐米(bortezomib)(MilleniumPharmaceuticals)、甲磺酸伊馬替尼卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、他莫昔芬、吉非替尼、厄洛替尼、羧胺三唑、efaproxiral、替拉扎明(tirapazamine)、xcytrin、胸腺法新、長春氟寧。烷化劑之所以被命名為“烷化劑”，是因為它們能夠烷化許多分子(包括蛋白質(zhì)、RNA和DNA)。這種通過它們的烷基共價結(jié)合于DNA的能力是它們抗癌作用的主要原因，因為這引發(fā)細胞凋亡。烷化劑是不依賴于細胞周期的藥物，并且它們的作用通常是劑量依賴性的。烷化劑的亞型是氮芥、亞硝基脲、四嗪、氮丙啶和非經(jīng)典烷化劑。氮芥包括甲二氯二乙胺(mechlorethamine)、環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、異環(huán)磷酰胺和白消安。亞硝基脲包括N-亞硝基-N-甲基脲(MNU)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和賽氮芥(semustine)(MeCCNU)、福莫司汀(fotemustine)和鏈脲佐菌素。四嗪包括達卡巴嗪、米托唑胺(mitozolomide)和替莫唑胺。氮丙啶包括塞替派(thiotepa)、絲裂霉素(mytomycin)和地吖醌(diaziquone)(AZQ)。非經(jīng)典烷化劑包括甲基芐肼和六甲嘧胺(hexamethylmelamine)。在整個本申請中，為基于鉑化療藥物(也稱為“鉑類似物”)并以類似方式用作烷化劑的“烷基化樣劑”將被包括在“烷化劑”的范疇內(nèi)。此類試劑不具有烷基，但仍然損傷DNA。它們與DNA永久配位以干擾DNA修復(fù)。如本文中定義的該子類的烷化劑的實例為鉑、順鉑、卡鉑、奈達鉑、奧沙利鉑、沙鉑和四硝酸三鉑(triplatintetranitrate)。生物療法抗癌“生物療法”涉及使用活的生物、來源于活的生物的物質(zhì)或此類物質(zhì)的實驗室產(chǎn)生的形式，通過直接靶向癌細胞或通過刺激身體的免疫系統(tǒng)以作用于癌細胞(“免疫療法”)來治療癌癥。生物療法包括單克隆抗體(包括靶向癌細胞表面的那些抗體，例如利妥昔單抗和阿侖單抗；抗-CTLA4Mab，諸如易普利姆瑪(ipilimumab)；靶向生長因子，例如：貝伐單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗和曲妥珠單抗；抗-PD-1Mab；抗-Tim3Mab；抗-ICOSMab)、免疫綴合物(例如：90Y-替伊莫單抗(90Y-ibritumomabtiuxetan)、131I-托西莫單抗和ado-trastuzumabemtansine)、細胞因子(包括干擾素諸如IFNα；白細胞介素，諸如IL-2、IL-11、G-CSM、GM-CSF)、治療性疫苗(例如：Sipuleucel-T)、細菌卡介苗Calmette-Guérin、殺癌病毒、基因療法和過繼T細胞轉(zhuǎn)移。益生元、益生菌和合生元“益生元”是以聲稱對健康有益的方式刺激細菌在消化系統(tǒng)中的生長和/或活性的不可消化的食物成分。它們通常是允許腸道微生物群的組成和/或活性的特定變化的選擇性地發(fā)酵的成分?！耙嫔碑敱幌M時具有聲稱的健康益處的微生物。益生菌通常被作為具有特別添加的活性活培養(yǎng)物的發(fā)酵食物的部分(諸如在酸奶、大豆酸奶中)或作為膳食補充劑消費。通常，益生菌幫助腸道微生物群保持(或重建)其平衡性、完整性和多樣性。益生菌的作用通常是菌株依賴性的。“合生元”是指以協(xié)同作用的形式組合益生菌和益生元的營養(yǎng)補充劑(從而合生元)。組合使用益生元和益生菌通常被描述為合生元，但聯(lián)合國食品與農(nóng)業(yè)組織(FAO)推薦只有在凈健康益處是協(xié)同的情況下才使用術(shù)語“合生元”。癌癥、治療等.如本文中所用，“癌癥”意指所有類型的癌癥。具體地，癌癥可以是實體癌或非實體癌。癌癥的非限定性實例是癌或腺癌諸如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌或結(jié)腸癌、肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤、白血病、生殖細胞癌和母細胞瘤。如本文中所用，術(shù)語“治療”、“醫(yī)治”和“醫(yī)療”是指癌癥，特別是實體瘤(例如在乳腺癌中)的進展、嚴重性和/或持續(xù)時間的任何減少或改善，因一種或多種療法的施用而導(dǎo)致的其一個或多個癥狀的減輕。必要時，在下文中指定其它定義。根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種益生菌組合物，其包含選自海氏腸球菌、約氏乳桿菌、分節(jié)絲狀菌(SFB)、紫單胞菌屬、厭氧桿菌屬、霍爾德曼氏菌屬及其混合物的細菌，所述益生菌組合物用作向癌癥患者施用的抗腫瘤治療的佐劑。根據(jù)本發(fā)明的益生菌組合物的優(yōu)選實施方案，所述組合物包括海氏腸球菌和至少一種選自紫單胞菌屬、厭氧桿菌屬和霍爾德曼氏菌屬的菌株。用于上述組合物的海氏腸球菌的優(yōu)選菌株為2013年11月7日以編號I-4815保藏于法國國立微生物保藏中心CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)的菌株。這種組合物可有利地還包含約氏乳桿菌菌株，諸如2013年11月15日以編號I-4823保藏于法國國立微生物保藏中心CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)的約氏乳桿菌菌株LJFS001B。上述益生菌組合物可被有利地配制用于口服施用并作為食物添加劑或作為功能性食品施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種可包含活的或被殺死的微生物并且可呈現(xiàn)為食品添加劑(例如，丸劑、片劑等)或為功能性食品(諸如飲料、發(fā)酵酸奶等)的配方。根據(jù)優(yōu)選實施方案，在向有些需要的患者施用抗腫瘤治療例如化療劑例如環(huán)磷酰胺(CTX)后，向所述患者施用根據(jù)本發(fā)明的益生菌組合物。例如，可在與CTX給藥的同一天，或在數(shù)天的治療后施用益生菌組合物。在節(jié)律性環(huán)磷酰胺施用的情況下，可在每一次CTX攝取后或甚至在同時每天施用益生菌組合物。或者，在施用抗腫瘤治療之前，向有此需要的患者施用根據(jù)本發(fā)明的益生菌組合物。一些化療劑，尤其是CTX，已被描述為抗癌疫苗的有效佐劑。根據(jù)本發(fā)明的益生菌組合物的特別有用的應(yīng)用是它們與此種化療劑組合以用于進一步增強癌癥接種疫苗的效力的用途。用于治療癌癥患者的方法(其包括在單獨地或與抗癌疫苗組合地施用化療劑之前和/或之后，向所述患者施用益生菌細菌組合物(諸如上述的))，也是本發(fā)明的一部分。雖然可向利用抗腫瘤治療(諸如化療)的任何患者適當?shù)厥┯?單獨地或與抗腫瘤疫苗組合地)上述組合物，但它們對于以下患者是特別有用的：所述患者患有生態(tài)失調(diào)，其中存在于所述益生菌組合物中的益生菌種的不足。本的發(fā)明另一個方面是化療劑和抗生素組合物的組合用于治療癌癥的用途，當向個體施用所述組合時，所述組合在所述個體的腸道微生物群中降低厚壁菌門/擬桿菌門的比，或者特異性增加SFB和/或紫單胞菌科，和/或減少梭菌屬IV群。根據(jù)具體的實施方案，抗生素組合物包含萬古霉素與亞胺培南的組合或由所述組合組成。根據(jù)另一個具體的實施方案，抗生素組合物包含新霉素與頭孢噻吩的組合或由所述組合組成。有利地，與上述抗生素組合物組合使用的化療劑為環(huán)磷酰胺(CTX)。如本文中所用，術(shù)語“組合”是指不止一種試劑(例如，萬古霉素+亞胺培南和CTX)的使用。術(shù)語“組合”的使用不限制其中向患者施用治療劑的順序，盡管優(yōu)選地在化療劑之前或與之同時施用抗生素混合物。例如，可在CTX之前(例如，之前24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周)按時地或數(shù)次地(例如，每一天)施用萬古霉素和亞胺培南，優(yōu)選持續(xù)3至7天，隨后施用抗腫瘤治療。有利地，在施用化療藥物之前施用抗生素組合物以調(diào)節(jié)患者的腸道微生物群，以優(yōu)化所述化療藥物(諸如環(huán)磷酰胺)的作用。本發(fā)明因此提供了用于治療癌癥患者的方法，其包括在施用化療藥物(單獨地或與抗癌疫苗組合地)之前施用抗生素組合物，當向所述個體施用時，所述抗生素組合物在所述個體的腸道微生物群中降低厚壁菌門/擬桿菌門的比，或者特異性增加SFB和/或紫單胞菌科，和/或減少梭菌屬IV群。本發(fā)明還涉及抗生素組合物作為輔助療法用以增強向所述患者施用的化療劑的抗癌作用的用途，當向所述個體施用時，所述抗生素組合物在所述個體的腸道微生物群中降低厚壁菌門/擬桿菌門的比，或者特異性增加SFB和/或紫單胞菌科，和/或減少梭菌屬IV群。實際上，如在下面的實驗部分中所示，其可用于通過抗生素和/或益生菌的使用調(diào)節(jié)患者的腸道微生物群，用以增強化療劑(諸如，例如CTX)的抗癌作用?？股亟M合物(諸如萬古霉素+亞胺培南和新霉素+頭孢噻吩)對于該目的是特別有用的。本發(fā)明的另一個目的是免疫原性組合物，其包含選自海氏腸球菌、約氏乳桿菌、糞腸球菌、分節(jié)絲狀菌(SFB)、紫單胞菌屬、厭氧桿菌屬、霍爾德曼氏菌屬及其混合物的細菌的片段，所述免疫原性組合物用作向癌癥患者施用的抗腫瘤治療的佐劑。根據(jù)優(yōu)選實施方案，所述免疫原性組合物包含與選自紫單胞菌屬、厭氧桿菌和霍爾德曼氏菌屬的至少一個菌株的片段一起的海氏腸球菌的片段，更優(yōu)選菌株CNCMI-4815的片段。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物優(yōu)選被配制用于皮下或肌內(nèi)施用?？捎欣卦谑┯没焺?諸如CTX)之前、與之同時或之后施用它們，以誘導(dǎo)將對所述治療具有輔助作用的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及細胞組合物以及它們在與化療劑組合的過繼細胞轉(zhuǎn)移中的用途。用于從患者獲得各種免疫細胞類型以及離體脈沖或訓(xùn)練此類細胞的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。此類技術(shù)，除其它以外，由Caux等人(1996)、Sallust(1994)、Palucka(2013)、Vanlint(2014)、Arrntzen(2008)和Lesterhuis(2008)進行了描述。根據(jù)本發(fā)明的第一細胞組合物是包含已用益生菌組合物或用上述免疫原性組合物離體脈沖的抗原提呈細胞(APC)(諸如樹突狀細胞(DC))的組合物。根據(jù)優(yōu)選實施方案，存在于細胞組合物中的抗原提呈細胞也已用腫瘤抗原離體脈沖。根據(jù)本發(fā)明的細胞組合物對于治療(通過組合過繼細胞轉(zhuǎn)移與抗腫瘤治療)癌癥是特別有用的。取決于臨床情況，醫(yī)師將決定如何施用這樣的細胞組合物。具體地，可通過結(jié)內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射或皮下注射施用這些組合物。根據(jù)本發(fā)明的另一種過繼轉(zhuǎn)移法，可將上述APC組合物用于離體“訓(xùn)練”從患者獲得的T細胞，隨后將這些經(jīng)訓(xùn)練的T細胞(尤其是記憶T細胞)再注射至患者。因此，包含通過包括將從癌癥患者獲得的T細胞與上述APC組合物離體接觸的方法獲得的記憶T細胞的細胞組合物也是本發(fā)明的一部分。此種T細胞組合物可有利地作為佐劑用于繼細胞轉(zhuǎn)移以增強單獨地或與抗腫瘤疫苗接種組合地施用的抗腫瘤治療(諸如化療(尤其是CTX施用))的作用。對于樹突狀細胞，取決于臨床情況，可通過結(jié)內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射或皮下注射施用T細胞。本發(fā)明還涉及用于離體獲得能夠提高化療藥物的抗癌活性的方法，其包括將多克隆T細胞系或大量自體T細胞與提呈來自海氏腸球菌、約氏乳桿菌、分節(jié)絲狀菌(SFB)、紫單胞菌屬、厭氧桿菌和霍爾德曼氏菌屬的肽的樹突狀細胞(DC)一起離體擴增。本發(fā)明的另一個方面是鑒定可能為好的化療應(yīng)答者的患者的體外方法，其包括測定TLR4、NOD1和NOD2在所述患者中的功能性，其中如果所述患者缺乏功能性TLR4和/或NOD1/CARD4(rs2006847、rs2066844、rs2066845、rs2066842、ND(1)+32656、rs2075820、……)和/或NOD2/CARD15(諸如p.R702W、p.G908R、p.Leu1007fsX1008)，所述患者被鑒定為好的化療(除蒽環(huán)類和草酸鉑和放射療法外的所有化療)應(yīng)答者。已在編碼TLR4的基因內(nèi)鑒定了兩個共分離的單核苷酸多態(tài)性(SNP)—Asp299Gly和Thr399Ile。這些SNP存在于約10％的白種人個體中，并且已發(fā)現(xiàn)其與幾種感染性疾病呈正相關(guān)。在本方法的特定實施方案中，例如通過PCR或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它方法確定這些SNP之一或兩者的存在與否。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及用于體外確定癌癥患者是否可從抗腫瘤治療受益的方法，其包括以下步驟：(i)從來自所述患者的適當生物樣品，測定癌癥和化療的特定背景中的“不利”細菌(例如來自包含以下種：吉氏副擬桿菌和Faecalibacteriumprausnitzii，來自包含以下屬：吉米菌屬、Alistipes和梭菌屬IV簇(柔嫩梭菌群；如由Collins等人在thetaxonomicdescriptionofClostridiumbacteria中描述的)或由所述種或?qū)俳M成的組的細菌)在所述患者的腸道微生物群中的相對豐度；任選地，在同樣的生物樣品中，也測定癌癥和化療的特定背景中的“有利”細菌(例如來自以下屬的細菌：乳桿菌屬和雙歧桿菌屬)的相對豐度；例如，如果觀察到減小的厚壁菌門/擬桿菌門的比，則也確定來自以下科：紫單胞菌科、SFB……的細菌的存在；(ii)確定腸道生態(tài)失調(diào)的存在與否；其中具有過量的來自步驟(i)中引述的分類群的“不利”細菌的腸道生態(tài)失調(diào)表明患者將不是好的抗腫瘤治療應(yīng)答者。在前文中，“相對豐度”被定義為特定分類級(從門至種)的細菌數(shù)在生物樣品中占細菌總數(shù)的百分比。例如，可以通過測量存在于樣品中的被分配給這些細菌的16SrRNA基因序列的百分比來評估該相對豐度。其可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當?shù)募夹g(shù)諸如這些特定細菌的16SrRNA標志物的454焦磷酸測序和定量PCR(如在下文實驗部分中描述的)，或?qū)τ诰菏翘禺惖娜魏位虻亩縋CR來測量。在本說明書中，“好的治療應(yīng)答者”，也稱為“應(yīng)答者”或“應(yīng)答”患者，或換句話說“受益于”該治療的患者，是指患有癌癥并且在接受該治療后顯示或?qū)@示癌癥的臨床上顯著的緩解的患者。可根據(jù)本領(lǐng)域中公認的標準(諸如免疫相關(guān)應(yīng)答標準(irRC)、WHO或RECIST標準)來評估疾病臨床數(shù)據(jù)。根據(jù)具體的實施方案中，生物樣品是獲自患者的十二指腸或回腸粘膜的活組織檢查(優(yōu)選地大型活組織檢查)的生物膜。例如，可以已在胰腺癌、胃癌、膽道癌或結(jié)腸癌的特定手術(shù)過程中獲得該活組織檢查。根據(jù)涉及任何類型的癌癥的另一個實施方案，生物樣品是從患者獲得的糞便樣品?？梢岳缭谠\斷時，或在決定開始治療之前的任何時刻收集該樣品。當觀察到具有過量的如上定義的“不利”細菌的腸道生態(tài)失調(diào)時，這表明所述患者需要在開始抗腫瘤治療之前平衡腸道微生物群的治療，或作為所述治療的佐劑(例如：在開始化療之前/當開始化療時進行的益生元或益生菌施用)的治療。因此，可作出決定來在開始抗腫瘤治療之前的一段時間(例如，數(shù)周)內(nèi)改進患者的方案(提供益生元或益生菌)。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及用于體外確定抗腫瘤治療是否要繼續(xù)或停止用于癌癥患者的方法，其包括以下步驟：(i)從在抗腫瘤治療開始后至少3周，優(yōu)選在開始腫瘤治療后6-9周(對應(yīng)于3個周期的化療)獲得的來自所述患者的生物樣品，分析針對至少一種共生種的細菌(優(yōu)選至少2種和更優(yōu)選至少3、4或更多種共生菌)的記憶CD4+T細胞應(yīng)答；(ii)對于分析針對其的CD4+T細胞應(yīng)答的每一種共生種，將所述應(yīng)答分類在以下分類之一中：-無記憶CD4+T細胞應(yīng)答；-Th10:Tr1/Treg表型的記憶應(yīng)答；-Th1表型的記憶應(yīng)答，其中如果對于至少一個共生種觀察到Th1表型的記憶應(yīng)答，則繼續(xù)抗腫瘤治療，以及在此種應(yīng)答不存在的情況下，終止抗腫瘤治療或用適當?shù)囊嫔?參見下文)補償抗腫瘤治療。該藥效學(xué)測定特別地用于預(yù)測，在3-9周的化療(1-3個周期的化療)后，優(yōu)選在6-9周(2-3個周期)的化療后，該化療是否可能觸發(fā)輔助免疫應(yīng)答和臨床益處。為了對應(yīng)答進行分類，在離體再刺激測定中測量IL-2、TNFα、IFNγ和IL-10的分泌。在優(yōu)選實施方案中，在治療開始前完成第一測定，以將數(shù)周治療后的細胞因子分泌譜與治療前觀察到的細胞因子分泌譜相比較?？梢岳缡褂幂d有確定的細菌并用從自體血液純化的CD4+CD45RO+T細胞溫育的患者的自體單核細胞進行這些測定。如果應(yīng)答具有Th1表型，即，如果再刺激觸發(fā)顯著的IL-2、TNFα和IFNγ的分泌和低IL-10分泌(尤其是當比較治療后與治療前獲得的結(jié)果時)，則將所述應(yīng)答分類在第三(有利的)分類中。通常地，對于具有Th1表型的應(yīng)答的患者，治療后(相較于治療前)觀察到IFNγ分泌的至少2倍增加。第一分類(無記憶CD4+T細胞應(yīng)答)對應(yīng)于治療后再刺激測定中缺乏顯著的細胞因子分泌，而第二分類對應(yīng)于其中治療后再刺激測定中的IL-10分泌高于治療前觀察到的IL-10分泌的應(yīng)答。根據(jù)上述方法的特定實施方案，分析針對選自約氏乳桿菌、海氏腸球菌和糞腸球菌的至少兩個種的記憶CD4+T細胞應(yīng)答。優(yōu)選地，評估針對這些種中的2個種，更優(yōu)選針對這些種的所有種的應(yīng)答。該藥效學(xué)法的一個特別有利的方面是其可使用血液樣品來進行。當然，可對具有任何類型的癌癥的患者完成它。根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及用于體外確定已被施用于患者的新輔助抗腫瘤治療的生物學(xué)作用的方法，其包括以下步驟：(i)從所述患者的適當?shù)纳飿悠窚y定所述微生物群中的“有利”細菌的相對豐度；(ii)從同樣的生物樣品測定所述腸道微生物群中的“不利”細菌的相對豐度；(iii)計算有利細菌的豐度與不利細菌的豐度之比，其中如果所述比高于預(yù)定閾值，則該結(jié)果表明新輔助抗腫瘤治療誘導(dǎo)T-bet/Th1局部和全身性免疫應(yīng)答。為了進行上述方法，“有利”細菌可以是來自包含以下屬：乳桿菌屬和雙歧桿菌或由所述屬組成的組的細菌，以及“不利”細菌可以是來自包含以下種：吉氏副擬桿菌和Faecalibacteriumprausnitzii，以及來自包含以下屬：吉米菌屬、Alistipes和梭菌屬IV簇(柔嫩梭菌群)或由所述種或?qū)俳M成的組的細菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)用于測定來自每一個組的細菌的相對豐度的技術(shù)(例如，焦磷酸測序或定量PCR)和根據(jù)每一個組的患者的定義確定適當?shù)拈撝?。事實上，對于所有癌癥患者不能確定唯一的閾值，并且必須理解該比考慮到幾個因素，包括患者的健康和飲食習(xí)慣。為了進行上述方法，所述生物樣品優(yōu)選為來自獲自患者的十二指腸或回腸粘膜的活組織檢查(優(yōu)選來自大型活組織檢查)的生物膜。例如，可在胰腺癌、胃癌、膽道癌或結(jié)腸癌的特定手術(shù)過程中獲得該活組織檢查。重要的是，可進行上述方法來預(yù)后或診斷癌癥患者對如上定義的任何抗腫瘤治療(包括化療、生物療法、放射療法、激素療法等)的應(yīng)答性。具體地，這些方法可有利地用于評估化療(特別地對于烷化劑或鉑鹽諸如上述所引用的任一種)和/或抗腫瘤疫苗對于癌癥患者的(潛在)益處。下文中的實驗數(shù)據(jù)明確地描述了微生物群對由環(huán)磷酰胺(實施例1、3和4)、多柔比星(doxorubicine)(參見至少圖14)和奧沙利鉑(實施例2)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的作用。有趣地，實施例3至5表明，可將小鼠中獲得的結(jié)果外推至人。實驗數(shù)據(jù)顯示，“有益”微生物群也對利用蒽環(huán)類的治療的效力具有積極影響(圖8)并且很顯然的是，如果具有免疫調(diào)節(jié)作用的細菌種(諸如Faecalibacteriumprausnitzii)在腸道微生物群中太豐富，則這些細菌將對藥物效力具有負面影響。本發(fā)明還涉及選自用于與抗腫瘤劑組合使用以誘導(dǎo)T-bet/Th1局部和全身性免疫應(yīng)答(以治療癌癥)的益生菌菌株，其選自約氏乳桿菌、海氏腸球菌和糞腸球菌。根據(jù)本發(fā)明的益生菌的實例為2013年11月15日以編號I-4823保藏于法國國立微生物保藏中心CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)的約氏乳桿菌菌株LJFS001B，和2013年11月7日以編號I-4815保藏于法國國立微生物保藏中心CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)的海氏腸球菌菌株EHFS001。根據(jù)優(yōu)選實施方案，根據(jù)本發(fā)明的益生菌細菌菌株被配制用于口服施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種可包含活的或被殺死的微生物并且可呈現(xiàn)為食品添加劑(例如，丸劑、片劑等)或為功能性食品(諸如飲料、發(fā)酵酸奶等)的配方。本發(fā)明還涉及此類益生菌與抗腫瘤治療組合以用于治療癌癥患者的用途。如本文中所用，術(shù)語“組合”是指不止一種試劑(例如，益生菌菌株和化療藥物)的使用。術(shù)語“組合”的使用不限制其中向患者施用療法的順序，盡管優(yōu)選的是在抗腫瘤治療之前或與之同時施用益生菌。例如，可在抗腫瘤劑之前(例如，之前6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)按時地或數(shù)次地(例如，每一天)施用益生菌菌株，隨后施用抗腫瘤治療。根據(jù)優(yōu)選實施方案，將根據(jù)本發(fā)明的益生菌細菌菌株與化療劑或生物免疫療法組合，例如與利用烷化劑或利用免疫療法的治療組合使用。包含至少于2013年11月15日以編號I-4823保藏于法國國立微生物保藏中心CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)的約氏乳桿菌菌株LJFS001B(圖26A)和/或于2013年11月7日以編號I-4815保藏于法國國立微生物保藏中心CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(CNCM)的海氏腸球菌菌株EHFS001(圖26B)的組合物，也是本發(fā)明的一部分。根據(jù)本發(fā)明的組合物可呈食品添加劑(例如，丸劑、片劑、糖漿劑等)形式或呈功能性食品諸如飲料、發(fā)酵酸奶等形式。所述益生菌優(yōu)選在這些組合物中是活的。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明涉及優(yōu)選與抗腫瘤治療(諸如化療(例如，利用烷化劑)或免疫療法(例如，抗腫瘤疫苗，……))組合用于治療癌癥患者的，來源于來自所述患者的CD4+T細胞的“致病性”Th17(pTh17)細胞的過繼細胞轉(zhuǎn)移。例如，可從血液獲得首次接觸實驗的CD4+T細胞，隨后擴增所述細胞，并在有利于pTh17表型的細胞因子(例如在IL-1β、IL-6、IL-21和IL-23以及任選地IL-1b+IL-9存在的情況下)以及TCR交聯(lián)(諸如，用抗-CD3/抗-CD28Ab涂覆的珠)存在的情況下離體刺激所述細胞。如上所述，pTh17細胞共有Th1細胞(轉(zhuǎn)錄因子T-bet的細胞核表達、IFNγ的細胞質(zhì)表達以及細胞因子受體CXCR3的表面暴露)和Th17細胞(RORγt、IL-17和CCR6的表達)的標志物。在它們至患者的轉(zhuǎn)移之前，細胞表型受到控制。必要時，分選離體獲得的細胞以只保留表現(xiàn)出pTh17表型的那些細胞。本發(fā)明的其它特征也將在下面生物測定的描述過程中變得顯而易見，所述生物測定已在本發(fā)明的框架內(nèi)被執(zhí)行并且為其提供所需的實驗支持，而不限制其范圍。實施例實施例1:腸道微生物群調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺的抗癌免疫作用–小鼠研究材料和方法注意：不存在相反的指示，本實施例中描述的材料和方法是也已用于其他實施例的那些材料和方法。動物和腫瘤模型。遵照法國和歐洲的法律法規(guī)進行所有動物實驗。使用7至14周齡的小鼠。WTSPFC57BL/6J和DBA2/J小鼠獲得自Harlan,CharlesRiver或Janvier，并且被保持在無特定病原體條件(SPF)下。Nod1-/-Nod2-/-和Nod2-/-C57BL/6J小鼠由I.GompertsBoneca(InstitutPasteur,France)提供，Myd88-/-C57BL/6J小鼠由B.Ryffel(CNRS,France)提供，C57BL/6J無菌小鼠獲得自CDTA(Orléans,France)或InstitutPasteur，并且被維持在無菌隔離器中。將MCA205、B16F10(與C57BL/6J小鼠同基因的)和P815(與DBA2/J小鼠同基因的)在37℃、5％CO2下培養(yǎng)于含有10％FCS、2mML-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素/鏈霉素、1mM丙酮酸鈉和MEM非必需氨基酸(Invitrogen)的RPMI1640中。在右側(cè)腹中皮下接種0.5-1×106MCA205、0.3×106B16F10或0.8×106P815腫瘤細胞。當腫瘤達到35-60mm2時，通過多柔比星(Doxo)(2mM,50μl)的瘤內(nèi)注射或CTX(100mg/kg的體重)的腹腔內(nèi)接種進行化療。使用化療治療荷肺腺癌的KP小鼠。8周齡KrasLSL-G12D/WT；p53Flox/Flox小鼠通過鼻內(nèi)滴注接受表達Cre重組酶的腺病毒(定義為第0天)。所述Cre重組酶系統(tǒng)在肺的少數(shù)體細胞中激活致癌Kras(KrasG12D)和使p53失活；3級和4級腺癌在大約第70天變得可見(Cortez-Retamozo等人，2013)。小鼠不被處理或在0.25mg/ml萬古霉素(混入飲水中，始于第77天并持續(xù)至實驗結(jié)束；每兩周更換含抗生素的水一次)不存在或存在的情況下接受化療(第84天、第91天和第98天)。在第73天和第100天(等同于化療'前'和'后')通過前述非侵入性成像(Cortez-Retamozo等人，2013)定量經(jīng)麻醉的小鼠中的腫瘤體積。數(shù)據(jù)顯示兩個時間點之間的肺腫瘤總體積的絕對變化(平均值±SEM)。試劑。環(huán)磷酰胺(CTX)(Endoxan,Baxter)由InstitutGustaveRoussy提供。鹽酸多柔比星(D1515)和異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FITC-葡聚糖)(46944,4kDa)獲得自Sigma-Aldrich。針對CD3ε、CXCR3(CXCR3-173)、CD4(GK1.5)、CD8α(53-6.7)、γδTCR(GL-3)、IL-17(eBio17B7)、IFNγ–(XMG1.2)、T-bet(4B10)、RORγt(AFKJS-9)、CD45、CCR6(140706)的抗-小鼠抗體獲得自BioLegend、eBioscience和R&D。用于活力染色的LIVE/DEAD可固定黃色染色熒光購自Invitrogen/MolecularProbes。利用FloJo(TreeStar)軟件在Cyan(BeckmanCoulter)或FACSCANTOII(BD)流式細胞儀上分析所有細胞?？股胤桨浮Ｔ谀[瘤植入之前2-3周用抗生素處理小鼠，并持續(xù)至實驗結(jié)束。將氨芐青霉素(1mg/ml)+鏈霉素(5mg/ml)+粘菌素(1mg/ml)(Sigma-Aldrich)的混合物或單獨的萬古霉素(0.25mg/ml)或單獨的粘菌素(2.103U/ml)添加至無菌飲水中。每周更換溶液和瓶子2-3次。通過在盲腸水平上觀察到的肉眼可見變化(膨脹)和通過在37℃和5％CO2下分別在需氧條件下或厭氧條件下于血瓊脂板和厭氧血瓊脂板上培養(yǎng)重懸浮于BHI+15％甘油中的糞粒48小時來分析抗生素活性。在圖4中顯示的實驗中，萬古霉素偏向于使共生細菌的譜系朝向不同的共生種(諸如梭菌屬的不同種和大腸桿菌，圖16)，而粘菌素促進糞腸球菌的長出。細菌分離、培養(yǎng)和鑒定。無菌取出腸系膜淋巴結(jié)和脾，將其在PBS中磨碎，隨后涂板于COS瓊脂板(BioMérieux)上，以進行需氧和厭氧生長。培養(yǎng)48小時后，分離單個集落，將其在-80℃貯存在甘油中。將來自用NaCl或CTX、萬古霉素或廣譜抗生素(ATB)(氨芐青霉素+鏈霉素+粘菌素)處理的首次接觸實驗的小鼠或荷瘤者的糞便的系列稀釋物涂板于COS瓊脂板上并在48小時后，分離單個集落，進行革蘭氏染色。特定細菌的鑒定通過形態(tài)學(xué)測試與通過自動化系統(tǒng)(BioMérieux,France)分析的組合來實現(xiàn)，并在于PasteurInstitute,Paris,France進行的質(zhì)譜法(MALDI-TOF，參見下文)中進行驗證。實驗中使用的吉氏副擬桿菌分離自用廣譜ATB延長處理的SPF小鼠的糞便，并且如上所述進行了鑒定。對于體外實驗，將海氏腸球菌、糞腸球菌和大腸桿菌在BHI培養(yǎng)基(Flukaanalytical)中進行培養(yǎng)，而將約氏乳桿菌、植物乳桿菌和鼠乳桿菌在37℃下培養(yǎng)于MRS肉湯(BD)中直至它們達到OD600＝1，此時生長是指數(shù)的。將羅伊氏乳桿菌于厭氧條件下生長在COS瓊脂板上，37℃持續(xù)48小時。將細菌制劑的系列稀釋物涂板以使得可評估施用的劑量。大腸桿菌MC1061、糞腸球菌JH2-2和植物乳桿菌NCIMB8826由I.GompertsBoneca,InstitutPasteur,France友情提供。將吉氏副擬桿菌在厭氧條件下生長在COS瓊脂板上，持續(xù)48小時，隨后將集落重懸浮于PBS中以達到OD600＝1。通過MALDI-TOF分析和16SrRNA基因測序鑒定細菌。如下對制備的細胞進行MALDI-TOFMS分析。將菌株在MRS瓊脂上37℃生長過夜。將約5至10mg的細胞重懸浮于300μl的無菌超純水和900μl無水乙醇(通過輕打試管混勻的)中，以13000g離心2分鐘，并棄去上清液。隨后，將50μl甲酸添加至沉淀并混合，隨后添加50μl乙腈。將混合物以13000g再離心2分鐘。將1微升的上清液點在MALDI-TOF樣品板上，于室溫下風(fēng)干。用1μl的(HCCA)基質(zhì)溶液(BrukerDaltonicsref201344：50％乙腈-2.5％三氟乙酸中的α-氰-4-對羥基桂皮酸的飽和溶液)覆蓋每一個樣品，在室溫下風(fēng)干。利用Autoflex質(zhì)譜儀(BrukerDaltonikGmbH,Germany)，使用flexcontrol軟件(3.0版)進行測量。以陽性線性模式(激光頻率，200Hz，離子源I，20kV的電壓；離子源2，18.4kV的電壓；透鏡電壓，9.1kV；質(zhì)量范圍，2000-20000Da)記錄光譜。對于自動化數(shù)據(jù)分析，使用MALDIBioTyper2.0軟件(BrukerDaltonikGmbH,Germany)，利用默認設(shè)置處理原始光譜。在熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)中，使用通用引物A,5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQIDNo:1)(位置8至27，大腸桿菌編號)和H,5’-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3’(SEQIDNo:2)(位置1541至1522)(Bottger，1989)和以下參數(shù)：94℃4分鐘，25個循環(huán)(94℃1分鐘、57℃1分鐘、72℃2分鐘)，和最終的延伸步驟：72℃5分鐘，通過PCR擴增來自所研究的菌株的16SrRNA基因。由GATCCompany使用引物A、H和兩個其它測序引物(大腸桿菌編號系統(tǒng))：B，5’-CTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’(SEQIDNo:3)，位置339至358；和G，5’-GCATGTGGTTTAATTCGA-3’(SEQIDNo:4)，位置947至964對PCR產(chǎn)生的擴增子進行測序。在使用軟件BioNumerics6.6版(Applied-Maths,Belgium)組裝后獲得編碼16SrRNA基因的幾乎完整的序列，隨后將其在NCBIBLAST程序中進行序列比對(blast)。腸道組織的組織學(xué)和免疫熒光。取出整個小腸(十二指腸、空腸和回腸)，清潔去除糞便內(nèi)容物，將其在4％的PFA中固定1小時。在15％蔗糖中進行組織的再水化，持續(xù)1小時，并在30％蔗糖中過夜。取決于實驗，小腸是完全卷狀的，或被切成小片，隨后將其包埋在最佳切割溫度(OCT)化合物(Sakura)中，將其快速冷凍，隨后制備縱向或橫向的6μm切片。對于組織學(xué)分析，將縱向切片用蘇木精和伊紅進行復(fù)染色。對于組織學(xué)定量分析，對每一個切片的炎癥病灶、改變的絨毛和固有層的厚度進行評分，同時計數(shù)每一根絨毛的杯狀細胞數(shù)。對于帕內(nèi)特細胞計數(shù)，用0.5％triton將縱向切片透化15分鐘，并用0.1％triton、5％血清和1％BSA的溶液封閉1小時。隨后，使用針對溶菌酶蛋白的多克隆抗體(1:500，持續(xù)1小時，ThermoScientific)和山羊抗-兔IgG的AlexaFluor488片段(1:300，持續(xù)1小時，MolecularProbes)。在室溫下進行所有步驟。使用Histolab軟件(MicrovisionInstruments)定量鑲嵌圖像上的溶菌酶陽性區(qū)域。進行帕內(nèi)特細胞的定量，測量溶菌酶陽性簇(帕內(nèi)特細胞群)的平均面積以及這些簇的發(fā)射/μm2(未顯示)。腸道白細胞的免疫熒光染色。對于γδTCR+和γδTCR-T細胞定量，用0.1％triton和10％山羊正常血清的溶液將橫向切片封閉1小時。然后，用倉鼠抗-γδTCR(10μg/mlO/N4℃,BDPharmingen)以及用山羊抗-倉鼠A488(7.5μg/ml，進行45分鐘，JacksonImmunoResearch)(作為二抗)，或用倉鼠抗-小鼠CD3A647(5μg/ml進行2小時，Biolegend)對切片進行免疫染色。對于每一個切片，計數(shù)總的細胞、γδTCR+CD3+和CD3+細胞的數(shù)目，以測定γδTCR+和γδTCR-T細胞的百分比。體內(nèi)腸通透性測定。通過對FITC-葡聚糖(4kDa,SigmaAldrich)的通透性來評估腸道屏障的完整性。在以100或200mg/kg腹膜內(nèi)注射NaCl或CTX后14小時，使小鼠禁食4小時，隨后使其口服喂食0.6mg/g體重的FITC-葡聚糖(80mg/ml于NaCl中，NaCl/CTX處理后18小時)。3至4小時后，將小鼠安樂死，通過心臟穿刺進行放血。隨后使用熒光分光光度計(λex/λem＝485/535nm)測定血漿FITC水平。從小腸分離固有層細胞。收獲完整十二指腸和回腸，取出皮氏小結(jié)(Peyer’spatches)以及所有脂肪殘留物和糞便內(nèi)容物。通過首先沿長度縱向切割它們，隨后將其橫向切成1-2cm長的小片來獲得小片段。在除去上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)后，進一步切割腸道小片，并在搖動的情況下將其用0.25mg/ml膠原酶VIII和10U/mlDNA酶I在37℃溫育40分鐘，以分離固有層細胞(LPC)。消化后，將腸小片在細胞濾器上磨碎。對于FACS分析，將細胞懸浮液以2100RPM經(jīng)歷percoll梯度，持續(xù)20分鐘，而對于RNA提取，將細胞在RLT緩沖液(Qiagen)中直接裂解，并冷凍于-80℃。分析CTX-處理的小腸中的樹突狀細胞亞類。通過用膠原酶和DNA酶消化60分鐘來制備來自小鼠脾和淋巴結(jié)的細胞懸浮物，隨后將其通過70μm網(wǎng)孔過濾。如先前所述(Schlitzer等人，2013)分離結(jié)腸和小腸淋巴細胞。簡言之，在搖動的情況下將結(jié)腸和小腸在37℃于含有5mMEDTA和2mMDTT的PBS中進行消化。在初步消化后，將結(jié)腸和小腸組織小片在含有膠原酶/DNA酶的RPMI培養(yǎng)基中消化30分鐘。將組織小片通過70μm網(wǎng)格進一步過濾。對于流式細胞術(shù)分析，用針對以下表面標志物的抗體對細胞懸浮物進行染色：CD11c(N418)、CD11b(M1/70)、Ly6c(HK1.4)、MHCII類(M5/114.15.2)、CD24(M1/69)、CD64(X54-5/7.1)、CD317(ebio927)、CD45(30-F11)、F4/80(C1:A3-1)、CD8α(53-6.7)。將DAPI用于排除死的細胞?？贵w分別購自eBiosciences、BDBiosciences或BioLegend。如下門控細胞群：小腸(遷移級分)：CD103+DC(CD45+CD11c+MHC-II+CD103+CD24+)、CD11b+CD103+(CD45+CD11c+MHC-II+CD103+CD11b+CD24+)、CD11b+(CD45+CD11c+MHC-II+CD11b+CD24+)、炎癥DC(CD45+CD11c+MHC-II+CD11b+CD64+Ly6c+)、大腸：CD103+DC(CD45+CD11c+MHC-II+CD103+CD24+)、CD11b+(CD45+CD11c+MHC-II+CD11b+CD24+)、炎癥DC(CD45+CD11c+MHC-II+CD11b+CD64+Ly6c+)。微生物群重建。為了用SFB接種GF小鼠，利用無菌試管從SFB-單一定殖的(monocolonized)小鼠收集糞粒。通過口服管飼，利用200μl的懸浮物(通過將糞粒在水中進行均勻化處理獲得的)進行定殖。在腫瘤接種之前，首先檢查高效定殖。將海氏腸球菌、約氏乳桿菌和植物乳桿菌分別于BHI(Flukaanalytical)和MRS(BD)肉湯中37℃生長過夜。將細菌離心，洗滌一次，以及在OD(600nm)為1時重懸浮于無菌PBS中，所述OD值大致對應(yīng)于1x109個菌落形成單位(CFU)/ml。將等體積的每一種細菌懸浮物混合以產(chǎn)生1x109個細菌/ml的等比例的每種類型細菌懸浮物。將羅伊氏乳桿菌于厭氧條件下在COS瓊脂板上37℃生長48小時。對于吉氏副擬桿菌定殖，用氨芐青霉素/鏈霉素/粘菌素(ATB)的混合物處理小鼠4周，并在MCA205接種后4天以200μlPBS中的109CFU口服接種所述小鼠。對于其它實驗，在2-3周的ATB后，停止處理，并用在CTX施用后1天和處理懸浮后0-3天，用109CFU的海氏腸球菌+約氏乳桿菌或植物乳桿菌或羅伊氏乳桿菌對小鼠進行口服管飼。TCR和T細胞測定。對于交聯(lián)實驗，將2×105個總的脾細胞/孔(紅細胞裂解后)在用抗-CD3εmAb(145-2C11)(0.5μg/孔；eBioscience)和/或抗-CD28mAb(37.51)(2μg/ml；BD)預(yù)涂覆的MaxiSorp板(Nunc)中進行溫育。在48h時通過ELISA測定上清液的小鼠IL-17A(eBioscience)和IFNγ(BD)。對TIL分析，取出腫瘤，將其切成小片，并于釋放酶TM(Roche)和DNA酶I中37℃消化30分鐘。通過用注射器柱塞破碎消化的組織和并將其通過100μM的細胞濾器過濾來獲得單細胞懸浮物。對于細胞內(nèi)，將細胞用50ng/mlPMA、1μg/ml離子霉素和BDGolgiSTOP–37℃溫育4小時。在膜染色后，使用eBioscienceFoxP3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖裝置，用抗-IL-17A、IFNγ、T-bet和RORγt對細胞進行染色。T細胞極化和體外擴增。Th17細胞(致病性或調(diào)節(jié)性Th17)的過繼轉(zhuǎn)移。首次接觸實驗的CD4+T細胞(CD4+CD62Lhi)獲自C57BL/6WT小鼠的脾和淋巴結(jié)。隨后相應(yīng)地通過流式細胞術(shù)(BDARIAIII，利用FACSDiva軟件)分選細胞。分離的T細胞群的純度常規(guī)地超過95％。在重組小鼠IL-1β(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和IL-23(20ng/ml)(pTh17)或TGF-β(2.5ng/ml)和IL-6(Th17)(Miltenyi)存在的情況下，用板結(jié)合的針對CD3ε(145-2C11,2μg/ml)和CD28(PV-1,2μg/ml)的抗體刺激首次接觸實驗的T細胞。調(diào)節(jié)性Th17(Th17)由TGF-β(2.5ng/ml)和IL-6中的分化導(dǎo)致，而致病性Th17(pTh17)由IL-1β、IL-6和IL-23中的溫育導(dǎo)致。用3×106個T細胞靜脈內(nèi)注射小鼠。T細胞的體外引發(fā)。從C57BL/6小鼠的股骨和脛骨產(chǎn)生骨髓來源樹突狀細胞(BMDC)，在具有J558上清液(含有40ng/ml的GM-CSF)、10％FCS、100IU/ml青霉素/鏈霉素、2mML-谷氨酰胺、50μM2-巰基乙醇(Sigma-Aldrich)的Iscove培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)中培養(yǎng)8天，所述細胞每3-4天分瓶一次。在第8天，在無抗生素的適當培養(yǎng)基中以1:50的MOI(感染復(fù)數(shù))用分離的細菌菌株在37℃感染BMDC，進行1小時。然后，用PBS洗滌細胞，將其在補充有慶大霉素(50mg/ml)的完全培養(yǎng)基中溫育，以殺死細胞外細菌。24小時后，以1:1的比率將BMDC與從脾和淋巴結(jié)(Miltenyi)純化的首次接觸實驗的CD4+CD62L+T細胞一起培養(yǎng)培養(yǎng)4天。隨后通過ELISA測定培養(yǎng)上清液中的IL-17和IFNγ。CD4+T細胞記憶應(yīng)答。如上所述用不同劑量的細菌(細胞:細菌的比為1:2、1:10和1:50)感染BMDC，24小時后，以1:1將其與從CTX-或NaCl-處理的C57BL/6小鼠的脾(Miltenyi)純化的CD4+T細胞一起培養(yǎng)。24小時后，通過ELISA測定培養(yǎng)上清液的IL-17和IFNγ。過繼T細胞轉(zhuǎn)移。產(chǎn)生B6.CBir1TCR轉(zhuǎn)基因(CBir1Tg)小鼠(Cong等人，2009)，將其在伯明翰的阿拉巴馬大學(xué)的動物設(shè)施中進行繁育。由伯明翰的阿拉巴馬大學(xué)的機構(gòu)動物護理和應(yīng)用委員會審查和批準。使用抗-小鼠CD4磁珠從B6.CBir1TCRTg小鼠分離CD4+T細胞。簡言之，洗滌脾細胞2次，在4℃用抗-CD4磁珠溫育細胞30分鐘，然后通過磁場進行分離。當通過流式細胞術(shù)檢查時，超過95％的細胞為CD4+T細胞。在化療后2天，將100萬個CBir1TgT細胞(CD45.1+)靜脈內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移至CTX或NaCl處理的首次接觸實驗的同基因(CD45.2+)小鼠，在轉(zhuǎn)移后第5-7天收集脾以用于流式細胞術(shù)分析和離體脾細胞再刺激。在于莫能霉素存在的情況下進行5小時的PMA/離子霉素再刺激后，進行門控于CD45.1+細胞的流式細胞術(shù)分析以估量細胞內(nèi)IL-17+或IFNγ+細胞的百分比。以一式三份將其他脾細胞以1.0百萬個/ml在24孔平底板中，不用或用1μg/ml的CBir1-肽455-475(DMATEMVKYSNANILSQAGQ)進行培養(yǎng)，并使用抗-IFNγ特異性商業(yè)ELISA分析上清液。用于抗菌肽測定的定量RT-PCR。在CTX后18小時從十二指腸、回腸和結(jié)腸分離固有層細胞，按照制造商的說明書，利用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)進行總RNA提取和基因組DNA去除。按照制造商的說明書，利用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)進行回腸或十二指腸的總RNA提取和基因組DNA去除。然后，在隨機引物(Promega,Charbonnieres,France)和脫氧核糖核苷三磷酸組，PCR級(RocheDiagnostics,Meylan,France)存在的情況下，利用SuperScriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶和RNaseOUT–RecombinantRibonuclease抑制劑(LifeTechnologies,SaintAubin,France)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在StepOnePlus–實時PCR系統(tǒng)(LifeTechnologies,France)上，使用UniversalMasterMixII，利用基因表達測定分析RegIIIγ(Mm00441127_m1)和LysM(Mm01612741_m1)-相關(guān)基因的表達。通過2-ΔCt法將定量RT-PCR數(shù)據(jù)不變地針對管家基因肽基脯氨酰異構(gòu)酶A(Ppia)的表達水平進行標準化。針對共生細菌的微生物DNA提取、454焦磷酸測序和定量PCR。如先前所述(Lepage等人，2005；Seksik等人，2003)，使用物理和化學(xué)裂解，從粘膜樣品(大約50-100μg)提取總DNA?？梢暤?通過1％的含溴化乙錠瓊脂糖凝膠上的電泳)和通過分光光度計(通過使用Nanodrop儀(ThermoScientific))測定DNA濃度及完整性。微生物群的組成通過靶向細菌16SrRNA基因的V3-V4區(qū)(V3fwd:5’TACGGRAGGCAGCAG3’,SEQIDNo:5；V4rev:5’GGACTACCAGGGTATCTAAT3’,SEQIDNo:6)的454焦磷酸測序(GSFLXTitechnology)來進行評估。序列被修剪來用于條形碼、PCR引物，并且被合并成為300pb的最小序列長度、為27的最小堿基質(zhì)量閾值、為6的最大同聚物長度。使用RDA數(shù)據(jù)庫(版本(release)10，更新31)(Cole等人，2009)將所得序列賦予從門至屬的不同分類級。使用QIIME(Caporaso等人，2010)和cdhit(Li和Godzik,2006)，以97％的同一性將序列進一步聚類成OTU(運算分類單位(OperationalTaxonomicUnits)或種系型(phylotypes))。使用Seqmatch(RDP)和Blastall(NCBI)將OTU賦予最接近的分類為鄰居和相關(guān)細菌種。計算每一個樣品的每一個OTU和其它分類級(從門至屬)的相對豐度以解釋多個個體間的不同水平的取樣。在修剪后，將每一個OTU(或其它分類級)內(nèi)聚類的序列數(shù)轉(zhuǎn)換成代表每一個特征對每一個個體的相對貢獻的分數(shù)。對于熱圖圖示，將log10-轉(zhuǎn)化應(yīng)用于相對豐度數(shù)據(jù)矩陣，這允許使影響樣品中的可組成少于1％的相對豐度的菌群的成員的樣品之間的相似性或差異可視化。基于細菌屬的組成計算不同小鼠微生物群的主成分分析。使用MonteCarlo秩檢驗(n＝10000個重復(fù)，p<0.05)(Romesburg,1985)評估每一個聚類結(jié)果的穩(wěn)健性。為了進一步了解細菌計數(shù)，應(yīng)用定量PCR。使用Taqman技術(shù)(用于靶向所有細菌結(jié)構(gòu)域，柔嫩梭菌群(Mayeur等人，2013)的系統(tǒng))或SybrGreen(用于靶向乳桿菌屬/明串球菌屬/(Leuconoctoc)/片球菌屬(Pediococcus)群(Mayeur等人，2013)、腸球菌屬群(Furet等人，2009)、SFB(Yin等人，2013)和TM7(Hugenholtz等人，2001)的系統(tǒng))應(yīng)用被靶向的qPCR系統(tǒng)。在CTX后第7天未觀察到SFB和TM7或梭菌屬XIV群的相對量的CTX-特異性調(diào)節(jié)(未顯示)。使用ABI7000序列檢測系統(tǒng)、軟件1.2.3版(Applied-Biosystems)進行定量PCR。如先前所述，在具有10μl的DNA樣品的適當稀釋物的25μl的終體積中，以一式兩份利用TaqManUniversalPCR2_MasterMix(Applied-Biosystems)或SYBR-GreenPCR2_MasterMix(Applied-Biosystems)進行擴增和檢測。使用以下線性升溫配置(rampingprofile)進行擴增：1個循環(huán)(95℃10分鐘)，隨后40個循環(huán)(95℃30秒，60℃1分鐘)。對于SYBR-Green擴增，添加解鏈步驟(Yin等人，2013)。對于菌群定量，從來自每一個組的代表的已知濃度的基因組DNA的系列稀釋物產(chǎn)生標準曲線。通過將閾值循環(huán)(Ct)對細胞數(shù)量(CFU)繪圖來產(chǎn)生標準曲線。從平均的標準曲線插值得到細菌的總數(shù)(CFU)。通過定量PCR分析表征過繼轉(zhuǎn)移的Th17細胞。用Trizol(Invitrogen)提取T細胞的RNA。利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機引物和RNaseOUT抑制劑(Invitrogen)將100至300ngRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在Fast7500檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems,France)上，利用SYBRGreenReal-timePCR試劑盒(AppliedBiosystems)通過實時PCR定量cDNA。利用ΔCt法測定相對mRNA水平。相對于親環(huán)蛋白A來表示值。下面描述所使用的寡核苷酸的序列。表1:用于表征Th17細胞表達譜的寡核苷酸生物信息學(xué)和統(tǒng)計學(xué)。除了各自通過β回歸和負二項式回歸比較的比例和計數(shù)數(shù)據(jù)外，將線性建模應(yīng)用于評價治療對參數(shù)的影響(以它們的原始標度或以對數(shù)標度)。模型殘差的系統(tǒng)性檢查和各自針對每一種方法的診斷工具的應(yīng)用確認了數(shù)據(jù)的適當擬合。如先前所述(Helsel,2005)，通過最大似然估計腫瘤和CTX治療對細菌含量的影響，以解釋未檢測的測量。鑒于未檢測可出現(xiàn)在兩個參數(shù)中，計算Kendall'stau(Newton和Rudel,2007)以用于IL-17/IFNγ與細菌含量之間的相關(guān)性研究，其具有通過bootstrapping(B＝1999)評估的回歸線性標準誤差帶。通過進一步的驗證研究(包括對數(shù)據(jù)應(yīng)用相同的方法，排除含有未檢測的樣品和通過置換確定p-值)獲得類似的結(jié)果。通過對log預(yù)處理的腫瘤表面積進行線性混合作用建模來進行腫瘤生長建模(Demidenko,2006；Sugar等人，2012)。從連帶地檢驗?zāi)[瘤生長斜率和截矩(在log標度上)在目標治療組之間是相同的檢驗獲得報告的p-值。為清楚起見，僅給出在p<0.05時發(fā)現(xiàn)為顯著的比較的檢驗結(jié)果。單個取樣時間點上的事后成對檢驗確認圖上報告的作用。注意：治療時治療組之間無腫瘤面積的顯著差異被突出顯示。利用Firth懲罰-似然邏輯回歸(Heinze,2006)比較“腫瘤存在/腫瘤生長的不存在”發(fā)生率。所有報告的檢驗是雙尾的并且被認為是顯著的：*，p-值<0.05,**,p<0.01,***,p<0.001,ns，不顯著。結(jié)果在本實施例中，描述了CTX對小腸微生物群的影響及其接著發(fā)生的對抗腫瘤免疫應(yīng)答的作用。在于首次接觸實驗的小鼠中利用非骨髓抑制劑量的CTX或蒽環(huán)類多柔比星治療后48小時，表征腸道上皮屏障的炎癥狀態(tài)。兩種藥物均引起小腸純毛的縮短、上皮屏障的不連續(xù)性、間質(zhì)水腫和固有層(LP)中的單核細胞的病灶積累(圖1A-B)。化療后，杯狀細胞和帕內(nèi)特細胞的數(shù)量分別在絨毛(圖1C)和隱窩(圖1D)得以增加?？咕溉芫?而非殺微生物肽RegIIIγ)在CTX處理的小鼠的十二指腸中被上調(diào)(圖1E)?？诜┯玫漠惲蚯杷釤晒馑?FITC)-葡聚糖于CTX后18小時在血液中變得可檢測(Yang等人，2013)，從而確認了小腸通透性的增加(圖1F)。腸屏障的破壞伴隨著共生細菌在>50％的小鼠中顯著移位至腸系膜覆淋巴結(jié)和脾中，這在CTX后48小時可被良好地檢測，多柔比星處理后可檢測的程度較低(圖2A)。從這些淋巴器官可培養(yǎng)幾個革蘭氏陽性細菌種，包括約氏乳桿菌(在>40％案例中生長)、鼠乳桿菌和海氏腸球菌(圖2B)。接著，通過高通量454焦磷酸測序，隨后進行靶向細菌域和特定菌群的定量PCR來分析腸道微生物群的總體組成。雖然CTX不能在早期時間點(24-48小時，圖5)引起大的生態(tài)失調(diào)，但CTX在其施用后1周在荷皮下癌(即轉(zhuǎn)移性B16F10黑素瘤和非轉(zhuǎn)移性MCA205肉瘤)的小鼠中顯著改變小腸的(但非盲腸的)微生物組成(圖2C，圖5)。與關(guān)于來自患者的糞便樣品的先前報道(Zwielehner等人，2011)一致，CTX誘導(dǎo)CTX-處理動物的粘膜中分布在4個屬和群(梭菌屬XIVa簇、羅斯氏菌屬、未分類的毛螺旋菌科、糞球菌屬，表2)內(nèi)的來自厚壁菌門的細菌種的減少(圖5)。將定量PCR應(yīng)用于測定來自CTX對媒介物處理的首次接觸實驗的小鼠和荷瘤小鼠的小腸粘膜中的所有細菌和細胞的靶向群(乳桿菌屬、腸球菌屬、柔嫩梭菌IV簇群)的細菌計數(shù)。在荷瘤者中，CTX后第7天的小腸的總細菌載量以及柔嫩梭菌的細菌計數(shù)不受影響(圖2D)。然而，CTX處理導(dǎo)致乳桿菌屬和腸球菌屬的豐度減小(圖2D)?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)揭示CTX激發(fā)不同的革蘭氏陽性細菌種類的選擇性移位和隨后小腸微生物組的顯著變化的能力。與CTX后7天的生態(tài)失調(diào)一致，CD103+CD11b+樹突狀細胞(圖7A)和表達轉(zhuǎn)錄因子RORγt的TCRαβ+CD3+T細胞(圖7B)的頻率在小腸(但不是結(jié)腸)的固有層(LP)中顯著減少，如通過解離的組織的流式細胞術(shù)(圖7B)和原位免疫熒光染色(圖7C)顯示的。RORγt是產(chǎn)生Th17細胞(其產(chǎn)生白細胞介素-17即IL-17)所需的，并且在影響關(guān)節(jié)、腦或胰腺的自身免疫性疾病的背景中已建立了腸道駐留性Th17應(yīng)答與全身性Th17應(yīng)答之間的強關(guān)聯(lián)性(Ghiringhelli等人，2004；Lee等人，2011；Wu等人，2010)。通過確認先前的工作(Michaud等人，2011；Viaud等人，2011)，CTX誘導(dǎo)脾CD4+T細胞朝向Th1(產(chǎn)生干擾素-γ[IFNγ]的)和Th17模式(圖3A，圖7D)的極化。對于多柔比星未發(fā)現(xiàn)該作用(圖8)。對于銜接初始CD4+T細胞響應(yīng)CTX至IL-17生產(chǎn)者的轉(zhuǎn)化，腸道微生物群是必不可少的。事實上，通過TCR-刺激的脾細胞進行的離體IL-17釋放在無特定病原體(SPF)小鼠的CTX處理后增加，然而在無菌(GF)小鼠中未能發(fā)生該現(xiàn)象(圖3A，左圖)。通過廣譜抗生素(ATB，粘菌素、氨芐青霉素和鏈霉素的組合，圖9)對腸道的滅菌也抑制CTX刺激的IL-17分泌(圖3A，右圖)和TCR刺激的脾細胞的IFNγ產(chǎn)生(圖7D)。利用萬古霉素(特異性針對革蘭氏陽性細菌的抗生素)(Rice,2006)處理小鼠也減少CTX-誘導(dǎo)的Th17轉(zhuǎn)化(圖3A，右圖)。在常規(guī)SPF小鼠中，小腸粘膜中測得的乳桿菌屬和SFB的計數(shù)(圖2D)與脾細胞的Th1和Th17極化正相關(guān)(圖3B，圖7E)，而梭菌屬IV簇的計數(shù)則不與脾細胞的Th1和Th17極化正相關(guān)(圖3B)。總而言之，這些結(jié)果指向存在于腸道粘膜中(和偶爾淋巴器官中)的特定微生物組分與由CTX處理誘導(dǎo)的Th應(yīng)答的極性之間的特殊相關(guān)性。CTX增加脾內(nèi)的“致病性”Th17(pTh17)細胞的頻率(圖7F，圖3C)，所述細胞共有Th1細胞(轉(zhuǎn)錄因子T-bet的細胞核表達，IFNγ的細胞質(zhì)表達和趨化因子受體CXCR3的表面暴露)和Th17細胞(RORγt、IL-17和CCR6的表達)的標志物(Ghoreschi等人，2010；Lee等人，2012)。再次，該應(yīng)答取決于腸道微生物群(圖3C)。此外，pTh17細胞的增加需要髓樣分化初級應(yīng)答基因88(MyD88)的表達，所述基因的表達向toll樣受體的下游發(fā)出信號(圖10A)并且在幾個腫瘤模型中是抗腫瘤化療的治療成功所需的(Apetoh等人，2007)。相反，兩個模式識別受體(核苷酸結(jié)合寡聚化域-包含(Nod)1和Nod2)是CTX誘導(dǎo)的脾pTh17細胞的增加和CTX的腫瘤生長阻滯作用所需的(圖10B)。這些結(jié)果證實了CTX通過復(fù)雜線路(其牽涉腸細菌和MyD88)刺激pTh17細胞的能力，從而與其抗腫瘤作用相關(guān)聯(lián)。除了其對pTh17細胞頻率的一般影響以外，CTX誘導(dǎo)針對共生細菌的TCR限制的抗原特異性免疫應(yīng)答(圖11)。因此，本發(fā)明人解決了響應(yīng)CTX而移位至外周淋巴器官內(nèi)的革蘭氏陽性細菌種類(圖2A)是否可使首次接觸實驗的CD4+T細胞朝向Th1或Th17模式極化。在骨髓來源樹突狀細胞存在的情況下，約氏乳桿菌和海氏腸球菌在體外均刺激首次接觸實驗的CD4+T細胞至Th1和Th17細胞的分化，而toll-樣受體4-激活純化的細菌脂多糖(LPS)或大腸桿菌均具有很小的作用(圖12)。此外，口服的約氏乳桿菌和海氏腸球菌，而非植物乳桿菌(在移位實驗中未被檢測到的細菌，圖2B)也非羅伊氏乳桿菌促進ATB-處理的SPF小鼠的脾中的pTh17細胞的庫的重建(圖3D)。在用載有約氏乳桿菌(和在較低程度上海氏腸球菌，而非載有其它共生菌或致病菌)的骨髓來源樹突狀細胞體外再刺激CD4+T細胞后，在50％的接受CTX的小鼠中(圖3E)而非對照小鼠中始終檢測到針對約氏乳桿菌的Th1記憶應(yīng)答。這些結(jié)果表明特定組的革蘭氏陽性共生細菌的移位可介導(dǎo)CTX-驅(qū)動的pTh17細胞和Th1細菌特異性記憶T細胞應(yīng)答的積累。因為共生細菌調(diào)節(jié)CTX后的腸和全身性免疫，所以本發(fā)明人還研究了抗生素對CTX-介導(dǎo)的腫瘤生長抑制的作用。利用廣譜ATB的長期處理減弱CTX治愈在同基因DBA2小鼠中建立的P815肥大細胞瘤的能力(圖4A，圖13A)。此外，由CTX介導(dǎo)的針對MCA205肉瘤的抗腫瘤作用在GF小鼠中相較于SPF小鼠減小(圖4B，左和中圖)。由CTX主要減少革蘭氏陽性細菌的移位以及革蘭氏陽性細菌與脾Th1/Th17極化相關(guān)聯(lián)的觀察驅(qū)動，本發(fā)明人比較了幾個ATB方案的能力，即萬古霉素(耗盡革蘭氏陽性細菌)和粘菌素(耗盡大部分革蘭氏陰性細菌)干擾CTX的腫瘤生長抑制的作用。萬古霉素和在較低的程度上粘菌素削弱CTX對抗MCA205肉瘤的抗腫瘤效力(圖4C，圖13B)。通過使用由偶聯(lián)于條件p53缺失的致癌K-Ras驅(qū)動的自身肺致癌作用的轉(zhuǎn)基因腫瘤模型(Cortez-Retamozo等人，2013)，確認了萬古霉素對基于CTX的化學(xué)治療方案的抗腫瘤效力的抑制作用(圖4D)。萬古霉素還阻止CTX誘導(dǎo)的pTh17在脾中的積累(圖4E)和減少腫瘤浸潤CD3+T細胞和Th1細胞的頻率(圖4F)。雖然大多數(shù)利用ATB處理的SPF小鼠的糞便通常不含可培養(yǎng)的細菌(圖9)，但一些小鼠偶爾經(jīng)歷吉氏副擬桿菌(據(jù)報道維持腸道調(diào)節(jié)性T細胞庫的部分和介導(dǎo)局部抗-炎癥作用的種)的長出(Geuking等人，2011；Kverka等人，2011；Lathrop等人，2011)。該細菌污染與對抗建立的MCA205肉瘤的免疫原性化療(多柔比星)的失敗相關(guān)(圖14A)。此外，利用吉氏副擬桿菌對ATB滅菌的小鼠進行的實驗性再定殖減弱多柔比星的抗癌作用(圖14B)，這證明腸道微生物的生態(tài)失調(diào)消除了抗癌療法。最后，荷瘤GF小鼠與SFB(其促進LP中的Th17細胞分化(Hooper等人，2012；Lee等人，2012；Wu等人，2010))的單一結(jié)合也具有對CTX的腫瘤生長抑制作用的不利影響(圖4B，右圖)。前述結(jié)果突出顯示了特異性CTX誘導(dǎo)的腸道微生物群的改變、pTh17細胞在脾中的積累與化療的成功之間的關(guān)聯(lián)性。為了建立這些現(xiàn)象之間的直接因果關(guān)系，本發(fā)明人將Th17或pTh17群過繼轉(zhuǎn)移至萬古霉素-處理的小鼠中，并評價它們重建CTX介導(dǎo)的腫瘤生長遲滯的能力。離體繁殖的pTh17表現(xiàn)出與由CTX誘導(dǎo)的脾CD4+T細胞在體內(nèi)表達的模式相似的基因表達模式(圖15)。只有pTh17而非Th17細胞能夠拯救萬古霉素對CTX介導(dǎo)的治療作用的負面影響(圖4G)。這些結(jié)果強調(diào)了pTh17細胞對于CTX介導(dǎo)的抗癌免疫應(yīng)答的重要性。為了進一步了解腸道微生物群與細胞抗癌免疫之間的關(guān)系，使用兩個不同的實驗方法。第一，本發(fā)明人分析萬古霉素對由K-Ras和P53的致癌激活引起的并用基于CTX的化療治療的自身(auchthonous)非小細胞肺癌的微環(huán)境的影響。他們分析了萬古霉素對由γδT17細胞對化療處理的瘤床的浸潤的影響，已知所述浸潤對于化療后抗腫瘤CTL的募集是至關(guān)重要的(Ma等人，2011)。在萬古霉素-或廣譜ATB-處理的小鼠中，與水處理的化療接收者相反，瘤床在治療后缺乏γδT17(圖17)。第二，他們分析利用各種抗生素方案影響腸道微生物群，是否可干擾針對與TLR3激動劑多聚-(I:C)組合并被注射入抗生素處理的或未處理的接受CTX的小鼠的足墊的廣泛研究的模型抗原(雞卵清蛋白及其免疫顯性H-2b限制性表位)的Th1或Tc1初次免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。所使用的抗生素都不能抑制引流淋巴結(jié)細胞產(chǎn)生IFNγ。類似地，通過利用OVA的H-2b-限制性SIINFEKL免疫顯性肽的再刺激觸發(fā)的IFNγ分泌在萬古霉素-處理的小鼠中得以維持，這表明Th1(或Tc1)免疫應(yīng)答不受腸道微生物群影響(圖18)。因此，在該模型中，抗生素介導(dǎo)的共生細菌的消除在固有免疫的水平上引發(fā)缺陷(γδT17在腫瘤微環(huán)境中的損失)，這導(dǎo)致具有減小的CD8+/Foxp3比(圖20)和遲鈍的Th1應(yīng)答(圖4)的同源抗腫瘤免疫應(yīng)答(效應(yīng)記憶TIL)的調(diào)節(jié)。雖然許多控制上皮細胞、腸道微生物群與腸道免疫之間的復(fù)雜相互作用的詳細分子機制有待破解，但本研究揭示了腸道微生物群對化療引發(fā)的抗癌免疫應(yīng)答的意外影響。上述數(shù)據(jù)強調(diào)了在癌癥治療過程中與抗生素藥物治療相關(guān)的新的風(fēng)險以及操縱腸道微生物群的潛在治療效用。實施例2:腸道微生物群調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺的抗癌免疫作用–關(guān)于模擬人腫瘤發(fā)生的臨床前模型的結(jié)果將由偶聯(lián)于條件P53缺失的致癌K-Ras驅(qū)動的自身NSCLC的轉(zhuǎn)基因腫瘤模型(如最初由T.Jacks,Cell2012描述的)用于測試基于萬古霉素的抗生素療法對奧沙利鉑+CTX的組合的抗癌效力的抑制作用。在該模擬人腫瘤發(fā)生的臨床前模型中，驗證了萬古霉素對革蘭氏陽性細菌的根除削弱了基于CTX的化療的效力的概念(圖19A和圖4D)，這與減小的瘤內(nèi)CD8+T效應(yīng)子/Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞之比相關(guān)(圖19B)。因此，革蘭氏陽性細菌似乎是CTX誘導(dǎo)的抗癌免疫應(yīng)答和腫瘤塊減小的最佳效力所必需的。實施例3:人的結(jié)果：環(huán)磷酰胺在癌癥患者中誘導(dǎo)針對共生細菌的TH1和TH10免疫應(yīng)答為了進一步證明CTX在人中與在小鼠中一樣誘導(dǎo)至外周淋巴組織的細菌移位，本發(fā)明人評估了在利用節(jié)律性環(huán)磷酰胺(CTX)的治療之前和之后，晚期癌癥患者中的外周血中的特異于一系列細菌的記憶CD4+Th1細胞應(yīng)答。被監(jiān)測的應(yīng)答包括針對腸球菌屬(海氏腸球菌和糞腸球菌，兩者在接受CTX的小鼠均具有免疫原性)、乳桿菌屬(約氏乳桿菌和不太相關(guān)的植物乳桿菌)以及針對大腸桿菌的那些應(yīng)答。結(jié)果獲得自6個利用CTX+阿伐斯汀(avastin)治療的轉(zhuǎn)移性卵巢癌患者(Viaud等人，2011)、3個利用CTX治療的NSCLC(非小細胞肺癌)患者(在基于DC的外切體(exosome)II期疫苗試驗之前)(Chaput等人，2006)和2個參與先CTX后靶向免疫療法的I期試驗的黑素瘤患者(Chaput等人，2013)。從這11個患者中，6個(54％)產(chǎn)生了對抗腸球菌屬的記憶Th1應(yīng)答，2個產(chǎn)生了對抗約氏乳桿菌的記憶Th1應(yīng)答(18％)，2個(18％)個產(chǎn)生了對抗大腸桿菌的記憶Th1應(yīng)答，而他們中的一個(9％)產(chǎn)生了對抗植物乳桿菌的細胞免疫應(yīng)答(圖20)。有趣的是，一些個體引發(fā)了對抗糞腸球菌(高IL-10和低IFNγ產(chǎn)生，如患者5和6)的Th10免疫應(yīng)答(即，通常與腫瘤進展相關(guān)的IL-10釋放)?？偟膩碚f，在這些實驗條件下觀察到3種細胞因子釋放模式：(i)無細胞因子釋放，即，無對共生菌的記憶應(yīng)答；(ii)Th10表型的記憶應(yīng)答；和(iii)Th1表型的記憶應(yīng)答。本發(fā)明人預(yù)期只有模式3將易于從化療受益，并且他們現(xiàn)將該抗共生細菌免疫應(yīng)答與臨床結(jié)果相關(guān)聯(lián)。該藥效學(xué)測定用于預(yù)測，在3-6周(1-2個周期的化療)后此種基于CTX的化療是否可觸發(fā)輔助免疫應(yīng)答和臨床益處。實施例4:人的結(jié)果：基于奧沙利伯的化療誘導(dǎo)腸道微生物群中的細菌種分布的改變以及腸道微生物群的T-BET轉(zhuǎn)錄的增加在原發(fā)性結(jié)腸癌或胰腺癌或胃癌的斑塊切除的手術(shù)過程中，可設(shè)想進入十二指腸(對于胃腫瘤和胰腺腫瘤)或回腸(對于右結(jié)腸癌)。在此類病例中，可刮取和收集粘膜樣品(用于在如上所述的不同分類級上的16SrRNA基因焦磷酸測序分析和粘膜微生物群組成的描述)，以及可將粘膜保持冷凍(在RNAzol中，以用于qRT-PCR)或保持在石蠟包埋的組織中(以用于免疫組織化學(xué)分析)?？稍诨熤?輔助化療)或化療之后(新輔助化療)進行該手術(shù)。在本實施例中，分析來自動過右結(jié)腸癌手術(shù)的患者(6個處于基于新輔助奧沙利伯的化療中的患者和7個治療前的患者)的回腸粘膜，以比較輔助化療對新輔助化療的病例中(意指在已接受(《化療》)或未接受(《對照》)化療的結(jié)腸癌患者中)的回腸微生物群的組成以及不同屬和種(分離株)的代表性的相對損失或獲得。種(第一相對分離株)級上的細菌分布在化療后的回腸中顯著不同(主成分分析，MonteCarlo檢驗，p＝0.018)(圖21)。與小鼠中一樣，化療在幾乎所有患者中誘導(dǎo)屬于梭菌屬IV簇的種的減少，更具體地來自以下屬的細菌：Dorea屬、糞球菌屬、毛螺菌科、吉米菌屬、Alistipes，和以下種的細菌：Faecalibacteriumprausnitzii(圖22和23，表3)。相反，來自雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的細菌在化療后傾向于增加(表3，圖24)。本發(fā)明人在進行回腸的腸道微生物群的16SrRNA的焦磷酸測序分析的同時，還研究了接受或不接受化療的患者的粘膜中的可檢測的細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄譜。通過來自同樣患者回腸粘膜的qRT-PCR進行該研究。雖然RORγt和IL-17在兩個組中極為不同，但T-bet在化療后被上調(diào)，并且在兩個在化療后具有高水平的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的患者中，T-bet轉(zhuǎn)錄物相較于另外的患者相當高，這表明pTh17T細胞應(yīng)答已被所述治療引發(fā)。實施例5:海氏腸球菌為PTH17/TH1細菌，單獨地或與乳桿菌屬(約氏乳桿菌)組合地誘導(dǎo)益生菌抗腫瘤作用為了分析不同的細菌種(尤其是能夠在CTX后移位至脾的那些種)對細菌特異性致病性TH17免疫應(yīng)答的引發(fā)的影響，本發(fā)明人用廣譜ATB處理C57BL/6小鼠15天(這對糞便進行滅菌)，進行CTX(100mg/kg)的注射，隨后用109個海氏腸球菌±109個約氏乳桿菌進行口服管飼。細胞單一或雙結(jié)合后6天，收集脾細胞以用于流式細胞術(shù)分析，所述分析集中于TH17細胞中的IFNγ+或CXCR3+T細胞(此后稱為“pTH17”)(圖25A)，所述IFNγ+或CXCR3+T細胞可從源自CD3+CD4+RORγτ+或CCR6+T細胞(此后稱為“TH17”細胞)(圖25B)并且可產(chǎn)生真正的CD3+CD4+IFNγ+或CXCR3+T細胞(此后稱為TH1細胞)(圖25C)。所獲得的數(shù)據(jù)表明海氏腸球菌而非約氏乳桿菌為在CTX后介導(dǎo)脾中的TH1和pTH17反應(yīng)的主導(dǎo)細菌，所述TH1和pTH17應(yīng)答在約氏乳桿菌存在的情況下可被進一步放大(圖25A、25C)。此外，本發(fā)明人現(xiàn)提出了革蘭氏陽性細菌的混合物(約氏乳桿菌+海氏腸球菌)在小腸中的存在與不僅全身性pTH17細胞的單純誘發(fā)(圖25)，而且還有ATB處理的小鼠中的CTX-誘導(dǎo)的抗腫瘤作用的部分恢復(fù)(圖26)之間的因果關(guān)系的證據(jù)。實施例6:海氏腸球菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗癌免疫應(yīng)答為了研究針對海氏腸球菌的同源TH應(yīng)答是否可促進抗癌T細胞應(yīng)答，建立兩個不同的臨床前模型。第一，已在14天-廣譜ATB療法(或鹽水作為對照)后皮下植入經(jīng)遺傳修飾以表達卵清蛋白抗原(OVA)(纖維肉瘤MCA205OVA)的腫瘤細胞系。已用OVA323-339特異性MHCII類限制性O(shè)TIITCR轉(zhuǎn)基因T細胞過繼轉(zhuǎn)移動物，并用CTX(或鹽水)處理所述動物。本發(fā)明人監(jiān)測利用海氏腸球菌的口服管飼對同基因CD45.1+T細胞和同源CD45.2+OTII細胞在脾中和瘤床中(圖27A中所示的實驗設(shè)置)中的擴增和活化的“臨床”影響。在脾中，他們確認了至少部分因伴隨pTH17細胞的積累(圖27B，右圖)的CD4+T細胞的擴增(圖27B，中圖)而引起的海氏腸球菌誘導(dǎo)的宿主(CD45.1+)脾細胞(圖27B，左圖)的擴增。事實上，他們證明了海氏腸球菌在脾中介導(dǎo)的過繼轉(zhuǎn)移的CD45.2OTII細胞的分裂、積累和至記憶T細胞的分化(圖27C)。此外，CD45.2+T細胞回收自瘤床，獲取CD44分子并且在口服海氏腸球菌的情況下幾乎與宿主TIL一樣高效地擴增(圖27D-F)。第二，為了模擬臨床上相關(guān)的小鼠模型，我們使用表達人乳頭瘤病毒16(HPV16)E7的TC1細胞系建立了頭頸癌和肺癌的原始原位模型并對其進行了報道(F.Sandoval等人，2013)。腫瘤回歸可通過使用由偶聯(lián)于E7抗原的志賀毒素的B亞單位組成的非復(fù)制性遞送系統(tǒng)(SBxT-E7)(作為粘膜載體)接種小鼠來獲得。Vingert等人報道，只有靶向存在于胸LN中的CD103+DC(而非巨噬細胞)的鼻內(nèi)疫苗接種才可引發(fā)表達粘膜整聯(lián)蛋白(CD49a和CD103)的多功能Db-E739-47四聚體結(jié)合CD8+T細胞(B.Vingert等人，2006)。該實驗的實驗設(shè)置示于圖28A中。在皮下TC1模型中，腫瘤生長可被SBxT-E7與CTX的組合顯著減小，最終導(dǎo)致完全腫瘤根除(圖28B-C)。廣譜ATB對疫苗效力的負面影響描繪于圖28B-C中，其中完全排斥它們的TC1腫瘤的動物的百分比急劇減小。隨后，監(jiān)測利用海氏腸球菌的口服管飼對多功能Db-E739-47四聚體結(jié)合CD8+T細胞在脾中的擴增的“臨床”影響。事實上，海氏腸球菌恢復(fù)Db-E739-47四聚體結(jié)合CD8+T細胞在已排斥它們的腫瘤的小鼠中(但非在另外的小鼠中)的擴增，如在非ATB/CTX-處理的陽性對照中顯示的(圖28D)?？偠灾?，腸道滅菌的小鼠與海氏腸球菌的單一結(jié)合可部分恢復(fù)CTX誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答，繼續(xù)檢查腫瘤進展。實施例7:海氏腸球菌的各種克隆之間的比較(對于PTH17，就CACO-2抗-細胞凋亡作用而言)測試多達13個其它海氏腸球菌分離株/克隆以分析它們在體內(nèi)的差異免疫原性和介導(dǎo)這樣的“抗癌益生菌”性質(zhì)的能力。在脈沖場凝膠電泳(PFGE)中分析的海氏腸球菌的各種克隆的細菌基因組模式的比對(圖29)表明，由本發(fā)明人最初分離的克隆(于2013年11月7日在編號I-4815下保藏于法國國立微生物保藏中心CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismesdel’InstitutPasteur,Paris(CNCM)的克隆“Villejuif”)在基因組序列方面與許多其它克隆不同。一個人分離株(克隆708)表現(xiàn)出比克隆CNCMI-4815大的TH1和Tc1潛力(圖30)。然而，克隆708在于CTX處理的建立的MCA205肉瘤中的抗癌益生菌作用方面，表現(xiàn)不如CNCMI-4815克隆好(未顯示)。各種海氏腸球菌分離株之間的序列和功能差異在目的在于監(jiān)測來自Caco-2上皮腸細胞系(其暴露于CTX+/-海氏腸球菌或大腸桿菌的各種克隆)的LDH釋放(表征細胞死亡)和人β2防衛(wèi)素分泌的體外測定中得以確證。雖然克隆CNCMI-4815和克隆708可最可能地通過促進抗菌肽β2防衛(wèi)素的產(chǎn)生來阻止CTX-誘導(dǎo)的Caco-2細胞死亡，但大腸桿菌未能產(chǎn)生該作用(未顯示)。實施例8:TLR4、NOD1和NOD2阻止CTX-介導(dǎo)的細菌移位、PTH17誘發(fā)和殺腫瘤活性為了分析哪個腸道免疫檢查點在利用烷化劑的治療過程中保持檢查細菌移位，本發(fā)明人在荷MCA205的C57BL/6小鼠中，研究了調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)的主要模式識別受體在脾pTH17細胞的誘發(fā)中和由CTX促進的腫瘤控制中的作用。通過在已知主要允許海氏腸球菌和約氏乳桿菌增殖的厭氧條件下(Viaud等人，ScienceNov.2013)培養(yǎng)來自脾的細菌集落分析的細菌移位，在NOD1xNOD2-/-中得到增強(圖31A)。另外，CTX施用后脾pTH17細胞的引發(fā)在NOD2-/-小鼠中得以增強(雖然其在Myd88-/-動物中相較于野生型(WT)小鼠被消除，Viaud等人，Science2013)(圖31B)。根據(jù)這些使用基因缺陷型動物獲得的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人使用藥物模擬物(pharmacomimetics)(即NOD1和NOD2的配體(肽聚糖胞壁酰二肽和TriDAP)，其通過促進抗菌肽脂質(zhì)運載蛋白-2在糞便中的釋放來局部起作用(圖31D)，從而在脾中減少CTX-介導(dǎo)的pTH17(圖31C))表型模擬這些作用。這些結(jié)果在另一個實驗系統(tǒng)中得到確證，在所述實驗系統(tǒng)中通過海氏腸球菌的口服管飼重建廣譜ATB處理的小鼠，并用CTX進行處理，隨后進行腸系膜LN中的細菌移位的動力學(xué)監(jiān)測。在該設(shè)置中，的確顯示了CTX后于mLN中恢復(fù)的海氏腸球菌集落的頻率和厭氧條件下生長的發(fā)生率在TLR4、NOD1和NOD2敲除小鼠中得以增加(未顯示)。因此，ATB處理的受體中利用革蘭氏陽性細菌口服管飼后CTX誘導(dǎo)的pTH17細胞的誘發(fā)在TLR4激動劑(LPS或大腸桿菌)存在的情況下急劇減少(圖32B)，然而CTX-誘導(dǎo)的TH1和Tc1細胞不受影響(圖32A)。由CTX介導(dǎo)的免疫依賴性抗-肉瘤作用在單敲除小鼠(NOD1或NOD2或RIP2或CARD15)中相較于WT對應(yīng)物(圖33A-C)未得到提高，但在NOD1-/-xNOD2-/-小鼠中得以顯著增強(圖33D-E)。此外，在ATB-處理的小鼠中將外源大腸桿菌或LPS提供給利用海氏腸球菌和約氏乳桿菌的口服管飼，嚴重地削弱了革蘭氏陽性細菌的抗癌益生菌作用(圖34A-B)，從而支持TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻止移位，從而阻pTH17積累以及隨后的抗腫瘤作用的概念。實施例9:與CTX增強的殺腫瘤活性相關(guān)的NOD1-/-XNOD2-/-小鼠中有益的生態(tài)失調(diào)在CTX或PBS施用后7天，進行來自從WT對比NOD1-/-xNOD2-/-首次接觸實驗的小鼠收集的小腸和糞便的生物膜的16SrRNA基因擴增子的焦磷酸測序分析。主坐標分析表明，細菌群落結(jié)構(gòu)在來自WT對基因缺陷型小鼠的CTX組的之間顯著不同(圖35-36針對門和屬，表4針對OTU)。在接受CTX的NOD1-/-xNOD2-/-首次接觸實驗的小鼠中相較于接受PBS的所述小鼠，在小腸(SI)中存在過量的梭菌科(主要歸功于分節(jié)絲狀菌(表4))(圖36A-B)以及在糞便中存在過量的紫單胞菌科(主要是厭氧桿菌屬)(圖35A-B)，在SI中存在丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)的相對損失(圖36A-B)以及在糞便中存在毛螺菌科的相對損失(圖35A-B)。利用海氏腸球菌+產(chǎn)氣莢膜桿菌的雙結(jié)合進行的ATB-滅菌的小鼠的重建在CTX處理的小鼠中介導(dǎo)累加的/協(xié)同的抗癌益生菌作用(圖37)。在哺乳動物中，海氏腸球菌與非致病性(nonpathobiontic)梭菌屬(諸如SFB或厭氧桿菌屬或霍爾德曼氏菌屬)的組合與海氏腸球菌+產(chǎn)氣莢膜桿菌一樣高效，并且毒性較低。實施例10:革蘭氏陰性細菌對于抗癌記憶T細胞應(yīng)答是必需的考慮到在表現(xiàn)更好的抗癌應(yīng)答的NOD1xNOD2雙敲除小鼠中分離的革蘭氏陰性O(shè)TU的過量，本發(fā)明人闡明了革蘭氏陰性細菌在使用與CTX結(jié)合使用的基于OVA的癌癥疫苗產(chǎn)生的長期保護作用中的作用。廣譜ATB阻止癌癥疫苗對抗OVA工程化腫瘤細胞的致死攻擊的長期保護作用。有趣的是，萬古霉素不阻止疫苗免疫動物，然而殺死革蘭氏陰性細菌的粘菌素阻止疫苗免疫動物(圖38)?？傻贸觯珻TX可動員革蘭氏陰性腸道佐劑以增強腫瘤疫苗。實施例11:抗生素方案提高CTX-介導(dǎo)的抗腫瘤作用由于通過NOD遺傳缺陷介導(dǎo)或強加的生態(tài)失調(diào)可提高CTX的治療成功，因此本發(fā)明人解決了不同的ATB方案(如在ZhangY等人(2014)中描述的)是否可正面影響腫瘤生長。事實上，據(jù)報道減少厚壁菌門(最特別地Clostridiae)最終減小厚壁菌門/擬桿菌屬之比(諸如新霉素+頭孢噻吩或萬古霉素+亞胺培南的組合)(圖39C-D)的方案可提高CTX誘導(dǎo)的抗腫瘤作用，然而cifloxacin(其相反誘導(dǎo)擬桿菌門的顯著抑制)是無效的(圖39B)。值得注意的是，新霉素+頭孢噻吩的組合可增加SFB代表，然而萬古霉素+亞胺培南增加紫單胞菌屬的代表(ZhangY等人，2014)。參考文獻Apetoh,L.etal.(2007)Toll-likereceptor4-dependentcontributionoftheimmunesystemtoanticancerchemotherapyandradiotherapy.NatMed,13,1050-1059.ArrntzenEH,(2008),CancerImmunolImmunother57(10):1559Bottger,E.C.(1989)RapiddeterminationofbacterialribosomalRNAsequencesbydirectsequencingofenzymaticallyamplifiedDNA.FEMSMicrobiolLett,53,171-176.Caporaso,J.G.etal.(2010).QIIMEallowsanalysisofhigh-throughputcommunitysequencingdata.NatMethods,7,335-336.Chaput,N.etal.(2013)PhaseIclinicaltrialcombiningimatinibmesylateandIL-2:HLA-DRNKcelllevelscorrelatewithdiseaseoutcome.Oncoimmunology,2,e23080.Chaput,N.etal.(2006)Dendriticcellderived-exosomes:biologyandclinicalimplementations.JLeukocBiol,80,471-478.CauxCetal.(1996),JExpMed,184(2):695.Cole,J.R.,etal.(2009)TheRibosomalDatabaseProject:improvedalignmentsandnewtoolsforrRNAanalysis.NucleicAcidsRes,37,D141-145.Cong,Y.etal.(2009)Adominant,coordinatedTregulatorycell-IgAresponsetotheintestinalmicrobiota.ProcNatlAcadSciUSA,106,19256-19261.Cortez-Retamozo,V.etal.(2012).Originsoftumor-associatedmacrophagesandneutrophils.ProcNatlAcadSciUSA,109,2491-2496.Cortez-Retamozo,V.etal.(2013).AngiotensinIIdrivestheproductionoftumor-promotingmacrophages.Immunity,38,296-308.Darfeuille-Michaud,A.etal.(2004)Highprevalenceofadherent-invasiveEscherichiacoliassociatedwithilealmucosainCrohn'sdisease.Gastroenterology,127,412-421.Demidenko,E.(2006)Theassessmentoftumourresponsetotreatment.JournaloftheroyalstatisticalsocietyseriesC-appliedstatistics,55,365.DzutsevA,etal.(2014)Theroleofthemicrobiotaininflammation,carcinogenesis,andcancertherapy.EurJImmunol.2014Oct18.doi:10.1002/eji.201444972.[Epubaheadofprint]PubMedPMID:25328099.Furet,J.P.etal.(2009).Comparativeassessmentofhumanandfarmanimalfaecalmicrobiotausingreal-timequantitativePCR.FEMSMicrobiolEcol,68,351-362.Furet,J.P.,etal.(2010).Differentialadaptationofhumangutmicrobiotatobariatricsurgery-inducedweightloss:linkswithmetabolicandlow-gradeinflammationmarkers.Diabetes,59,3049-3057.Geuking,M.B.,etal.(2011)IntestinalbacterialcolonizationinducesmutualisticregulatoryTcellresponses.Immunity,34,794-806.Ghiringhelli,F.,etal.(2004)CD4+CD25+regulatoryTcellssuppresstumorimmunitybutaresensitivetocyclophosphamidewhichallowsimmunotherapyofestablishedtumorstobecurative.EurJImmunol,34,336-344.Ghoreschi,K.etal.(2010).GenerationofpathogenicT(H)17cellsintheabsenceofTGF-betasignalling.Nature,467,967-971.Grivennikov,S.I.etal.(2012).Adenoma-linkedbarrierdefectsandmicrobialproductsdriveIL-23/IL-17-mediatedtumo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