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發(fā)明背景

1. 發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于通過(guò)測(cè)序鑒定基因突變和兆堿基的核酸信息的工具、組合物和方法，并且，特別地，涉及用于通過(guò)測(cè)序分析序列、基因和完整基因組的電子媒介和程序，以及涉及所鑒定的突變和包含用于鑒定生物樣品中的突變的試劑的試劑盒。

2. 背景描述

結(jié)核病的致病物質(zhì)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(MTB)是一種高度傳染性的細(xì)菌病原體，具有顯著的發(fā)病率和死亡率，特別是在HIV感染患者中。從1997年以來(lái)結(jié)核病在南非一直是死亡的主要原因，為與該國(guó)家逐漸增長(zhǎng)的HIV流行關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)量。此外，越來(lái)越多的多藥抗性(MDR)和廣泛藥物-抗性(XDR)臨床分離物（clinical isolates）案例使具有活性MTB的患者中的有效治療措施惡化。

在世界上MTB和HIV二者流行的許多資源匱乏區(qū)域，顯微鏡術(shù)依然是用于診斷MTB的基石。然而，許多具有MTB的HIV感染患者為涂片陰性，并且顯微鏡術(shù)不提供關(guān)于抗生素抗性的信息。多藥-抗性(MDR)和廣泛藥物-抗性菌株(XDR)的出現(xiàn)致使標(biāo)準(zhǔn)MTB治療方案變得無(wú)效。根據(jù)一個(gè)研究，在南非大約20%的具有HIV的TB患者具有MDR MTB?？焖贆z測(cè)MTB和開(kāi)始有效治療對(duì)減少傳播和改善治療結(jié)果至關(guān)重要。Cephiad’s Gene Xpert (Xpert)的推出(roll-out)改善了MTB的診斷并提供了利福平抗性的證據(jù)，但沒(méi)有提供關(guān)于其它藥物的信息。此外，在資源匱乏環(huán)境的許多顯微鏡術(shù)實(shí)驗(yàn)室中放置Xpert檢驗(yàn)可能是不可行的。有效地將痰樣本運(yùn)送到中心用于下一代測(cè)序(NGS)的能力提供了利用中心或地方實(shí)驗(yàn)室的訓(xùn)練有素的工作人員和可用的基礎(chǔ)設(shè)施的機(jī)會(huì)。

MDR結(jié)核病菌株耐受一線抗生素利福平(RIF)和異煙肼(INH)，而XDR MTB菌株耐受RIF和INH二者以及任何氟喹諾酮和二線可注射抗生藥物(例如，阿米卡星、卡那霉素或卷曲霉素)。所有MTB案例的約6%為MDR菌株并且南非每年持續(xù)報(bào)告更高百分比的XDR案例。當(dāng)7%的感染標(biāo)準(zhǔn)MTB菌株的患者屈服于感染時(shí)，MDR結(jié)核病的死亡率上升至幾乎50%?？股乜剐訫TB菌株的出現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了對(duì)快速和高準(zhǔn)確度診斷的即時(shí)需求，特別是在非洲的發(fā)展中國(guó)家。另外遷移人口使得藥物抗性菌株的地理監(jiān)督和追蹤更加迫切。

對(duì)于MDR菌株認(rèn)為基于培養(yǎng)的藥物易感性檢驗(yàn)(DST)為金標(biāo)準(zhǔn)，但其費(fèi)時(shí)(數(shù)周至數(shù)月)，技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性并且成本高昂，特別是在資源有限的國(guó)家。例如，BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson Microbiology System, Silver Sparks NV, USA)為測(cè)量細(xì)菌氧消耗的自動(dòng)化連續(xù)的基于培養(yǎng)的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，可使用制備的試劑盒進(jìn)行DST，所述試劑盒對(duì)于菌株對(duì)許多抗生素的敏感性可用。用BACTEC MGIT 960獲得的DST結(jié)果可靠和可重現(xiàn)但需要處理有活力和潛在傳染性的培養(yǎng)物，數(shù)天至數(shù)周或延期直至結(jié)果可用，專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備以及與儀器和消耗品相關(guān)的高費(fèi)用。

近年來(lái)，開(kāi)發(fā)了若干用于檢測(cè)MTB藥物抗性的基于核酸的測(cè)定。一個(gè)最流行的市售可得的診斷測(cè)定為Hain LifeScience的GenoType MTBDRplus Line Probe Assay (LPA)。該檢驗(yàn)利用核酸提取、PCR擴(kuò)增、探針雜交和在橫向條上經(jīng)由堿性磷酸酶反應(yīng)比色顯影（colorimetric visualization）。已經(jīng)顯示LPA為靈敏和特異的，但存在幾個(gè)缺點(diǎn)。LPA對(duì)所有抗性-相關(guān)突變的靈敏度最有可能將永遠(yuǎn)達(dá)不到100%，因?yàn)樵S多賦予抗性的基因尚未被發(fā)現(xiàn)。LPA的另一個(gè)固有限制為不能檢測(cè)包含抗性和易感菌株的混合物的樣品群。檢測(cè)不到含有將一個(gè)氨基酸改變?yōu)長(zhǎng)PA上不存在的先前未表征或未知的突變的置換突變的菌株。此外，LPA僅允許檢測(cè)最頻繁的導(dǎo)致抗性的突變。若菌株包含靶突變之外的突變，將會(huì)出現(xiàn)野生型帶型，導(dǎo)致假陰性(易感)結(jié)果。

因此，存在對(duì)用于關(guān)鍵基因，例如與一線和二線藥物抗性相關(guān)的基因的全長(zhǎng)基因分析的快速、標(biāo)準(zhǔn)化、成本有效的方案的需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明克服了當(dāng)前策略和設(shè)計(jì)相關(guān)的缺點(diǎn)，并由此提供用以促進(jìn)和簡(jiǎn)化測(cè)序的工具、組合物、方法和用于分析核酸的序列信息的方法，所述核酸包括全長(zhǎng)基因和完整基因組。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)半導(dǎo)體測(cè)序和優(yōu)選地，離子激流測(cè)序分析藥物抗性突變。通過(guò)PCR擴(kuò)增包含目的基因的核酸區(qū)段，處理擴(kuò)增產(chǎn)物并隨后通過(guò)測(cè)序分析。對(duì)于包含RNA的核酸區(qū)段，將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA。測(cè)序優(yōu)選通過(guò)Ion Torrent，或包括Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM?; Life Technologies)的下一代測(cè)序儀進(jìn)行。優(yōu)選地，擴(kuò)增產(chǎn)物代表生物體的許多種類(lèi)、菌株和/或血清型的共同的全長(zhǎng)基因，或多個(gè)重疊基因段。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并鑒定和定位突變。定位鑒定已知和先前未知的突變二者并且可用于跨種群追蹤藥物抗性的進(jìn)展和移動(dòng)。優(yōu)選地，本發(fā)明分析病原體，例如，病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)的核酸。優(yōu)選所述病毒病原體為流感或HIV的致病物質(zhì)并且細(xì)菌病原體為結(jié)核病的致病物質(zhì)。核酸區(qū)段的離子激流測(cè)序?yàn)榭焖?、有效、成本有效的全長(zhǎng)基因分析方案提供增強(qiáng)的測(cè)序。藥物抗性和其它突變即時(shí)測(cè)定。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于進(jìn)行基因或完整基因組的NGS測(cè)序，優(yōu)選離子激流或MiSeq?測(cè)序的工具、組合物和方法。本發(fā)明包括獲得目的生物體的DNA序列和使用多對(duì)核酸引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)分析。每對(duì)引物經(jīng)設(shè)計(jì)以在相似的PCR條件下同時(shí)擴(kuò)增基因組的重疊區(qū)段并且這些可作為測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行或?qū)τ诙鄠€(gè)基因或整個(gè)基因組多路復(fù)用(multiplex)。優(yōu)選的引物具有相似的GC含量和總體尺寸?；蚪M的單個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生數(shù)百種擴(kuò)增產(chǎn)物，其序列包括生物體的全長(zhǎng)基因、大基因和非編碼段或整個(gè)基因組。優(yōu)選通過(guò)NGS分析這些產(chǎn)物，序列經(jīng)匹配建立整個(gè)基因或基因組的序列圖譜。

本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案涉及鑒定微生物的基因組中賦予對(duì)抗微生物化合物的抗性的序列基序的方法，包括：提供從微生物的多個(gè)不同菌株或血清型獲得的多個(gè)核酸樣品；通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增多個(gè)核酸樣品的序列；通過(guò)離子激流測(cè)序獲得所擴(kuò)增序列的序列信息；從獲得的序列信息鑒定至少一個(gè)微生物菌株或血清型的基因組中的多態(tài)性；和關(guān)聯(lián)鑒定的多態(tài)性與至少一個(gè)微生物菌株或血清型的表型或基因組定位以鑒定賦予對(duì)抗微生物化合物的抗性的序列基序。優(yōu)選地，所述微生物為病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng)，并且所述病毒為流感病毒，細(xì)菌為結(jié)核分枝桿菌。優(yōu)選地，核酸樣品在包含離液劑、去污劑、還原劑、螯合劑、緩沖劑和醇，一起以足以裂解細(xì)胞、變性蛋白、滅活核酸酶，殺死病原體和不降解核酸的量存在的水性分子轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中提供。優(yōu)選地，擴(kuò)增在一步聚合酶鏈反應(yīng)中使用擴(kuò)增與對(duì)抗微生物化合物的抗性相關(guān)的基因或核酸區(qū)段的引物對(duì)進(jìn)行，并且聚合酶鏈反應(yīng)在包含以下的水性混合物中實(shí)施：熱穩(wěn)定聚合酶，包含約等量dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脫氧核苷三磷酸混合物，螯合劑，滲透壓劑，白蛋白，鎂鹽；和緩沖劑。優(yōu)選所述抗微生物化合物為抗生素。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用通過(guò)本發(fā)明方法所鑒定的抗微生物化合物治療由至少一種微生物菌株或血清型引起的疾病或病癥的方法。優(yōu)選地，治療包括靶向殺死為疾病或病癥的致病物質(zhì)的特定病原體。同樣優(yōu)選地，有效劑量通過(guò)評(píng)估與鑒定的靶序列或序列們相關(guān)的表型特征從本發(fā)明方法確定。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于測(cè)定微生物的完整基因組序列的方法，包括：通過(guò)在包含以下的水性混合物中進(jìn)行基因組的單個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生一系列擴(kuò)增子：熱穩(wěn)定聚合酶；包含約等量dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脫氧核苷三磷酸混合物；螯合劑；鹽；緩沖劑；穩(wěn)定劑和多個(gè)引物對(duì)，其中所述多個(gè)引物對(duì)的每一引物具有相似的退火溫度；通過(guò)半導(dǎo)體測(cè)序測(cè)序所產(chǎn)生的系列擴(kuò)增子的每一，以及關(guān)聯(lián)擴(kuò)增子的序列和構(gòu)建基因組的完整序列。優(yōu)選地，多個(gè)引物對(duì)的每一引物包括15-25個(gè)核酸長(zhǎng)并且每一具有約25%-50%的GC含量的引物。優(yōu)選地，每一引物對(duì)經(jīng)設(shè)計(jì)以PCR擴(kuò)增擴(kuò)增子，并且PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增子的集合包含完整基因組序列的重疊區(qū)段。優(yōu)選地，多個(gè)引物對(duì)與基因組雜交，并且以約每500-2,000核苷酸沿基因組間隔開(kāi)。優(yōu)選地，所述微生物為病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)或細(xì)胞，并且所述病毒為流感病毒，細(xì)菌為結(jié)核分枝桿菌。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于一步測(cè)定核酸區(qū)段的序列的方法，包括：在核酸區(qū)段上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)以產(chǎn)生一系列擴(kuò)增子，其中PCR包含含有以下的熱穩(wěn)定組合物：聚合酶；包含約等量dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脫氧核苷三磷酸混合物；螯合劑；鹽；緩沖劑；穩(wěn)定劑和多個(gè)引物對(duì)，其中所述多個(gè)引物對(duì)的每一引物具有5℃內(nèi)的退火溫度；通過(guò)半導(dǎo)體測(cè)序測(cè)序所產(chǎn)生的系列擴(kuò)增子的每一，和關(guān)聯(lián)擴(kuò)增子的序列并構(gòu)建核酸區(qū)段的序列。優(yōu)選所述核酸區(qū)段為1 Mb長(zhǎng)或更大，更優(yōu)選大于2或更多Mb長(zhǎng)，更優(yōu)選5或更多Mb長(zhǎng)并且更優(yōu)選10或更多Mb長(zhǎng)。優(yōu)選地，多個(gè)引物對(duì)的每一引物為16-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)，具有約28-35%的GC含量，并且具有每一其它引物的3℃內(nèi)的退火溫度。優(yōu)選地，每一引物對(duì)經(jīng)設(shè)計(jì)以PCR擴(kuò)增代表核酸區(qū)段序列的一部分的擴(kuò)增子，并且PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增子的集合代表所述區(qū)段的完整序列的重疊部分。優(yōu)選地，多個(gè)引物對(duì)以約800-1,200個(gè)核苷酸長(zhǎng)的間隔與所述區(qū)段雜交。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及包含多對(duì)核酸引物的混合物，其中，當(dāng)使該集合經(jīng)受與核酸區(qū)段相關(guān)的聚合酶鏈反應(yīng)時(shí)，引物對(duì)的集合產(chǎn)生擴(kuò)增子的集合，其中每一擴(kuò)增子為約500-2,000個(gè)核苷酸長(zhǎng)，以致在所得的擴(kuò)增子集合中表示了所述區(qū)段的整個(gè)序列。優(yōu)選地，引物對(duì)集合的每一引物為約15-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)，具有約25-45%的GC含量，以及每一其它引物的3℃內(nèi)的退火溫度，并且引物對(duì)集合的每一引物包含與同一微生物的基因組雜交的序列。優(yōu)選地，所述微生物為病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)或真菌。優(yōu)選地，所述混合物包含熱穩(wěn)定聚合酶、含有約等量dATP、dCTP、dGTP和dTTP的脫氧核苷三磷酸混合物、螯合劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑和無(wú)核酸酶水。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括包含試劑容器的試劑盒，所述試劑容器優(yōu)選包含用于測(cè)序的一種或多種化學(xué)試劑、引物和聚合酶。將待分析的樣品與優(yōu)選包含足以殺死樣品中存在的所有病原體、滅活樣品中的核酸酶和維持核酸完整性致使樣品對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)和后續(xù)操作安全的化學(xué)組分，例如，水性裂解緩沖劑、水性或無(wú)水轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)或水性PrimeStore Molecular Transport Medium?的試劑容器混合?；旌衔锟山Y(jié)合（combine）在柱，例如微型離心柱中以幫助從樣品提取核酸，所述柱可包含在試劑盒中。提取的核酸優(yōu)選與方便核酸檢驗(yàn)例如PCR測(cè)序的另一種化學(xué)試劑組合物例如PrimeMix?組合。這樣的試劑組合物可包含陽(yáng)性對(duì)照序列、陰性對(duì)照序列和/或與病原體存在所特有的特定靶序列(在期需的高或低嚴(yán)格性雜交條件下)特異性雜交的序列。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及實(shí)現(xiàn)本發(fā)明分析方法的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。優(yōu)選的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)分析獲得的序列信息和集中信息的集合。還優(yōu)選將序列信息與從相同或相似序列的序列信息的一個(gè)或多個(gè)已知數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的序列信息比較并鑒定為微生物提供抗生素抗性和其它表型特征的突變。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)在隨后的描述部分列出，并且部分上，可從該描述顯而易見(jiàn)，或可從本發(fā)明的實(shí)踐學(xué)習(xí)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1 說(shuō)明pncA基因序列加100側(cè)翼堿基對(duì)以及反向互補(bǔ)序列（reverse compliment sequence）、蛋白序列和引物序列。

圖2 說(shuō)明H37RV基因菌株的核苷酸序列以及TB 16S核糖體RNA基因測(cè)序引物的序列。

圖3 說(shuō)明賦予對(duì)利福平的敏感性/抗性的rpoB基因以及rpoB的正向和反向引物序列。

圖4 說(shuō)明結(jié)核分枝桿菌H37Ra，完整基因組(GenBank: CP000611.1) GyrA基因以及三組正向和反向引物。

圖5 結(jié)核分枝桿菌H37Ra，完整基因組(GenBank: CP000611.1)過(guò)氧化氫酶-過(guò)氧化物酶-過(guò)氧化亞硝酸鹽酶(peroxynitritase) T katG以及三組正向和反向引物。

圖6 說(shuō)明旋轉(zhuǎn)酶A和IS 6110測(cè)定的循環(huán)閾值。

圖7 說(shuō)明通過(guò)循環(huán)數(shù)目相對(duì)于Ct值使用序列分離物（sequence islates）的旋轉(zhuǎn)酶A測(cè)定和IS 6110測(cè)定。

圖8 說(shuō)明相對(duì)于循環(huán)閾值(ct)使用序列分離物的旋轉(zhuǎn)酶A測(cè)定和IS 6110測(cè)定。

圖9 使用多種引物對(duì)集合用離子激流測(cè)序方法學(xué)測(cè)序甲型流感基因組中取得的結(jié)果概要。

圖10 用于甲型流感(H3N2)的全基因組離子激流測(cè)序的引物對(duì)的表征。

圖11 (A) pncA的基因序列，所述序列將編碼區(qū)顯示為陰影的，和(B) PCR鋪瓦(PCR tiling)中使用的pncA正向和反向引物以及pncA區(qū)域P1-P4。

圖12 本發(fā)明方法的電子系統(tǒng)的體系結(jié)構(gòu)。

發(fā)明描述

對(duì)于許多疾病和病癥的成功治療，藥物抗性菌株相關(guān)基因的快速分析是一個(gè)主要挑戰(zhàn)。新出現(xiàn)MTB藥物抗性的實(shí)時(shí)地理監(jiān)督將會(huì)促進(jìn)更適當(dāng)?shù)闹委煵呗?例如，藥物、抗生素、化學(xué)品)。當(dāng)前，可用的分子方法例如GenoType? MTBDRplus LPA提供有限的檢測(cè)能力，特別是當(dāng)新型/不常見(jiàn)的氨基酸置換在已知的藥物抗性區(qū)域中時(shí)或當(dāng)未發(fā)現(xiàn)的氨基酸突變影響藥物抗性時(shí)。同樣，當(dāng)前的方法學(xué)（包括離子激流方案）需要多步、輔助設(shè)備和增加的費(fèi)用，并且為勞動(dòng)密集型的。

已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)用于快速表征全長(zhǎng)基因和基因組的簡(jiǎn)化的半導(dǎo)體測(cè)序方案。本發(fā)明包括用于基因測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)化方案，優(yōu)選利用半導(dǎo)體測(cè)序并優(yōu)選全長(zhǎng)基因的離子激流測(cè)序。所述方案使得能夠?qū)崿F(xiàn)整個(gè)編碼區(qū)域的測(cè)序，允許表征已知突變和發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)性。該方案還使得能夠測(cè)序兆堿基核苷酸信息，以致可測(cè)定細(xì)胞和生物體的完整基因組并且容易地定位和鑒定遺傳多態(tài)性。優(yōu)選地所述細(xì)胞和生物體為引發(fā)疾病的原核或真核細(xì)胞，或酵母或真菌細(xì)胞。優(yōu)選的引發(fā)疾病的生物體包括寄生蟲(chóng)和真菌、病毒、細(xì)菌種類(lèi)。示例性的生物體包括，但不限于，DNA病毒、RNA病毒、正或負(fù)單鏈病毒、雙鏈病毒、正粘病毒、副粘病毒、麻疹病毒(例如，麻疹)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、黃病毒、線狀病毒、慢病毒、漢坦病毒、皰疹病毒(例如，VZV、HSV I、HSV II、EBV)、肝炎病毒(例如，A、B、C、非A、非B)、流感病毒(例如，H5N1、H1N1、H7N9)、呼吸道合胞病毒、HIV或埃博拉病毒。示例性的生物體還包括但不限于分枝桿菌(例如，結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis))、炭疽芽胞桿菌（Bacillus anthracis)、瘧原蟲(chóng)屬(例如，惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum))、血吸蟲(chóng)(例如，曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosoma mansoni))、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、腦膜炎球菌感染、假單胞菌感染、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)。本發(fā)明還涉及檢測(cè)和表征與病原性生物體相關(guān)但非病原性的生物體。一種或多種非病原性但相關(guān)的生物體的檢測(cè)可成為疾病不存在的最終診斷。另外，本發(fā)明的工具和方法允許鑒定和表征個(gè)體的現(xiàn)存基因組中的異常，例如可能從出生就存在的(先天性的)和可能為可遺傳的病況。這些遺傳病癥通過(guò)本發(fā)明的工具和方法是同等可檢測(cè)的和可表征的并且可通過(guò)與其它非患病個(gè)體（non-afflicted individual）的正?；?qū)φ栈蚪M比較診斷。

該相對(duì)快速的(例如，1、2或3天，或更短)、標(biāo)準(zhǔn)化的、成本有效的方案允許基因的全長(zhǎng)分析，例如，以鑒定具有DNA、RNA、蛋白質(zhì)和/或肽序列的一個(gè)或多個(gè)變更的突變。對(duì)于為RNA的樣品序列，通常將樣品中的目的RNA序列反轉(zhuǎn)錄為DNA用于PCR分析。優(yōu)選鑒定和表征的為一個(gè)或多個(gè)為微生物提供對(duì)抗生素的抗性的基因突變。用本發(fā)明方法鑒定的優(yōu)選突變位于氨基酸編碼區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或終止位點(diǎn)、終止或起始密碼子、非編碼區(qū)中的位點(diǎn)、剪接位點(diǎn)、修飾位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄或翻譯因子結(jié)合或識(shí)別位點(diǎn)、促成三維結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，或其組合。所分析的優(yōu)選基因包括與一線和二線MTB藥物抗性有關(guān)的MTB基因(參見(jiàn)圖1-5)。MTB-相關(guān)基因的優(yōu)選實(shí)例包括，例如，rpoB (利福平)、katG和inhA (異煙肼)、gyrA和gyrB (氟喹諾酮)、pncA和panD (PZA或吡嗪酰胺)以及rrs(16s) (氨基糖苷類(lèi)、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、鏈霉素)和rspL (鏈霉素)。

使用本發(fā)明方法用下一代 Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM)評(píng)估在南非收集的26個(gè)地理上不同的臨床分離物，包括MDR和XDR菌株。特別感興趣的為INDELS，其為引起蛋白結(jié)構(gòu)中的錯(cuò)義變化的單核苷酸(A、T、G、C)的插入或缺失。將從該開(kāi)發(fā)的方法學(xué)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)與來(lái)自培養(yǎng)的HAIN LPA和基因分型DST數(shù)據(jù)比較。該方法學(xué)第一次使得能夠測(cè)序?qū)崿F(xiàn)抗性的基因的整個(gè)編碼以及非編碼區(qū)，允許表征已知突變和發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)性。在rrs、 rpoB、 katG、 pncA、gyrA和gyr B、katG、inhA及 panD基因上鑒定到先前未表征的置換突變。

本發(fā)明為新型測(cè)序平臺(tái)，例如，下一代儀器在資源匱乏環(huán)境例如非洲、亞洲和印度中被更多利用提供了顯著的潛力。具體地，當(dāng)前發(fā)明改善和簡(jiǎn)化了預(yù)先的（up-front）實(shí)驗(yàn)室制備過(guò)程。本發(fā)明的方法學(xué)不需要使用制造商所通常使用或需要的(typically utilized or required by the manufacturer)昂貴的輔助設(shè)備件。具體地，本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)化程序不需要用于DNA定量的Agilient Bioanalyzer，用于乳化PCR步驟的OneTouch ePCR系統(tǒng)，或用于凝膠切除的PipinPrep。另外，由于本發(fā)明的方案涉及全-編碼基因(不必須是全基因組)的重測(cè)序，不需要Bioruptor將DNA剪切成較小的片段。另外，不需要測(cè)序整個(gè)基因組然后鑒定基因。本發(fā)明方法和工具允許預(yù)先選擇待測(cè)序的目的基因和/或區(qū)域。由于Agilent 2100 BioAnalyzer、OneTouch、PipinPrep和Bioruptor均需要額外的使用訓(xùn)練，消耗有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)臺(tái)空間，并且極其昂貴，本發(fā)明代表超過(guò)常規(guī)方法學(xué)的顯著進(jìn)步和改善。

本發(fā)明的測(cè)序方案在本文中使用離子激流測(cè)序例示，因?yàn)樵摐y(cè)序方法已經(jīng)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌。正如認(rèn)為對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言清楚的，所述方案涉及半導(dǎo)體測(cè)序，其通過(guò)離子激流測(cè)序例示并且，同樣，涉及許多不同區(qū)域的同時(shí)測(cè)序。所述測(cè)序和核酸方法學(xué)可應(yīng)用于任何系列的基因、基因組或核酸序列。

本發(fā)明還包括用于選擇用于測(cè)序目的靶的引物對(duì)的方法學(xué)。引物對(duì)優(yōu)選以匹配的對(duì)靶的退火和熔解溫度選擇。優(yōu)選地，熔解和退火溫度基于序列特征例如序列的GC含量、引物自雜交(例如，形成引物內(nèi)的發(fā)夾環(huán))的可能性，和結(jié)合位點(diǎn)附近的可能結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地所述引物在測(cè)序條件下不自雜交。優(yōu)選引物的GC含量為約25%-50%，更優(yōu)選約30%-40%，更優(yōu)選約25%-35%，并且還更優(yōu)選約40%-50%。因此，基于序列特征選擇靶的引物序列用于雜交，使得靶利用的所有引物對(duì)將具有相似的對(duì)靶的熔解和/或退火溫度。優(yōu)選引物序列不包含引物序列按理可能自雜交的區(qū)域。優(yōu)選引物對(duì)的退火和/或解離溫度匹配，所述溫度可在5℃內(nèi)、4℃內(nèi)、3℃內(nèi)、2℃內(nèi)、1℃內(nèi)并且更優(yōu)選退火溫度相同、熔解溫度相同或二者。引物對(duì)優(yōu)選產(chǎn)生代表靶的重疊區(qū)段的約500-約2,000核苷酸(NT)長(zhǎng)的擴(kuò)增子，更優(yōu)選約600-1,500 NT，更優(yōu)選約700-1,300 NT，更優(yōu)選約800-1,200 NT，更優(yōu)選約900-1,100 NT并且更優(yōu)選約1,000 NT。引物通常為12 NT-45 NT長(zhǎng)，更優(yōu)選15-35 NT，并且更優(yōu)選約18-25 NT。盡管不是規(guī)則，一般較長(zhǎng)的引物具有較低的GC含量。對(duì)于pncA基因(參見(jiàn)圖1)、H37RV基因種類(lèi)(參見(jiàn)圖2)、rpoB基因(參見(jiàn)圖3)、GyrA基因(參見(jiàn)圖4)和katG基因(參見(jiàn)圖5)鑒定了示例性的引物對(duì)。這些引物對(duì)可用于在即用型試劑盒中組合以簡(jiǎn)化全長(zhǎng)基因的測(cè)序。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，確定了用于測(cè)定MDR和XDR菌株藥物抗性的結(jié)核分枝桿菌的五個(gè)基因的半導(dǎo)體測(cè)序方案(例如，每個(gè)分離物累積測(cè)序11.4 kb)。結(jié)核分枝桿菌rpoB基因編碼RNA依賴(lài)性DNA聚合酶的1,178氨基酸的β亞基。rpoB基因的81-bp“核心區(qū)”中的突變對(duì)結(jié)核分枝桿菌菌株中大約95%的利福平抗性負(fù)有責(zé)任。這些突變中在516 (D→V)、526 (H→Y/D)和531 (S→L)位處的三個(gè)構(gòu)成該區(qū)域內(nèi)的大多數(shù)突變。本研究表征的21個(gè)利福平-抗性菌株中，11個(gè)(52.4%)攜帶rpoB基因的S531L突變，7個(gè)(33.3%)在rpoB基因的516位包含氨基酸置換，3個(gè)(14.3%)在rpoB基因的526位包含突變(表1)。在516位觀察到的最流行的rpoB置換為纈氨酸(D516V)。本發(fā)明的離子激流測(cè)序揭示7個(gè)菌株中的6個(gè)在該位置包含罕見(jiàn)的甘氨酸殘基(D516G) (表1)。這6個(gè)菌株通過(guò)LPA顯示為突變體和野生型帶二者均不存在(表1)。在rpoB基因的526位類(lèi)似地鑒定到一個(gè)不常見(jiàn)的氨基酸置換。在rpoB基因的526位報(bào)道的最流行的氨基酸置換為組氨酸至酪氨酸或天冬氨酸(H526Y/D)。離子激流測(cè)序顯示3個(gè)分離物中的1個(gè)包含一個(gè)不常見(jiàn)的精氨酸(R)殘基(H526R)，其通過(guò)HAIN LPA顯示為野生型和突變體帶二者均不存在(表1)。盡管根據(jù)LPA檢驗(yàn)樣品中野生型和突變體帶均不存在被解釋為抗性，但仍存在模糊性，因?yàn)榘被嶙兓念?lèi)型未直接表征。這強(qiáng)調(diào)了離子激流測(cè)序?qū)剐员O(jiān)督和傳播中的MTB菌株中新型氨基酸的發(fā)現(xiàn)的效用。

表1

通過(guò)離子激流測(cè)序、Hain LPA基因分型和培養(yǎng)推斷的來(lái)自南非的26個(gè)(14個(gè)MDR、7個(gè)XDR和5個(gè)完全易感的)結(jié)核分枝桿菌分離物的ropB基因的最初900個(gè)氨基酸殘基^*中10個(gè)氨基酸突變的概要

katG基因編碼過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化物酶，一種將異煙肼(INH)轉(zhuǎn)化為活性形式的酶。大多數(shù)異煙肼抗性與katG密碼子315 (S315T)有關(guān)，盡管inhA和nod啟動(dòng)子區(qū)域中的突變也導(dǎo)致抗性。在評(píng)估的26個(gè)菌株中，16個(gè)(62%)在315位包含典型的絲氨酸至蘇氨酸氨基酸置換(S315T)，其賦予異煙肼抗性(表2)。這些測(cè)序結(jié)果顯示與使用HAIN LPA和培養(yǎng)DST作出的比較100%的一致性。

表2

通過(guò)離子激流測(cè)序、Hain LPA基因分型和培養(yǎng)推斷的來(lái)自南非的26個(gè)(14個(gè)MDR、7個(gè)XDR和5個(gè)完全易感的)結(jié)核分枝桿菌分離物的katG基因中的4個(gè)氨基酸突變的概要

吡嗪酰胺(PZA)為合成的煙酰胺衍生物，其從1952年以來(lái)已經(jīng)被用作一線藥物抗擊結(jié)核病。用于PZA的標(biāo)準(zhǔn)DST為復(fù)雜的，因?yàn)轶w外需要酸性pH，其抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)并使準(zhǔn)確的表型評(píng)估復(fù)雜化。PZA抗性歸因于編碼吡嗪酰胺酶的pncA基因中的突變。這些賦予抗性的突變數(shù)目眾多，并包括氨基酸置換、移碼和終止密碼子突變。從評(píng)估的26個(gè)南非分離物表征了7個(gè)突變，包括1個(gè)沉默突變、5個(gè)氨基酸置換和1個(gè)鏈終止突變。在一個(gè)分離物中觀察到的Q122 (終止)終止突變(表3)為新的，別處尚未曾報(bào)道過(guò)。PZA表型評(píng)估的困難和沿pncA基因的突變的變異性進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了離子激流基因測(cè)序評(píng)估此超變量（hyper variable）MTB基因中的突變的附加價(jià)值。

表3

通過(guò)離子激流測(cè)序和培養(yǎng)推斷的來(lái)自南非的26個(gè)(14個(gè)MDR、7個(gè)XDR和5個(gè)完全易感的)結(jié)核分枝桿菌的pncA基因中的6個(gè)氨基酸突變的概要

氟喹諾酮(FQ)在結(jié)核分枝桿菌中的主要靶為DNA旋轉(zhuǎn)酶，由gyrA和gyrB基因分別編碼的兩個(gè)A和B亞基組成的II型拓?fù)洚悩?gòu)酶。位于稱(chēng)為喹諾酮抗性-決定區(qū)(QRDR)的gyrA基因的短區(qū)域內(nèi)的氨基酸置換占已知FQ抗性結(jié)核病菌株的大多數(shù)。QRDR中88、90和94位的置換突變?cè)诒狙芯康?6個(gè)序列的10個(gè)(38.5%)中觀察到(表4)。這10個(gè)菌株中的3個(gè)在gyrA基因的94位包含置換；兩個(gè)記錄為D94G置換，1個(gè)為D94Y置換。D94G和D94Y二者均已作為置換表征并且密碼子94的兩種氨基酸置換引起相似水平的FQ抗生素抗性。評(píng)估的菌株中，gyrA基因最可變，在評(píng)估的26個(gè)臨床分離物中包含9個(gè)氨基酸置換。此外，這些gyrA密碼子中的兩個(gè)(549和613)顯示異質(zhì)殘基(表4)，這為進(jìn)行離子激流測(cè)序超過(guò)HAIN LPA和DST的優(yōu)點(diǎn)。

表4

通過(guò)離子激流測(cè)序和培養(yǎng)推斷的來(lái)自南非的26個(gè)(14個(gè)MDR、7個(gè)XDR和5個(gè)完全易感的)結(jié)核分枝桿菌分離物的gyrA基因中的10個(gè)氨基酸突變的概要

定義為已經(jīng)獲得額外的對(duì)FQ，即，氧氟沙星，和三種可注射“二線藥物”，即，阿米卡星(AMK)、卡那霉素(KAN)或卷曲霉素(CAP)中的至少一種的抗性的MDR案例的新出現(xiàn)的XDR結(jié)核病案例已經(jīng)成為全世界發(fā)展中國(guó)家的公眾健康威脅。大多數(shù)對(duì)二線藥物的抗性與16 S核糖體RNA rrs基因的密碼子1401 (A1401G)、1402 (C1402T)和1484 (G1483T)中的突變有關(guān)。對(duì)非洲MTB菌株的分析顯示26中的7個(gè)(27%)定義為XDR，如1401位的核苷酸突變(A1401G)所證明的(表4)。在來(lái)自該分析的菌株中還發(fā)現(xiàn)了492、514和878位的三個(gè)額外的核苷酸突變(表5)。G878A為新的核苷酸突變但根據(jù)DST顯示對(duì)AMK、KAN和CAP敏感。

表5

通過(guò)離子激流測(cè)序和培養(yǎng)推斷的來(lái)自南非的26個(gè)(14個(gè)MDR、7個(gè)XDR和5個(gè)完全易感的)結(jié)核分枝桿菌分離物的rrs (16s)基因中的4個(gè)核苷酸突變的概要

先前的研究顯示katG密碼子463和gyrA密碼子95中的突變?yōu)閷⒕攴诸?lèi)為流行病學(xué)遺傳群1、2和3的遺傳標(biāo)志，并且這些密碼子對(duì)抗生素抗性無(wú)作用。群1菌株為群2和群3菌株的遺傳祖先，其連接占優(yōu)勢(shì)的非人類(lèi)分枝桿菌屬(田鼠分枝桿菌(M. microti)和牛分枝桿菌 (M. bovis) 菌株)與人非洲分枝桿菌(M. africanum)和結(jié)核分枝桿菌譜系。如katG密碼子463和gyrA密碼子95中的置換突變所證明的，本發(fā)明表征的非洲分離物的總共26中的7個(gè)(27%)、26中的18個(gè)(69%)和26中的1個(gè)(4%)分別為遺傳群1、2和3的成員。追蹤群1生物體對(duì)于MTB檢測(cè)相當(dāng)重要，因?yàn)閷儆谶z傳群1的數(shù)個(gè)分離物缺乏插入序列1661 (IS-1661)，其為幾個(gè)基于PCR的MTB檢測(cè)測(cè)定的通用遺傳靶。

用于MTB藥物抗性的離子激流方案可容易地整合到遍及國(guó)家和地區(qū)，例如非洲、印度和中國(guó)的資源匱乏環(huán)境中。離子激流方法學(xué)不需要使用昂貴的輔助設(shè)備例如當(dāng)前的離子激流方案所推薦的Pippin Prep? Workstation或Agilent 2100 BioAnalyzer、DiaGenode Bioruptor? Sonication System、Ion OneTouch System?、超速離心機(jī)。這具有重要意義，因?yàn)檫@些儀器以及所需的配件和消耗品可為昂貴的，需要大量實(shí)驗(yàn)室足跡(footprints)，并且常常需要例行維護(hù)。

與GenoType? MTBDRplus或MTBDRsl Line Probe Assay (LPA)相反，離子激流PGM方案提供基因的全長(zhǎng)表征，使得可能發(fā)現(xiàn)可潛在地被LPA錯(cuò)過(guò)的新的氨基酸置換，因?yàn)長(zhǎng)PA僅限于已知的突變。使用該方案，已經(jīng)在臨床領(lǐng)域分離物中發(fā)現(xiàn)了若干不常見(jiàn)的氨基酸變化。此外，離子激流序列覆蓋的廣闊深度允許發(fā)現(xiàn)分離物中的異質(zhì)或混合的菌株遺傳群。

離子激流測(cè)序的可擴(kuò)縮性允許擴(kuò)展以在單個(gè)芯片上包含兆堿基的額外基因。本發(fā)明的方法學(xué)可擴(kuò)展超過(guò)5個(gè)全長(zhǎng)MTB基因以包含當(dāng)前構(gòu)成MTB藥物抗性的所有16加（16 plus）基因。使用離子激流PGM的全長(zhǎng)基因分析將鑒定新突變，當(dāng)與表型最小抑制濃度(MIC)檢驗(yàn)關(guān)聯(lián)時(shí)，其鑒定新的結(jié)核病抗性殘基以及多個(gè)突變的累積抑制作用。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及利用半導(dǎo)體測(cè)序方案的兆堿基序列鑒定。本發(fā)明的兆堿基測(cè)序涉及選擇擴(kuò)增靶序列的不同區(qū)段的引物對(duì)，借此區(qū)段的集合代表靶序列的全部。優(yōu)選所述區(qū)段重疊達(dá)到允許比對(duì)所得擴(kuò)增子而形成完整靶序列的程度。引物對(duì)優(yōu)選設(shè)計(jì)為形成具有約0.5 k-約5 k核苷酸，優(yōu)選約0.6 k-約3 k核苷酸，最優(yōu)選約0.7 k-約2 k核苷酸并且更優(yōu)選約0.8 k-約1 k核苷酸的長(zhǎng)度的擴(kuò)增子。引物對(duì)優(yōu)選GC含量（GC contact）相似，以致退火或雜交溫度相似或優(yōu)選在約5℃內(nèi)，更優(yōu)選在約2℃內(nèi)，并且更優(yōu)選在約1℃內(nèi)。還優(yōu)選雜交解離溫度相似，以致對(duì)于聚合和PCR而言退火和解離在非常相似的溫度發(fā)生。在退火和解離中，引物的長(zhǎng)度影響溫度概況，因此優(yōu)選所有或至少大部分引物長(zhǎng)度相似。引物長(zhǎng)度優(yōu)選約15-30個(gè)核苷酸、更優(yōu)選約20-28個(gè)核苷酸，并且更優(yōu)選約18-25個(gè)核苷酸。盡管優(yōu)選所有的引物具有這樣的相似特征，兆堿基測(cè)序可在大于約80%的引物共享一個(gè)或多個(gè)特征，更優(yōu)選85%或更多，更優(yōu)選90%或更多，甚至更優(yōu)選95%或更多時(shí)實(shí)施。引物對(duì)可組合（assemble）在試劑盒中以方便全長(zhǎng)測(cè)序。向從樣品獲得的核酸添加靶向擴(kuò)增靶序列的引物。根據(jù)這些相似引物的使用，用一個(gè)待擴(kuò)增的靶核酸與所有引物對(duì)的混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。還優(yōu)選在完全相同的混合物上進(jìn)行雙份PCR分析。循環(huán)數(shù)目可為10-50或更多并且，優(yōu)選溫度循環(huán)按照常規(guī)PCR溫度和反應(yīng)條件進(jìn)行。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用通過(guò)本發(fā)明方法鑒定的抗微生物化合物治療由至少一種微生物菌株或血清型引起的疾病或病癥的方法。優(yōu)選地，治療包括靶向殺死為疾病或病癥的致病物質(zhì)的特定病原體。還優(yōu)選通過(guò)評(píng)估與鑒定的靶序列或序列們相關(guān)的表型特征從本發(fā)明方法確定有效劑量，從而選擇已知或檢驗(yàn)中的易感劑用于治療。優(yōu)選地，治療有效劑量可從通過(guò)本發(fā)明測(cè)序方法所獲得的測(cè)序信息確定。例如，已知某些序列，如果經(jīng)測(cè)定存在，引起某些表型特征，例如，對(duì)某些抗生素或其它治療處理的抗性或敏感性。這些序列的存在或不存在，以及序列存在的量，可提供有效治療以及用于治療的治療有效劑量的指示和指導(dǎo)。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括包含試劑容器的試劑盒，所述試劑容器優(yōu)選含有用于測(cè)序的一種或多種化學(xué)試劑、引物和聚合酶。將待分析的樣品與優(yōu)選包含足以殺死樣品中存在的所有病原體、滅活樣品中的核酸酶和維持核酸完整性致使樣品對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)和后續(xù)操作安全的化學(xué)組分，例如，水性裂解緩沖劑、水性或無(wú)水轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)或水性PrimeStore Molecular Transport Medium?(在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,084,443、8,080,645和8,097,419中描述，所有這些專(zhuān)利明確地通過(guò)引用結(jié)合)的試劑容器混合?；旌衔锟稍谥缥⑿碗x心柱中組合以幫助從樣品提取核酸，所述柱可包含在試劑盒中。提取的核酸優(yōu)選與方便核酸檢驗(yàn)例如PCR測(cè)序的另一種化學(xué)試劑組合物例如PrimeMix?(也在2011年4月25日提交的標(biāo)題為“用于檢測(cè)、鑒定和定量分枝桿菌-特異性核酸的組合物和方法”美國(guó)專(zhuān)利出版號(hào)2011/0281754和2012年4月26日提交的標(biāo)題為“用于檢測(cè)和鑒定生物樣品中的核酸序列的組合物和方法”的國(guó)際申請(qǐng)出版號(hào)WO2012/149188中描述，二者通過(guò)引用特異性結(jié)合)組合。這樣的試劑組合物可包含陽(yáng)性對(duì)照序列、陰性對(duì)照序列和/或與病原體存在所特有的特定靶序列(在期需的高或低嚴(yán)格性雜交條件下)特異性雜交的序列。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的計(jì)算機(jī)可讀編程(參見(jiàn)圖12)。優(yōu)選所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括提供用于包含關(guān)于每一樣品的特異性和一般信息二者的格式。該信息可容易地集中和儲(chǔ)存。本發(fā)明方法的一個(gè)示例性的電子系統(tǒng)包括至少一個(gè)一般用途的計(jì)算裝置100，其包括處理單元(CPU) 120和將包括系統(tǒng)存儲(chǔ)器例如只讀存儲(chǔ)器(ROM) 140和隨機(jī)訪問(wèn)存儲(chǔ)器(RAM) 150在內(nèi)的多個(gè)系統(tǒng)組件連接（couple）至處理單元120的系統(tǒng)總線110。優(yōu)選地，還可使用額外的系統(tǒng)存儲(chǔ)器。所述電子方法可在具有一個(gè)以上CPU 120的計(jì)算裝置上或在網(wǎng)絡(luò)連接在一起的計(jì)算裝置群或簇上操作以提供更大的處理能力。系統(tǒng)總線110可為幾種總線結(jié)構(gòu)類(lèi)型中的任何，包括使用各種總線體系結(jié)構(gòu)的任何的存儲(chǔ)總線或存儲(chǔ)控制器、外圍總線和局部總線。ROM 140等中儲(chǔ)存的基本輸入/輸出(BIOS)可提供幫助在計(jì)算裝置100中的元件之間轉(zhuǎn)移信息的基本例行程序，例如在啟動(dòng)期間。計(jì)算裝置100進(jìn)一步包括存儲(chǔ)裝置例如硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)160、磁盤(pán)驅(qū)動(dòng)、光盤(pán)驅(qū)動(dòng)、磁帶驅(qū)動(dòng)等。存儲(chǔ)裝置160通過(guò)驅(qū)動(dòng)接口與系統(tǒng)總線110連接。驅(qū)動(dòng)和相關(guān)的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)提供計(jì)算機(jī)可讀指令、數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)、程序模塊和用于計(jì)算裝置100的其它數(shù)據(jù)的非易失性?xún)?chǔ)存。基礎(chǔ)組件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知并且根據(jù)裝置的類(lèi)型，例如裝置是否為小的手提式計(jì)算裝置、臺(tái)式計(jì)算機(jī)、計(jì)算機(jī)服務(wù)器、手提式掃描裝置或無(wú)線裝置包括無(wú)線個(gè)人數(shù)字助理(“PDAs”)、平板裝置、具有無(wú)線網(wǎng)絡(luò)功能的或“智能”電話考慮適當(dāng)變更。優(yōu)選地，所述系統(tǒng)為技術(shù)無(wú)關(guān)的。

盡管本文所述的示例性環(huán)境使用硬盤(pán)，在示例性的操作環(huán)境中也可使用可儲(chǔ)存計(jì)算機(jī)可訪問(wèn)數(shù)據(jù)的其它類(lèi)型的計(jì)算機(jī)-可讀介質(zhì)，例如磁盒、閃存卡、數(shù)字通用盤(pán)、盒式磁盤(pán)（cartridges）、隨機(jī)訪問(wèn)存儲(chǔ)器(RAMs)、只讀存儲(chǔ)器(ROMs)、包含比特流的線纜或無(wú)線信號(hào)等。

為了使用戶能夠與計(jì)算裝置100交互，輸入裝置190代表任何數(shù)目的輸入機(jī)制，例如用于言語(yǔ)的麥克風(fēng)、用于手勢(shì)或圖片輸入的觸敏屏、鍵盤(pán)、鼠標(biāo)、運(yùn)動(dòng)輸入、言語(yǔ)、游戲機(jī)控制器、TV遙控器等。輸出裝置170可為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多輸出機(jī)制中的一種或多種，例如，打印機(jī)、監(jiān)視器、投影儀、揚(yáng)聲器和繪圖機(jī)。在一些實(shí)施方案中，輸出可經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)交互，例如上載至網(wǎng)站、電子郵件、附在或放置在其它電子文件中和發(fā)送SMS或MMS信息。在一些情況下，多式系統(tǒng)(multimodal systems)使用戶能夠提供多種輸入類(lèi)型以與計(jì)算裝置100通信。通信接口180一般支配和管理用戶輸入和系統(tǒng)輸出。不限制本發(fā)明在任何具體硬件排列上操作，因此此處的基本特征可隨其發(fā)展針對(duì)改善的硬件或固件排列而容易地置換。

為了解釋的清楚性，說(shuō)明性的系統(tǒng)實(shí)施方案呈現(xiàn)為包括個(gè)體功能塊(包括標(biāo)記為“處理器”的功能塊)。這些塊代表的功能可通過(guò)使用共享或?qū)Ｓ玫挠布峁?，所述硬件包括，但不限于能夠?zhí)行軟件的硬件。例如圖1中呈現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)處理器的功能可通過(guò)單個(gè)共享的處理器或多個(gè)處理器提供。(術(shù)語(yǔ)“處理器”的使用不應(yīng)解釋為專(zhuān)指能夠執(zhí)行軟件的硬件。)說(shuō)明性的實(shí)施方案可包括微處理器和/或數(shù)字信號(hào)處理器(DSP)硬件、用于儲(chǔ)存進(jìn)行下文所討論操作的軟件的只讀存儲(chǔ)器(ROM)和用于儲(chǔ)存結(jié)果的隨機(jī)訪問(wèn)存儲(chǔ)器(RAM)。還可提供超大規(guī)模集成(VLSI)硬件實(shí)施方案，以及與一般用途DSP回路組合的定制的VLSI線路。

本發(fā)明范圍內(nèi)的實(shí)施方案可還包括用于攜帶或具有存儲(chǔ)于其上的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)或計(jì)算機(jī)-可執(zhí)行指令的計(jì)算機(jī)-可讀介質(zhì)。這樣的計(jì)算機(jī)-可讀介質(zhì)可為一般用途或?qū)Ｓ糜?jì)算機(jī)可訪問(wèn)的任何可用介質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，而非限制，這樣的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可包括RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或其它光盤(pán)存儲(chǔ)器、磁盤(pán)存儲(chǔ)器或其它磁存儲(chǔ)裝置，或可用于攜帶或存儲(chǔ)呈計(jì)算機(jī)-可執(zhí)行指令或數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)形式的所需程序代碼方法的任何其它介質(zhì)。當(dāng)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)或另一種通信連接(硬連線、無(wú)線或其組合)向計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)移或提供信息時(shí)，計(jì)算機(jī)適當(dāng)?shù)貙⑦B接視為計(jì)算機(jī)-可讀介質(zhì)。因此，任何這樣的連接均被適當(dāng)?shù)胤Q(chēng)為計(jì)算機(jī)-可讀介質(zhì)。上述的組合也應(yīng)包括在計(jì)算機(jī)-可讀介質(zhì)的范圍內(nèi)。

計(jì)算機(jī)-可執(zhí)行指令包括，例如，引起一般用途計(jì)算機(jī)、專(zhuān)用計(jì)算機(jī)或?qū)Ｓ锰幚硌b置實(shí)施一定功能或功能群的指令和數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)-可執(zhí)行指令還包括獨(dú)立或網(wǎng)絡(luò)環(huán)境中的計(jì)算機(jī)所執(zhí)行的程序模塊。一般而言，程序模塊包括實(shí)施特定任務(wù)或?qū)崿F(xiàn)特定抽象數(shù)據(jù)類(lèi)型的例行程序、程序、對(duì)象、組件和數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)等。計(jì)算機(jī)-可執(zhí)行指令、相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和程序模塊代表用于執(zhí)行本文所公開(kāi)方法的步驟的程序代碼方法的實(shí)例。這樣的可執(zhí)行指令或相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的具體序列代表用于實(shí)現(xiàn)這樣的步驟中所描述的功能的相應(yīng)活動(dòng)的實(shí)例。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案可在具有許多種計(jì)算機(jī)系統(tǒng)配置類(lèi)型的網(wǎng)絡(luò)計(jì)算環(huán)境中實(shí)踐，包括個(gè)人計(jì)算機(jī)、手提式裝置、多-處理器系統(tǒng)、基于微處理器的或可編程的消費(fèi)者電子產(chǎn)品、網(wǎng)絡(luò)PCs、小型計(jì)算機(jī)、大型計(jì)算機(jī)等。網(wǎng)絡(luò)可包括因特網(wǎng)、一個(gè)或多個(gè)局域網(wǎng)(“LANs”)、一個(gè)或多個(gè)大城市區(qū)域網(wǎng)(“MANs”)、一個(gè)或多個(gè)廣域網(wǎng)(“WANs”)、一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部互聯(lián)網(wǎng)等。實(shí)施方案還可在分布式計(jì)算環(huán)境（distributed computing environment）中實(shí)踐，其中任務(wù)由本地或通過(guò)通信網(wǎng)絡(luò)連接(通過(guò)硬線連接、無(wú)線連接，或通過(guò)其組合)的遠(yuǎn)程處理裝置執(zhí)行。在一個(gè)分布式計(jì)算環(huán)境中，程序模塊可位于本地或遠(yuǎn)程記憶存儲(chǔ)裝置二者中。

優(yōu)選地，計(jì)算機(jī)-可讀介質(zhì)與因特網(wǎng)連接并且可訪問(wèn)公開(kāi)可用的數(shù)據(jù)庫(kù)，例如，PubMed或GeneBank，并尋回關(guān)于要分析的微生物的序列和相關(guān)信息，包括所述微生物的一個(gè)或多個(gè)基因或部分基因的DNA、RNA和/或蛋白質(zhì)序列。將通過(guò)，例如，離子激流測(cè)序分析的序列與相同或相似微生物一個(gè)或多個(gè)(例如，1、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或甚至更大數(shù)目)已知序列或其它合成或重組序列比較。取得的結(jié)果可提供與數(shù)打、數(shù)百或甚至數(shù)千已知序列比較的基因或基因部分的快速和徹底分析。代表抗性的突變可容易并快速地測(cè)定和鑒定。

下列實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，但不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

臨床分離物 從南非Pretoria大學(xué)和南非Sandringham國(guó)立傳染病研究所(NICD)的樣品存檔獲得共計(jì)26個(gè)地理上不同的臨床分離物，其代表藥物-敏感、MD和XDR結(jié)核病菌株。H37Rv MTB實(shí)驗(yàn)室菌株作為貫穿方案的測(cè)序?qū)φ瞻趦?nèi)。使用的所有MTB分離物均為來(lái)自純培養(yǎng)MGIT? 960 System管(Becton Dickinson, Sparks, MD)的存檔菌株，其中使用Genotype? MTBDplus測(cè)定(HAIN LifeSciences, Germany)按照制造商的說(shuō)明測(cè)定對(duì)利福平和異煙肼的基因型抗性和鑒定物種。對(duì)一線和二線藥物的表型抗性使用MGIT? 960 System如先前所描述的進(jìn)行。對(duì)于氧氟沙星和卡那霉素(二線藥物)的臨界濃度分別為2.0 μg/mL和5.0 μg/mL。對(duì)一線和二線藥物的抗性使用標(biāo)準(zhǔn)診斷學(xué)算法測(cè)定。

DNA制備 MTB分離物自始至終盲式處理。將MTB樣品(0.5 mL)吸入包含1.5 mL PrimeStore Molecular Transport Medium? (一種分子轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)) (Longhorn Vaccines & Diagnostics, San Antonio, TX)的冷凍管中。滅活的樣品在環(huán)境溫度下從南非轉(zhuǎn)運(yùn)至美國(guó)德克薩斯州圣安東尼奧(3-4天)并儲(chǔ)存在5℃直至使用?？侱NA (50 μl)使用Qiagen? EZ1? Advanced Robot and EZ1 DNA Tissue Kit (Cat No. 953034)按照制造商的推薦(Qiagen Inc., Germantown, MD)從包含滅活培養(yǎng)物的PrimeStore MTM?的200 μl等分試樣純化。

引物設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)新的PCR引物用于擴(kuò)增每一目的MTB基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)(表6)。

表6

用于MTB基因的全長(zhǎng)分析的PCR擴(kuò)增引物

用于rpoB (2組引物)、katG、pncA、gyrA和rrs (16s)基因擴(kuò)增的引物對(duì)使用結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組序列作為參考(GenBank登錄號(hào)NC_000962)設(shè)計(jì)。引物二級(jí)結(jié)構(gòu)、熔解溫度和潛在的引物-二聚體形成使用LaserGene 9.1 (DNAStar, Madison, WI)和PrimerExpress 3.0 (Life Technologies, Foster City, CA)測(cè)定。所有的寡核苷酸均使用標(biāo)準(zhǔn)脫鹽引物合成(Integrated DNA Technologies (IDT), San Diego, CA)。

PCR擴(kuò)增 對(duì)于所有MTB基因靶的擴(kuò)增反應(yīng)經(jīng)設(shè)計(jì)和優(yōu)化在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的熱循環(huán)參數(shù)集下使用。使用Platinum Taq DNA聚合酶、10X 緩沖劑和50 mM MgCl₂ (P/N 10966-034; Life Technologies, Foster City, CA)制備所有PCR“預(yù)混物”。擴(kuò)增在包含24.1 μl Ambion無(wú)核酸酶水(Cat No. AM 9932; Life Technologies, Foster City, CA)、5 μl 10X PCR 緩沖劑、2 μl 50 mM MgCl₂ (最終2 mM)、0.4 μl PCR Nucleotide Mix Ultrapure dNTPS (對(duì)于每一dNTP最終200 μM ；P/N 77119; USB, Santa Clara, CA)、0.5 μl Platinum Taq DNA聚合酶(最終2.5單位)和2 μl引物混合物(rpoB、katG、pncA、gyrA或rrs基因；對(duì)于每一引物最終0.4 μM)的50 μl終體積反應(yīng)混合物中進(jìn)行。向每一34 μl的“預(yù)混物”反應(yīng)混合物中加入16 μl提取的DNA以使總體積達(dá)到50 μl。反應(yīng)在MicroAmp Optical 96-孔反應(yīng)板(P/N N801-0560, Life Technologies, Foster City, CA)中進(jìn)行并使用MicroAmp 8-Cap Strips (P/N 4323032, Life Technologies, Foster City, CA)加帽。擴(kuò)增使用ABI 2720熱循環(huán)儀(Life Technologies, Foster City, CA)進(jìn)行。熱循環(huán)參數(shù)為95℃ 2分鐘，接著95℃ 30秒，55℃ 15秒和72℃ 2分鐘，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。所得的擴(kuò)增子通過(guò)在具有溴化乙錠(最終0.1 μg/mL；Cat No 161-0433; Bio-Rad, Hercules, CA)的1% (wt/vol)分子生物學(xué)級(jí)瓊脂糖(Cat No. BP1356; Fischer Scientific, Pittsburg, PA)上加入5 μl PCR產(chǎn)物與1 μl GelPilot Loading Dye 5X (P/N 1037649; Qiagen, Germantown, MD)確認(rèn)。產(chǎn)物的電泳分離在1X Tris Borate-EDTA (TBE) Buffer (Cat No. 1B70153; IBI Scientific, Peosta, IA)中以0.4 mV cm²進(jìn)行60分鐘。擴(kuò)增子在UV透照下可視化，使用TrackIt 1 kb Plus DNA Ladder (P/N 10488-085; Life Technologies, Foster City, CA)進(jìn)行大小評(píng)估?？梢暬螅瑢?i>rpoB、katG、pncA、gyrA和rrs (16s)靶對(duì)應(yīng)的每一臨床分離物基因擴(kuò)增的剩余PCR反應(yīng)物(~45 μL)轉(zhuǎn)移至單個(gè)微量離心管中。每一臨床分離物對(duì)應(yīng)的匯集的基因使用MinElute Reaction Cleanup Kit (Cat No. 28204; Qiagen, Germantown, MD)按照制造商的說(shuō)明經(jīng)受PCR純化并洗脫在50 μl Low Tris-EDTA (TE) (Cat No. 602-1155-010; Life Technologies, Foster City, CA)中。DNA的濃度和純度使用NanoDrop ND 1000 (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE)經(jīng)分光光度法測(cè)定。

離子激流文庫(kù)制備 標(biāo)有條碼的文庫(kù)使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit (Cat No. 4471269, Life Technologies, Foster City, CA)和Ion Xpress DNA Barcoding 1-16 Kit (Cat No. 4468654, Life Technologies, Foster City, CA)按照改良版本的Ion Xpress Plus gDNA和擴(kuò)增子文庫(kù)制備（Amplicon Library Preparation）中概述的方案產(chǎn)生。

擴(kuò)增子剪切 化學(xué)剪切使用包含rpoB、katG、pncA、 gyrA和rrs (16s)基因擴(kuò)增子的近似等摩爾池的1-3 μg DNA進(jìn)行。DNA剪切在50 μl總反應(yīng)體積中通過(guò)組合5 μl Ion Shear Plus 10X反應(yīng)緩沖液、10 μl酶和35 μl匯集的DNA模板(Ion Xpress Plus Fragment Library Kit, Cat No. 4471269, Life Technologies, Foster City, CA)進(jìn)行。反應(yīng)混合物37℃孵育45分鐘，使用5 μl Ion Shear Stop Buffer終止，并儲(chǔ)存在冰上直至純化。剪切的DNA使用Agencourt Ampure XP-PCR純化小珠(P/N A63880; Beckman Coulter, Brea, CA)與Dynal磁珠架(Cat No. 123-21D; Life Technologies, Foster City, CA)按照制造商的推薦純化。簡(jiǎn)言之，將99 μl Agencourt小珠與50 μl離子剪切反應(yīng)物混合，室溫孵育5分鐘，放置在磁珠架上，用70% (v/v)乙醇洗滌兩次，使用12 μl Low TE Buffer (Cat No. 602-1155-010; Life Technologies Inc., Foster City, CA)洗脫。

銜接頭連接 銜接頭連接在0.2 mL低結(jié)合PCR管(P/N PCR-02-L-C; Axygen Inc., Union City, CA)中通過(guò)組合12 μl 剪切的擴(kuò)增子與1.25 μl連接酶緩沖液、1.25 μl P1-IA 銜接頭混合物(Ion DNA Barcoding 1–16 Kit, Cat No. 4468654 Life Technologies, Foster City, CA)和0.2 μl DNA連接酶(Ion Xpress Plus Fragment Library Kit, Cat No. 4471269, Life Technologies, Foster City, CA)進(jìn)行。將混合物上下吸5次并室溫(22-25°C)孵育30分鐘。使用Agencourt Ampure XP-PCR純化小珠(P/N A63880; Beckman Coulter, Brea, CA)與Dynal磁珠架(Cat No. 123-21D; Life Technologies, Foster City, CA)按照制造商的推薦純化銜接頭連接反應(yīng)物并洗脫在10 μl Low TE Buffer中。

切口平移和條碼擴(kuò)增 使用Ion DNA Barcoding 1–16 Kit和Ion Xpress Fragment Library Kit (分別為Part Nos. 4468654和4471269; Life Technologies, Foster City, CA)為來(lái)自每一患者樣品的擴(kuò)增子池標(biāo)上條碼。為了使收率最大化，通過(guò)組合40 μl Platinum PCR SuperMix High Fidelity、4.4 μl Ion Primer Mix (BC X 其中X= 條碼 1-16)和10 μl連接的DNA將反應(yīng)按比例調(diào)至2x。擴(kuò)增使用ABI 2720熱循環(huán)儀(Life Technologies, Foster City, CA)進(jìn)行。熱循環(huán)參數(shù)包括72℃ 20分鐘，95℃ 5分鐘，接著10個(gè)循環(huán)的95℃ 15秒，58℃ 15秒和68℃ 1分鐘。擴(kuò)增之后，使用MinElute Reaction Cleanup Kit (Cat No. 28204; Qiagen, Germantown, MD)按照制造商的說(shuō)明純化標(biāo)有條碼的樣品并洗脫在50 μl Low TE (Cat No. 602-1155-010; Life Technologies, Foster City, CA)中。DNA濃度和純度使用NanoDrop ND 1000 (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE)通過(guò)分光光度分析測(cè)定。純化的標(biāo)有條碼的樣品的范圍通常為150-300 ng/μl，A260/280純度為1.7-1.9。在單個(gè)1.5 mL無(wú)核酸酶微量離心管中組合等摩爾濃度(~2-3 μg每一標(biāo)有條碼的樣品)并用于大小選擇。

大小選擇 向匯集的標(biāo)有條碼的MTB文庫(kù)管中加入適當(dāng)體積的GelPilot 5X Loading Dye (P/N 1037649; Qiagen, Germantown, MD)并上樣到包含溴化乙錠(最終0.1 μg/mL; Cat No 161-0433; Bio-Rad, Hercules, CA)的1 % (w/v)瓊脂糖凝膠(Cat No. BP1356; Fischer Scientific, Pittsburg, PA)上。標(biāo)有條碼的文庫(kù)在1X TBE Buffer (Cat No. 1B70153; IBI Scientific, Peosta, IA)中于0.4 mV cm²電泳60分鐘并在UV透照下可視化。大小估計(jì)使用TrackIt 1 kb Plus DNA Ladder (P/N 10488-085; Life Technologies, Foster City, CA)確定。凝膠切除在UV透照下使用無(wú)菌解剖刀刀片切去75-200 bp之間的靶區(qū)域進(jìn)行。將切除的瓊脂糖凝膠切片放置在無(wú)菌1.5 mL微量離心管中并使用PureLink Quick Gel Extraction Kit (Cat No. K210012; Life Technologies, Foster City, CA)按照制造商的說(shuō)明經(jīng)受DNA純化。使用NanoDrop ND 1000 (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE)經(jīng)分光光度法測(cè)定標(biāo)有條碼的DNA文庫(kù)的濃度和純度值。對(duì)于乳液PCR推薦的文庫(kù)輸入為~140-560 x 10⁶分子/18 μl。該范圍通過(guò)使用文庫(kù)原液和無(wú)核酸酶水1:1000稀釋達(dá)到。

乳液聚合酶鏈反應(yīng)(emPCR) 乳液聚合酶鏈反應(yīng)使用Ion Template Preparation Kit (Cat No. 4469000; Life Technologies, Foster City, CA)通過(guò)加入582 μl無(wú)核酸酶水、200 μl 5X PCR試劑混合物、100 μl 10X PCR酶混合物、100 μ離子球顆粒（Ion Sphare Particles）和18 μl稀釋的文庫(kù)模板在1 mL反應(yīng)體積中進(jìn)行。充分混合制備物接著在微量離心機(jī)中短暫離心。乳液使用Ultra-Turrax Tube Drive (Life Technologies, Foster City, CA)獲得。向Ion Template Preparation Tube (Cat No. 4467226, Life Technologies, Foster City, CA)中加入總共9 mL冷凍的Emulsion Oil(Ion Torrent Preparation Kit; Cat No. 4469000, Life Technologies, Foster City, CA)。將乳液管放置和鎖定在IKA Ultra-Turrax Tube Drive上并開(kāi)始。當(dāng)管處于運(yùn)動(dòng)中（in motion）時(shí)，整個(gè)1 mL PCR預(yù)混溶液(master mix)分配入帽口(cap port)并混合5分鐘。將混合的乳液轉(zhuǎn)移至96-孔PCR板并使用ABI 2720熱循環(huán)儀(Life Technologies, Foster City, CA)使用下列熱循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增：94℃ 6分鐘，接著94℃ 30秒，58℃ 30秒和72℃ 90秒，40個(gè)循環(huán)；接著94℃ 30秒和68℃ 6分鐘，5個(gè)循環(huán)。

離子球顆粒(ISP)回收和Qubit測(cè)量 使用Ion Xpress Template Kit (Cat No. 4469001, Life Technologies, Foster City, CA)中提供的試劑按照制造商的方案(Ion Xpress Template Kit用戶指南v2.0, 18-19頁(yè))回收離子球顆粒。回收顆粒的定量使用Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies, Foster City, CA)和Ion Sphere Quality Control Kit (Cat No. 4468656, Life Technologies, Foster City, CA)按照制造商的推薦(Ion Xpress Template Kit用戶指南，25-26頁(yè))進(jìn)行。模板-陽(yáng)性離子球顆粒(ISPs)的最佳量在4-50%之間。所獲得的在此范圍之外的相對(duì)熒光單位(RFU)值不繼續(xù)（persued）隨后的ISP富集。

ISP富集 ISPs使用Ion Xpress Template Kit、Ion Sequencing Kit和DynaBeads MyOne Streptavidin C1小珠(分別為Cat Nos. 4469001、4468997和650.01; Life Technologies, Foster City, CA)中提供的試劑按照制造商的方案(Ion Xpress Template Kit用戶指南v2.0，15-17頁(yè))富集。

離子激流314芯片制備和PGM測(cè)序 離子激流314芯片(Cat No. 4462923; Life Technologies, Foster City, CA)按照制造商的推薦(Ion Sequencing Kit用戶指南v 2.0)制備和裝載。離子激流PGM按照離子激流314芯片說(shuō)明書(shū)運(yùn)行，其包括65-循環(huán)測(cè)序方案，使用18兆歐姆純化水和標(biāo)準(zhǔn)壓縮氬氣驅(qū)動(dòng)穿過(guò)PGM系統(tǒng)的應(yīng)用流體學(xué)（fluidics）。所有的rpoB、 katG、 pncA、 gyrA和rrs基因以及相應(yīng)的蛋白質(zhì)均存放入Genbank中(登錄號(hào)JX303203-JX303332)。

用于檢測(cè)TB的旋轉(zhuǎn)酶PCR vs. 6110 PCR測(cè)定在離子激流PGM上測(cè)序整個(gè)旋轉(zhuǎn)酶基因和針對(duì)OCR的旋轉(zhuǎn)酶靶（the gyrase target for OCR）也可用于鑒定導(dǎo)致抗性的TB突變。該第二個(gè)PCR靶允許準(zhǔn)確分析可能不包含整個(gè)IS6110插入元件的TB菌株。盡管IS6110測(cè)定在多數(shù)菌株中具有多個(gè)基因拷貝，但一些僅具有一個(gè)。如圖6、7和8中所顯示的，與IS6110測(cè)定相比該旋轉(zhuǎn)酶測(cè)定具有普遍更高的循環(huán)閾值，這是由于在那些分離物中有多個(gè)IS6110基因拷貝，并因此更靈敏。因此通過(guò)該全基因測(cè)序的方法可追蹤任何可能的TB突變—甚至遠(yuǎn)離檢測(cè)位點(diǎn)的TB突變。

表型和基因型結(jié)果 通過(guò)rpoB、 katG、 pncA、 gyrA和rrs (16s)基因的離子激流測(cè)序?qū)?6個(gè)結(jié)核分枝桿菌分離物的氨基酸表征分別在表1-5中概述，并與BACTEC? MGIT? 960 (表型)和/或HAIN GenoType? MTBDRplus (基因型) LPA比較。通過(guò)BACTEC? MGIT? 960表型分析，在26個(gè)MTB臨床分離物中，14個(gè)(54%)為MDR，7個(gè)(27%)為XDR，5個(gè)(19%)對(duì)藥物敏感。離子激流PGM測(cè)序方法顯示與通過(guò)MGIT? 960培養(yǎng)獲得的表型抗性(表1-5)和通過(guò)Hain LPA獲得的基因型rpoB和katG數(shù)據(jù)(表1，2)二者100% (26/26)一致。

rpoB基因突變 與H37Rv野生型菌株相比，在26個(gè)臨床分離物中共鑒定了10個(gè)rpoB氨基酸置換。常見(jiàn)的S531L突變是最流行的，但觀察到了也已知賦予對(duì)利福平的抗性的密碼子516和526中的突變(表1)。另外，在rpoB的開(kāi)放閱讀框中但在81-堿基對(duì)的利福平抗性-決定區(qū)(RRDR; 表1)之外觀察到突變。在一個(gè)菌株中RRDR之外觀察到的V194I突變?yōu)橐粋€(gè)可能與利福平抗性不相關(guān)的獨(dú)特置換。在至少一個(gè)菌株中在rpoB蛋白質(zhì)的殘基位置900以外記錄了5個(gè)氨基酸置換。存在7個(gè)其中根據(jù)LPA野生型帶不存在也沒(méi)有相應(yīng)突變帶的具有rpoB突變(6個(gè)在516位，1個(gè)在526位)的菌株。在這7個(gè)分離物的6個(gè)中，離子激流測(cè)序在516位處的已知突變位點(diǎn)中顯示一個(gè)不常見(jiàn)的氨基酸置換(即，甘氨酸)，在此處通常已知發(fā)生纈氨酸(V)置換(D516V) (表2)。相似地，在一個(gè)分離物中離子激流測(cè)序在526位處的已知突變位點(diǎn)中顯示精氨酸(R)，在此處通常發(fā)生酪氨酸(Y)或天冬氨酸(D)置換(H526Y/D)。

katG基因突變 在katG基因中觀察到4個(gè)氨基酸置換，所有抗性菌株中存在已知賦予異煙肼抗性的S315T(表2)。通過(guò)DST檢測(cè)到內(nèi)含R463L、W191R和N138H突變的臨床菌株(表2)，并且先前已經(jīng)表征。katG中463位處的置換(R463L)先前顯示對(duì)抗生素抗性無(wú)作用并且可用于將結(jié)核分枝桿菌分離物分類(lèi)為遺傳群1 (Arg463)或2/3 (Leu463)。所評(píng)估的26個(gè)臨床分離物中，7個(gè)(27%)為遺傳群1的成員，如該R463L置換所證明的。

pncA基因突變 在包含pncA基因全長(zhǎng)編碼區(qū)域的561 bps之中在至少一個(gè)菌株中記錄了7個(gè)核苷酸突變(表3)。26個(gè)菌株中的9個(gè)(34.6%)包含賦予吡嗪酰胺抗性的氨基酸突變(表3)。在一個(gè)菌株中，在核苷酸195位處表征了一個(gè)沉默(同義)核苷酸突變(C195T)。5個(gè)菌株包含先前表征的已知賦予對(duì)吡嗪酰胺的抗性的氨基酸置換(C14R、A102V、V139G、R154G和L172P)。在一個(gè)分離物中在pncA蛋白質(zhì)的殘基122處發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼終止密碼子的新的突變(Q122終止)(表3)，其先前未在別處報(bào)道過(guò)。

gyrA基因突變 在編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶亞基A的2,517 bp全長(zhǎng)gyrA基因中觀察到9個(gè)獨(dú)特突變。僅在通過(guò)gyrA中密碼子88、90和94處的置換定義的喹諾酮抗性決定區(qū)(QRDR)中包含突變的菌株中記錄了對(duì)氟喹諾酮(FQ)的抗性。在QRDR之外的區(qū)域還觀察到許多額外的突變，包括在gyrA蛋白的549和613位處的兩個(gè)“混合菌株”突變(表4)。已知95位的突變(S95T)對(duì)FQ抗性無(wú)作用，但可用于將菌株分類(lèi)為遺傳群2或3。在屬于遺傳群2/3的總計(jì)19個(gè)臨床分離物中，根據(jù)對(duì)gyrA 95位的評(píng)估(T = 遺傳群2，S = 遺傳群3)，18個(gè)(96%)為群2，1個(gè)(4%)為群3。

rrs(16s)基因突變 在包含全長(zhǎng)16s rrs基因的1,540 bps之中記錄了4個(gè)核苷酸突變。通過(guò)DST，26個(gè)中的7個(gè)(27%)臨床分離物顯示耐受氨基糖苷類(lèi)，并且所有的菌株含有已知賦予抗性的A1401G突變(表5)。觀察到兩個(gè)其它的氨基酸突變(C492T和A514C)，但先前已經(jīng)顯示不抑制氨基糖苷功效。觀察到一個(gè)先前未表征的G878A核苷酸突變，但根據(jù)DST該分離物顯示為敏感的(表5)。

兆堿基測(cè)序 離子激流基因芯片測(cè)序在甲型流感病毒的完整基因組上于五種不同條件下實(shí)施，在圖9中作為路線(Tracks)鑒定。將甲型流感菌株H3N2的全病毒核酸(約14.4 kb總RNA)按如上文所討論制備，僅反轉(zhuǎn)錄或反轉(zhuǎn)錄并PCR擴(kuò)增，如圖9中所示。流感病毒基因組通過(guò)反轉(zhuǎn)錄(RT)來(lái)質(zhì)量擴(kuò)增（mass amplified）并且某些經(jīng)擴(kuò)增的cDNA群經(jīng)受PCR。然后使用離子激流測(cè)序方案分析每一結(jié)果。RT和/或RT-PCR分析用均質(zhì)的六聚體、Uni 12和/或24不同流感-特異性引物(長(zhǎng)度和序列二者都不同)進(jìn)行。均質(zhì)的六聚體包括每一長(zhǎng)6個(gè)核苷酸的引物的集合，借此該集合包括六個(gè)核苷酸的所有序列重復(fù)。Uni 12為包含與流感H3N2病毒基因組每一段的3′末端的12個(gè)核苷酸互補(bǔ)的序列的引物(5′-ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG; SEQ ID NO 13)。如圖9中所顯示的，路線4用六聚體引物和Uni 12擴(kuò)增和測(cè)序接著用24流感-特異性引物PCR擴(kuò)增，離子激流方案測(cè)序鑒定約70%的流感基因組。

進(jìn)行了額外的實(shí)驗(yàn)以實(shí)現(xiàn)完整流感基因組的一步測(cè)序。開(kāi)發(fā)了一系列流感-特異性引物，對(duì)于PCR反應(yīng)其將會(huì)允許實(shí)施統(tǒng)一的條件。開(kāi)發(fā)的引物在圖10中列出。這些引物全部對(duì)流感病毒基因組特異，引物對(duì)沿基因組以約每800-1,000堿基對(duì)長(zhǎng)間隔(參見(jiàn)圖10，擴(kuò)增子長(zhǎng)度以及引物放置和序列的起始和終止位置)。所有引物長(zhǎng)度相似，約18-23個(gè)核苷酸并且含有相似的GC含量，約22.7%-38.9%，幾乎約33% ±6%并且大部分約33% ±3%。PCR分析使用這些引物的不同集合進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物使用離子激流測(cè)序方案鑒定。

pncA基因的測(cè)序 使用根據(jù)本發(fā)明沿pncA基因間隔或“平鋪”的一系列引物測(cè)定用于PZA抗性的pncA的基因序列并與用傳統(tǒng)Sanger測(cè)序取得的結(jié)果比較。圖11A中描繪了pncA基因的編碼序列，使用的引物在圖11B中以粗體和下劃線描繪。使用這些引物與離子激流方法學(xué)協(xié)同，測(cè)定了pncA的整個(gè)編碼區(qū)域(參見(jiàn)圖11B的P1-P4)。將使用的引物擴(kuò)展至所有基因或特定區(qū)域允許一步測(cè)序整個(gè)基因組。所取得的令人驚訝的結(jié)果鑒定了2或11個(gè)混合菌株(異質(zhì))群案例，其包含野生型和突變體二者，這通過(guò)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序?qū)?huì)遺漏。通過(guò)根據(jù)本發(fā)明方法的離子激流推斷的MTB臨床分離物的pncA中的氨基酸突變的概要在表7中示出并且可與顯示用Sanger測(cè)序取得的結(jié)果的表8比較。

如表7與表8的比較所示，WC2601/2顯示T135突變，通過(guò)Sanger測(cè)序無(wú)相應(yīng)突變。該突變?yōu)楫愘|(zhì)的，61%的細(xì)胞包含突變，29%為野生型。用ML1440/2，鑒定到S59P突變，通過(guò)Sanger測(cè)序無(wú)相應(yīng)突變。該突變?yōu)楫愘|(zhì)的，95%包含突變，5%野生型。

藥物抗性基因直接從患者痰樣品的快速表征 本發(fā)明方法致力于對(duì)從獲自，例如，偏遠(yuǎn)地區(qū)的患者痰樣品的藥物抗性基因進(jìn)行快速表征的需求。該方法包括收集以分析分別賦予對(duì)一線藥物，利福平和吡嗪酰胺的抗性的MTB rpoB和pncA基因。該方法學(xué)采用在PrimeStore Molecular Transport Medium (MTM)中環(huán)境溫度運(yùn)輸痰、直接從痰提取核酸、基因擴(kuò)增和測(cè)序用于MTB藥物抗性表征。

在南非農(nóng)村痰樣品作為MTB診斷的大型前瞻性分析的一部分收集(南非Mopani的患者)。對(duì)于分子檢驗(yàn)，將植絨拭子(Copan Diagnostics, Brescia, Italy)浸沒(méi)在痰中并渦旋最少5次，然后轉(zhuǎn)移至1.5 mL分子轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)，PrimeStore MTM? (PS-MTM)中。PS-MTM是為安全起見(jiàn)滅活包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的微生物以及保存和穩(wěn)定釋放的RNA/DNA、室溫運(yùn)輸?shù)呐R床轉(zhuǎn)運(yùn)溶液。將包含痰的PS-MTM管使用商業(yè)貨架（commercial carrier）室溫全部從南非運(yùn)輸至德克薩斯州圣安東尼奧的裝備齊全的機(jī)構(gòu)里。

使用PrimeXtract kit (Longhorn Vaccines and Diagnostics, San Antonio, TX, USA)按照制造商的推薦純化總基因組DNA。MTB的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增使用PrimeMix TB? (PM-PCR)，一種靶向高度保守的MTB IS6110區(qū)域的包含所有的試劑混合物，來(lái)進(jìn)行。

使用用于pncA和rpoB的MTB引物的PCR擴(kuò)增如先前所描述的進(jìn)行。用于rpoB (1,625 bps)和pncA (960 bps)的引物分別擴(kuò)增包含全部ropB決定區(qū)和啟動(dòng)子加pncA基因的全部編碼區(qū)的基因的一部分。對(duì)于NGS文庫(kù)制備，使用Nextera XT Sample Prep Kit制備pncA和rpoB基因擴(kuò)增子。MiSeq NGS按照制造商的說(shuō)明(Illumina, San Diego, CA, USA)使用MiSeq Reagent Kit (V3)以600循環(huán)進(jìn)行。生物信息學(xué)使用SeqMan NGen (V8)和LaserGene (V12) Core Suite (DNAStar, Inc, USA)與H37Rv參考菌株遺傳比較進(jìn)行。

在選擇用于rpoB和pncA NGS的22個(gè)樣本中，17個(gè)(77.3%)產(chǎn)生完整的DNA序列(表9)。由于部分基因測(cè)序、序列質(zhì)量差或低覆蓋深度(即，低于10X)略去總計(jì)5個(gè)樣品。產(chǎn)生全部序列的樣本具有23.5-37.4范圍內(nèi)的PCR實(shí)時(shí)值，多數(shù)具有小于30的CT值。從原始樣品獲得優(yōu)質(zhì)NGS的成功取決于提取期間回收的MTB的濃度。在進(jìn)行MTB抗性基因的終點(diǎn)擴(kuò)增之前使用定性實(shí)時(shí)PCR測(cè)定可預(yù)測(cè)NGS成功。在三個(gè)樣本中NGS未產(chǎn)生合適的數(shù)據(jù)，最有可能是因?yàn)檩^長(zhǎng)的1625 bp rpoB PCR擴(kuò)增子的無(wú)效擴(kuò)增(表9)。

表9

來(lái)自所選擇的通過(guò)Primemix MTB實(shí)時(shí)PCR檢驗(yàn)陽(yáng)性的患者痰的MTB rpoB和pncA基因的離子激流測(cè)序* (N-22)

在與通過(guò)Xpert測(cè)定的那些相關(guān)的rpoB基因序列中發(fā)現(xiàn)抗性突變。根據(jù)rpoB基因NGS表征，三個(gè)樣本在rpoB決定區(qū)的526位包含經(jīng)典抗性突變。有趣地，兩個(gè)樣本包含H-526-Y并且一個(gè)包含H-526-D突變(表9)。在一個(gè)樣本(患者89)中觀察到先前已經(jīng)顯示為非-抗性賦予突變的V-194-I置換。在一個(gè)樣本的rpoB中記錄了同義沉默突變，即，C-309-T。與H37RV參考菌株相比，發(fā)現(xiàn)來(lái)自所有菌株的pncA基因序列均為野生型(表9)，除了在一個(gè)樣本中有一個(gè)新的R-2-P突變。該突變是否賦予對(duì)吡嗪酰胺的抗性尚不清楚，因?yàn)槠渫ㄟ^(guò)Xpert或MGIT培養(yǎng)未檢測(cè)到，對(duì)于該樣本無(wú)藥物抗性數(shù)據(jù)可用。衍生該樣本的患者存在持續(xù)咳嗽和體重減輕。使用實(shí)時(shí)PCR對(duì)該患者的跟進(jìn)檢驗(yàn)（follow up testing）為低陽(yáng)性(CT= 36.1)但Xpert和MGIT培養(yǎng)為陰性。

用靈敏的實(shí)時(shí)PCR改善MTB檢測(cè)然后迅速測(cè)序抗性基因的能力為資源匱乏區(qū)域提供了另一個(gè)機(jī)會(huì)。由于PS-MTM迅速殺死MTB并在環(huán)境溫度及以上保存DNA，可有效地轉(zhuǎn)運(yùn)樣本用于實(shí)時(shí)PCR和測(cè)序以提高藥物抗性菌株的檢測(cè)和優(yōu)化患者治療。先前的研究已經(jīng)顯示測(cè)序來(lái)自從具有MDR和XDR的國(guó)家來(lái)到美國(guó)的患者的MDR菌株以鑒定已知的和新的抗性突變的益處。NGS的一個(gè)額外的優(yōu)點(diǎn)為覆蓋深度提供檢測(cè)一個(gè)以上的群，即，患者樣本中的異質(zhì)抗性的能力。異質(zhì)抗性表征對(duì)于患者護(hù)理為重要的，特別是如果耐受如這些的關(guān)鍵抗生素的MTB亞群成為占優(yōu)勢(shì)的患者菌株。本實(shí)施例還證明了將痰樣本有效轉(zhuǎn)運(yùn)至中心和地方實(shí)驗(yàn)室以提供對(duì)農(nóng)村臨床的支持的可行性。不添加額外的培訓(xùn)工作人員或基礎(chǔ)設(shè)施，來(lái)自農(nóng)村區(qū)域的患者痰樣本可轉(zhuǎn)運(yùn)至具有訓(xùn)練有素的人員和現(xiàn)有技術(shù)水平裝備的實(shí)驗(yàn)室以支持MTB患者護(hù)理監(jiān)督和研究。

結(jié)核分枝桿菌(MTB)藥物抗性的表征對(duì)結(jié)核病(TB)的適當(dāng)治療至關(guān)重要。分子檢測(cè)和下一代測(cè)序(NGS)迅速提供新的工具以診斷和改善藥物抗性TB的治療。當(dāng)我們致力于治療和根除TB時(shí)，理解在迅速改變的抗性模式中流行病學(xué)和流動(dòng)人口的作用，特別是在非洲農(nóng)村環(huán)境中，為重要的。在該簡(jiǎn)報(bào)中，使用NGS表征直接從自南非農(nóng)村收集并在PrimeStore^? MTM (PS-MTM)中室溫轉(zhuǎn)運(yùn)至德克薩斯的痰的MTB rpoB和pncA藥物抗性基因。這些基因分別賦予對(duì)一線藥物，利福平和吡嗪酰胺的抗性。本工作意義深長(zhǎng)，因?yàn)榘哔|(zhì)量DNA的穩(wěn)定樣本使得能夠直接從痰快速、集中處理。

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