背景技術(shù)：

已知β-葡聚糖是幾種微生物(尤其是真菌和酵母)細(xì)胞壁中非常保守的成分。

大量密切相關(guān)的β-葡聚糖顯示相似的分枝模式，如裂褶菌素、小核菌聚糖、pendulan、cinerian、昆布多糖、蘑菇多糖和pleuran，它們?nèi)硷@示β-D-(1-3)-吡喃葡糖基(glucopyranosyl)單位的線(xiàn)性主鏈，單個(gè)β-D-吡喃葡糖基單位(1-6)連接至線(xiàn)性主鏈的β-D-吡喃葡糖基單位，平均分枝度為約0.3。

WO 2014/006088涉及能夠產(chǎn)生聚合物的遺傳修飾微生物，該聚合物由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基單位的線(xiàn)性主鏈組成，具有(1-6)連接至線(xiàn)性主鏈的β-D-吡喃葡糖基單位的單個(gè)β-D-吡喃葡糖基單位，平均分枝度為約0.3，其特征在于，與對(duì)應(yīng)的同一菌株的未修飾對(duì)照微生物相比，該遺傳修飾微生物過(guò)量表達(dá)(i)編碼具有1,3-β-D-葡聚糖合酶活性的多核苷酸和/或(ii)具有1,3-β-D-葡聚糖合酶活性的多肽。

WO 2010/123350涉及超過(guò)200種多肽的表達(dá)水平提高或降低的真菌或蘑菇。在實(shí)施例4中，描述了hom2基因敲除，其產(chǎn)生徑向菌落生長(zhǎng)而無(wú)蘑菇形成的表型。

發(fā)明詳述

在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生聚合物的方法，該聚合物由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基單位的線(xiàn)性主鏈組成，具有(1-6)連接至線(xiàn)性主鏈的β-D-吡喃葡糖基單位的單個(gè)β-D-吡喃葡糖基單位，平均分枝度為約0.3， 該方法包括步驟：

(i)在允許遺傳修飾微生物產(chǎn)生聚合物的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生該聚合物的該微生物，該聚合物由β-D-(1-3)-吡喃葡糖基單位的線(xiàn)性主鏈組成，具有(1-6)連接至線(xiàn)性主鏈的β-D-吡喃葡糖基單位的單個(gè)β-D-吡喃葡糖基單位，平均分枝度為約0.3，其中與同一菌株的未修飾對(duì)照微生物相比，該修飾賦予降低的hom2基因產(chǎn)物活性；

(ii)可選地從該培養(yǎng)基回收該聚合物。

hom2基因產(chǎn)物是由hom2基因編碼的同源域蛋白。Ohm等2010,Genome sequence of the model mushroom Schizophyllum commune,Nature Biotechnology 28:957-963中描述了hom2基因產(chǎn)物的優(yōu)選多肽序列(蛋白質(zhì)ID 257987)，其在SEQ ID NO:3中公開(kāi)。

另一優(yōu)選的hom2基因產(chǎn)物在SEQID NO:4中公開(kāi)。

BLAST檢索結(jié)果一般包含同源域蛋白。除同源框外具有同源序列的實(shí)例可見(jiàn)于灰蓋鬼傘(Coprinopsis cinerea)、雙色蠟?zāi)?Laccaria bicolor)、褐腐菌(Postia placenta)、干朽菌(Serpula lacrymans)、Phanerochaete carnosa、雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)中。

具有賦予降低的hom2基因產(chǎn)物活性的修飾的遺傳修飾微生物應(yīng)指通過(guò)內(nèi)源或外源因子處理以最終降低對(duì)應(yīng)的基因產(chǎn)物活性的微生物。

這可能在不同水平進(jìn)行，例如在DNA水平、在RNA水平和在蛋白質(zhì)水平。

在DNA水平，可以通過(guò)在微生物基因組中部分或完全缺失hom2基因來(lái)達(dá)到降低對(duì)應(yīng)的基因產(chǎn)物活性。如果不存在hom2基因的其他等位基因或拷貝，則hom2的完全缺失(也稱(chēng)為敲除)可以導(dǎo)致hom2基因產(chǎn)物在該微生物中完全消失。在雙核體中，完全缺失指兩個(gè)核中hom2基因的雙敲除?？梢酝ㄟ^(guò)僅缺失hom2基因的片段(部分)或通過(guò)在攜帶其他hom2基因的基因組中僅缺失一個(gè)等位基因或拷貝來(lái)達(dá)到hom2基因的部分缺失。如果僅缺失hom2基因的片段，則取決于缺失片段的位置和/或長(zhǎng)度，可能保持hom2基因產(chǎn)物的殘余活性。但是，也可能通過(guò)部分缺失導(dǎo)致hom2基 因產(chǎn)物活性的完全消失，例如通過(guò)缺失導(dǎo)致翻譯過(guò)程中移碼的單個(gè)堿基對(duì)。

在RNA水平，也可能通過(guò)RNA干擾(RNAi)減少基因表達(dá)，可以通過(guò)其來(lái)抑制hom2基因的基因表達(dá)。這可以通過(guò)構(gòu)建micro RNA(miRNA)或小干擾RNA(siRNA)來(lái)達(dá)到，其結(jié)合從hom2基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，并抑制或破壞此mRNA。

在RNA水平，也可能通過(guò)使用遺傳元件來(lái)減少基因表達(dá)，如弱或瞬時(shí)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子和其他調(diào)節(jié)元件替換強(qiáng)或永久啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子和其他調(diào)節(jié)元件，其允許該基因的基因表達(dá)更低或僅瞬時(shí)表達(dá)。

另一種可能性是去穩(wěn)定化各基因產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物，以實(shí)現(xiàn)每單位時(shí)間內(nèi)可用于翻譯的轉(zhuǎn)錄物數(shù)目的降低。

在蛋白質(zhì)方面干擾的另一種可能性是基因的密碼子選擇。如果使用具有該微生物中的稀有密碼子的密碼子選擇，則與未修飾微生物相比，產(chǎn)生更低的翻譯速率，導(dǎo)致活性蛋白質(zhì)減少。

在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾微生物”應(yīng)以廣義理解；不僅“基因”和“遺傳元件”(如啟動(dòng)子)為術(shù)語(yǔ)“遺傳修飾微生物”所涵蓋，通過(guò)使用緊密結(jié)合操縱子從而失活基因表達(dá)的分子(阻遏物)來(lái)阻遏基因調(diào)節(jié)也理解為本發(fā)明的遺傳修飾微生物。

Hom2基因產(chǎn)物活性的降低是與未修飾微生物相比。這是指，除實(shí)現(xiàn)hom2基因產(chǎn)物活性降低的測(cè)量外，兩種微生物(修飾和未修飾)都具有相同的遺傳背景，且應(yīng)在相同的生理?xiàng)l件下處理。例如，在裂褶菌(S.commune)中敲除hom2基因的情況下，未修飾參考生物應(yīng)是除hom2基因敲除外具有相同的遺傳背景且在與敲除生物相同的條件下處理的裂褶菌生物。

適合用作本發(fā)明的遺傳修飾的起始生物的微生物的非限制性實(shí)例是以下屬的微生物：裂褶菌屬(Schizophyllum)，尤其是裂褶菌(Schizophyllum commune)；菌核屬(Sclerotium)，尤其是齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)、Sclerotium glucanicum、翠雀小核菌(Sclerotium delphinii)；小盤(pán)孔菌屬(Porodisculus)，尤其是懸垂小盤(pán)孔菌(Porodisculus pendulus)；葡萄孢屬(Botrytis)，尤其是灰葡萄孢(Botrytis cinerea)；昆布屬(Laminaria)，尤其是 昆布屬物種(Laminaria sp.)；Lentinula，尤其是Lentinula edoles；及鏈核盤(pán)菌屬(Monilinia)，尤其是果生鏈核盤(pán)菌(Monilinia fructigena)。

用于本發(fā)明方法的優(yōu)選微生物是可從公共保藏中心獲得的裂褶菌，例如：

DSM-1024、DSM-1025、DSM-1026、DSM-11223；

編號(hào)204191、編號(hào)MYA-2104、編號(hào)26890、編號(hào)26892、編號(hào)62873、編號(hào)38229；

編號(hào)32746、編號(hào)MYA-4819、編號(hào)52396；

編號(hào)MYA-1128、編號(hào)42093、編號(hào)18246；

編號(hào)MYA-1124、編號(hào)38230、編號(hào)26889；

編號(hào)26262、編號(hào)52398、編號(hào)MYA-1123。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于通過(guò)培養(yǎng)上文公開(kāi)的任意遺傳修飾微生物來(lái)產(chǎn)生上文公開(kāi)的聚合物的方法。

本發(fā)明的遺傳修飾微生物可以通過(guò)已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，如描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning–A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989)或Current Protocols in Molecular Biology 1-3卷,John Wiley&Sons,Inc.(1994-1998))中的重組DNA技術(shù)。用于構(gòu)建遺傳修飾微生物的其他實(shí)例在實(shí)驗(yàn)部分中公開(kāi)。

用于培養(yǎng)微生物的方法如發(fā)酵方法為本領(lǐng)域已知，且還在本文中描述和示例(Kumari,Bioresource Technol(2008),99:1036-1043；Reyes,J Natural Studies(2009),7(2),1月-6月)。在本發(fā)明的背景中，這類(lèi)方法允許各微生物生長(zhǎng)，并產(chǎn)生本文所描述和示例的希望得到的β-葡聚糖。適宜的培養(yǎng)基可以包括例如Reyes,上文中所述的椰子水。此外，如本領(lǐng)域已知，存在幾種尤其適合用于具體微生物的培養(yǎng)基。

例如，同樣在本發(fā)明的背景中，適合用于培養(yǎng)裂褶菌的培養(yǎng)基包括CYM培養(yǎng)基(每升水25g瓊脂(Difco)、20g葡萄糖(Sigma)、2g胰化酪蛋白胨(trypticase peptone，Roth)、2g酵母提取物(Difco)、0.5g MgSO₄ x 7 H₂O(Roth)、0.5g KH₂PO₄和1g K₂HPO₄(都來(lái)自Riedel-de))(尤其用于固體支持物上的培養(yǎng))，或也在本文中描述和示例的每升水包含30g葡萄糖(Sigma)、3g酵母提取物(Difco)、1g KH₂PO₄(Riedel-de)、0.5g MgSO₄ x 7H₂O(Roth)的培養(yǎng)基(尤其用于液體培養(yǎng)物)。

在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)“平均分枝度約0.3”可以指10個(gè)β-D-(1-3)-吡喃葡糖基單位中平均約有3個(gè)(1-6)鏈接至單個(gè)β-D-吡喃葡糖基單位。在此背景中，術(shù)語(yǔ)“約”可以指平均分枝度可以在0.1至0.5的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.2至0.4，更優(yōu)選0.25至0.35，更優(yōu)選0.25至0.33，更優(yōu)選0.27至0.33，最優(yōu)選0.3至0.33。它還可以是0.3或0.33。裂褶菌素、小核菌聚糖、pendulan、cinerian、昆布多糖、蘑菇多糖和pleuran全都具有0.25至0.33之間的平均分枝度；例如，小核菌聚糖和裂褶菌素具有0.3至0.33的平均分枝度(Survase,上文；Novak,上文)。β-葡聚糖的平均分枝度可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定，例如通過(guò)定期氧化分析、甲基化糖分析和NMR(Brigand,Industrial Gums,Academic Press,New York/USA(1993),461-472)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，要產(chǎn)生的聚合物選自裂褶菌素、小核菌聚糖、pendulan、cinerian、昆布多糖、蘑菇多糖和pleuran。例如，該聚合物可以是褶菌多糖或小核菌聚糖，尤其是裂褶菌素。

從發(fā)酵產(chǎn)物回收聚合物可以通過(guò)生物技術(shù)中已知的許多常規(guī)技術(shù)如沉淀和離心來(lái)進(jìn)行。

用于制備β-葡聚糖的方法包括培養(yǎng)和發(fā)酵能夠合成這類(lèi)生物聚合物的微生物。例如，EP 271 907 A2、EP 504 673 A1和DE 40 12 238 A1公開(kāi)了制備方法，即通過(guò)伴隨攪拌和通氣分批發(fā)酵真菌裂褶菌來(lái)實(shí)現(xiàn)制備。培養(yǎng)基主要包含葡萄糖、酵母提取物、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水。EP 271 907 A2描述了用于分離多糖的方法，其中首先離心培養(yǎng)物懸液，并用異丙醇從上清沉淀多糖。第二種方法包括加壓過(guò)濾后超濾所獲得的溶液，方法詳情未公開(kāi)?！癠do Rau,“Biosynthese,Produktion und Eigenschaften von Pilz-Glucanen”,Habilitationsschrift,Technical University of Brunswick,1997,70至95頁(yè)”和"Udo Rau,Biopolymers,Editor A.Steinbüchel,6卷,63至79頁(yè),WILEY-VCH Publishers,New York,2002"描述了通過(guò)連續(xù)或分批發(fā)酵制備裂褶菌素。“GIT Fachzeitung Labor 12/92,1233-1238頁(yè)”描述了用細(xì)胞再循環(huán)制備分枝的β-1,3-葡聚糖。WO 03/016545 A2公開(kāi)了用齊整小核菌制備小核菌聚糖的連續(xù)方法。

此外，出于經(jīng)濟(jì)原因，β-葡聚糖水溶液的濃度應(yīng)盡可能高，以確保用于將葡聚糖水溶液從生產(chǎn)地點(diǎn)運(yùn)輸至使用地點(diǎn)的運(yùn)輸工作(effect)盡可能小。為了此目的，通常在運(yùn)輸前通過(guò)干燥、冷凍干燥和/或沉淀來(lái)濃縮β-葡聚糖溶液，以減小其重量。

與對(duì)應(yīng)的未修飾對(duì)照微生物相比，本發(fā)明的遺傳修飾微生物能夠產(chǎn)生至少1.5倍、更優(yōu)選至少多1.8倍、更優(yōu)選至少多2.0倍和最優(yōu)選至少多2.2倍的β-葡聚糖聚合物。在此背景中，產(chǎn)生例如“多”1.5倍的β-葡聚糖聚合物可以指，與對(duì)應(yīng)的未修飾對(duì)照微生物在相同條件下在相同時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的β-葡聚糖聚合物的量相比，遺傳修飾微生物產(chǎn)生的β-葡聚糖聚合物的量高1.5倍。備選地，產(chǎn)生例如“多”1.5倍的β-葡聚糖聚合物可以指，遺傳修飾微生物在相同條件下產(chǎn)生與對(duì)應(yīng)的未修飾對(duì)照生物相同量的β-葡聚糖聚合物，但快1.5倍。產(chǎn)生的β-葡聚糖聚合物的量可以通過(guò)本領(lǐng)域已知且還在本文中描述的方法來(lái)測(cè)量。

實(shí)驗(yàn)部分

表1.所用菌株

用于實(shí)施例1的菌株和培養(yǎng)條件

雙核裂褶菌菌株(表1)從點(diǎn)接種起在基本培養(yǎng)基(MM)瓊脂(1.5％)平板上25℃避光培養(yǎng)7天(Dons JJM等(1979).Characterization of the genome of the basidiomycete Schizophyllum commune.Biochimica et Biophysica Acta 563:100-112.)。在韋林?jǐn)嚽衅髦性?0ml液體MM中全速勻漿1/4個(gè)菌落30秒。在250ml錐形瓶中25℃和200轉(zhuǎn)/分鐘避光孵育50ml勻漿。24小時(shí)后，勻漿預(yù)培養(yǎng)物(參見(jiàn)上文)，并將2ml離心。棄上清，測(cè)定沉淀的濕重。據(jù)此，計(jì)算包含0.2g濕重菌絲體的勻漿體積。使用MM和250ml錐形瓶，用此體積接種100ml液體震蕩培養(yǎng)物。培養(yǎng)物按一式三份或甚至更多重復(fù)在25℃和200轉(zhuǎn)/分鐘避光培養(yǎng)。

用于實(shí)施例2的菌株和培養(yǎng)條件

雙核菌株H4-8和Δhom2Δhom2從點(diǎn)接種起在MM瓊脂平板上避光培養(yǎng)7天。從這些菌落的中央?yún)^(qū)帶切下2×3cm²的小片。盡可能多地去除瓊脂，用T 25數(shù)字ULTRA-TURRAX(IKA)按6,000轉(zhuǎn)/分鐘在15ml DHSV培養(yǎng)基(33g l^-1一水合葡萄糖、0.5g l^-1 MgSO₄·7H₂O、0.9g l^-1 KH₂PO₄、0.1g l^-1 K₂HPO₄、0.5g l^-1檸檬酸、50g l^-1尿素、pH 5.8。在這其中補(bǔ)充孢子元素：20mg l^-1 FeSO₄·7H₂O、50mg l^-1 Titriplex III(Merck Millipore)、1mg l^-1 ZnSO₄·7H₂O、0.3mg l^-1 MnSO₄·4H₂O、3mg l^-1 H₃BO₃、2mg l^-1CoCl₂·6H₂O、0.1mg l^-1 CuCl₂·2H₂O、0.2mg l^-1 NiCl₂·6H₂O、0.3mg l^-1Na₂MoO₄·2H₂O；及維生素：0.0105mg l^-1生物素、0.0045mg l^-1葉酸、2.31mg l^-14-氨基苯甲酸、0.18mg l^-1核黃素、0.825mg l^-1泛酸鈣、1.8mg l^-1煙酰胺、0.135mg l^-1鹽酸吡哆醇、4.2mg l^-1肌醇、1.605mg l^-1鹽酸硫胺素)中勻漿菌絲體1分鐘。用2.5ml勻漿接種每個(gè)菌株的2瓶50ml預(yù)培養(yǎng)物。為此，在100ml錐形瓶中加入50ml DHSV培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在30℃和180轉(zhuǎn)/分鐘避光培養(yǎng)72小時(shí)。將培養(yǎng)物9,935g離心10分鐘，混合每個(gè)菌株的沉淀。收集上清，按上文所述測(cè)量葡萄糖和葡聚糖。在25ml DHSV中再次勻漿混合的沉淀(參見(jiàn)上文)。使用100ml錐形瓶，用2.5ml勻漿接種50ml DHSV培養(yǎng)物。培養(yǎng)物按一式三份在30℃和180轉(zhuǎn)/分鐘避光培養(yǎng)3、8或10天。

用于實(shí)施例1的培養(yǎng)基的黏度

通過(guò)5,000g離心10分鐘或在Miracloth上過(guò)濾來(lái)收集培養(yǎng)基。加入甲酸(4g l^-1終濃度)以穩(wěn)定培養(yǎng)基，并測(cè)量黏度。為此，用培養(yǎng)基裝滿(mǎn)在其噴嘴處附著Greiner Bio One藍(lán)吸頭(1000μl)的10ml BD Plastipak注射器。用8ml流體流出注射器(培養(yǎng)基的上部水平從10ml標(biāo)記位置至2ml標(biāo)記位置)所耗費(fèi)的時(shí)間作為黏度的測(cè)量。此方法與HAAKE Rheostress 1 Rotational Rheometer 1(Thermo Fischer)測(cè)量結(jié)果相關(guān)。測(cè)量結(jié)果以超過(guò)0.95的皮爾遜相關(guān)系數(shù)相關(guān)。

實(shí)施例1和/或2的葡聚糖、尿素、乙醇和生物量測(cè)量

為了測(cè)定SPG產(chǎn)生，將10ml培養(yǎng)物吸入50ml離心管(Falcon tube)，用3g l^-1ACTICIDE BW20(Thor)穩(wěn)定，并用10ml l^-1來(lái)自繩狀青霉NS(Penicillium funiculosum NS)的Submers β-葡聚糖酶在40℃處理24小時(shí)。3,400g離心30分鐘后，以5mM H₂SO₄(Roth)作為洗脫液，按0.5ml/分鐘流速在30℃運(yùn)行，用HPLC陽(yáng)離子交換(Aminex HPX-87H,Bio-Rad)測(cè)量上清中的乙醇和葡萄糖濃度。培養(yǎng)基中的尿素濃度也通過(guò)HPLC測(cè)量。為此，用水作為洗脫液，按1ml/分鐘流速在70℃運(yùn)行，使用100×7.8mm(Biorad)快速糖柱。

為了測(cè)定培養(yǎng)物中產(chǎn)生的生物量，將3,400g離心30分鐘(參見(jiàn)上文)后獲得的沉淀重懸在30ml H₂O中，并劇烈震蕩。3,400g離心30分鐘后，再次通過(guò)震蕩將沉淀懸浮在30ml H₂O中，并放置在Whatman濾紙上，用50ml水漂洗兩次，然后真空干燥。用Mettler Toledo HB43-S鹵素水分分析儀進(jìn)一步干燥并稱(chēng)重樣品?？鄢秊V紙的重量(在將菌絲體放置在濾紙上之前測(cè)定)。

實(shí)施例1

在10天的培養(yǎng)期期間測(cè)量野生型H4-8×H4-8b雙核體及其衍生的Δhom2Δhom2菌株的液體震蕩培養(yǎng)物的黏度。如分別通過(guò)培養(yǎng)基流出注射器的流速降低(圖1)及通過(guò)旋轉(zhuǎn)流變儀1(圖2)所顯示，從第5天和第6天起，與野生型相比，Δhom2Δhom2菌株的培養(yǎng)基的黏度更高。培養(yǎng)基的黏 度與通過(guò)葡聚糖分析獲得的SPG產(chǎn)生相關(guān)。為此，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行葡聚糖酶降解，并通過(guò)HPLC分析定量所產(chǎn)生的葡萄糖(圖3)。分別在培養(yǎng)Δhom2Δhom2菌株和野生型菌株8天和10天后檢測(cè)葡聚糖酶活性的葡萄糖釋放。10天后，Δhom2Δhom2菌株中的葡萄糖水平高5倍。概括而言，如通過(guò)黏度和葡聚糖酶實(shí)驗(yàn)所顯示，Δhom2Δhom2菌株產(chǎn)生更多的SPG。

還測(cè)量了ΔWC2ΔWC2和Δfst4Δfst4菌株及兩個(gè)補(bǔ)償Δhom2Δhom2菌株的培養(yǎng)基的黏度(圖4、5)。全部四個(gè)菌株的培養(yǎng)基的黏度與野生型菌株培養(yǎng)基的黏度沒(méi)有顯著不同。概括而言，這些數(shù)據(jù)確認(rèn)，Hom2的缺乏增加裂褶菌素產(chǎn)生。相反，雖然有這些菌株像Δhom2Δhom2菌株一樣不能產(chǎn)生子實(shí)體的事實(shí)，但Fst4和WC2的缺乏不影響SPG產(chǎn)生。

實(shí)施例2

定量Δhom2Δhom2和野生型裂褶菌雙核體的3、8和10天培養(yǎng)物中的黏度、葡聚糖、葡萄糖(作為碳源加入)、尿素、乙醇和生物量(圖6、7和8)。如通過(guò)流變儀所測(cè)量，在第8和10天，Δhom2Δhom2菌株的培養(yǎng)基比野生型的培養(yǎng)基更黏(圖6)。培養(yǎng)10天后，與野生型菌株相比，Δhom2Δhom2菌株中通過(guò)葡聚糖釋放的葡萄糖的量顯著更高(圖7)。Δhom2Δhom2菌株在第8天時(shí)顯示更少的乙醇產(chǎn)生(與野生型有2倍差異)，且此代謝物在10天后甚至缺乏(圖8)。相反，野生型在第8-10天具有超過(guò)2倍量的乙醇(圖8)。在第10天，在Δhom2Δhom2雙核體的情況下葡萄糖和尿素完全消耗，但野生型的情況并非這樣(圖8)。與野生型相比，Δhom2Δhom2菌株中每生物量的SPG的產(chǎn)率高20％(圖9)。但是，Δhom2Δhom2菌株產(chǎn)生每葡萄糖比野生型多3.7倍的SPG。我們得出結(jié)論，與親本相比，在產(chǎn)生SPG中，裂褶菌Δhom2雙核體更優(yōu)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.通過(guò)通過(guò)注射器的流速測(cè)量的裂褶菌的野生型和Δhom2Δhom2雙核體的液體震蕩培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的黏度。

圖2.裂褶菌的野生型和Δhom2Δhom2雙核體的液體震蕩培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的黏度(mPa·s)。使用與圖1中相同的樣品，用流變儀測(cè)量黏度。

圖3.來(lái)自裂褶菌的野生型和Δhom2Δhom2雙核體的液體培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的葡聚糖分析。通過(guò)測(cè)量源自葡聚糖酶處理的葡萄糖釋放來(lái)定量葡聚糖。樣品與圖1和2的樣品相同。

圖4.雙核野生型菌株H4-8×H4-8b及雙核敲除菌株Δhom2Δhom2、ΔWC2ΔWC2和Δfst4Δfst4的10天液體培養(yǎng)物中每克生物量的SPG產(chǎn)生。

圖5.雙核野生型菌株H4-8×H4-8b、雙核敲除菌株Δhom2Δhom2及在親本核之一中再引入hom2的兩個(gè)補(bǔ)償Δhom2Δhom2菌株的10天液體培養(yǎng)物中每克生物量的SPG產(chǎn)生。

圖6.裂褶菌的野生型和Δhom2Δhom2雙核體的液體震蕩培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的黏度(mPa·s)。用流變儀測(cè)量黏度。

圖7.來(lái)自裂褶菌的野生型和Δhom2Δhom2雙核體的液體培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的葡聚糖分析。通過(guò)測(cè)量源自葡聚糖酶處理的葡萄糖釋放來(lái)定量葡聚糖。樣品與圖6的樣品取自相同的培養(yǎng)物。

圖8.裂褶菌的野生型和Δhom2Δhom2雙核體的液體震蕩培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中的葡萄糖、尿素和乙醇水平。樣品與圖6的樣品相同。

圖9.裂褶菌的雙核野生型菌株及其衍生的Δhom2Δhom2菌株的每生物量(克/克)和每葡萄糖(克/克)的SPG產(chǎn)率。

SEQ ID NO:1是用于實(shí)驗(yàn)部分的來(lái)自裂褶菌的hom2基因的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:2是與SEQ ID NO:1中公開(kāi)的序列略有不同的來(lái)自裂褶菌的hom2基因的多核苷酸序列。

SEQ ID NO:3是從SEQ ID NO:1翻譯的來(lái)自裂褶菌的hom2基因的多肽序列。

SEQ ID NO:4是從SEQ ID NO:2翻譯的來(lái)自裂褶菌的hom2基因的多肽序列。

參考文獻(xiàn)

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