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本申請(qǐng)要求2013年12月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/919,391的權(quán)益，并將其全文以引用的方式納入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用針對(duì)α-烯醇化酶的特異性抗體治療多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和相關(guān)的免疫疾病，包括慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、過敏、牛皮癬、1型糖尿病和骨質(zhì)疏松。

多發(fā)性硬化(MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎性疾病。多發(fā)性硬化中，神經(jīng)纖維的髓鞘被破壞，即神經(jīng)纖維被自身抗體脫髓鞘。多發(fā)性硬化的癥狀相對(duì)地為非特異性的，例如疲勞的復(fù)發(fā)與減輕，麻木，步態(tài)及協(xié)調(diào)問題，腸/膀胱功能障礙，認(rèn)知功能障礙及疼痛。迄今為止，對(duì)病因及病理生理所知有限，有可能是遺傳背景、維生素D缺乏和地理環(huán)境造成。MS的流行率隨地理位置不同而不同。世界上西歐和北美的發(fā)病率最高；在美國(guó)，每100000人中有100例有癥狀的MS患者，在英格蘭該比例為118/100000。日本和臺(tái)灣的發(fā)病率分別為8.57/10000和1.9/100000(Amino,MJ.等，(2009)紐約：麥格勞希爾醫(yī)學(xué)(McGraw Hill Medical.)，第848-911頁；Tsai,C-P.等，(2004)，中國(guó)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)(Chinese Med.Assoc.)，67:500-505)。MS的發(fā)病機(jī)理中也涉及到遺傳背景。如果家族成員患有MS，則其親戚患MS的風(fēng)險(xiǎn)與他們與該病患之間的遺傳相似性成正比。在環(huán)境因素中，已證實(shí)維生素D和EB病毒感染是與MS相關(guān)的因素。最近提出臺(tái)灣的MS中有皰疹病毒V和VI型的參與。最早的對(duì)MS病理學(xué)的理解中，認(rèn)為髓磷脂特異性CD4+T淋巴細(xì)胞從血液遷移至大腦中，結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞(包括大腦中小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)呈遞的抗原性肽，無限繁殖，攻擊并損傷少突細(xì)胞，破壞髓磷脂。最近的假說提出，髓磷脂CD+4T細(xì)胞僅參與MS的早期。CNS中MCP-1誘導(dǎo)的循環(huán)中的單核細(xì)胞負(fù)責(zé)疾病進(jìn)展的中后期。趨化因子受體CCR2(其配體為MCP-1)缺陷小鼠耐受實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)。用不同量的來自EAE誘導(dǎo)的CCRC2⁺小鼠的單核細(xì)胞輸給CCRC2敲除小鼠時(shí)，受體小鼠的臨床分值與所輸入的來自供體EAE小鼠的單核細(xì)胞的量成正比。此結(jié)果表明單核細(xì)胞對(duì)EAE疾病進(jìn)展非常重要。

迄今為止，還未發(fā)現(xiàn)令人滿意的對(duì)多發(fā)性硬化的治療。美國(guó)FDA批準(zhǔn)了8種藥物，用于治療MS患者。利比(Rebif)、干擾素β-1a粉針劑Avonex、干擾素β-1b(betaferon)和重組干擾素β-1b(Extavia)是不同類別的β干擾素，它們都是免疫調(diào)節(jié)劑?？伺了?Copaxon)是髓磷脂類似物，作為Th1CD4+抗原的誘餌受體起作用。芬戈莫德(Gilenya)是鞘氨醇1-磷酸鹽(S1P-1)受體調(diào)節(jié)劑，結(jié)構(gòu)與鞘氨醇非常接近。芬戈莫德在淋巴細(xì)胞S1P中作為功能性拮抗劑起作用，其免疫調(diào)節(jié)作用可能是抑制抗原特異性T細(xì)胞從淋巴結(jié)中流出。那他珠單抗(Tysabri)是一種抗胞外基質(zhì)受體整聯(lián)蛋白(α4β1)的單克隆抗體，對(duì)白細(xì)胞遷移相當(dāng)重要。拉喹莫德是NFκB介導(dǎo)的炎癥通路的抑制劑，其效應(yīng)細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突細(xì)胞。Tecfidera(富馬酸二甲酯BG12)是Nrf2轉(zhuǎn)錄通路抑制劑，其阻止免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，阻止上皮細(xì)胞表達(dá)CD 62E。米托蒽醌是蒽二酮(anthracenedion)的類似物，對(duì)活化的免疫細(xì)胞有毒性。雖然這些藥物中有一些非常有效，但這些藥物僅使該疾病急性期的頻率和強(qiáng)度降低。它們總是有些副作用，例如β干擾素相關(guān)的藥物導(dǎo)致的感染，和那他珠單抗導(dǎo)致的進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是影響到患者關(guān)節(jié)的慢性炎性疾病。RA的癥狀包括關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、僵硬和變形?；颊咄ǔ?huì)感到發(fā)熱和疲勞。RA的病因尚未完全理解。該疾病起源于針對(duì)患者結(jié)締組織的自身抗體，接著發(fā)生白細(xì)胞(包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)的浸潤(rùn)。然后，淋巴細(xì)胞腐蝕和侵襲關(guān)節(jié)的骨頭和軟組織。傳統(tǒng)的RA治療藥物被稱為抗風(fēng)濕藥，包括如甲氨蝶呤和來氟米特。有時(shí)使用類固醇類藥物。最近，可給予更有效的生物制劑，如Remicade^TM和Humira^TM，它們是TNF-α的抗體，或TNF-α的誘餌受體恩利(Enbrel)，或IL-1的受體拮抗劑Anakinra^TM。雖然這些藥物有效，但存在副作用，例如感染和發(fā)熱。此外，在許多病例中仍無法令人滿意地治療該疾病及避免對(duì)關(guān)節(jié)的損傷，這甚至?xí)?dǎo)致關(guān)節(jié)固定。

在兩種疾病(MS和RA)中，文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)表明，血液中的炎性單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞參與到兩種免疫疾病的發(fā)展。

α-烯醇化酶(烯醇化酶-1，ENO1)是一種多功能蛋白，最初發(fā)現(xiàn)是糖酵解通路中的一個(gè)關(guān)鍵的酶。在正常條件下，ENO1表達(dá)在細(xì)胞溶質(zhì)中。但是，文獻(xiàn)中的最新數(shù)據(jù)也支持，ENO1可表達(dá)在許多癌細(xì)胞和活化的造血細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的細(xì)胞表面上，作為血纖維蛋白溶酶原的受體。已知血纖維蛋白溶酶原受體蛋白的上調(diào)可誘導(dǎo)尿激酶血纖維蛋白溶酶原活化信號(hào)(uPAS)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并導(dǎo)致胞外基質(zhì)降解。結(jié)果導(dǎo)致癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)增加。使用如LPS進(jìn)行的炎性刺激，會(huì)通過翻譯后修飾和移位至細(xì)胞表面而上調(diào)人血液?jiǎn)魏思?xì)胞和U937單核細(xì)胞的細(xì)胞表面上ENO1的表達(dá)。

據(jù)信ENO1的移位受到MAP激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。這意味著細(xì)胞表面上ENO1表達(dá)的增加可能在炎癥疾病中起到重要作用。已在不同自身免疫和炎性疾病中發(fā)現(xiàn)抗ENO1的自身抗體，包括紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化、白塞氏病、潰瘍和克羅恩病。Saulot等(Arthritis Aheum.,46:1196-1201(2002))和Wkui等(Clin.Exp.Immunol.,118:445-450(1999))的研究表明，25-66％的RA患者的血清中抗ENO1抗體的水平升高。Bae的研究(J.Immunology,189:365-372(2013))表明，當(dāng)用抗ENO1抗體處理RA患者的PBMC以刺激ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性時(shí)，來自PBMC的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞經(jīng)由p38MAPK和NF-κB通路產(chǎn)生較大量的促炎介體，如TNFα、IL1-α/β、IFN-γ和PGE2。該研究表明，ENO1通過其血纖維蛋白溶酶原受體活性增加單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的侵襲活性而在RA患者的疾病進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用。

總之，其細(xì)胞表面上作為血纖維蛋白溶酶原受體的ENO1的表達(dá)上調(diào)的單核細(xì)胞對(duì)于MS、RA以及相關(guān)的免疫疾病的疾病進(jìn)展是非常重要的。因此，靶向單核細(xì)胞細(xì)胞表面上的ENO1對(duì)治療炎性疾病如MS、RA、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、和系統(tǒng)性紅斑狼瘡或相關(guān)的免疫疾病，如慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、過敏、牛皮癬、1型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松，具有良好的潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的實(shí)施方案涉及炎性疾病或免疫疾病如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或相關(guān)的免疫疾病，如慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、過敏、牛皮癬、1型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松的新療法。

根據(jù)本發(fā)明的任一實(shí)施方案，治療炎性疾病或免疫疾病的方法可包括給予有需要的對(duì)象抗ENO1的拮抗劑，其中，該拮抗劑結(jié)合ENO1并抑制ENO1的血纖維蛋白溶酶原受體活性。根據(jù)本發(fā)明的任一實(shí)施方案，該拮抗劑可以是抗ENO1抗體，或其scFv、Fab或F(ab)₂片段。此外，根據(jù)本發(fā)明的任一實(shí)施方案，所述方法可進(jìn)一步包括給予該對(duì)象免疫調(diào)節(jié)劑。免疫調(diào)節(jié)劑的例子是富馬酸二甲酯。

根據(jù)本發(fā)明的任一實(shí)施方案，治療炎性疾病或免疫疾病的方法可使用含可特異性結(jié)合ENO1血纖維蛋白溶酶原受體的抗體的藥劑來實(shí)現(xiàn)，用以治療對(duì)象的多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或相關(guān)的免疫疾病，以及使用所述抗體制備分別用于治療對(duì)象的多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或相關(guān)的免疫疾病的藥劑。

根據(jù)本發(fā)明的任一實(shí)施方案，抗體或其scFv、Fab或F(ab)₂片段可結(jié)合人ENO1上的表位并抑制ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性，其中所述表位可位于由人ENO1的²⁹⁶FDQDDWGAWQKFTASAGIQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKS³³⁶(SEQ ID NO:39)序列組成的區(qū)域中。根據(jù)本發(fā)明的任一實(shí)施方案，所述抗體或其scFv、Fab或F(ab)₂片段可結(jié)合人ENO1上的表位并抑制ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性，其中所述表位可位于由人ENO1的²⁹⁶FDQDDWGA WQKFTA³⁰⁹(SEQ ID NO:40)或³²⁶KRIAKAVNEKS³³⁶(SEQ ID NO:41)序列組成的區(qū)域中。

如上文所述，Bae的研究(J.Immunology,189:365-372(2013))表明，當(dāng)用抗ENO1抗體處理RA患者的PBMC時(shí)，ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性被刺激，來自PBMC的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞將經(jīng)由p38MAPK和NF-κB通路產(chǎn)生較大量的促炎介體，如TNFα、IL1-α/β、IFN-γ和PGE2。與此觀察相反，本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)給予抗ENO1抗體可實(shí)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床改善。即，發(fā)現(xiàn)給予針對(duì)的表位不同于Bae等選用的抗體表位的抗ENO1活性的抗體可實(shí)現(xiàn)炎性疾病或免疫疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的臨床改善。同樣地，發(fā)現(xiàn)也可實(shí)現(xiàn)多發(fā)性硬化的臨床改善。這些觀察結(jié)果表明并非每一種ENO1抗體對(duì)免疫疾病都具有治療效果，這種效果是表位依賴性的。

此外，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物模型中，不僅可在疾病發(fā)生之初即可進(jìn)行治療，而且在疾病已存在明顯的臨床癥狀時(shí)也可進(jìn)行治療。這使得人類臨床實(shí)踐中所需的在相對(duì)晚期進(jìn)行的治療干預(yù)得以進(jìn)行。

本領(lǐng)域已知人ENO1血纖維蛋白溶酶原受體(見美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的網(wǎng)頁，GenBank：AAH50642.1)。該受體是血纖維蛋白溶酶原受體，在人中具有兩個(gè)不同剪切變體，ENO1和Myc結(jié)合蛋白。ENO1也已知為人ENO1、α～-烯醇化酶或ENO-1基因。

還已知來自幾種其它物種的ENO1的相應(yīng)直系同源物，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易確定這些同源物，例如基于人ENO1進(jìn)行序列檢索。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，術(shù)語“ENO1”指人和動(dòng)物(如寵物或牲畜)ENO1蛋白。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“抗體”應(yīng)廣義理解，包括多克隆抗體、單克隆抗體和重組產(chǎn)生的抗體，包括雙特異性抗體及其片段，如Fv、Fab和F(ab)₂片段，其中所述Fv可以是單鏈抗體。優(yōu)選的是，抗體是IgG同種型中的一種。優(yōu)選的是，抗體不被對(duì)象的免疫系統(tǒng)排斥，或僅低程度排斥。這可通過如將抗體識(shí)別抗原(如ENO1蛋白，為血纖維蛋白溶酶原受體)時(shí)不需要的某些區(qū)域(如Fc區(qū))轉(zhuǎn)變成衍生自該對(duì)象所屬物種的抗體序列的序列而實(shí)現(xiàn)。例如，所謂的人源化抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的，特別適合用于人。本發(fā)明的上下文所用的術(shù)語“抗體”也意圖包括修飾的抗體，如雙特異性抗體(參見，例如Kontermann,R.E.(編)(2011)，《雙特異性抗體》(Bispecific antibodies)，斯普林格海德堡多德雷赫特倫敦紐約出版社)，雙體(diabodies)，以及所謂的結(jié)合劑或適體，可采用例如肽骨架或核酸骨架如RNA制備得到這些抗體。優(yōu)選的，本文的抗體的分子量低于600kDa，更優(yōu)選低于300kDa，更優(yōu)選低于200kDa，最優(yōu)選約150kDa。本文所用抗體還可包括嵌合抗體、人抗體、親和力成熟抗體(已進(jìn)行突變以優(yōu)化其結(jié)合(親和力)的抗體)?？贵w還可與藥物偶聯(lián)，形成抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)。形成抗體和藥物偶聯(lián)物的方法為本領(lǐng)域所周知，例如包括使用高碘酸鈉氧化抗體上的碳水化合物，形成醛，然后使其與藥物或連接于藥物的接頭上的胺官能團(tuán)反應(yīng)。

制備合適的多克隆抗體、單克隆抗體和重組抗體，包括結(jié)合劑和適體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的，例如，參見Jorg Knablein編的《現(xiàn)代生物制藥學(xué)》(Modern Biopharmaceuticals)第2卷第635頁，以及下文所述的實(shí)施例。例如，可通過注射ENO1蛋白進(jìn)行免疫。通過使用相應(yīng)的分子(抗原)篩選雜交瘤上清，也可鑒定到合適的抗體。鑒定后，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法制備抗體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，抗ENO1抗體可以是EN10mAb或7E5mAb，或其scFv、Fab或F(ab)₂片段?？笶NO1抗體EN10mAb和7E5mAb可結(jié)合血纖維蛋白溶酶原受體ENO1。優(yōu)選的是，該抗體結(jié)合的解離常數(shù)Kd為10^-7M或以下，更優(yōu)選為10^-8M或以下，更優(yōu)選為10^-9M或以下，最優(yōu)選為10^-10M或以下。優(yōu)選的是，結(jié)合是特異性的。本發(fā)明的特異性結(jié)合指在生理?xiàng)l件下(即，例如在生理鹽水中，在細(xì)胞培養(yǎng)物中或在體內(nèi)，優(yōu)選在相應(yīng)個(gè)體的血液或組織中)，該抗體與ENO1的親和力至少是其與其它蛋白質(zhì)尤其是類似的蛋白質(zhì)(如Annexin 2，Histone 2B，CK8或其它血纖維蛋白溶酶原受體)的親和力的10倍，優(yōu)選至少20倍，更優(yōu)選至少50倍，最優(yōu)選至少100倍。但是，與其它蛋白的結(jié)合也是可以接受的，只要該結(jié)合不干擾該抗體的治療效果。但是，也可能與來自其它物種的直系同源的ENO1血纖維蛋白溶酶原受體具有交叉反應(yīng)性，且為了使該抗體在幾個(gè)物種中使用，這種交叉反應(yīng)性可能是有利的。這種交叉反應(yīng)性很常見，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知如何測(cè)定這種交叉反應(yīng)性。關(guān)于此方面的更詳細(xì)內(nèi)容也可參見實(shí)施例。

優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案使用的抗體可抑制ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性?？扇菀椎臏y(cè)定抗體是否抑制ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性。例如，抗體可經(jīng)由LPS-誘導(dǎo)細(xì)胞(如U937細(xì)胞)表達(dá)的ENO1血纖維蛋白溶酶受體與ENO1的反應(yīng)而降低血纖維蛋白溶酶蛋白酶活性。示例性的檢測(cè)在下文實(shí)施例中進(jìn)行描述。

此外，可通過細(xì)胞(如U937)中出現(xiàn)的LPS和MCP-1誘導(dǎo)的侵襲活性的抑制來測(cè)定ENO1血纖維蛋白溶酶受體活性的抑制。下文實(shí)施例描述了示例性的檢測(cè)。

適合或可模擬修飾抗體的起始點(diǎn)的抗體例子包括單克隆抗體EN10mAb和7E5mAb?？贵wEN10mAb和7E5mAb的生產(chǎn)以及它們的特征在下文實(shí)施例中描述。

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的藥物可含有抗體EN10mAb和7E5mAb。此外，藥物可含有本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為可接受的任何類型的佐劑。這類佐劑可以是例如載體物質(zhì)，如淀粉、乳糖、脂肪、硬脂酸、乙醇、生理鹽水溶液或其它添加劑。具體而言，可穩(wěn)定抗體和保持其活性的佐劑是有利的。本發(fā)明實(shí)施方案的藥物還可含有具有偶聯(lián)于該抗體的其它治療分子(即抗體-藥物偶聯(lián)物，ADC)的抗體。制備ADC的方法為本領(lǐng)域所知。

可以任何已知的方法給予藥物，將藥物中所含的抗體EN10mAb和7E5mAb體外或體內(nèi)遞送到靶細(xì)胞，如特定的單核細(xì)胞。例如，可通過如靜脈內(nèi)(i.v.)、皮下(s.c.)或腹膜內(nèi)(i.p.)以溶液、懸液或輸注液(infusion)的形式注射給予藥物。但是，也可采用其它給藥形式，例如以微膠囊的形式或植入物的形式給予。優(yōu)選地，給予藥物的方式應(yīng)使得抗體能進(jìn)入循環(huán)中，或進(jìn)入各個(gè)靶標(biāo)區(qū)域。還可直接給予至靶標(biāo)區(qū)域，例如，對(duì)于多發(fā)性硬化，可直接給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)(如腦脊液)；對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，可直接給予到受影響的關(guān)節(jié)；對(duì)于炎性腸病，可直接給予至小腸；對(duì)于SLE，可直接給予到腎，或?qū)τ谄渌仔约膊?，可直接給予到相應(yīng)的器官。

多發(fā)性硬化(MS)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，且已在前文描述。術(shù)語治療也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在本發(fā)明中，治療涉及引起對(duì)象疾病或病癥臨床改善的任何種類的干預(yù)，所述疾病或病癥如多發(fā)性硬化癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩病，潰瘍性結(jié)腸炎，或系統(tǒng)性紅斑狼瘡或免疫疾病。臨床上的改善，例如對(duì)于多發(fā)性硬化癥而言，可通過測(cè)量神經(jīng)功能缺損的減少(例如，麻痹)來確定。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，可通過如癥狀如腫脹，發(fā)炎或疼痛的減少來確認(rèn)臨床癥狀的改善。優(yōu)選地，改善表現(xiàn)為臨床癥狀的減輕，例如，根據(jù)實(shí)施例，臨床癥狀的減輕對(duì)應(yīng)于EAE計(jì)值至少0.25個(gè)單位，優(yōu)選0.5個(gè)單位，更優(yōu)選至少0.75單位，更優(yōu)選至少1.0個(gè)單位，或最優(yōu)選至少1.3個(gè)單位的改善。優(yōu)選地，改進(jìn)為臨床癥狀的減輕，例如，根據(jù)實(shí)施例，對(duì)應(yīng)于關(guān)節(jié)炎計(jì)值至少0.25個(gè)單位，優(yōu)選至少0.5個(gè)單位，更優(yōu)選至少1.0單位，更優(yōu)選至少2.0單位，或最優(yōu)選至少3.0個(gè)單位的改善。

評(píng)估人臨床上的改善的許多參數(shù)如用于多發(fā)性硬化的臨床評(píng)分(Avnir,Y.等，2011，PLoS ONE，6:1-13)已為人熟知。另外，治療尤其可以涉及難以治療的多發(fā)性硬化癥和/或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，對(duì)于這類疾病，迄今已知的藥物均不能達(dá)成臨床上的改善。相當(dāng)數(shù)量對(duì)象的病程中，使用已知藥物已無法改善臨床癥狀。此外，治療可涉及患有所述個(gè)別疾病的對(duì)象，其中，給予該對(duì)象迄今已知的治療方法導(dǎo)致不需要的副作用達(dá)不可接受的程度。治療還可涉及已為晚期的個(gè)別疾病。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，對(duì)象可以是脊椎動(dòng)物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物可以是嚙齒動(dòng)物(如小鼠、大鼠或兔)，豬，狗，貓或靈長(zhǎng)類動(dòng)物。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)類動(dòng)物，如獼猴、普通狨猴或人。尤其優(yōu)選的是，對(duì)象是人。

通常，測(cè)定給予的藥物的有效劑量。術(shù)語“有效劑量”以及該有效劑量的確定為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可經(jīng)由本文提供的信息來測(cè)定有效劑量。當(dāng)給予某劑量引起所治療疾病具有臨床改善時(shí)，該劑量應(yīng)理解為有效。尤其是，在本發(fā)明中，使對(duì)象的多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病，潰瘍性結(jié)腸炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡或免疫疾病的癥狀減輕的藥物劑量應(yīng)理解為有效劑量。有效劑量是例如這樣的劑量，當(dāng)選用該劑量時(shí)，外周血中表達(dá)ENO1的單核細(xì)胞其至少20％、優(yōu)選至少30％、更優(yōu)選至少40％、最優(yōu)選至少50％的侵襲活性被抑制。

優(yōu)選地，選擇藥物的有效劑量，使其與能提供滿足治療多發(fā)性硬化癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩病，潰瘍性結(jié)腸炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡或免疫疾病的最低劑量相似?？赏ㄟ^持續(xù)增加測(cè)試系列中的劑量直到所需藥效與不利副作用達(dá)到一定比例來確定特別合適的有效劑量。在本發(fā)明中，這種情況可以是，例如，進(jìn)一步增加劑量未能再在臨床上改善所治療的疾病(甚至加重)，和/或不利副作用相對(duì)于療效不再是可接受的。

此外，本發(fā)明涉及含有能抑制多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或免疫疾病對(duì)象的單核細(xì)胞的侵襲活性的抗體的藥物，以及所述抗體在制備用于治療對(duì)象的多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或免疫疾病的藥物中的用途。

顯而易見的是，本發(fā)明所有優(yōu)選實(shí)施方案及其變化以及本說明書所描述的定義也涉及所有前述藥物及對(duì)應(yīng)方式的用途。

在本發(fā)明中，已發(fā)現(xiàn)給予能抑制血纖維蛋白溶酶受體ENO1的抗體能影響到表達(dá)ENO1的單核細(xì)胞的侵襲活性。

本發(fā)明者假設(shè)，經(jīng)由表達(dá)ENO1的炎性單核細(xì)胞的血纖維蛋白溶酶受體活性受損而優(yōu)先實(shí)現(xiàn)多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或免疫疾病的治療。

本發(fā)明中，表達(dá)ENO1的炎性單核細(xì)胞的血纖維蛋白溶酶受體活性的抑制應(yīng)理解為將導(dǎo)致該相應(yīng)單核細(xì)胞的侵襲活性受損。

通過涉及抗體可影響到血纖維蛋白溶酶受體活性的抑制機(jī)制。優(yōu)選地，通過使UPAS(尿激酶型纖溶酶原激活信號(hào))活性受損這一機(jī)制實(shí)現(xiàn)所述抑制。基于UPAS的抑制可經(jīng)由例如ENO1蛋白介導(dǎo)。ENO1抗體可阻止單核細(xì)胞向炎癥組織的遷移。

在本發(fā)明抗體的幫助下實(shí)現(xiàn)的侵襲活性的抑制可在不同物種中實(shí)現(xiàn)。例如，小鼠和人的單核細(xì)胞群是相似的。在小鼠中，血液?jiǎn)魏思?xì)胞可分為炎性單核細(xì)胞(CD11b+CCR2+GR1+CD62L+CX3CRl低)和非炎性單核細(xì)胞(CD11b+CCR2^-GR^l-CD62L^-CX3CRl高)(Geissmann F.等，2003，Immunity，19：71-82)。在人中，很久以前就已知有兩個(gè)單核細(xì)胞群，這兩個(gè)細(xì)胞群主要是通過其表面標(biāo)記物CD14和CD16的表達(dá)水平加以確定(Ziegler-Heitbrock H.W.等，2000，J.Leukoc.Biol.，67：603-6)。

本發(fā)明的實(shí)施方案涉及抑制單核細(xì)胞侵襲的方法，所述方法包括使單核細(xì)胞與能特異性結(jié)合血纖維蛋白溶酶受體ENO1的抗體接觸。優(yōu)選地，所述接觸在體內(nèi)或體外進(jìn)行。本文中，術(shù)語“體外”應(yīng)理解為最廣泛的可能形式。它涉及在活體外發(fā)生的任何事件，如在細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)或器官培養(yǎng)中的方法。尤其是，術(shù)語“體外”還可理解為包括涉及在對(duì)象身體之外的血液的治療的方法。

本發(fā)明還涉及對(duì)象多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、或系統(tǒng)性紅斑狼瘡或免疫疾病的治療方法。該方法包括給予能特異性結(jié)合血纖維蛋白溶酶受體ENO1的抗體的步驟。

本發(fā)明還涉及抑制對(duì)象特定單核細(xì)胞的侵襲活性的方法。該方法包括給予能特異性結(jié)合血纖維蛋白溶酶受體ENO1的抗體的步驟。

顯而易見的是，上述已呈述的本發(fā)明所有優(yōu)選實(shí)施方式及其變化以及定義也以相應(yīng)的方式涉及到前述方法。

附圖說明

圖1顯示分離自雜交瘤腹水的小鼠抗ENO1mAb與ENO1結(jié)合的ELISA結(jié)果。如實(shí)施例1所述進(jìn)行硫酸銨純化、蛋白A柱純化和SDS-PAGE純化。這些數(shù)據(jù)顯示抗人ENO1抗體EN10mAb的K_d。

圖2A、2B和2C顯示使用LPS處理人正常PBMC時(shí)CD11b+細(xì)胞表面上ENO1的表達(dá)結(jié)果。采用實(shí)施例2所述的方法，使用LPS誘導(dǎo)人正常PBMC的ENO1表達(dá)。圖1A顯示LPS誘導(dǎo)細(xì)胞表面上ENO1的表達(dá)，如FACS掃描中熒光細(xì)胞群的增加及向右偏移所證明。圖2B和2C的數(shù)據(jù)顯示，炎性PBMC的CD11b^高(圖2B)和Mac3^高(圖2C)細(xì)胞中ENO1上調(diào)。

圖3顯示分離自雜交瘤腹水的EN10mAb(抗ENO1抗體)對(duì)LPS誘導(dǎo)的U937纖維蛋白溶解活性的影響結(jié)果。如實(shí)施例3所述使用LPS誘導(dǎo)人U937單核細(xì)胞系上ENO1的表達(dá)并進(jìn)行血纖維蛋白溶酶活性測(cè)試。這些數(shù)據(jù)顯示EN10mAb可抑制單核細(xì)胞上的ENO1血纖維蛋白溶酶原受體功能。

圖4顯示使用LPS誘導(dǎo)ENO1在人U937單核細(xì)胞表面表達(dá)后經(jīng)不同濃度的EN10mAb處理的該細(xì)胞系的侵襲活性結(jié)果。詳細(xì)的過程如實(shí)施例4所述實(shí)施。這些數(shù)據(jù)顯示，EN10mAb以劑量依賴性的方式抑制U937細(xì)胞的侵襲活性。

圖5顯示EN10mAb識(shí)別經(jīng)LPS處理的人U937單核細(xì)胞上的細(xì)胞表面ENO1。詳細(xì)的過程如實(shí)施例5所述實(shí)施。

圖6A顯示ENO1缺失突變體的EN10mAb結(jié)合活性。EN10mAb的結(jié)合表位位于人ENO1蛋白氨基酸殘基297到434之間，因?yàn)榇似蔚娜笔Щ旧舷丝贵w結(jié)合。如實(shí)施例6所述使ENO1的大部分缺失，以測(cè)定EN10mAb的結(jié)合區(qū)域。

圖6B顯示純化自大腸桿菌的ENO1的6個(gè)C末端缺失突變體蛋白的12％SDS PAGE。純化所述ENO1缺失突變體的詳細(xì)方法如實(shí)施例6所述。

圖6C顯示ENO1的6個(gè)C末端缺失突變體的EN10mAb結(jié)合活性。EN10mAb的結(jié)合表位位于人ENO1蛋白的氨基酸殘基296和336之間。如實(shí)施例6所述使ENO1的大部分缺失，以測(cè)定EN10mAb的結(jié)合區(qū)域。

圖7A描述人ENO1氨基酸296-336之間的晶體結(jié)構(gòu)和表面暴露的氨基酸殘基。如實(shí)施例7所述進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

圖7B顯示純化自大腸桿菌的ENO1的11種丙氨酸掃描突變蛋白的12％SDS PAGE。純化ENO1突變蛋白的詳細(xì)過程如實(shí)施例7所述。

圖7C顯示11種丙氨酸掃描突變體抗EN10mAb的ENO1結(jié)合ELISA和Kd值。結(jié)果表明，位于人ENO1氨基酸殘基296到336之間的ENO1肽1(FDQDDWGAWQKFTA，SEQ ID NO:40)和肽2(KRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:41)序列參與了EN10mAb結(jié)合。如實(shí)施例7所述進(jìn)行丙氨酸掃描。

圖7D顯示人ENO1氨基酸殘基296到336之間的ENO1肽1(FDQDDWGAWQKFTA，SEQ ID NO：40)和肽2(KRIAKAVNEKS，SEQ ID NO：41)的序列，其參與到人ENO1與EN10mAb結(jié)合。

圖8A和8B顯示給予非傳染性炎癥小鼠模型EN10mAb中白細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制結(jié)果。詳細(xì)過程如實(shí)施例8所述。圖8A顯示EN10mAb對(duì)總腹膜細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響，圖8B顯示給予EN10mAb后對(duì)嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)無影響。

圖9顯示給予EN10mAb改善了多發(fā)性硬化動(dòng)物預(yù)防模型中實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的病程。詳細(xì)過程如實(shí)施例9所述實(shí)施。

圖10A顯示給予EN10mAb緩和了動(dòng)物治療模型中EAE多發(fā)性硬化的癥狀。詳細(xì)過程如實(shí)施例10所述實(shí)施。

圖10B顯示給予EN10mAb降低了動(dòng)物治療模型中EAE的CNS組織病理學(xué)分值。詳細(xì)過程如實(shí)施例10所述實(shí)施。

圖10C顯示給予EN10mAb改善了動(dòng)物治療模型中EAE的CNS脫髓鞘分值。詳細(xì)過程如實(shí)施例10所述實(shí)施。

圖10D顯示給予EN10mAb改善了動(dòng)物治療模型中EAE的CNS炎癥。詳細(xì)過程如實(shí)施例10所述實(shí)施。

圖11A顯示給予EN10mAb減輕了膠原蛋白抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎嚙齒動(dòng)物模型中關(guān)節(jié)炎的癥狀。詳細(xì)過程如實(shí)施例11所述實(shí)施。

圖11B顯示用EN10mAb處理下調(diào)了膠原蛋白抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎嚙齒動(dòng)物模型中滑液IL1-b。詳細(xì)過程如實(shí)施例11所述實(shí)施。

圖11C顯示用EN10mAb處理下調(diào)了膠原蛋白抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎嚙齒動(dòng)物模型中滑液MMP9。詳細(xì)過程如實(shí)施例11所述實(shí)施。

圖12A和12B顯示大鼠抗小鼠ENO1抗體雜交瘤的制備，以及通過結(jié)合性ELISA和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA驗(yàn)證各單克隆抗體克隆。來自ELISA實(shí)驗(yàn)的OD讀數(shù)顯示在各克隆之后。產(chǎn)生雜交瘤的過程以及產(chǎn)生各抗體并通過結(jié)合性ELISA和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA驗(yàn)證各抗體的過程如實(shí)施例12所述。數(shù)據(jù)顯示75個(gè)雜交瘤抗體中有5個(gè)可識(shí)別小鼠ENO1蛋白中EN10mAb的直系同源表位。

圖13顯示分離自各雜交瘤的上清的5種大鼠抗小鼠ENO1抗體與ENO1結(jié)合的ELISA結(jié)果。如實(shí)施例1所述進(jìn)行硫酸銨純化和蛋白A柱純化。這些數(shù)據(jù)顯示大鼠抗小鼠ENO1 7E5的Kd。

圖14A顯示給予大鼠抗小鼠ENO1抗體7E5減輕了動(dòng)物治療模型中EAE的多發(fā)性硬化癥狀。詳細(xì)過程如實(shí)施例14所述實(shí)施。

圖14B顯示給予大鼠抗小鼠ENO1抗體7E5降低了動(dòng)物治療模型中EAE的CNS組織病理學(xué)分值。詳細(xì)過程如實(shí)施例14所述實(shí)施。

圖14C顯示給予大鼠抗小鼠ENO1抗體7E5改善了動(dòng)物治療模型中EAE的CNS脫髓鞘分值。詳細(xì)過程如實(shí)施例14所述實(shí)施。

圖14D顯示給予大鼠抗小鼠ENO1抗體7E5減輕了動(dòng)物治療模型中EAE的CNS炎癥。詳細(xì)過程如實(shí)施例14所述實(shí)施。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的實(shí)施方案涉及治療各種ENO1相關(guān)的疾病或病癥的方法。ENO1相關(guān)的疾病或病癥可包括炎性疾病或免疫疾病。炎性疾病的例子包括多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。免疫疾病的例子包括慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、過敏、牛皮癬、1型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松。該方法使用能結(jié)合ENO1以抑制其作為血纖維蛋白溶酶原受體的功能的拮抗劑。通過該抑制，血纖維蛋白溶酶原活性被抑制，從而阻止或減少下游涉及血纖維蛋白溶酶活性的反應(yīng)?？笶NO1的拮抗劑可以是抗體，其可以是多克隆抗體，單克隆抗體或其它可結(jié)合ENO1并抑制ENO1活化血纖維蛋白溶酶原的功能的修飾抗體。

將結(jié)合下文所述的具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的實(shí)施。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，這些實(shí)施例僅僅是闡述性的，并不意圖限制，因?yàn)樵诓黄x本發(fā)明范圍的情況下可做出各種修改和變動(dòng)。

實(shí)施例

實(shí)施例1

為了評(píng)估抗人ENO1抗體EN10mAb對(duì)ENO1的結(jié)合親和力，在含10％胎牛血清(FCS)的RPMI中使雜交瘤生長(zhǎng)。培養(yǎng)一周后，收集1×10⁶個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌，重懸于200微升RPMI培養(yǎng)基中，并IP注射到重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中。三周后，收集小鼠腹水，稀釋到15ml。根據(jù)本領(lǐng)域周知方法，采用40％硫酸銨和蛋白A柱(Montage抗體純化試劑盒，密理博公司)進(jìn)一步純化抗體。根據(jù)制造商(密理博公司)提供的方案，用Amicon Ultra-15離心過濾裝置濃縮純化的抗體。采用12％SDS PAGE分析抗體純度。

將400ng的人ENO1蛋白包涂在96孔ELISA板上，進(jìn)一步用PBS洗滌該板。將1×10^-12到1×10^-8M的系列稀釋的EN10mAb抗體加到該板，然后37℃孵育1小時(shí)。加入偶聯(lián)有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的山羊抗小鼠IgG。1小時(shí)后，加入3,3′,5,5′-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯(TMB)，讀取OD405讀數(shù)。每個(gè)研究重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。使用Sigmaplot將OD讀數(shù)和抗體濃度制作多重分散曲線。由四個(gè)參數(shù)的邏輯擬合預(yù)測(cè)K_d值。

此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖1所示?？贵wEN10mAb的產(chǎn)率從每只小鼠20.4mg到4.6mg不等。EN10mAb抗體的Kd值為2.03±0.12×10^-10M(N＝3)。此結(jié)果表明，EN10mAb抗體可識(shí)別人ENO1蛋白，具有良好的親和力，其K_d值為約2.03±0.12×10^-10M(N＝3)。

實(shí)施例2

已知ENO1蛋白在小鼠炎性單核細(xì)胞中在體內(nèi)和體外情況下都上調(diào)(Wygrecka,M.等，2009，Blood，113：5588-5598)。為了評(píng)估人炎癥狀態(tài)下PBMC中的ENO1表達(dá)水平，遵照臺(tái)灣生物技術(shù)開發(fā)中心人體試驗(yàn)委員會(huì)通過許可，從正常的捐獻(xiàn)者采集新鮮血樣。使用Ficoll-Hypaque梯度離心處理血液，純化PBMC。將Ficoll-Hypaque(法瑪西亞公司，法國(guó))的密度調(diào)整為約1.077g/ml。使收獲的細(xì)胞在含10％胎牛血清的RPMI中生長(zhǎng)至細(xì)胞密度約為1×10⁶個(gè)細(xì)胞/毫升。使用臺(tái)盼藍(lán)染色液檢查細(xì)胞的存活力，以核實(shí)淋巴細(xì)胞的總％超過90％。使用10微克/毫升的脂多糖(LPS)進(jìn)一步處理PBMC六小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞2次，進(jìn)行流式細(xì)胞分析。用或未用EN10mAb(1：300的稀釋度)和大鼠抗人CD11b或Mac3抗體染色完整的細(xì)胞。針對(duì)EN10mAb，使用FITC偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG使染色的細(xì)胞可見；針對(duì)CD11b或Mac3抗體(貝克頓-迪金森公司)，使用PE偶聯(lián)的抗大鼠IgG使染色的細(xì)胞可見。然后使用FACSan流式細(xì)胞儀(貝克頓-迪金森公司)分析樣品。由所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度測(cè)量ENO1和CD11b+表達(dá)。

這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖2A中。與未用LPS但用EN10mAb孵育的細(xì)胞相比，用LPS和EN10mAb處理正常PBMC使得曲線向右偏移。該觀察結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞處于炎癥狀態(tài)(如用LPS刺激)時(shí)，正常PBMC在其細(xì)胞表面上表達(dá)ENO1。此外，可鑒別出高表達(dá)ENO1的細(xì)胞群。如圖2B和2C所示，與未處理細(xì)胞相比，LPS處理的人PBMC中Mac3+和CD11b+細(xì)胞群也增加。ENO1高表達(dá)細(xì)胞群與CD11b^高和Mac3^高細(xì)胞相關(guān)(圖2B和2C)。這些結(jié)果表明ENO1蛋白在活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面上上調(diào)。

實(shí)施例3

Wygrecka的研究表明ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性對(duì)單核細(xì)胞遷移至炎癥位點(diǎn)而言至關(guān)重要(Wygrecka,M.等，2009，Blood.，113：5588-5598)。為了評(píng)估EN10mAb抑制人單核細(xì)胞ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性的能力，使人U937單核細(xì)胞系在含10％FCS的RPMI中生長(zhǎng)。用10微克/毫升的LPS處理細(xì)胞6小時(shí)，以誘導(dǎo)ENO1蛋白在細(xì)胞表面上表達(dá)。然后分別用1微克/毫升的人Lys-血纖維蛋白溶酶原和10微克/毫升的EN10mAb預(yù)培育PBS中的細(xì)胞(1.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/毫升)1小時(shí)。PBS洗滌樣品2次，加入3nM組織特異性血纖維蛋白溶酶原活化劑和0.5mM生色底物S-2251。37℃孵育1小時(shí)后，讀取OD405。每個(gè)研究重復(fù)3次，分析拮抗劑活性。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗(yàn)比較各組。P<0.05認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。

此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖3所示。EN10mAb具有高的ENO1血纖維蛋白溶酶原受體拮抗活性，可對(duì)LPS誘導(dǎo)的特異性ENO1活性可達(dá)到100％的抑制。因此，EN10mAb具有良好的抑制單核細(xì)胞遷移至靶器官的潛力。

實(shí)施例4

實(shí)施例3的結(jié)果表明，EN10mAb可抑制ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性，導(dǎo)致血纖維蛋白溶酶原活化被抑制，以及LPS刺激的人單核細(xì)胞的遷移活性被抑制。此結(jié)果進(jìn)一步獲得指出無血纖維蛋白溶酶原的小鼠的單核細(xì)胞在小鼠非傳染性炎癥模型中喪失遷移能力和浸潤(rùn)活性的其它文獻(xiàn)報(bào)道(Ploplis,V.A.等，1998，Blood，91:2005-2009)的支持。

為了評(píng)估ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性受損是否能減輕活化的單核細(xì)胞的侵襲活性，使人單核細(xì)胞U937細(xì)胞系在含10％FCS的RPMI中生長(zhǎng)。用10微克/毫升LPS處理細(xì)胞6小時(shí)，誘導(dǎo)ENO1蛋白在細(xì)胞表面上表達(dá)。與5到50微克/毫升的EN10mAb混合后，將2×10⁴個(gè)細(xì)胞接種到含15微摩爾Lys-血纖維蛋白溶酶原的兩室檢測(cè)系統(tǒng)的上層腔室中，孵育24小時(shí)，下層腔室中含含有10％FBS和10nM MCP-1的培養(yǎng)基。使用抗小鼠IgG作為陰性對(duì)照組。兩個(gè)室經(jīng)包涂基質(zhì)膠Matrigel的微孔過濾器(孔徑為8微米)隔開。培養(yǎng)期后，在顯微鏡下用血球計(jì)統(tǒng)計(jì)下層腔室的細(xì)胞。每個(gè)研究重復(fù)三次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗(yàn)比較各組。P值<0.05時(shí)被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。

結(jié)果顯示在圖4中。當(dāng)LPS處理的U937細(xì)胞經(jīng)5-50微克/ml的EN10mAb處理時(shí)，U937的侵襲活性為對(duì)照IgG的90.2±2％到49.1±1％(N＝3)。這些結(jié)果表明，EN10mAb可以劑量依賴性的方式損害ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性而減輕活化的U937單核細(xì)胞的侵襲能力。通過靶向炎性單核細(xì)胞表面上的ENO1蛋白，可使用EN10mAb抑制細(xì)胞進(jìn)入侵犯部位。

實(shí)施例5

為了了解炎癥刺激后細(xì)胞表面上ENO1的表達(dá)水平，使人U937單核細(xì)胞在含10％FCS的RPMI中生長(zhǎng)。用10微克/毫升LPS處理細(xì)胞6小時(shí)，誘導(dǎo)ENO1蛋白在細(xì)胞表面上表達(dá)。對(duì)于流式細(xì)胞分析，用或不用EN10mAb(1：300的稀釋度)染色完整的全細(xì)胞，用FITC偶聯(lián)的山羊抗血清(杰克遜實(shí)驗(yàn)室，Jackson Lab)使其可見，并使用FACSsan流式細(xì)胞儀(貝克頓-迪金森公司)分析。根據(jù)所獲得的熒光強(qiáng)度計(jì)算ENO1表達(dá)。

這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖5所示。與未用LPS但用EN10mAb培育的U937細(xì)胞相比，用LPS和EN10mAb培育U937細(xì)胞使得其曲線向右偏移。該結(jié)果表明當(dāng)U937細(xì)胞受到LPS的刺激時(shí)在其表面上表達(dá)ENO1。這些數(shù)據(jù)支持這一觀點(diǎn)，即EN10mAb識(shí)別單核細(xì)胞表面上LPS誘導(dǎo)的ENO1。

實(shí)施例6：表位作圖

抗體表位作圖

為測(cè)定人ENO1蛋白上EN10mAb的表位，設(shè)計(jì)兩條正向引物，其核苷酸序列為5’-GGATCCGCAGCAAACTTCAGGGAAGCCATG-3’(SEQ ID NO:1)和5’-GGATCCTCGAAGATCCCTTTGACCAGGATG-3’(SEQ ID NO:2)，和反向引物5’-TCAGGCTGAAAATCTCTCATCCGC-3(SEQ ID NO:3)。使用含人ENO1cDNA基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pTRC-HIS ENO1作為模板擴(kuò)增ENO1缺失突變體。使用SEQ ID NO:1和2作為正向引物，使用SEQ ID NO:3作為反向引物，分別擴(kuò)增缺失突變體Δ1-189(圖6A)和Δ1-297(圖6A)。使用其它組引物(序列為5’-GGATCCTATCTATTCTCAAGATCCATGCC-3’(SEQ ID NO:4)和5’-CTCGAGGTCATGGTGTCTCATCGTTCGCTCGAG-3’(SEQ ID NO:5))擴(kuò)增缺失突變體Δ297-434(圖6A)。對(duì)于各突變體的擴(kuò)增，制備含1微升1：1000稀釋度的模板DNA(約0.1ng)、5微升10×反應(yīng)緩沖液、1微升10mM dNTP混合物、1微升2.5單位的Taq聚合酶、1微升正向引物和1微升反向引物的反應(yīng)溶液，并用二次蒸餾的水使其最終體積為50微升，進(jìn)行PCR。進(jìn)行一輪94℃、10分鐘的反應(yīng)，然后進(jìn)行94℃、1分鐘，52℃、1分鐘和72℃、1分鐘的反應(yīng)，重復(fù)35輪，最后72℃孵育10分鐘以上。將反應(yīng)溶液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，分析反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)所附指導(dǎo)手冊(cè)，將具有正確分子量的反應(yīng)產(chǎn)物連接到pCR2.1-TOPO載體(英杰公司制造)，進(jìn)行亞克隆。然后使用M13正向引物(5'-GTAAACAACGACGGCGAG-3'，SEQ ID NO:6)和M13反向引物(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，SEQ ID NO:7)測(cè)定核苷酸序列。使用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI消化具有正確序列的每個(gè)突變克隆，將消化產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠切下各突變子的插入片段，使用Gene Clean試劑盒，根據(jù)所附的制造商(BIO101)提供的指導(dǎo)手冊(cè)純化。將各突變體的BamHI和XhoI DNA片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體pTRC His A(英杰公司)的BamHI和XhoI位點(diǎn)。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21Rosseta中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)使ENO1突變蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，超聲處理細(xì)菌沉淀物后，根據(jù)制造商(恰根)提供的附帶指導(dǎo)手冊(cè)采用Ni-瓊脂糖進(jìn)行純化。采用12％SDS PAGE分析各突變體的純度。為了測(cè)定各突變蛋白的結(jié)合活性，將400ng的各人ENO1突變蛋白包被到96孔ELISA板上，用PBS洗滌該板。將10微克EN10mAb加到該板上，在37℃孵育1小時(shí)。用PBS洗滌結(jié)合復(fù)合物2次后，加入偶聯(lián)了HPRT的山羊抗小鼠IgG。孵育1小時(shí)后，加入TMB。根據(jù)OD405讀數(shù)測(cè)定結(jié)合親和力。各研究重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗(yàn)比較各組之間的活性。P值<0.05時(shí)被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。

結(jié)果顯示在圖6A中。ENO1突變體Δ1-189和Δ1-297的OD405讀數(shù)約為1.43±0.18和1.56±0.08(N＝3)(圖6A)，分別約為野生型ENO1(2.87±0.08，N＝3)的42％和39％。但是，當(dāng)刪除氨基酸殘基297到434時(shí)，與BSA背景相比，此突變的ENO1對(duì)EN10mAb的結(jié)合活性喪失。這些結(jié)果表明氨基酸殘基297到434是ENO1蛋白結(jié)合EN10mAb所需，突變體Δ1-182和Δ1-297結(jié)合活性的下降可能是這些突變蛋白的不穩(wěn)定或構(gòu)象變化所致。

為了進(jìn)一步研究ENO1蛋白中EN10mAb的表位，設(shè)計(jì)5條反向引物，分別具有以下序列：5’-CTCGAGAGGGATCTTCGATAGACACCACTGGG-3’(SEQ ID NO:8)，5’-CTCGAGCTACCTGGATTCCTGCACTGGCTG-3’(SEQ ID NO:9)，5’-CTCGAGACTTCTCGTTCACGGCCTTGGCGATC-3’(SEQ ID NO:10)，5’-CTCGAGACTTCTCGTTCACGGCCTTGGCGATCC-3’(SEQ ID NO:11)，5’-CTCGAGCAGTCTCCCCCGAACGATGAGACACC-3’(SEQ ID NO:12)和5’-CTCGAGCACCAGTCTTGATCTGCCCAGTGCAC-3’(SEQ ID NO:13)。使用含人ENO1cDNA基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pTRC-HIS ENO1作為模板擴(kuò)增ENO1缺失突變體。SEQ ID NO:4用作正向引物，分別與引物SEQ ID NO:8、SEQ ID：9、SEQ ID：10、SEQ ID：11、SEQ ID：12、SEQ ID：13擴(kuò)增缺失突變體296-434、316-434、336-434、376-434和396-434。對(duì)于各突變體的擴(kuò)增，制備含1微升1：1000稀釋度的模板DNA(約0.1ng)、5微升10×反應(yīng)緩沖液、1微升10mM dNTP混合物、1微升2.5單位的Taq聚合酶、1微升正向引物和1微升反向引物的反應(yīng)溶液，并用二次蒸餾的水使其最終體積為50微升，進(jìn)行PCR。進(jìn)行一輪94℃、10分鐘的反應(yīng)。然后進(jìn)行94℃、1分鐘，52℃、1分鐘和72℃、1分鐘的反應(yīng)，重復(fù)35輪，最后72℃孵育10分鐘以上。將反應(yīng)溶液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，分析反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)所附指導(dǎo)手冊(cè)，將具有正確分子量的反應(yīng)產(chǎn)物連接到pCR 2.1-TOPO載體(英杰公司制造)，進(jìn)行亞克隆。使用M13正向引物(5'-GTAAACAACGACGGCGAG-3'，SEQ ID NO:6)和M13反向引物(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，SEQ ID NO:7)測(cè)定核苷酸序列。使用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI消化具有正確序列的每個(gè)突變克隆，將消化產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠分離各突變體的DNA片段，使用Gene Clean試劑盒，根據(jù)所附的制造商(BIO101)提供的指導(dǎo)手冊(cè)純化。將各突變體的BamHI和XhoI DNA片段連接到大腸桿菌表達(dá)載體pTRC His A(英杰公司)的BamHI和XhoI位點(diǎn)。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21Rosseta中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)使ENO1突變蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，超聲處理細(xì)菌沉淀物后，根據(jù)制造商(恰根)提供的附帶指導(dǎo)手冊(cè)采用Ni-瓊脂糖進(jìn)行純化。采用12％SDS PAGE分析各突變體的純度。為了測(cè)定各突變蛋白的結(jié)合活性，將400ng的人ENO1蛋白或突變蛋白包被到96孔ELISA板上，用PBS洗滌該板。加入10微克EN10mAb，37℃孵育1小時(shí)。用PBS洗滌結(jié)合復(fù)合物2次后，加入偶聯(lián)了HPRT的山羊抗小鼠IgG。孵育1小時(shí)后，加入TMB。根據(jù)OD405讀數(shù)測(cè)定結(jié)合親和力。各研究重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。采用T-檢驗(yàn)比較各組之間的活性。P值<0.05時(shí)被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。

各突變體和野生型蛋白的12％SDS PAGE顯示在圖6B中。各突變體的分子量從突變體296-343增加到野生型。此結(jié)果表明我們可從各突變體獲得完整蛋白，即便發(fā)現(xiàn)突變體336-434和376-434有一些降解。如圖6C所示，EN10mAb對(duì)野生型ENO1的結(jié)合親和力與對(duì)缺失突變體336-434、376-434和369-343的結(jié)合親和力之間無顯著差異。但是，當(dāng)缺失氨基酸殘基296-316和317-336時(shí)，與大腸桿菌細(xì)胞裂解物背景相比，這兩種ENO1突變體的EN10mAb結(jié)合活性喪失。這些結(jié)果表明，296-336左右區(qū)域的氨基酸殘基(FDQDDWGAWQKFTASAGIQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:39)對(duì)ENO1蛋白與EN10mAb的結(jié)合起重要作用。

實(shí)施例7：丙氨酸掃描

為了進(jìn)一步研究人ENO1殘基296到336中哪些殘基對(duì)EN10mAb結(jié)合而言起重要作用，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(pdb登陸號(hào)：2PSN)下載ENO1的晶體結(jié)構(gòu)。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析后，預(yù)測(cè)氨基酸殘基D300、W301、G302、Q305、K306、A309、K326、K330、N333、E334和K335暴露在蛋白表面，作為突變的候選位點(diǎn)，用于分析它們是否確實(shí)對(duì)EN10mAb結(jié)合起重要作用。使用QuickChange II定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，根?jù)制造商(安捷倫科技有限公司)提供的附帶指導(dǎo)手冊(cè)，將這11個(gè)殘基中的10個(gè)突變?yōu)楸彼?，A309被突變成甘氨酸。由基因組學(xué)生物科技有限公司產(chǎn)生下述用于丙氨酸掃描的誘變寡核苷酸(表1)。

表1：寡核苷酸序列

5’-GATCCCTTTGACCAGGATGCCTGGGGAGCTTGGCAG-3’(SEQ ID NO:14)

5’-CTGCCAAGCTCCCCAGGCATCCTGGTCAAAGGGATC-3’(SEQ ID NO:15)

5’-CCCTTTGACCAGGATGACGCGGGAGCTTGGCAGAAG-3’(SEQ ID NO:16)

5’-CTTCTGCCAAGCTCCCGCGTCATCCTGGTCAAAGGG-3’(SEQ ID NO:17)

5’-CTTTGACCAGGATGACTGGGCAGCTTGGCAGAAGTTC-3’(SEQ ID NO:18)

5’-GAACTTCTGCCAAGCTGCCCAGTCATCCTGGTCAAAG-3’(SEQ ID NO:19)

5’-GACTGGGGAGCTTGGGCGAAGTTCACAGCCAGTGCA-3’(SEQ ID NO:20)

5’-TGCACTGGCTGTGAACTTCGCCCAAGCTCCCCAGTC-3’(SEQ ID NO:21)

5’-GGGGAGCTTGGCAGGCGTTCACAGCCAGTGCAGG-3’(SEQ ID NO:22)

5’-CCTGCACTGGCTGTGAACGCCTGCCAAGCTCCCC-3’(SEQ ID NO:23)

5’-GGCAGAAGTTCACAGGCAGTGCAGGAATCCAGGTAG-3’(SEQ ID NO:24)

5’-CTACCTGGATTCCTGCACTGCCTGTGAACTTCTGCC-3’(SEQ ID NO:25)

C5’-TCACAGTGACCAACCCAGCGAGGATCGCCAAGGCC-3’(SEQ ID NO:26)

5’-GCCTTGGCGATCCTCGCTGGGTTGGTCACTGTGAG-3’(SEQ ID NO:27)

5’-CAACCCAAAGAGGATCGCCGCGGCCGTGAACGAGAAG-3’(SEQ ID O:28)

5’-CTTCTCGTTCACGGCCGCGGCGATCCTCTTTGGGTTG-3’(SEQ ID NO:29)

5’-GAGGATCGCCAAGGCCGTGGCCGAGAAGTCCTGCAAC-3’(SEQ ID O:30)

5’-GTTGCAGGACTTCTCGGCCACGGCCTTGGCGATCCTC-3’(SEQ ID NO:31)

5’-GATCGCCAAGGCCGTGAACGCGAAGTCCTGCAACTG-3’C(SEQ ID NO:32)

5’-GCAGTTGCAGGACTTCGCGTTCACGGCCTTGGCGATC-3’(SEQ ID NO:33)

5’-GCCAAGGCCGTGAACGAGGCGTCCTGCAACTGCCTC-3’(SEQ ID NO:34)

5’-GAGGCAGTTGCAGGACGCCTCGTTCACGGCCTTGGC-3’(SEQ ID NO:35)

5’-CAAGGCCGTGAACGCGGCGTCCTGCAACTGCCTCCTG-3’(SEQ ID NO:36)

5’-CAGGAGGCAGTTGCAGGACGCCGCGTTCACGGCCTTG-3’(SEQ ID NO:37)

對(duì)于各突變體的擴(kuò)增，制備含3微升模板DNA(約30ng)、5微升10×反應(yīng)緩沖液、1微升10mM dNTP混合物、1微升2.5單位的pfu聚合酶、12.5微升125ng正向引物和12.5微升125ng反向引物的反應(yīng)溶液，并用二次蒸餾的水使其最終體積為50微升，進(jìn)行PCR。進(jìn)行一輪95℃、10分鐘的反應(yīng)。然后進(jìn)行95℃、30秒，55℃、30秒和68℃、6分鐘的反應(yīng)，重復(fù)16輪。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將1微升DpnI加到各PCR試管中，37℃孵育1小時(shí)，然后加熱DpnI至80℃20分鐘，使其失活。根據(jù)所附指導(dǎo)手冊(cè)(英杰公司制備)用反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50微升的XL-1藍(lán)感受態(tài)細(xì)胞。使用ENO1R400-420引物(5'-GCAAGGGGCACCAGTCTTGATCTG-3'，SEQ ID NO:38)測(cè)定核苷酸序列。將每個(gè)具有正確序列的突變克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21Rosseta。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)使ENO1突變蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，超聲處理細(xì)菌沉淀物后，根據(jù)制造商(恰根)提供的附帶指導(dǎo)手冊(cè)采用Ni-瓊脂糖進(jìn)行純化。各突變蛋白的純度采用12％SDS PGE分析。

為了測(cè)定各突變蛋白的結(jié)合活性，將400ng/100微升的人ENO1蛋白或突變ENO1蛋白包被到96孔ELISA板上，4℃過夜，然后用PBS洗滌該板。室溫下用1％BSA(w/v)的PBS溶液封阻該板1小時(shí)，然后用1x PBS再次清洗。一抗(EN10mAb)經(jīng)2倍系列稀釋，獲得15個(gè)不同的濃度，然后加到各板中，37℃放置1小時(shí)。反應(yīng)完成后，用1x PBS洗滌板三次。加入1/8000稀釋度的山羊抗-小鼠-HRP抗體，37℃孵育1小時(shí)，然后用1x PBS洗滌板三次。然后加入TMB底物，允許反應(yīng)在室溫下進(jìn)行30分鐘。加入1N HCl結(jié)束反應(yīng)，讀取OD450測(cè)定活性。各研究重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。使用Sigmaplot^TM將OD讀數(shù)和抗體濃度制作多重分散曲線。由四個(gè)參數(shù)的邏輯擬合預(yù)測(cè)K_d值。

根據(jù)實(shí)施例6所示的ENO1大部分刪除研究結(jié)果，殘基296-336的肽序列(FDQDDWGAWQKFTASAGIQVVGDDLTVTNPKRIAKAVNEKS，SEQ ID NO:39)是ENO1蛋白與EN10mAb緊密結(jié)合所需?！熬o密結(jié)合”在本文中指特異性結(jié)合劑(如抗體，scFv或Fab片段)與配體/靶標(biāo)(如肽、蛋白或細(xì)胞)之間結(jié)合時(shí)解離常數(shù)(K_d)為10nM或以下，優(yōu)選為1.0nM或以下。

上述刪除實(shí)驗(yàn)鑒定了ENO1的殘基296-336是抗體結(jié)合的區(qū)域。為了進(jìn)一步表征實(shí)際的結(jié)合位點(diǎn)(如表位)，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(pdb登陸號(hào)：2PSN)下載ENO1的晶體結(jié)構(gòu)，分析此區(qū)域的殘基位置。在蛋白表面暴露有以下11個(gè)氨基酸殘基：D300、W301、G302、Q305、K306、A309、K326、K330、N333、E334和K335(圖6A，推定的表位)。通過定點(diǎn)誘變，將這11個(gè)氨基酸突變，在大腸桿菌中分別表達(dá)所得突變蛋白，并純化(圖7B)。使用ELISA分析每個(gè)純化的ENO1突變蛋白的任何K_d變化(與ENO1結(jié)合相比)。

結(jié)果顯示，這些突變體中存在3種功能類別的氨基酸殘基。氨基酸殘基W301和K330對(duì)ENO1蛋白與EN10mAb的結(jié)合是重要的。如果這兩個(gè)氨基酸殘基分別被突變成丙氨酸，這兩個(gè)ENO1突變體對(duì)EN10mAb的結(jié)合活性明顯被削弱。第二類氨基酸殘基包括A309、E334、K335和D300。如果E334、K335和D300分別被突變成丙氨酸或A309被突變成甘氨酸，這些ENO1突變體對(duì)EN10mAb的結(jié)合活性被削弱。余下的氨基酸殘基，包括G302、Q305、K306、N333和K326，屬于對(duì)ENO1蛋白與EN10mAB的結(jié)合無明顯結(jié)合影響的氨基酸殘基組(圖7C和表II)。這些結(jié)果表明，W301、K330、A309、E334、K335和D300對(duì)ENO1和EN10mAb之間的蛋白-蛋白結(jié)合是重要的。這些氨基酸殘基屬于ENO1肽1(²⁹⁶FDQDDWGAWQKFTA ³⁰⁹，SEQ ID NO:40)和肽2(³²⁶KRIAKAVNEKS³³⁶，SEQ ID NO:41)的序列，它們可能是人ENO1氨基酸殘基296-335(圖7D，SEQ ID NO:39)中EN10mAb的結(jié)合表位。

表II：突變體K_d值

實(shí)施例8

實(shí)施例3和4的結(jié)果表明，EN10mAb可損害ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性。ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性的下降反過來抑制血纖維蛋白溶酶原的活化，導(dǎo)致活化的U937單核細(xì)胞的侵襲能力減弱。此結(jié)果進(jìn)一步獲得指出無血纖維蛋白溶酶原的小鼠的單核細(xì)胞在小鼠非傳染性炎癥模型中喪失遷移能力和浸潤(rùn)活性的其它文獻(xiàn)報(bào)道(Ploplis,V.A.等，1998，Blood，91:2005-2009)的支持。

為了證明EN10mAb在體內(nèi)對(duì)白細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制效果，本研究使用非傳染性炎癥(NII)小鼠模型。將12只小鼠分成4組，每組3只。第1天，各組分別給予PBS，6mg/kg(mpk)的恩利(Enbrel)，10mpk的小鼠IgG，和10mpk的EN10mAb(ip)。2小時(shí)后，給各小鼠注射200微克酪蛋白(ip)。使小鼠處在25℃12小時(shí)。然后分別用相同劑量的相同藥物處理小鼠，2小時(shí)后接著用200微克酪蛋白處理。3小時(shí)后，剖開小鼠腹膜，收集液體。統(tǒng)計(jì)各組的總腹膜細(xì)胞。為了鑒別單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的細(xì)胞群分布，對(duì)各組的腹膜液體中的細(xì)胞進(jìn)行染色，其中，針對(duì)嗜中性粒細(xì)胞，用大鼠1A8抗體進(jìn)行染色，對(duì)單核細(xì)胞，用大鼠抗BR1進(jìn)行染色，然后用FITC偶聯(lián)的山羊抗大鼠IgG(杰克遜實(shí)驗(yàn)室)使其可見，并使用FACSsan流式細(xì)胞儀(貝克頓-迪金森公司)分析。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。采用T-檢驗(yàn)比較各組。P值<0.05時(shí)被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。

此研究的結(jié)果如圖8A和8B所示。腹膜6mpk的恩利、載劑和10mpk的對(duì)照IgG處理的小鼠的平均總細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為1.5±0.1×10⁷(N＝3)，1.8x10⁷和4±0.5×10⁷(N＝3)。但是，當(dāng)給予經(jīng)相同酪蛋白處理的小鼠10mpk的EN10mAb時(shí)，腹膜中的平均細(xì)胞計(jì)數(shù)為5±1.2x10⁶(N＝3)，明顯低于恩利、溶劑和對(duì)照IgG組。10mpk EN10mAb處理組和天然組(3.9±1.2x10⁶，N＝3)之間無顯著差異(圖8A)。

分析腹膜中的細(xì)胞群時(shí)，嗜中性粒細(xì)胞占腹膜總細(xì)胞數(shù)的約73％到85％，本研究各組(除未處理組外)之間無顯著差異(圖8B)。此結(jié)果暗示EN10mAb可損害ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性，這反過來會(huì)如無血纖維蛋白溶酶原的小鼠那樣組織中血纖維蛋白溶酶原的活化降低，且炎性細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞)向侵犯部位的浸潤(rùn)受阻。因此，用ENO1抗體靶向ENO1血纖維蛋白溶酶原受體具有治療免疫疾病的潛在應(yīng)用。

實(shí)施例9

最近的文獻(xiàn)報(bào)道，EAE動(dòng)物模型中單核細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)于多發(fā)性硬化的疾病進(jìn)展至關(guān)重要?；趯?shí)施例8的數(shù)據(jù)，推測(cè)使用抗ENO1抗體削弱ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性將減輕EAE動(dòng)物模型中的多發(fā)性硬化癥狀。皮下給予12只7-10周齡的CB57/BL/6雌性小鼠100微克于完全弗氏佐劑中的MOG p35-55，然后腹膜內(nèi)注射100ng的百日咳毒素。小鼠隨機(jī)分成2組，每組6只。第2天，各組小鼠分別皮下注射200微升10mpk EN10mAb和小鼠IgG。第3天，腹膜給予另一劑100ng的百日咳毒素。每天觀察動(dòng)物，如下評(píng)估臨床癥狀：0，無跡象；1，尾緊張下降；2，輕度單肢輕癱或局部麻痹；3，嚴(yán)重下肢輕癱；4，下身麻痹和/或四肢癱瘓；5，垂死或死亡。所有研究按照臺(tái)灣生物技術(shù)開發(fā)中心的動(dòng)物護(hù)理及使用委員會(huì)所述的規(guī)范完成。

結(jié)果如圖9所示。各組小鼠在第7天開始出現(xiàn)EAE癥狀，第7到第12天兩組的臨床分值之間沒有顯著差異。EN10mAb處理組中，小鼠在第13天疾病達(dá)到最嚴(yán)重程度，平均最大臨床分值約為2.7±032(N＝6)。然后，小鼠進(jìn)入EAE的消退期，直至第28天，該日研究結(jié)束。相反，經(jīng)小鼠IgG處理的小鼠在第16天疾病達(dá)到最嚴(yán)重程度，平均最大臨床分值約為3.3±0.21(N＝6)。然后，小鼠開始進(jìn)入消退期。研究結(jié)束時(shí)，兩組具有相同的平均臨床分值。

本研究表明，與IgG處理小鼠相比，ENO1抗體處理的小鼠具有較低的最大臨床分值，平均低約0.6分。這些數(shù)據(jù)表明，抗體抑制ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性在EAE小鼠預(yù)防模型中具有益處。

實(shí)施例10

實(shí)施例9中，結(jié)果表明給予ENO1抗體在EAE小鼠預(yù)防模型中具有益處。為了研究EN10mAb對(duì)MS的治療效果，下一項(xiàng)研究使用小鼠EAE治療模型。皮下給予28只7到10周齡的CB57/BL/6雌性小鼠100微克于完全弗氏佐劑中的MOG p35-55，然后腹膜內(nèi)注射100ng的百日咳毒素。第3天，給予另一劑100ng的百日咳毒素。每天觀察動(dòng)物，如下評(píng)估臨床癥狀：0，無跡象；1，尾緊張下降；2，輕度單肢輕癱或局部麻痹；3，嚴(yán)重下肢輕癱；4，下身麻痹和/或四肢癱瘓；5，垂死或死亡。直到約第10天(此時(shí)小鼠的平均臨床分值約為0.5)，將小鼠隨機(jī)分成4組，每組7只。第11、13和15天，組1小鼠腹膜內(nèi)注射5mpk EN10mAb。第11天后，組2小鼠每天喂食15mpk富馬酸二甲酯兩次。組3小鼠如組2小鼠處理，但在第11、13和15天腹膜內(nèi)注射5mpk EN10mAb。組4是對(duì)照組，注射載劑，即每天腹膜內(nèi)注射PBS。

研究結(jié)束時(shí)，獲取每一組中臨床分值接近平均最大臨床分值的3只小鼠，給其全身灌注鮑音液(Bouin’s solution)。用10％福爾馬林固定這些小鼠的大腦和脊髓，切片，并用勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(Luxol fast blue)，以及蘇木精和曙紅(H&E)染色。由病理學(xué)家基于Shackelford計(jì)分法(Toxicologic Pathology，卷30，第1期，pp93-96，2002)如下評(píng)估腦膜及腦實(shí)質(zhì)脫髓鞘發(fā)炎性病變的組織病理學(xué)分?jǐn)?shù)：1，最??；2，輕微；3，中度；4，中/嚴(yán)重；5，嚴(yán)重/重度。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。采用T-檢驗(yàn)比較各組。P值<0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。所有研究按照臺(tái)灣生物技術(shù)開發(fā)中心的動(dòng)物護(hù)理及使用委員會(huì)所述的規(guī)范完成。

結(jié)果顯示在圖10A、10B、10C和10D中。各組小鼠在第10天開始出現(xiàn)EAE綜合癥，此時(shí)平均臨床分值約為0.5。第11天小鼠開始接受測(cè)試藥物，分別接受5mpk的EN10mAb，15mpk的DMF(每天兩次)，以及EN10mAb和DMF組合的小鼠EAE綜合癥的發(fā)作開始出現(xiàn)減緩。每組小鼠的疾病在大約第27天達(dá)最嚴(yán)重程度。此時(shí)載劑組、5mpk EN10mAb組、15mpk DMF(每天兩次)組、以及EN10mAb和DMF組合組的平均最大臨床分值分別是4.1±0.34(N＝7)、2.9±0.16(N＝7)、2.7±0.47(N＝7)和2.4±0.39(N＝7)(圖10A)。第32天停止研究，研究過程中，載劑組中有3只小鼠由于疾病進(jìn)展而死亡。雖然5mpk EN10mAb、15mpk DMF(每天兩次)、以及EN10mAb和DMF組合處理的小鼠顯示治療益處(與載劑組的平均最大臨床分值相比，這三組的平均最大臨床分值出現(xiàn)大約1.2、1.4和1.7的下降)，但各組的平均最大臨床分值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

這些結(jié)果表明，抗體對(duì)ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性的抑制在小鼠EAE治療模型中具有臨床益處，3劑5mpk EN10mAb與每天2次的15mpk的DMF具有類似的療效。EN10mAb和DMF組合治療組具有一定的協(xié)同作用(圖10A-10D)。

為了研究用EN10mAb和DMF治療小鼠EAE疾病的益處，進(jìn)一步分析這些小鼠CNS切片的病理發(fā)生率。分析的項(xiàng)目包括總臨床組織病理學(xué)，CNS的脫髓鞘和炎癥分值，被檢測(cè)的組織包括大腦、小腦、骨髓、頸椎、胸椎、腰椎和骶骨。結(jié)果顯示在圖10B、10C和10D中。

載劑組、5mpk EN10mAb組、15mpk DMF組(每天兩次)和EN10mAb和DMF組合組小鼠的平均總病理發(fā)生率分值分別為40.7±7.1(N＝3)、15±4.4(N＝3)、28±5.2(N＝3)和13±11.7(N＝3)。與載劑組每只小鼠的平均總病理發(fā)生率分值相比，EN10mAb處理組和EN10mAb和DMF組合處理組的每只小鼠的平均總病理發(fā)生率分值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值分別為0.025和0.004(圖10B)。此結(jié)果表明，EN10mAb或EN10mAb和DMF組合處理的小鼠對(duì)EAE疾病的CNS具有總的病理學(xué)和病灶益處。CNS的脫髓鞘分值的比較結(jié)果顯示在圖10C中。載劑組、5mpk EN10mAb組、15mpk DMF組(每天兩次)和EN10mAb和DMF組合組每只小鼠CNS中的平均總脫髓鞘分值分別為13±1.8(N＝3)、4.3±0.7(N＝3)、7±1.0(N＝3)和3±2.3(N＝3)。與載劑組每只小鼠CNS中的平均總脫髓鞘發(fā)生率分值相比，所有藥物處理組每只小鼠CNS中的平均總脫髓鞘發(fā)生率分值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，EN10mAb組的P值為0.01，DMF組的P值為0.04，組合處理組的P值為0.04。此結(jié)果表明，本研究中，用EN10mAb或DMF或EN10mAb和DMF組合處理的小鼠在EAE疾病過程中受到藥物的保護(hù)，免受CNS脫髓鞘損傷。此研究進(jìn)一步得到報(bào)道了DMF對(duì)MS患者具有神經(jīng)元保護(hù)效果的文獻(xiàn)(Moharregh-Khiabani,D.等，2009，Current Neuropharmacology，7:60-64；Oh,C.J.(2012)等，PLoS ONE，7:1-10)的支持。疾病過程中3劑5mpk的EN10mAb比每日30mpk的DMF更有效。

CNS中白細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)生率分值是另一檢測(cè)的參數(shù)。結(jié)果顯示在圖10D中。載劑組、5mpk EN10mAb組、15mpk DMF組(每天兩次)和EN10mAb和DMF組合組每只小鼠CNS中的平均總炎癥分值分別為10.3±1.18(N＝3)、6.3±0.9(N＝3)、9±1.0(N＝3)和2.7±1.3(N＝3)。與載劑組每只小鼠CNS中的平均總炎癥分值相比，EN10mAb處理組和EN10mAb和DMF組合組每只小鼠CNS中的平均總炎癥分值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值分別為0.05和0.01(圖10D)。但是，在阻止炎癥細(xì)胞進(jìn)入患病的CNS位置方面，DMF未具有統(tǒng)計(jì)學(xué)效果。此結(jié)果表明EN10mAb或EN10mAb與DMF的組合能阻止白細(xì)胞浸潤(rùn)C(jī)NS，從而降低CNS中的病理學(xué)發(fā)生率，更重要的是緩和MS癥狀中CNS神經(jīng)元的脫髓鞘。

實(shí)施例11

Bae的結(jié)果(Bae,S.等，2013，J.Immunology，189:365-372)顯示，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者中單核細(xì)胞表面上ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性的激活增加該患者PBMC中的促炎細(xì)胞因子如TNFα和ILβ，使疾病惡化。當(dāng)比較Bae研究中所用抗體的表位與EN10mAb時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)EN10mAb結(jié)合的表位與Bae研究所用抗體的表位不同。Bae研究所用抗人ENO1的表位位于ENO1蛋白的N末端和中間部位。但是，EN10mAb的表位位于氨基酸殘基296-336。兩種抗體具有不同的血纖維蛋白溶酶原受體激動(dòng)劑差異。Bae研究所用抗體具有激動(dòng)劑活性，其活化ENO1的血纖維蛋白溶酶原受體活性。但是，當(dāng)將EN10mAb給予受刺激的人單核細(xì)胞時(shí)，EN10mAb顯示拮抗劑活性。此研究支持了我們?cè)趯?shí)施例8、9和10中獲得的MS結(jié)果，也支持了Presslor在肺炎模型研究中的結(jié)果，該研究中單核細(xì)胞上ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性的下調(diào)阻止了活化的單核細(xì)胞浸潤(rùn)炎癥部位。兩個(gè)結(jié)果表明，ENO1抗體在免疫疾病中的治療效果是表位依賴性的，一些ENO1抗體(如Bae研究所用的那種)會(huì)導(dǎo)致疾病惡化。為證實(shí)我們的EN10mAb在RA中的療效，使用膠原蛋白抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎嚙齒動(dòng)物模型進(jìn)行研究。給6周齡Balb/c雄性小鼠靜脈內(nèi)注射1.5mg/小鼠的小鼠單克隆抗II型膠原蛋白。4天后，用50微克/小鼠的LPS(大腸桿菌0111B4)腹膜內(nèi)處理小鼠。將小鼠分成3組，每組3只。第1、3、5、7天，每組小鼠分別用5mpk小鼠IgG、5mpk EN10mAb和6mpk恩利處理。每天觀察動(dòng)物，如下評(píng)估臨床癥狀：體重(每天)，足墊厚度(第1、3、7和10天)，關(guān)節(jié)炎分值(第3、7和10天)，病理學(xué)(第10天)，和細(xì)胞因子(ELISA)。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。采用ANOVA和Newman-Keuls多重比較檢驗(yàn)比較3組或多組數(shù)據(jù)。P值<0.05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。所有研究按照臺(tái)灣生物技術(shù)開發(fā)中心的動(dòng)物護(hù)理及使用委員會(huì)所述的規(guī)范完成。對(duì)于細(xì)胞因子分析，切開膝蓋，用PBS洗滌滑液并收集。用細(xì)胞因子ELISA試劑盒分析細(xì)胞因子濃度。

結(jié)果顯示在圖11A中。第7天10mpk EN10mAb、6mpk恩利和載劑組的平均關(guān)節(jié)炎分值分別為10±0.54(N＝3)、12±0.8(N＝3)和12±0.3(N＝3)。EN10mAb處理的小鼠的平均關(guān)節(jié)炎分值與載劑組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值為0.0001。第10天，10mpk EN10mAb、6mpk恩利和載劑組的平均關(guān)節(jié)炎分值分別為8.9±0.53(N＝3)、7.2±0.8(N＝3)和11.7±0.3(N＝3)。EN10mAb和6mpk恩利處理的小鼠的平均關(guān)節(jié)炎分值與載劑組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值小于0.0001(圖11A)。此研究的結(jié)果表明，用EN10mAb削弱ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性能減少CAIA嚙齒動(dòng)物模型中RA的癥狀。當(dāng)分析CAIA小鼠滑液中的IL1b和MMP9細(xì)胞因子時(shí)，EN10mAb處理組、恩利處理組和載劑組的平均MMP9濃度為62.5±5、34±9.4和92.5±11.25ng/ml(N＝3)。對(duì)于IL1b細(xì)胞因子，EN10mAb處理組、恩利處理組和載劑組的平均濃度分別為91±15.8、68.9±31和115.6±20pg/ml(N＝3)。兩種細(xì)胞因子在EN10mAb處理組和恩利處理組中都下調(diào)?；趫D11A、11B和11C的結(jié)果，可得出以下結(jié)論：在兩種情況中，3劑10mpk EN10mAb和恩利在減少RA癥狀方面具有療效。

實(shí)施例12

實(shí)施例9、10和11的結(jié)果表明，用ENO1拮抗劑抗體削弱ENO1活性能減輕小鼠EAE和CAIA模型中MS和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀。

我們推測(cè)小鼠ENO1的類似表位對(duì)類似的小鼠自身免疫疾病也有效。訂購10mg小鼠ENO1蛋白，由金斯瑞有限公司(Genescript Inc.，皮斯卡塔市，新澤西州，美國(guó))產(chǎn)生大鼠抗小鼠ENO1抗體。為了篩選分泌大鼠抗小鼠ENO1抗體的雜交瘤，用400ng的小鼠ENO1蛋白包被96孔ELISA板，進(jìn)一步用PBS洗滌該板。將從各雜交瘤上清獲得的系列稀釋液加到該板中，37℃孵育該板1小時(shí)。加入偶聯(lián)有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的山羊抗大鼠IgG。1小時(shí)后加入3,3′,5,5′-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯(TMB)，讀取OD405。30000個(gè)雜交瘤中，將75個(gè)具有顯著的小鼠ENO1結(jié)合親和力的陽性克隆進(jìn)行EN10mAb競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)(圖12A)。用小鼠ENO1蛋白包被ELISA平板，將其用于結(jié)合各陽性雜交瘤克隆的上清(約100微升)。PBS洗滌平板兩次后，將100ng的EN10mAb加到該平板中，37℃孵育該平板1小時(shí)。加入偶聯(lián)有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的山羊抗大鼠IgG。1小時(shí)后加入3,3′,5,5′-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯(TMB)，讀取OD405。結(jié)果顯示在圖12B中。75個(gè)雜交瘤上清中，僅5個(gè)上清在EN10mAb競(jìng)爭(zhēng)下具有小鼠ENO1結(jié)合活性。此結(jié)果表明這5種大鼠抗小鼠ENO1抗體在小鼠ENO1中的表位可能與人ENO1中EN10mAb的表位類似。

實(shí)施例13

為評(píng)估5種抗小鼠ENO1抗體針對(duì)小鼠ENO1的結(jié)合親和力，使雜交瘤在25ml的SFM培養(yǎng)基(吉科有限公司，Gibco Inc)中生長(zhǎng)。培養(yǎng)1周后，收集每一種上清。采用40％硫酸銨和蛋白A柱(Montage抗體純化試劑盒，密理博公司)進(jìn)一步純化抗體。根據(jù)制造商(密理博公司)提供的方案，用Amicon Ultra-15離心過濾裝置濃縮純化的抗體。

用400ng的小鼠ENO1蛋白包被96孔ELISA板，進(jìn)一步用PBS洗滌該平板。將每一種抗體從1×10^-12到1×10^-8M系列稀釋的溶液加到該平板中，37℃孵育該平板1小時(shí)。加入偶聯(lián)有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的山羊抗大鼠IgG。1小時(shí)后加入3,3′,5,5′-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯(TMB)，讀取OD405。每個(gè)研究重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示。使用Sigmaplot將OD讀數(shù)和抗體濃度制作多重分散曲線。由四個(gè)參數(shù)的邏輯擬合預(yù)測(cè)K_d值。

此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖13中。每一種抗體的Kd值從3.90±0.66x10^-10M(N＝3)到3.39±1.89X10^-8M(N＝3)。由于克隆12D9的產(chǎn)率低，選用7E5進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

實(shí)施例14

實(shí)施例9和10的結(jié)果表明給予ENO1抗體賦予EAE小鼠預(yù)防和治療模型臨床益處。為研究7E5對(duì)MS是否具有類似于EN10mAb的治療效果，接下來的研究中使用小鼠EAE治療模型。給18只7到10周齡的雌性CB57/BL/6小鼠皮下提供100微克于完全弗氏佐劑中的MOG p35-55，然后腹膜內(nèi)注射100ng的百日咳毒素。第3天，給予另一劑100ng的百日咳毒素。每天觀察動(dòng)物，如下評(píng)估臨床癥狀：0，無跡象；1，尾緊張下降；2，輕度單肢輕癱或局部麻痹；3，嚴(yán)重下肢輕癱；4，下身麻痹和/或四肢癱瘓；5，垂死或死亡。直到約第10天(此時(shí)小鼠的平均臨床分值約為0.5)，將小鼠隨機(jī)分成3組，每組6只。第11、13和15天，組1小鼠皮下注射5mpk 7E5mAb。組2小鼠皮下注射20000單位的干擾素β-1b(Betaferon)。組3為對(duì)照組，皮下注射PBS載劑。

研究結(jié)束時(shí)，獲取每一組中臨床分值接近平均最大臨床分值的3只小鼠，給其全身灌注鮑音液(Bouin’s solution)。用10％福爾馬林固定這些小鼠的大腦和脊髓，切片，并用勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(Luxol fast blue)，以及蘇木精和曙紅(H&E)染色。由病理學(xué)家基于Shackelford計(jì)分法(Toxicologic Pathology，卷30，第1期，第93-96頁，2002)如下評(píng)估腦膜及腦實(shí)質(zhì)脫髓鞘發(fā)炎性病變的組織病理學(xué)分?jǐn)?shù)：1，最小；2，輕微；3，中度；4，中/嚴(yán)重；5，嚴(yán)重/重度。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。采用T-檢驗(yàn)比較各組。P值<0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。所有研究按照臺(tái)灣生物技術(shù)開發(fā)中心的動(dòng)物護(hù)理及使用委員會(huì)所述的規(guī)范完成。

結(jié)果顯示在圖14A、14B、14C和14D中。各組小鼠在第10天開始出現(xiàn)EAE綜合癥，此時(shí)平均臨床分值約為0.5。第11天小鼠開始接受測(cè)試藥物，分別接受5mpk的7E5mAb和20000單位干擾素β-1b的小鼠EAE綜合癥的發(fā)作開始出現(xiàn)減緩。每組小鼠的疾病在大約第27天達(dá)最嚴(yán)重程度。此時(shí)載劑組、5mpk 7E5mAb組和20000單位干擾素β-1b組的平均最大臨床分值分別是2.6±0.9(N＝6)、1.6±0.5(N＝6)和2.1±0.4(N＝6)(圖14A)。雖然7E5mAb和20000單位干擾素β-1b處理的小鼠顯示治療益處(與載劑組的平均最大臨床分值相比，這兩組的平均最大臨床分值分別出現(xiàn)大約1.0和0.5的下降)，但各組的平均最大臨床分值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果表明，與在小鼠EAE治療模型中顯示的臨床益處的EN10mAb類似，7E5抗體也能抑制ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性，雖然它們結(jié)合具有類似表位但來自不同物種的ENO1。

為了研究7E5mAb和干擾素β-1b治療小鼠EAE疾病的益處，進(jìn)一步分析這些小鼠CNS切片的病理發(fā)生率。分析的項(xiàng)目包括總臨床組織病理學(xué)，CNS的脫髓鞘和炎癥分值，被檢測(cè)的組織包括大腦、小腦、骨髓、頸椎、胸椎、腰椎和骶骨。結(jié)果顯示在圖14B、14C和14D中。

載劑組、5mpk 7E5mAb組和20000單位干擾素β-1b組小鼠的平均總病理發(fā)生率分值分別為40.7±6.8(N＝3)、14.7±9.(N＝3)和41.8±3.4(N＝3)。與載劑組每只小鼠的平均總病理發(fā)生率分值相比，7E5mAb處理組每只小鼠的平均總病理發(fā)生率分值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值為0.025(圖14B)。此結(jié)果表明，7E5mAb處理的小鼠對(duì)EAE疾病的CNS具有總的病理學(xué)和病灶益處。CNS的脫髓鞘分值的比較結(jié)果顯示在圖14C中。載劑組、5mpk 7E5mAb組和20000單位干擾素β-1b組每只小鼠CNS中的平均總脫髓鞘分值分別為12.2±0.8(N＝3)、5.1±1.4(N＝3)和9.1±1.1(N＝3)。與載劑組每只小鼠CNS中的平均總脫髓鞘發(fā)生率分值相比，7E5mAb組每只小鼠CNS中的平均總脫髓鞘發(fā)生率分值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，P值為0.01。此結(jié)果表明，本研究中，用7E5mAb處理的小鼠在EAE疾病過程中受到測(cè)試藥物的保護(hù)，免受CNS脫髓鞘損傷。

CNS中白細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)生率分值是另一檢測(cè)的參數(shù)。結(jié)果顯示在圖14D中。載劑組、5mpk 7E5mAb組和20000單位干擾素β-1b組每只小鼠CNS中的平均總炎癥分值分別為10.±1.9(N＝3)、4.6±2.7(N＝3)和9.2±2.6(N＝3)。與載劑組每只小鼠CNS中的平均總炎癥分值相比，7E5mAb處理組每只小鼠CNS中的平均總炎癥分值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值為0.05(圖14D)。但是，在阻止炎癥細(xì)胞進(jìn)入患病的CNS位置方面，干擾素β-1b看起來不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)效果。此結(jié)果表明，與EN10mAb相同，7E5mAb能阻止白細(xì)胞浸潤(rùn)C(jī)NS，從而降低CNS中的病理學(xué)發(fā)生率，更重要的是緩和MS癥狀中CNS神經(jīng)元的脫髓鞘。我們的結(jié)果表明，人ENO1氨基酸296-336(SEQ ID NO:39)肽區(qū)域(該區(qū)域包括FDQDDWGA WQKFTA(SEQ ID NO:40)和KRIAKAVNEKS(SEQ ID NO:41)的肽序列)對(duì)抗體抑制血纖維蛋白溶酶原受體活性并作為治療免疫性單核細(xì)胞相關(guān)的免疫疾病的治療劑起非常重要的作用，即使在小鼠中MOA也是有效的。

實(shí)施例9、10、11和14的結(jié)果表明，不論何種物種，用ENO1抗體抑制ENO1血纖維蛋白溶酶原受體活性可降低血纖維蛋白溶酶原活化，抑制UPAS級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少胞外基質(zhì)活性的降解。結(jié)果，炎性單核細(xì)胞向受損病患細(xì)胞的浸潤(rùn)被抑制，且這種抑制減輕了CAIA模型中的RA、EAE中的MS以及NII的炎癥癥狀。因此，可靶向活化細(xì)胞(如單核細(xì)胞)表面上的ENO1血纖維蛋白溶酶原受體，以治療炎性疾??；抗人ENO1氨基酸296-336(SEQ ID NO:39)的肽區(qū)域(該區(qū)域包括FDQDDWGA WQKFTA(SEQ ID NO:40)和KRIAKAVNEKS(SEQ ID NO:41)的肽序列)的ENO1抗體可用作免疫疾病患者的治療藥物。

雖然已結(jié)合一定數(shù)量的實(shí)施例描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本公開的內(nèi)容之后將理解，在不偏離本文所公開的本發(fā)明范圍的情況下可設(shè)計(jì)其它實(shí)施方案。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)僅由所附權(quán)利要求書限定。