本發(fā)明涉及具有改性磷酸基團(tuán)的核苷酸和寡核苷酸，以及它們的制造方法。

背景技術(shù)：

核酸衍生物，例如附加有各種額外功能的寡核苷酸在生命科學(xué)中被廣泛用作研究工具，具體而言，它們被認(rèn)為是有前景的療法[1]和用于分子診斷的靈敏探針[2]。一些寡核苷酸療法已經(jīng)受到FDA批準(zhǔn)用于臨床。實例包括抗病毒試劑福米韋生(Fomivirsen,ISIS 2922)[3]、抗血管生成適體哌加他尼鈉(Pegaptanib sodium)[4]和抗膽固醇缺口聚物(gapmer)米泊美生(Mipomersen)(Kynamro,ISIS 301012)[5]。一些其它寡核苷酸候選物，如siRNA、DNA酶和反嗎啉類似物(PMO)目前正處于臨床試驗的各個階段。

若要被認(rèn)為是潛在療法，則寡核苷酸應(yīng)當(dāng)滿足以下要求。

1.與它們的生物標(biāo)靶(通常為細(xì)胞RNA)的互補(bǔ)配合物具有足夠的穩(wěn)定性和序列特異性。

2.在生物介質(zhì)如血清中提高的抗性。

3.有利的物理化學(xué)性質(zhì)，如水溶解性和化學(xué)穩(wěn)定性。

4.經(jīng)濟(jì)有效的合成和可接受的價格。

5.優(yōu)選在不使用外傳染劑的情況下具有充分的細(xì)胞攝取和體內(nèi)遞送。

根據(jù)作用機(jī)制，寡核苷酸類似物實際上可以干預(yù)遺傳信息傳遞的任何階段：從DNA到RNA(轉(zhuǎn)錄)或從RNA到蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)譯)。通過用三鏈體形式的寡核苷酸(TFOs)[6]特別是肽核酸(PNAs)[7]結(jié)合基因組DNA來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的抑制。轉(zhuǎn)譯的抑制(反義機(jī)制)通過mRNA阻斷來實現(xiàn)[8]。迄今已知的大多數(shù)寡核苷酸類似物通過反義機(jī)制起作用。那些是小的干預(yù)RNA(siRNA)[9],核酸酶(核酶或脫氧核酶)[10]，以及大部分化學(xué)改性寡核苷酸類似物[11]。特定的寡核苷酸衍生物如適體也能夠通過直接與蛋白質(zhì)或小分子輔因子結(jié)合來阻斷蛋白質(zhì)功能[12]。

大部分反義寡核苷酸類似物結(jié)合mRNA并通過立體阻擋來抑制轉(zhuǎn)譯[13]。它們包括在糖部分具有修飾的大部分類似物，例如2’-氟[14],2’-O-甲基[15],2’-O-β-甲氧基乙基(2’-MOE)[16]或鎖核酸(LNA)[17]衍生物。用不帶電基團(tuán)取代陰離子性核苷間磷酸酯基團(tuán)如甲基膦酸酯[18]、磷酸三酯[19]或氨基磷酸酯[20]的寡核苷酸類似物也通過立體阻擋來起作用。遠(yuǎn)端和酸模擬物如PNA[21]或磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)[22]的作用中也涉及相同的反義機(jī)制。

其它興趣也關(guān)注這些類似物，其能夠通過催化RNA發(fā)生水解來不可逆地使RNA失活，例如通過用2’-脫氧硫代磷酸酯[23],аrа-2’-氟衍生物(2’-FANA)[24]或缺口聚物[24]來吸附細(xì)胞酶RNase H。SiRNA通過激活具有核糖核酸活性的RISC復(fù)合物來誘導(dǎo)mRNA的催化裂解[25]，其中核酸酶(核酶或脫氧核酶)不需要針對它們催化RNA裂解作用的蛋白質(zhì)[27]。

許多寡核苷酸類似物已經(jīng)修飾了核苷間磷酸酯基團(tuán)。它們中有硫代磷酸酯[28]、二硫代磷酸酯[29]和borano磷酸酯[30]。這些衍生物的一個正面特點是它們相對低的成本，因為使用天然2’-脫氧核糖核苷酸和高效固態(tài)DNA磷酸酰二胺化學(xué)[31]。磷酸酯改性的類似物包含不對稱磷原子并且通常以n聚體寡核苷酸的2^n-1種非對映異構(gòu)體的混合物的形式獲得。不同的非對映異構(gòu)體通常具有不同的RNA親和性和酶耐性，這對于潛在的反義作用是至關(guān)重要的。

目前，特別優(yōu)先的任務(wù)是開發(fā)具有充分細(xì)胞攝取和體內(nèi)遞送的寡核苷酸類似物，優(yōu)選不存在外部遞送試劑如陽離子脂質(zhì)體、聚合物或納米顆粒。這里，具有降低或完全消除負(fù)電荷的寡核苷酸類似物可能特別受關(guān)注[32]。其中有用電中性氨基磷酸酯基取代陰離子磷酸酯的寡核苷磷酸酯。氨基磷酸酯的化學(xué)合成相對簡單。但是，這些類似物顯示出降低的RNA親和性[33]并且對酸性水解敏感[34]。N3’→P5’氨基磷酸酯已經(jīng)提高了RNA結(jié)合，但是難以合成[35]。那些在側(cè)鏈具有正電基團(tuán)的代表更加容易靠近并且具有優(yōu)異的酶活性，但是它們的RNA親和性較低[36]。與此同時，大部分已知的氨基磷酸酯衍生物包含有用的反義試劑如嗎啉(PMOs)[37]在酸性pH下顯示出某種程度的不穩(wěn)定性。需要提高酸穩(wěn)定性來防止寡核苷酸類似物在內(nèi)體內(nèi)部降解。

在過去二十年中，已經(jīng)出現(xiàn)了新型膦酸酯寡核苷酸類似物，其用可離子化的膦酸酯基取代天然磷酸酯。它們中有膦?；宜狨ズ土虼Ⅴ；宜狨38]、膦?；姿狨39]和1,2,3-三唑-4-基膦酸酯[40]。這些化合物顯示出提高的生物抗性和適當(dāng)?shù)腞NA結(jié)合，并且,它們支持RNase H裂解并且即使沒有轉(zhuǎn)染試劑也具有提高的細(xì)胞攝取。但是，它們的化學(xué)合成困難且昂貴。

還報道了至少曾經(jīng)含有P＝N-Acc結(jié)構(gòu)的改性核苷酸和寡核苷酸,其中Acc為電子受體[41]。合適的Acc的例子有–CN、-SO₂R和缺電子的六元N⁺雜環(huán)，在所述雜環(huán)中至少一個氮是烷基化的并且在鄰位或?qū)ξ弧?/p>

目前，磷酸二酰胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)受到很多關(guān)注，其是已知的反義試劑[42]。它們可以從GeneTools LLC公司購得。人們積極地探索PMO作為Sarepta療法的潛在治療藥物(2012 AVI Biopharma)。在2013年，該公司宣布成功完成了PMO藥物Eteplirsen(AVI-4658)治療杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)的階段III臨床試驗，該臨床試驗修正了抗肌萎縮蛋白前體mRNA的異常剪接[43]。在2014年初Sarepta Therapeutics聲稱他們的嗎啉代候選藥物AVI-7288已經(jīng)成功通過了針對含RNA的病毒引起的致命的馬爾堡出血熱的階段I臨床試驗[44]。

然而，嗎啉與其它氨基磷酸酯一樣是酸敏感性的[45]。此外，它們的合成建立在P(V)化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上[46]。該化學(xué)反應(yīng)可能導(dǎo)致副反應(yīng)，例如鳥嘌呤中發(fā)生O⁶的改性[47]。該副反應(yīng)可以通過O⁶位上的保護(hù)基團(tuán)來防止[48]，但是這需要特殊的G單體，這增加了PMO合成的成本。該化學(xué)反應(yīng)的另一個缺點是其與通常的亞磷酰胺方法不匹配并且不能使用可從通常供應(yīng)商如Glen Research,Inc公司獲得的改性和標(biāo)記試劑。

PMO的另一個嚴(yán)重缺陷是難以對它們進(jìn)行化學(xué)改性來獲得用于結(jié)構(gòu)-活性研究的各種衍生物。僅報道了若干針對PMO的側(cè)鏈修飾，聲稱增強(qiáng)了它們的細(xì)胞攝取和療效[49]。

嗎啉通常顯示相對差的細(xì)胞攝取因此為了看到良好的療效需要高度重復(fù)的給藥。PMO-肽結(jié)合對的細(xì)胞攝取遠(yuǎn)高于裸PMO，因此在體內(nèi)試驗中需要低得多的劑量[50]。需要獲得更好的寡核苷酸類似物，在沒有遞送助劑的情況下顯示更高水平的細(xì)胞和組織遞送以及提高的治療效果。

因此，新型寡核苷酸類似物的開發(fā)仍是一項重要任務(wù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是基于本發(fā)明人對寡核苷酸療法的具有提高的細(xì)胞攝取的可能候選藥物的發(fā)現(xiàn)。具體而言，本發(fā)明基于以下針對這種新型寡核苷酸療法的合適方法/特征的方面:

1.用中性或帶正電的基團(tuán)取代天然陰離子性磷酸酯。

2.滿足以上列出的潛在寡核苷酸治療藥物的要求。

3.優(yōu)選地保留常規(guī)的核苷酸骨架。

4.顯示充分的化學(xué)穩(wěn)定性。

5.具有允許加入多種側(cè)鏈基團(tuán)的結(jié)構(gòu)柔性。

6.具有低毒性。

本文公開了新型寡核苷酸類似物，其對應(yīng)于以上要求并且可能潛在地顯示提高的細(xì)胞攝取。廣泛地講，這些寡核苷酸類似物歸類為磷酰亞胺及其類似物，例如，磷酰基胍、磷酰基脒、磷酰基異脲、磷?；惲螂?、磷酰亞胺酸酯、磷酰基硫代亞胺酸酯及其類似物。

因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種核苷酸或寡核苷酸，包含磷酰基胍(FI)、磷酰基脒(FII)、磷?；愲?FIII)、磷?；惲螂?FIV)、磷酰亞胺酸酯(FV)或磷?；虼鷣啺匪狨?FVI)，例如磷酰基胍(FI)、磷?；?FII)、磷?；愲?FIII)、磷?；惲螂?FIV)。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還涉及這些部分的改性磷酸酯形式；即，磷原子周圍的一個或多個氧原子被例如硫原子、硒原子、亞胺基或硼烷取代的磷酸酯。

例如，本發(fā)明特別涉及一種核苷酸或寡核苷酸及其類似物，包含以下模體中的一種或多種：

其中表示取代基結(jié)合點。

這些改性的磷酸酯基團(tuán)因其物理化學(xué)性質(zhì)而受到很大關(guān)注。不受限于任何具體理論，本發(fā)明人相信，這些部分在生理pH下可以是電中性的、帶負(fù)電或帶正電，這使得它們在合成用于治療、診斷和研究應(yīng)用的核苷酸和寡核苷酸方面受到很大關(guān)注。

此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用本文所描述的方法可以方便地將這些改性的磷酸酯基團(tuán)結(jié)合到寡核苷酸結(jié)構(gòu)中，并且這些改性的磷酸酯基團(tuán)可以與許多已知且生物學(xué)上受關(guān)注的改性和/或標(biāo)記的寡核苷酸模體和序列相兼容。

例如，所述模體可以是：

其中：

R¹選自

-NR^1AR^1B、-OR³、-SR³、-H、-S(O)H、-S(O)R³、-S(O)₂H、-S(O)₂R³、-S(O)₂NH₂、-S(O)₂NHR³、-S(O)₂NR³₂、-C_1-10烷基、-C_2-10烯基、-C_2-10炔基、-C_6-10芳基或-C_5-10雜環(huán)基；

R²選自-H、-NR^2AR^2B、-OR³、-SR³、鹵素、-CN、-S(O)H、-S(O)R³、-S(O)₂H、-S(O)₂R³、-S(O)₂NH₂、-S(O)₂NHR³、-S(O)₂NR³₂、-C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基；

其中每個R^1A、R^1B、R^2A和R^2B獨立地選自-H、-C_1-10烷基,-C_2-10烯基,-C_2-10炔基、-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基；

任選地，其中R^1A和R^2A一起形成2-4個原子長度的亞烷基或雜亞烷基鏈；

任選地，其中R^1A和R^1B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)；

任選地，其中R^2A和R^2B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)；R³選自-C_1-10烷基、-C_2-10烯基、-C_2-10炔基、-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基；

其中每個烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、亞烷基或雜亞烷基任選地被取代。

因此，在第一方面，本發(fā)明可以提供一種式(I)的化合物：

其中Z選自-O^-、-S^-、-Se^-、-N^-R^N或-BH₃^-，其中R^N為H、C_1-4烷基或保護(hù)基團(tuán)；

X選自核苷、核苷類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物的5’端，且Y選自核苷、核苷類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物的3’端、-H、-OH、-SH、NHR^N、-O-PG或S-PG，其中PG為保護(hù)基團(tuán)；連接基、單磷酸酯、二磷酸酯或標(biāo)記或淬滅劑；

或者

Y選自核苷、核苷類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物的3’端，且X選自核苷、核苷類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物的5’端、-H、-OH、-SH、NHR^N、-O-PG或S-PG，其中PG為保護(hù)基團(tuán)；連接基、單磷酸酯或二磷酸酯或標(biāo)記或淬滅劑；

R¹選自

-NR^1AR^1B、-OR³、-SR³、-H、-S(O)H、-S(O)R³、-S(O)₂H、-S(O)₂R³、-S(O)₂NH₂、-S(O)₂NHR³、-S(O)₂NR³₂、-C_1-10烷基、-C_2-10烯基、-C_2-10炔基、-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基；

R²選自-H、-NR^2AR^2B、-OR³、-SR³、鹵素、-CN、-S(O)H、-S(O)R³、-S(O)₂H、-S(O)₂R³、-S(O)₂NH₂、-S(O)₂NHR³、-S(O)₂NR³₂、-C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基；

其中R^1A、R^1B、R^2A和R^2B獨立地選自-H、-C_1-10烷基、-C_2-10烯基、-C_2-10炔基、-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基；

任選地，其中R^1A和R^2A一起形成2-4個原子長度的亞烷基或雜亞烷基鏈；

任選地，其中R^1A和R^1B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)；

任選地，其中R^2A和R^2B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)；R³選自-C_1-10烷基、-C_2-10烯基、-C_2-10炔基、-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基；

其中，每個烷基、芳基、雜芳基,亞烷基或雜亞烷基任選地被取代。

在一些實施方式中，R¹選自-NR^1AR^1B、-OR³和-SR³。在一些實施方式中，R¹為-NR^1AR^1B。

因此，該化合物可以是式(Ia)的化合物，其中，X、Y、Z、R^1A、R^1B和R²如本文中所定義的那樣。

該化合物可以是“改性的”核苷酸、“改性的”寡核苷酸或“改性的”核苷三磷酸酯。應(yīng)當(dāng)理解，在本文中術(shù)語“改性的”是指引入了式(I)所述的改性磷酸酯部分，即包含式(FVII)所述的模體的磷酸酯。

核苷三磷酸酯是包含鍵合有三個磷酸酯基團(tuán)的核苷的分子。應(yīng)當(dāng)理解，在本文中，術(shù)語磷酸酯包括本文所定義的改性磷酸酯。適當(dāng)?shù)?，該核苷三磷酸酯具有三個磷酸酯串聯(lián)連接在一起的三磷酸酯基團(tuán)；即，該分子可以是dNTP或類似物。在其它實施方式中，核苷可以在5’位和3’位都具有磷酸酯，例如，在5’位具有單磷酸酯且在3’位具有二磷酸酯(兩個磷酸酯連接在一起)。應(yīng)當(dāng)理解，這些磷酸酯基中的任一個或全部可以是本文所述的改性的磷酸酯。

當(dāng)該化合物為寡核苷酸時，應(yīng)當(dāng)理解，每個進(jìn)一步的核苷其本身可以獨立地使核苷類似物，另外，每個進(jìn)一步的磷酸酯基(如果存在的話)其自身可以是改性的。

在一些實施方式中，R²選自-H、-NR^2AR^2B、-OR³、-SR³、-S(O)H、-S(O)R³、-S(O)₂H、-S(O)₂R³、-S(O)₂NH₂、-S(O)₂NHR³、-S(O)₂NR³₂、-C_1-10烷基、-C_2-10烯基、-C_2-10炔基、-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基，其中每個烷基、芳基、雜芳基、亞烷基或雜亞烷基任選地被取代。

在一些實施方式中，R²為-H、-NR^2AR^2B、-OR³、-SR³、-C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基，其中每個烷基、芳基、雜芳基、亞烷基或雜亞烷基任選地被取代。

在一些實施方式中，R²為-H、-NR^2AR^2B或-OR³。例如，該化合物可以含有膦?；纂?P-N＝CHNR^1AR^1B)基團(tuán)、磷?；?P-N＝C(NR^1AR^1B)(NR^2AR^2B))或磷?；愲?P-N＝C(NR^1AR^1B)OR³)基團(tuán)。

在一些實施方式中，R³為C_1-4烷基，優(yōu)選為甲基。

在一些實施方式中，R^1A獨立地選自-H和-C_1-4烷基，該-C_1-4烷基任選地被選自–F、-Cl、-Br、-I、-OH、-C_1-4烷氧基、-NH₂、-NH(C_1-4烷基)和-N(C_1-4烷基)₂中的一個或多個取代基取代，R^1A優(yōu)選選自-H和-C_1-4烷基，更優(yōu)選選自-H和甲基。

在一些實施方式中，R^1B獨立地選自-H和-C_1-4烷基，該-C_1-4烷基任選地被選自-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-C_1-4烷氧基、-NH₂、-NH(C_1-4烷基)和-N(C_1-4烷基)₂中的一個或多個取代基取代；R^1B優(yōu)選選自-H和-C_1-4烷基，更優(yōu)選選自–H和甲基。

在一些實施方式中，R^2A獨立地選自-H和-C_1-4烷基，該-C_1-4烷基任選地被選自-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-C_1-4烷氧基、-NH₂、-NH(C_1-4烷基)和-N(C_1-4烷基)₂中的一個或多個取代基取代；R^2A優(yōu)選選自-H和-C_1-4烷基，更優(yōu)選選自–H和甲基。

在一些實施方式中，R^2B獨立地選自-H和-C_1-4烷基，該-C_1-4烷基任選地被選自-F、-Cl、-OH、-C_1-4烷氧基、-NH₂、-NH(C_1-4烷基)和-N(C_1-4烷基)₂中的一個或多個取代基取代，R^2B優(yōu)選選自-H和-C_1-4烷基，更優(yōu)選選自–H和甲基。

在一些實施方式中，每個R^1A、R^1B、R^2A和R^2B獨立地選自-H和-C_1-4烷基，該-C_1-4烷基任選地被選自-F、-Cl、-Br、-I、-OH、-C_1-4烷氧基、-NH₂、-NH(C_1-4烷基)和-N(C_1-4烷基)₂中的一個或多個取代基取代；優(yōu)選每個R^1A、R^1B、R^2A和R^2B獨立地選自-H和-C_1-4烷基，該-C_1-4烷基任選地被選自-F,-Cl,-OH和-NH₂中的一個或多個取代基取代，更優(yōu)選每個R^1A、R^1B、R^2A和R^2B獨立地選自-H和-C_1-4烷基，更優(yōu)選選自–H和甲基。

在一些實施方式中，R²為-NR^2AR^2B，優(yōu)選為-NMe₂。

在一些實施方式中，R¹為–NH₂或-NMe₂。

在一些實施方式中，R^1A和R^2A一起形成2-4個原子長度的亞烷基或雜亞烷基鏈并且R^1B和R^2B各自獨立地選自-H和-C_1-4烷基。在一些實施方式中，R^1A和R^2A一起形成-CH₂-CH₂-。在一些實施方式中，R^1A和R^2A一起形成-CH₂-CH₂-且R^1B和R^2B為–H或甲基。

在一些實施方式中，R^1A和R^1B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)，優(yōu)選形成吡咯烷、哌啶、哌嗪或嗎啉。適當(dāng)?shù)兀鼈兣c它們所結(jié)合的原子一起形成5元雜環(huán)，優(yōu)選形成吡咯烷。

在一些實施方式中，R^2A和R^2B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)，優(yōu)選形成吡咯烷、哌啶、哌嗪或嗎啉。適當(dāng)?shù)兀鼈兣c它們所結(jié)合的原子一起形成5元雜環(huán)，優(yōu)選形成吡咯烷。

如本文所述，Z可以選自-O^-、-S^-、-Se^-、-N^-R^N或-BH₃^-，其中R^N為-H、-C_1-4烷基或保護(hù)基團(tuán)。優(yōu)選地，Z選自-O^-或-S^-，最優(yōu)選-O^-。應(yīng)當(dāng)理解，-P⁺-O^-是-P＝O的共振結(jié)構(gòu)。

一些優(yōu)選的化合物為以下式表示的化合物：

在另一個方面，本發(fā)明提供一種寡核苷酸，其具有至少一個式FVII所示的改性磷酸酯部分：

其中R¹和R²如本文所定義。

在另一個方面，本發(fā)明提供一種寡核苷酸，其中連接相鄰核苷/核苷類似物的磷酸酯包含磷?；?、磷?；?、磷酰基異脲、磷?；惲螂?、磷酰亞胺酸酯或磷酰基硫代亞胺酸酯。

在另一個方面，本發(fā)明提供一種合成包含式FVII所示的模體的化合物的方法：

在一個方面，該方法包括亞磷酸與亞胺基衍生物HN＝CR¹R²或N-硅烷化的亞胺基衍生物R^Si₃SiN＝CR¹R²在氧化劑、任選的硅烷化劑和/或堿的存在下發(fā)生反應(yīng)(工序A)，其中每個R^Si為烷基或芳基。例如，該亞磷酸衍生物可以是亞磷酸酯或H-亞磷酸酯。

工序A的亞胺基衍生物的實例包括但不限于1,1,3,3-四甲基胍(TMG)、胍鹽酸鹽、1,1-二甲基胍硫酸鹽、1,3-二苯基胍、甲脒鹽酸鹽、乙脒鹽酸鹽、1H-吡唑-1-甲脒鹽酸鹽、N-B℃-1H-吡唑-1-甲脒、乙基甲脒鹽酸鹽、乙基乙脒鹽酸鹽、O-甲基異脲硫酸氫鹽、S-甲基異硫脲硫酸氫鹽、S-苯甲基異硫脲鹽酸鹽等。

應(yīng)當(dāng)理解，亞胺基衍生物可以是游離堿或本文所述的鹽的形式。如果該亞胺基衍生物為鹽，則可以加入堿來釋放出該亞胺基衍生物的游離堿，以及/或者可以使用硅烷化劑來制備亞胺基化合物的N-硅烷基化衍生物。所述氧化劑可以是碘I₂、溴Br₂、氯Cl₂、氯化碘Icl、N-溴琥珀酰亞胺、N-氯琥珀酰亞胺、N-碘琥珀酰亞胺、四氯化碳CCl₄、溴三氯甲烷CCl₃Br、四溴甲烷CBr₄、四碘甲烷CI₄、三碘甲烷CHI₃、六氯乙烷C₂Cl₆、六氯丙酮(CCl₃)₂CO等。優(yōu)選的氧化劑為碘I₂。

在另一個方面，該方法包括亞磷酸衍生物與有機(jī)疊氮化物任選地在硅烷基化劑和/或堿的存在下進(jìn)行反應(yīng)(工序B)。

例如，有機(jī)疊氮化物可以選自雙(二取代氨基)-1-疊氮碳鎓鹽、1-(二取代氨基)-1-疊氮胍鹽、1-(二取代氨基)-1-疊氮-乙烯、N-取代的-1-疊氮胍等。在工序A和工序B的反應(yīng)中，反應(yīng)可以在硅烷化劑的存在下進(jìn)行，該硅烷化劑例如為N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)、N,O-雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)、氯三甲基硅烷、溴三甲基硅烷、碘三甲基硅烷、三乙基甲硅烷基氯化物、三苯基甲硅烷基氯化物、六甲基二硅氮烷、三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)、二甲基異丙基甲硅烷基氯化物、二乙基異丙基甲硅烷基氯化物、叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物、叔丁基二苯基甲硅烷基氯化物、三異丙基甲硅烷基氯化物、二甲基二氯硅烷、二苯基二氯硅烷等。例如，該反應(yīng)可以在選自N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)、N,O-雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)和氯三甲基硅烷中的甲硅烷基化劑的存在下進(jìn)行。

在工序A和工序B的反應(yīng)中，反應(yīng)可以在堿的存在下進(jìn)行，該堿例如為三乙基胺、N,N-二異丙基乙基胺(DIEA)、N-甲基嗎啉、N-乙基嗎啉、三丁基胺、1,4-二氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷(DABCO)、N-甲基咪唑(NMI)、吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1,8-雙(二甲基氨基)萘(“質(zhì)子海綿”)、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、1,5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1,5,7-三氮雜雙環(huán)[4.4.0]癸-5-烯(TBD)、7-甲基-1,5,7-三氮雜雙環(huán)[4.4.0]癸-5-烯(MTBD)、1,1,3,3-四甲基胍(TMG)、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍、2,8,9-三甲基-2,5,8,9-四氮雜-1-磷雜雙環(huán)[3.3.3]十一烷、磷腈堿等。

用于工序A的溶劑的例子包括但不限于吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、喹啉、四氫呋喃(THF)、1,4-二噁烷、1,2-二甲氧基乙烷(DME)、二乙二醇二甲基醚(diglym),二乙基醚、乙腈等。

用于工序B的溶劑的例子包括但不限于乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、四甲基脲、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、環(huán)丁砜、六甲基磷酸三酰胺(HMPT)、1,4-二噁烷、四氫呋喃(THF)、丙酮、乙酸乙酯等。

下面介紹這工序的其它細(xì)節(jié)。

如本文所述，本發(fā)明的該性磷酸酯部分的具體優(yōu)點如本發(fā)明人所論述的那樣，這些部分便于引入。例如，在基于H-膦酸酯或亞磷酰胺化學(xué)反應(yīng)的序列寡核苷酸合成中，式VI的改性磷酸酯部分能夠便利地引入到寡核苷酸中。下面介紹其他細(xì)節(jié)。

本發(fā)明的一個或多個方面可以與本發(fā)明的任一個或多個其他方面組合。相似地，這些方面中的任一個或多個特征以及任選的特征可以應(yīng)用到任一個其它方面。因此，這里討論的任選和優(yōu)選的特征可以應(yīng)用到一些或全部方面中。具體而言，涉及化合物、模體和中間體、制備化合物的方法以及使用化合物的方法等的任選和優(yōu)選的特征適用于全部的其它方面。例如，化合物的優(yōu)選取代基也適用于疊氮化物/亞胺基衍生物，反之亦然。此外，與方法或用途有關(guān)的任選和優(yōu)選的特征也可以應(yīng)用于產(chǎn)品，反之亦然。

說明書附圖

參照以下附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不限于以下附圖：

圖1.用N,N,N’,N’-四甲基-N”-膦?；一鶊F(tuán)改性的寡核苷酸5’-d(GCGCCAAACpA)(細(xì)黑線)、5’-d(GCGCCAAApCpA)(灰色線)和5’-d(GCGCCAApApCpA)(粗黑線)的RP-HPLC；這里和以下р標(biāo)記改性基團(tuán)的位置。

圖2.用N-磷?；一鶊F(tuán)改性的寡核苷酸5’-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTрT)的RP-HPLC。

圖3.具有LNA核苷酸的寡脫氧核糖核苷酸5’-d(TTTT)tdT(細(xì)黑線)、用N,N,N’,N’-四甲基-N”-磷?；一鶊F(tuán)改性的5’-d(TTTT)tpdT(灰色線)和5’-tpd(TTTTT)(虛線)的RP-HPLC；t標(biāo)記LNA核苷酸的位置。

圖4.用N,N'-雙(四亞甲基)-N”-磷?；一鶊F(tuán)改性的寡-2'-O-甲基核糖核苷酸5’-UUUUUp*U(粗黑線)、用N,N’-二甲基-N”-磷酰基亞胺基-2-咪唑烷基改性的5’-UUUUUpU(灰色線)和未改性的寡-2'-O-甲基核糖核苷酸5’-UUUUUU(細(xì)黑線)的RP-HPLC。

圖5.用N-氰基亞氨基磷酸酯基團(tuán)改性的寡核苷酸5’-d(TрTTTTT)的RP-UPLC。

圖6.用N,N'-雙(四亞甲基)-N”-胍基磷酸酯基團(tuán)改性的寡核苷酸5’-d(TTTTTT)р(粗黑線)、5’-DMTr-Flu pd(TTTTTT)(細(xì)黑線)和核苷酸5’-DMTr-Flu pdT(灰色線)的RP-HPLC。

圖7.用N,N’-二甲基-N”-磷?；鶃啺坊?2-咪唑烷基團(tuán)改性的寡核苷酸5’-d(TTTTTрT)、5’-d(TTTTpTрT)、5’-d(TTTpTpTрT)、5’-d(TTpTpTpTрT)和5’-d(TpTpTpTpTрT)的RP-HPLC；р標(biāo)記改性基團(tuán)的位置。

圖8.在全部間核苷位置用N,N’-二甲基-N”-磷酰基亞胺基-2-咪唑烷基團(tuán)完全改性的寡核苷酸5’-d(GpCpGpCpCpApApApCpA)的RP-HPLC。

縮寫和符號

p–表示所描述的改性磷酸酯基團(tuán)的位置

t–表示LNA-T核苷酸的位置

a–表示LNA-A核苷酸的位置

c–表示LNA-5-Me-C核苷酸的位置

g–表示LNA-G核苷酸的位置

F–2-羥基甲基-3-羥基四氫呋喃(脫嘌呤/脫嘧啶位點)磷酸酯

BHQ–BlackHole Quencher^TM

DD–1,12-十二烷二醇磷酸酯

Flu–5(6)-羧基熒光素標(biāo)記

N_S–表示核苷酸的硫代磷酸酯殘基“N”

BSA–N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺

BSTFA–N,O-雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺

DIEA–N,N-二異丙基乙基胺

NMI–N-甲基咪唑

DMAP–4-二甲基氨基吡啶

DBU–1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯

TMG–1,1,3,3-四甲基胍

具體實施方式

磷酰基胍在自然界表現(xiàn)為例如磷酸肌酸和磷酸精氨酸的化合物。合成的低分子量磷酰基胍至少從20世紀(jì)60年代起就是已知的[52]。小分子磷酰基胍被發(fā)現(xiàn)有限的農(nóng)藥[53]、阻燃劑[54]和治療藥物[55]用途。磷酰基胍二酯通過胍氮原子與金屬離子形成絡(luò)合物[56]。O,O’-二異丙基磷酰基胍的X-射線分析已經(jīng)證實在晶體結(jié)構(gòu)中僅存在具有磷?；鶃啺坊鶊F(tuán)>P(＝O)–N＝C<的互變異構(gòu)體。

然而，到目前為止還沒有報道核苷或寡核苷酸衍生物，它們的性質(zhì)還是未知的。本發(fā)明采用與之前報道的與仲胺相關(guān)的方法[57]類似的方法通過在N,N,N’,N’-四甲基胍(TMG)的存在下在吡啶中進(jìn)行二硫嘧啶β-氰基乙基亞磷酸酯的碘氧化首次制備了寡核苷磷?；?。

本發(fā)明人研究了CPG-結(jié)合的3’,5’-二硫嘧啶β-氰基乙基亞磷酸酯的氧化，其是一種在根據(jù)β-氰基乙基亞磷酰胺方法的固相DNA分析中常見的中間體[58]。如前所述，用0.1M的碘的干燥吡啶溶液在1M TMG和20％N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺的存在下將上述亞磷酸酯氧化生成3’,5’-二硫嘧啶-N,N,N’,N’-四甲基磷?；易鳛橹鳟a(chǎn)物。在室溫下濃氨水處理1小時后以兩種非對映異構(gòu)體的混合物的形式分離出寡核苷酸5’-d(TTTTTpT),其中p表示改性磷酸酯基的位置(實施例1.1)。分離出的唯一副產(chǎn)物是dT₆，其可能是痕量水導(dǎo)致同時發(fā)生的反應(yīng)性碘磷中間體水解的結(jié)果。本發(fā)明人以得出結(jié)論，磷?；一鶊F(tuán)在固相寡核苷酸分析和pH11下氨脫保護(hù)過程中是穩(wěn)定的。

通過MALDI-TOF MS證實了寡胸腺嘧啶脫氧核苷單磷?；业耐暾?。其在20％丙烯酰胺凝膠中的凝膠電泳過程中的移動性比dT6低，這表明suggesting charge neutral character of the四甲基磷?；一鶊F(tuán)在pH7.4下為電中性，這與低分子量磷?；业奈墨I(xiàn)數(shù)據(jù)對應(yīng)[59]。

通過合成具有一個四甲基磷?；一鶊F(tuán)的20-聚體寡胸苷酸，本發(fā)明人注意到隨著載體的增加產(chǎn)率逐漸變差，5’-d(T₁₈TрT)>5’-d(T₁₀TрT₉)>5’-d(TTрT₁₈)。所得到的寡胸苷酸用于通過與dT₂₀比較來確定單四甲基磷?；一鶊F(tuán)對具有寡核苷酸5’-d(C₂A₂₀C₂)的互補(bǔ)雙鏈熱穩(wěn)定性的影響。

本發(fā)明人還成功獲得了具有未取代的磷?；一鶊F(tuán)的寡核苷酸。在0.5M胍鹽酸鹽、0.5M 1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)和20％BSA的存在下用0.1M碘的吡啶溶液對CPG-結(jié)合的3’,5’-二硫嘧啶β-氰基乙基亞磷酸酯進(jìn)行氧化，然后合成寡核苷酸，制備了具有磷酰基胍基團(tuán)的六胸苷酸作為主產(chǎn)物以及dT₆水解產(chǎn)物(實施例5)。

類似地，在甲脒鹽酸鹽、DBU和BSA的存在下在吡啶中進(jìn)行二硫嘧啶亞磷酸酯的碘氧化，然后合成寡核苷酸，結(jié)果形成了六胸苷酸磷酰基甲脒，其是另一類磷?；鶃啺坊衔锏拇恚毫柞；?實施例39).

在0.5M O-甲基異脲硫酸氫鹽、1M DBU和20％BSA的存在下用0.1M碘的吡啶溶液進(jìn)行CPG-結(jié)合的3’,5’-二硫嘧啶β-氰基乙基亞磷酸酯的氧化，然后合成寡核苷酸并用濃氨水在室溫下脫保護(hù)1h，根據(jù)MALDI-TOFMS可知，結(jié)果得到含有dT₆、寡核苷O-甲基磷?；愲搴土柞；业幕旌衔?實施例7)。后者可能是通過氨取代磷?；愲宓募籽趸纬傻?。另外在55℃下進(jìn)行氨處理16h，結(jié)果導(dǎo)致磷酰基胍的量增加以及O-甲基磷?；愲宓牧拷档汀Ｍ瑯拥?，用乙二胺的乙醇溶液(1:1v/v)在55℃下處理該混合物16h，導(dǎo)致O-甲基磷?；愲逑Р⒌玫絅-β-氨基乙基磷?；易鳛橹鳟a(chǎn)物(實施例8)。這提供了將寡核苷酸中帶負(fù)電的磷酸酯取代為帶正電的基團(tuán)的途徑，因為N-β-氨基乙基磷?；一鶊F(tuán)在生理pH下應(yīng)該是代正電的。陽離子性寡核苷磷?；铱梢栽跊]有外部轉(zhuǎn)染劑存在的情況下潛在地顯示提高的細(xì)胞攝取體內(nèi)遞送。

如本文所述，本發(fā)明人獲得了具有一個未取代的磷?；一鶊F(tuán)的20聚體寡胸苷酸(Fig.2)。產(chǎn)率隨著寡核苷酸的長度而降低，d(T₁₈TрT)>d(T₁₀TрT₉)>d(TTрT₁₈)。還制備了具有兩個和三個磷?；一鶊F(tuán)的寡核苷酸；但是，反應(yīng)得到難以分離的產(chǎn)物混合物，從而本發(fā)明人得出結(jié)論，碘氧化化學(xué)反應(yīng)對制備單取代寡核苷酸最有效的。

如本文所述，H-膦酸酯化學(xué)反應(yīng)可以用于制備具有兩個和三個改性基團(tuán)的寡核苷酸[63]。可以用0.1M碘和20％vol.TMG的吡啶溶液加入或不加入BSA(實施例1.2和1.3)或者用CCl₄或CCl₃Br和20％vol.TMG的吡啶溶液(實施例1.4和1.5)將CPG-加載的3’,5’-二硫嘧啶-H-膦酸酯氧化成N,N,N’,N’-四甲基磷?；襕64]。在碘的情況下轉(zhuǎn)化率(70-75％)高于CCl₄或CCl₃Br的情況(10-20％)。在BSA的存在下，轉(zhuǎn)化率增加至80-85％。在使用亞磷酰胺法的固相合成之后，以良好的產(chǎn)率得到具有四甲基磷?；一鶊F(tuán)的六胸苷酸5’-d(TTTTTpT)，以及副產(chǎn)物dT₅和dT₆(實施例1.3)。本發(fā)明人通過碘/TMG/BSA氧化成功得到了二取代-和三取代的磷?；?’-d(TTTTрTрT)(實施例3.1)和5’-d(TTTрTрTрT)(實施例4.1)，但是后以情況的產(chǎn)率較低。

為了提高寡核苷磷?；业漠a(chǎn)率，本發(fā)明人開發(fā)了在N,N-二甲基甲酰胺或乙腈中在存在或不存在BSA的情況下CPG-結(jié)合的二核苷β-氰基乙基亞磷酸酯和四烷基疊氮碳鎓鹽之間的新型反應(yīng)。該反應(yīng)可以在室溫下或在40-45℃下進(jìn)行。加入5％三乙基胺和BSA可提高產(chǎn)率。該方法證明對制備具有多個四烷基磷酰基胍基團(tuán)的寡核苷酸是有效的(Fig.1)。該方法的自動模式的DNA合成器被用于制備完全改性的寡核苷磷?；?實施例47)。

連同電中性或陽離子性的磷?；?，本發(fā)明人還制備了含有可離子化的N-氰基亞胺基磷酸酯基團(tuán)的寡核苷酸。在這種情況下，CPG-結(jié)合的二核苷亞磷酸酯在室溫下與0.25M疊氮化氰乙腈溶液反應(yīng)。結(jié)果表明，寡核苷酸的產(chǎn)率取決于所使用的脫保護(hù)方法。當(dāng)用乙二胺和乙醇混合物(1:1v/v)[65]代替氨水來使具有N-氰基亞胺基磷酸酯基的寡核苷酸70℃脫保護(hù)1h的情況下，得到良好的結(jié)果(實施例40和41)。

所得到的N-氰基亞胺基六胸苷酸5’-d(TTTTTpT)和5’-d(TpTTTTT)的電泳移動性與dT₆非常相似，這表明N-氰基亞胺基在生理pH下帶負(fù)電。該寡核苷酸與未改性的六胸苷酸相比僅略顯示疏水性。RP-HPLC檢測中觀察到兩種非對映異構(gòu)體(Fig.5)。

發(fā)現(xiàn)一系列的改性寡核苷酸與磷?；腋男约嫒?，特別是核糖核苷酸衍生物，如寡-2’-O-甲基核糖核苷酸(Fig.4)、LNA(Fig.3)和RNA自身(實施例46)。硫代磷酸酯基團(tuán)可以成功地與磷?；一鶊F(tuán)一起結(jié)合至寡核苷酸(實施例32-35)。一系列其它改性例如熒光素、脫堿基位點、非核苷插入或或黑洞淬滅劑是可以忍受的。還制備了具有3’-或5’-磷?；一膯魏塑账?實施例42和44,Fig.6)。

定義

術(shù)語“核苷酸”表示含有核苷或改性核苷且至少一個磷酸酯基或改性磷酸酯基通過共價鍵與其連接的化合物。示例性的共價鍵包括但不限于核苷的3’、2’或5’羥基與磷酸酯基之間的酯鍵。

術(shù)語“寡核苷酸”表示含有兩個或多個核苷酸連接在一起形成聚合鏈的化合物。寡核苷酸可以是脫氧核糖核酸或核糖核酸。寡核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的。在雙鏈寡核苷酸的情況下，一個或兩個鏈可以含有本發(fā)明的改性磷酸酯。

寡核苷酸可以是兩種或多種核苷酸的聚合物，但是y可以具有任一長度。例如，寡核苷酸可以具有以下最小長度中的一種：2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,或40個核苷酸。任選地，其可以具有以下最大長度中的任一種：10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490或500個核苷酸，但是在一些實施方式中也提供更長的寡核苷酸。純粹地,通過實施例的方式提供具有以下長度的寡核苷酸：2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99或100個核苷酸。

在本發(fā)明的寡核苷酸中，一個、若干個(e.g.2,3,4,5,6,7,8,9,10個或更多個)核苷酸或每個核苷酸可以包含本發(fā)明的改性磷酸酯。

本發(fā)明的核苷酸和寡核苷酸可以包含本文所述的化學(xué)改性，例如在糖位置、磷酸酯位置和/或核酸的堿基位置的化學(xué)取代，包括，例如，引入改性的核苷酸、引入封端模體(e.g.3’封端)、結(jié)合至高分子量、非免疫性化合物(e.g.聚乙二醇(PEG))、結(jié)合至低分子量化合物(e.g.膽固醇)、結(jié)合至肽(e.g.a細(xì)胞穿透性肽)、磷酸酯基上的取代(e.g.硫代磷酸酯)。堿基改性可以包括5-位嘧啶改性、在環(huán)外胺處的改性、4-硫脲苷的取代、5-溴-或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架改性。糖改性可以包括2’-氨基核苷酸(2’-NH₂)、2’-氟核苷酸(2’-F)、2’-O-甲基(2’-OMe)核苷酸、2’-O-烯丙基核苷酸、2’-O-β-甲氧基乙基核苷酸、“鎖定”核苷酸(e.g.LNA)或三環(huán)-DNA核苷酸。磷酸酯的中心磷原子與核苷之間或各核苷之間的結(jié)合可以合適地經(jīng)由氧，即核苷的3’端和/或5’端為醇。但是，也估計存在核苷的3’端和/或5’端不是醇的核苷類似物也是合適的類似物的情況。例如，核苷的3’端和/或5’端可以為硫醇、硒醇或胺。

本發(fā)明的核苷酸和寡核苷酸可以以分離或純化的形式提供。

術(shù)語“核苷”表示含有糖部分和核堿基的化合物。示例性的糖包括但不限于核糖、2-脫氧核糖、阿拉伯糖等。示例性的核堿基包括但不限于胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、4-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮腺嘌呤、7-脫氮-8-氮鳥嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤等。

本文所用的術(shù)語“核苷類似物”表示糖部分被環(huán)結(jié)構(gòu)或非環(huán)結(jié)構(gòu)代替的改性的核苷。糖部分被其它環(huán)結(jié)構(gòu)代替的示例性的核苷類似物包括但不限于嗎啉代的單體單元(PMO)和三環(huán)-DNA。糖部分被非環(huán)結(jié)構(gòu)代替的示例性的核苷類似物包括但不限于肽核酸(PNA)和甘油核酸(GNA)的單體單元。術(shù)語“核苷類似物”還表示任一部分被任何性質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)代替的核苷。示例性的這樣的核苷類似物包括但不限于2’-代核苷，如2’-氟、2-脫氧、2’-O-甲基、2’-O-β-甲氧基乙基、2’-O-烯丙基核糖體核糖核苷、2’-氨基、鎖定的核酸(LNA)單體等。

適當(dāng)?shù)?，核苷類似物可以包括下述的糖部分被嗎啉環(huán)代替的核苷類似物。

應(yīng)當(dāng)理解，在這種類型的結(jié)構(gòu)中，也類似的采用在一般糖化學(xué)中采用的標(biāo)記3’和5’。即，在所述結(jié)構(gòu)中，環(huán)上的羥基甲基取代基被認(rèn)為是5’端，三價氮被認(rèn)為是3’端。

本文所用的術(shù)語“寡核苷酸類似物”表示其磷酸酯基團(tuán)被化學(xué)改性或其核苷被改性核苷類似物代替的改性寡核苷酸。示例性的寡核苷酸類似物包括但不限于硫代磷酸酯寡核苷酸(PS)、磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(嗎啉代,PMO)、三環(huán)-DNA和肽核酸(PNA)。

術(shù)語“肽核酸”通常表示用肽鍵取代磷酸酯基團(tuán)的寡核苷酸類似物。但是，如本文所述，其包括可以引入本發(fā)明的改性磷酸酯基團(tuán)的化合物。應(yīng)當(dāng)理解，這些化合物也可以包含在本申請中。

本文所使用的術(shù)語“磷酸酯基”表示磷酸H₃PO₄的氫原子被分別被一個、兩個或三個有機(jī)基團(tuán)取代而形成磷酸酯、磷酸二酯或磷酸三酯。

術(shù)語“改性磷酸酯基”表示與磷連接的任一氧原子被任何性質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)代替的磷酸酯基團(tuán)。合適的代替可以包括硫、硒、亞胺基(NR)和硼烷(-BH₃^-)。例如，該基團(tuán)可以是硫代磷酸酯基、硒代磷酸酯或硼烷磷酸酯基。優(yōu)選地，“改性磷酸酯基”為硫代磷酸酯基。

應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)它們的取代，本文所述的磷酸酯和取代磷酸酯可以是手性的。在未標(biāo)明立體化學(xué)的情況下，結(jié)構(gòu)包括Rp構(gòu)型和Sp構(gòu)型，各構(gòu)型的分離體和其混合物(例如，外消旋混合物)。例如，但不限于以下結(jié)構(gòu)：

如前所述，包括

應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的化合物可以包含大于1個的手性中心。除非另有說明，否則是指包含所有對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體。

本文所使用的術(shù)語“保護(hù)的寡核苷酸”是指引入了一個或多個保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸。

本文所使用的術(shù)語“脫保護(hù)的寡核苷酸”是指一個或多個保護(hù)基團(tuán)被移除了的寡核苷酸。

應(yīng)當(dāng)理解，提及核苷、核苷酸和寡核苷酸，包括其被保護(hù)的形式。

術(shù)語“保護(hù)基團(tuán)”是指用于暫時阻斷化合物活性位點的化學(xué)基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)在特定條件下會被移除。示例性的保護(hù)基團(tuán)包括但不限于乙?；?Ac)、苯甲?；?Bz)、異丁酰基(Ibu)、叔丁基苯氧基乙酰基(Tac)、乙酰丙?；?Lev)、甲基(Me)、2-氰基乙基(CE)、烯丙基(All)、2-氯苯基(o-ClPh)、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)、4-甲氧基三苯甲基(MMTr)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三異丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)等。

本文所使用的術(shù)語“連接基”包括將化合物與固體載體連接并且在特定條件下斷裂而從所述載體釋放所述化合物的化學(xué)基團(tuán)。在固相寡核苷酸合成中使用的示例性的連接基包括但不限于琥珀酰基、二乙醇?；⒁叶；漉?O,O’-二乙?；?Q-連接基)、鄰苯二甲?；?,5-二氯鄰苯二甲?；?、丙二酰基、戊二?；?、二異丙基甲硅烷基、1,1,3,3-四異丙基二硅氧烷-1,3-二基等。

其它連接基可以包括插入到寡核苷酸或改性寡核苷酸中的非核苷酸化學(xué)基團(tuán)(“核苷間/核苷酸間連接基”)，或在核苷酸與其它化學(xué)基團(tuán)之間形成連接的非核苷酸化學(xué)基團(tuán)，例如標(biāo)簽或淬滅劑。合適的連接基是本領(lǐng)域已知的并且包括1,12-十二烷二醇磷酸酯(DD)。

術(shù)語“固體載體”表示在固相寡核苷酸合成中使用的聚合物載體。示例性的固體載體包括但不限于可控多孔玻璃(CPG)、聚苯乙烯樹脂、樹脂、TSK樹脂、聚乙烯醇樹脂等。本文所用的術(shù)語“固體載體”還表示所使用的非樹脂型固體載體，例如，在多重寡核苷酸合成中，包括但不限于濾片、多芯體系、多孔板等。

本文所使用的術(shù)語“有機(jī)基團(tuán)”表示含有一個或多個與其它原子連接的碳原子且在碳原子上具有游離鍵的化學(xué)基團(tuán)。其它原子的實例包括但不限于氫、氮、氧、氟、硅、磷、硫、氯、溴和碘。

本文所使用的術(shù)語“烷基”表示直鏈或支鏈環(huán)形式或非環(huán)形式。術(shù)語“烷基”包括一價直鏈或支鏈的飽和的非環(huán)烴基。C_1-4烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基或叔丁基。

術(shù)語“烯基”包括具有至少一個碳碳雙鍵的一價直鏈或支鏈的不飽和非環(huán)烴基，在一些實施方式中，不包含碳碳三鍵。在一些實施方式中，烯基為C_2-10烯基，在一些實施方式中為C_2-6烯基,在一些實施方式中C_2-4烯基。

術(shù)語“炔基”包括具有至少一個碳碳三鍵的一價直鏈或支鏈不飽和烴基，在一些實施方式中，不包含碳碳雙鍵。在一些實施方式中，炔基為C_2-10炔基,在一些實施方式中為C_2-6炔基,在一些實施方式中為C_2-4炔基。

術(shù)語“雜環(huán)化合物”表示包含雜環(huán)基的化合物。術(shù)語“雜環(huán)基”表示包含一個或多個(例如1,2,3,4或5個)環(huán)雜原子的飽和、部分不飽和或不飽和(e.g.芳香)一元環(huán)或二元環(huán)的基團(tuán)，所述環(huán)雜原子選自O(shè)、S(O)_t(其中t為0,1,或2)或N，所述雜環(huán)基包括未取代的基團(tuán)或用一個或多個取代基(例如1,2,3,4或5個取代基)取代的基團(tuán)，任選地其中一個或多個一起形成環(huán)體系。除非另有說明，否則在雜環(huán)基鍵合至另一基團(tuán)的情況下，雜環(huán)基可以是C-連接的或N-連接的，即，其可以通過環(huán)碳原子或通過環(huán)氮原子(即環(huán)內(nèi)氮原子)連接至分子的其它部分。術(shù)語雜環(huán)基因此包括本文所定義的任選取代的雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基和雜芳基。

術(shù)語“芳基”包括一價芳香環(huán)狀烴基，如苯基或萘基(e.g.1-萘基或2-萘基)。通常，芳基可以是單環(huán)或多環(huán)的稠合環(huán)芳香族基團(tuán)。

術(shù)語“雜芳基”包括一個或多個碳原子被獨立地選自O(shè)、S、N和NR^N代替的芳基，其中R^N如本文所定義。

術(shù)語“鹵素”表示-F、-Cl、-Br和-I。在一些實施方式中，鹵素為-F、-Cl或-Br。在一些實施方式中，鹵素為–F或–Cl，例如Cl。

一般而言,雜芳基可以是單環(huán)或多環(huán)(e.g.二環(huán))稠合環(huán)狀雜芳基。典型地，雜芳基含有5-10個環(huán)原子，其中1、2、3或4個環(huán)原子獨立地選自O(shè)、S、N和NR^N。

如本文中所使用的，術(shù)語“任選取代的”表示可以被一個或多個(最多為該取代基上的自由價的最大數(shù))取代基取代的取代基。所述取代基可以選自：

-C_1-4烷基,

-F,-Cl,-Br,-I

-CF₃,-℃F₃,-SCF₃,

-OH,-L-OH,-O-L-OH,-NH-L-OH,-NR³⁰-L-OH,

-℃_1-4烷基,-L-℃_1-4烷基,-O-L-℃_1-4烷基,-NH-L-℃_1-4烷基,-NR³⁰-L-OC_1-4烷基,

-SH,-SC_1-4烷基,

-CN,

-NH₂,-NHC_1-4烷基,-N(C_1-4烷基)₂,

-L-NH₂,-L-NHC_1-4烷基,-L-N(C_1-4烷基)₂,

-℃(O)C_1-4烷基,

-C(O)OH,-C(O)℃_1-4烷基,

-C(O)C_1-4烷基,

-C(O)NH₂,-C(O)NHC_1-4烷基,-C(O)N(C_1-4烷基)₂,

-NHC(O)C_1-4烷基,-N(C_1-4烷基)C(O)C_1-4烷基；和

＝O；

其中各-L-為鍵或C_1-4亞烷基，R³⁰為-C_1-10烷基,-C_2-10烯基,-C_2-10炔基,-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基。

在一些實施方式中，這些任選取代基選自-C_1-4烷基,-F,-Cl,-CF₃,-OH,-℃_1-4烷基,-NH₂,-NHC_1-4烷基和-N(C_1-4烷基)₂。

本文所使用的術(shù)語“室溫”表示15–29℃范圍的溫度，優(yōu)選為20–25℃范圍的溫度。

反應(yīng)

如本文所述，本發(fā)明的改性磷酸酯部分的一個具體優(yōu)點如本發(fā)明人所描述的那樣是便于引入這些部分。例如，在基于H-膦酸酯或亞磷酰胺化學(xué)反應(yīng)的序列寡核苷酸合成中，式VI的改性磷酸酯部分可以方便地引入至寡核苷酸。因此，本發(fā)明提供合成本發(fā)明化合物的方法。這些方法可以使用固體加載的反應(yīng)試劑，并且可以在DNA合成器中進(jìn)行。

應(yīng)當(dāng)理解，磷酰基異脲、磷?；惲螂?、磷酰亞胺酸酯和磷?；虼鷣啺匪狨ナ腔钚灾虚g體，其通過與伯胺或仲胺反應(yīng)可以轉(zhuǎn)化成本文所述的磷酰基胍或磷?；?參見,例如，實施例7和8)。因此，本發(fā)明還提供具有磷?；一蛄柞；呋鶊F(tuán)的本文所述的化合物的合成方法，該方法包括使具有磷酰基異脲、磷?；惲螂?、磷酰亞胺酸酯或磷酰基硫代亞胺酸酯基團(tuán)的本文所述的化合物與伯胺或仲胺反應(yīng)。

H-膦酸酯化學(xué)反應(yīng)

H-膦酸酯化學(xué)反應(yīng)是方便的且已建立的化學(xué)寡核苷酸合成方法。適當(dāng)?shù)?，?jīng)由連接基固定于固體載體的5’-DMT-保護(hù)的核苷酸經(jīng)歷連續(xù)脫保護(hù)，然后與H-膦酸單酯發(fā)生耦合反應(yīng)形成H-膦酸二酯。在脫三苯基然后耦合的步驟之后，可以在序列中加入其它核苷單元，在與氧化劑典型地與碘組合結(jié)束時發(fā)生核苷間H-膦酸二酯連接被氧化成磷酸二酯連接。

如本文所述，本發(fā)明人已經(jīng)證明本發(fā)明的改性磷酸酯基能夠容易地引入到使用H-膦酸酯化學(xué)反應(yīng)組裝的寡核苷酸中。如本文所述，為了引入改性的磷酸酯，可以在合適的胍、脒、異脲、異硫脲、亞胺酯或硫代亞胺酯的存在下用合適的氧化劑進(jìn)行所述氧化，所述胍、脒、異脲、異硫脲、亞胺酯或硫代亞胺酯可以以游離堿或其鹽如鹽酸鹽或其它鹽的形式存在。合適的氧化劑包括碘I₂、溴Br₂、氯Cl₂、氯化碘Icl、N-溴琥珀酰亞胺、N-氯琥珀酰亞胺、N-碘琥珀酰亞胺、四氯化碳CCl₄、溴溴三氯甲烷CCl₃Br、四溴甲烷CBr₄,四碘甲烷CI₄、三碘甲烷CHI₃、六氯乙烷C₂Cl₆和六氯丙酮(CCl₃)₂CO。優(yōu)選的氧化劑為碘。

當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，在氧化之后，為了引入一個或多個改性的磷酸酯基，可以恢復(fù)脫三苯基然后耦合的循環(huán)，在鏈組裝過程中在合適的時刻進(jìn)行進(jìn)一步的氧化步驟。以這種方式，可以在鏈組裝過程中在合適的位置引入本發(fā)明的改性磷酸酯基。

可以使用各種本領(lǐng)域已知的溶劑，包括吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、喹啉、四氫呋喃(THF)、1,4-二噁烷、1,2-二甲氧基乙烷(DME)、乙腈。優(yōu)選的溶劑是吡啶。

可以優(yōu)選在氧化步驟中加入堿。適當(dāng)?shù)?，所述堿為胺堿，例如，三乙胺、N,N-二異丙基乙基胺(DIEA)、N-甲基嗎啉、N-乙基嗎啉、三丁基胺、1,4-二氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷(DABCO)、N-甲基咪唑(NMI)、吡啶、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1,8-雙(二甲基氨基)萘(“質(zhì)子海綿”)、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、1,5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、7-甲基-1,5,7-三氮雜雙環(huán)[4.4.0]癸-5-烯(MTBD)、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍、2,8,9-三甲基-2,5,8,9-四氮雜-1-磷雜雙環(huán)[3.3.3]十一烷或磷腈堿。例如，所述堿可以是三乙胺或DBU。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在引入改性磷酸酯模體的氧化過程中加入甲硅烷基化劑可能是優(yōu)選的。因此，可以加入N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA),N,O-雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA),氯三甲基硅烷,溴三甲基硅烷,碘三甲基硅烷,三乙基甲硅烷基氯化物,三苯基甲硅烷基氯化物,六甲基二硅氮烷,三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf),二甲基異丙基甲硅烷基氯化物,二乙基異丙基甲硅烷基氯化物,叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物,叔丁基二苯基甲硅烷基氯化物,三異丙基甲硅烷基氯化物,二甲基二氯硅烷,二苯基二氯硅烷或類似物。優(yōu)選的甲硅烷基化劑為N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)。

亞磷酰胺化學(xué)反應(yīng)

亞磷酰胺化學(xué)反應(yīng)也是化學(xué)合成寡核苷酸的有用的方法。與基于亞磷酰胺化學(xué)反應(yīng)的寡核苷酸化學(xué)反應(yīng)相關(guān)的循環(huán)在本領(lǐng)域是已知的。簡言之，將固體加載的核苷酸脫三苯基化，然后與適當(dāng)活化的核苷亞磷酰胺耦合形成亞磷酸三脂連接。然后可以發(fā)生封端，然后用氧化劑典型地用碘氧化亞磷酸三脂。然后重復(fù)該循環(huán)來組裝成鏈。

如本文所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在合適的胍、脒、異脲或異硫脲的存在下進(jìn)行所屬氧化步驟可以制備期望的改性磷酸酯基，所述胍、脒、異脲或異硫脲可以以其鹽的形式例如鹽酸鹽的形式存在。移除β-氰基乙基亞磷酸酯保護(hù)基團(tuán)從而完成該合成。如前所述，對于該氧化步驟而言，在H-膦酸酯方法中，期望加入堿和/或甲硅烷基化劑。

有機(jī)疊氮化物的使用

在這里還描述了通過二核苷β-氰基乙基亞磷酸酯和合適的有機(jī)疊氮化物任選地在甲硅烷基化劑如BSA的存在下反應(yīng)獲得本發(fā)明的改性磷酸酯基的新型反應(yīng)?？梢约尤雺A例如胺堿，例如三乙胺。

本發(fā)明人已經(jīng)證明該方法對于制備具有各種磷?；胰〈绞降墓押塑账崾怯行У?，所述磷?；胰〈绞嚼缬形慈〈?、單取代、二取代、三取代和四取代磷?；一鶊F(tuán)，以及對具有多種這類改性磷酸酯基的寡核苷酸是有效的。

適當(dāng)?shù)兀袡C(jī)疊氮化物可以是式R¹-C⁺(N₃)-R²的疊氮化物，例如雙(二取代氨基)-1-疊氮碳鎓鹽、1-(二取代氨基)-1-疊氮碳鎓鹽等，或1-(二取代氨基)-1-疊氮-乙烯、N-取代的-1-疊氮基胍；或以下式的疊氮化物：(N₃)₂C＝NR²、(N₃)₂C＝N⁺R^1AR^1B或疊氮化氰N₃–CN。有機(jī)疊氮化物可以使用本領(lǐng)域已知的方法制備。例如，四烷基脲可以轉(zhuǎn)化為疊氮雙(二烷基氨基)碳鎓鹽[60]，二烷基酰胺可以轉(zhuǎn)化為N,N-二烷基-疊氮碳鎓鹽[61]，三烷基脲或單烷基酰胺可以得到中性疊氮化物[62]。

適當(dāng)?shù)?，有機(jī)疊氮化物可以選自：

其中R¹,R²,R^1A,R^1B,R^2A和R^2B如本文所定義。在一些實施方式中，R²還可以是-N₃。

例如，疊氮化物可以選自：

其中，各R^1A,R^1B,R^2A,R^2B獨立地為-H或任選取代的C_1-10烷基,-C_2-10烯基,-C_2-10炔基,-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基；和/或

任選地，其中R^1A和R^2A一起形成2-4個原子長度的亞烷基或雜亞烷基鏈；任選地，其中R^1A和R^2A一起形成-CH₂-CH₂-，且R^1B和R^2B各自獨立地選自-H和甲基。

任選地，其中R^1A和R^1B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)；或者

任選地，其中R^2A和R^2B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)，任選地形成吡咯烷；

或者

其中，各R^1A和R^1B獨立地為-H或任選取代的C_1-10烷基,-C_2-10烯基,-C_2-10炔基,-C_6-10芳基或-C_5-10雜芳基；或者R^1A和R^1B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)，且R²選自-H,-F,-OPG,Cl,-Br,-I,-CN,-N₃,-O-C_1-10烷基,-SPG和-S-C_1-10烷基，其中PG為保護(hù)基團(tuán)。

在一些優(yōu)選的反應(yīng)中，有機(jī)疊氮化物為：

具有合適的反離子，例如氯離子。

合適的反離子包括但不限于氯Cl^─,溴Br^─,碘I^─,三氟甲磺酸根(三氟甲磺酸)CF₃SO₃^─,對甲苯磺酸根C₇H₇SO₃^─,二氯磷酸根PO₂Cl₂^─,高氯酸根ClO₄^─,四氟硼酸根BF₄^─,四苯基硼酸根BPh₄^─,六氟磷酸根PF₆^─等。在一些實施方式中，各R^1A,R^1B,R^2A和R^2B獨立地為-H或任選取代的C_1-10烷基,例如，H或任選取代的C_1-4烷基,例如，-H或甲基。在一些實施方式中，各R^1A,R^1B,R^2A和R^2B為甲基，即，得到用四甲基胍改性的磷酸酯。在一些實施方式中，R^1A和R^2A一起形成2-4個原子長度的亞烷基或雜亞烷基鏈，且R^1B和R^2B各自獨立地選自-H和C_1-4烷基。在一些實施方式中，R^1A和R^2A一起形成-CH₂-CH₂-。在一些實施方式中，R^1A和R^2A一起形成-CH₂-CH₂-，且R^1B和R^2B為-H或甲基。

在一些實施方式中，R^1A和R^1B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)，優(yōu)選形成吡咯烷,哌啶,哌嗪或嗎啉。例如它們可以與它們所結(jié)合的原子一起形成5元雜環(huán)，優(yōu)選形成吡咯烷。

在一些實施方式中，R^2A和R^2B與它們所結(jié)合的原子一起形成5-8元雜環(huán)，優(yōu)選形成吡咯烷,哌啶,哌嗪或嗎啉。例如，它們可以與它們所結(jié)合的原子一起形成5元雜環(huán)，優(yōu)選形成吡咯烷。

工序A和工序B

本文所述的化合物可以使用本文所述的工序A或工序B來合成。這些工序可以在自動寡核苷酸合成中使用，如這里所述以及在后文實施例中所描述的那樣。

工序A包括：

(i)在含有所述氧化劑、亞胺基衍生物和任選的甲硅烷基化劑、堿和溶劑的混合物中浸漬附著有保護(hù)的寡核苷酸或含有所述亞磷酸衍生物的保護(hù)改性寡核苷酸的固體載體；

(ii)使該固體載體保持浸漬并將溫度保持在所需范圍內(nèi)足夠的時間以確保所述亞磷酸衍生物轉(zhuǎn)化為改性磷酸基團(tuán)，由此制備具有改性磷酸基的式(I)的改性寡核苷酸；

(iii)按照期望的方案繼續(xù)固相寡核苷酸合成直到下一個期望的改性位點為止，然后重復(fù)步驟(i)和(ii)，或直到寡核苷酸序列結(jié)束；

(iv)進(jìn)行期望的脫保護(hù)和/或從固體載體上脫離，由此制備具有一個或多個改性磷酸酯基的脫保護(hù)的式(I)的改性寡核苷酸。

工序B包括：

(i)在含有所述有機(jī)疊氮化物、溶劑和任選的甲硅烷基化劑和堿的混合物中浸漬附著有保護(hù)的寡核苷酸或含有所述亞磷酸衍生物的保護(hù)改性寡核苷酸的固體載體；

(ii)重復(fù)工序A中的步驟(ii)至(iv)；

在該方法的最后回收改性寡核苷酸。

該方法可以在–20–150℃的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選在0–100℃，更優(yōu)選在15–80℃下進(jìn)行。

優(yōu)選地，工序A在室溫下進(jìn)行。

工序A中亞胺基衍生物的濃度適當(dāng)?shù)貫?.005–3M，更優(yōu)選0.1–1.5M。

工序B中疊氮化物的濃度適當(dāng)?shù)貫?.005–3M，優(yōu)選為0.1–1.5M。

任選地，可以加入甲硅烷基化劑。合適的甲硅烷基化劑包括N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA),N,O-雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA),氯三甲基硅烷,溴三甲基硅烷,碘三甲基硅烷,三乙基甲硅烷基氯化物,三苯基甲硅烷基氯化物,六甲基二硅氮烷,三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(TMSOTf),二甲基異丙基甲硅烷基氯化物,二乙基異丙基甲硅烷基氯化物,叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物,叔丁基二苯基甲硅烷基氯化物,三異丙基甲硅烷基氯化物,二甲基二氯硅烷,二苯基二氯硅烷等。在一些優(yōu)選的實施方式中，使用N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)作為甲硅烷基化劑。

任選地，可以加入堿。合適的堿為胺堿，例如，三乙胺,N,N-二異丙基乙基胺(DIEA),N-甲基嗎啉,N-乙基嗎啉,三丁基胺,1,4-二氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷(DABCO),N-甲基咪唑(NMI),吡啶,2,6-二甲基吡啶,2,4,6-三甲基吡啶,4-二甲基氨基吡啶(DMAP),1,8-雙(二甲基氨基)萘(“質(zhì)子海綿”),1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU),1,5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬-5-烯(DBN),1,5,7-三氮雜雙環(huán)[4.4.0]癸-5-烯(TBD),7-甲基-1,5,7-三氮雜雙環(huán)[4.4.0]癸-5-烯(MTBD),1,1,3,3-四甲基胍(TMG),2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍,2,8,9-三甲基-2,5,8,9-四氮雜-1-磷雜雙環(huán)[3.3.3]十一碳烷,磷腈堿等。

優(yōu)選的堿為三乙胺.

用于工序A的合適的溶劑包括吡啶,2-甲基吡啶,3-甲基吡啶,4-甲基吡啶,喹啉,四氫呋喃(THF),1,4-二噁烷,1,2-二甲氧基乙烷(DME),二乙二醇二甲醚(diglym),二乙醚,乙腈等。

用于工序A的優(yōu)選的溶劑為吡啶。

用于工序B的合適的溶劑包括乙腈,N,N-二甲基甲酰胺(DMF),N,N-二甲基乙酰胺(DMA),N-甲基吡咯烷酮(NMP),四甲基脲,1,3-二甲基-2-咪唑啉酮,環(huán)丁砜,六甲基磷酰三胺(HMPT),1,4-二噁烷,四氫呋喃(THF),丙酮,乙酸乙酯等。

用于工序B的優(yōu)選溶劑包括N,N-二甲基甲酰胺；N-甲基吡咯烷酮和乙腈。

寡核苷酸應(yīng)用

根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以在廣泛的用途中使用。例如，它們可以在體外例如用作研究或診斷試劑，或在體內(nèi)例如用作治療、診斷或研究試劑。因此，本發(fā)明的一個方面提供一種方法，該方法包括在體外或體內(nèi)使根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸(優(yōu)選單鏈)與具有高度序列完整性的寡核苷酸(優(yōu)選單鏈)接觸并使寡核苷酸雜交，(例如形成雙鏈寡核苷酸)。該方法可以任選進(jìn)一步包含檢測和/或定量所雜交的寡核苷酸的步驟。該方法可以是檢測特定寡核苷酸的方法，例如包含突變、變異或單一核苷酸多形態(tài)(SNP)的寡核苷酸。該方法可以是診斷患者疾病的方法，例如涉及檢測從患者采集的組織或體液樣本中的寡核苷酸。

可以設(shè)計和合成根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸來在核酸擴(kuò)增方法中，例如在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法中用作引物。

可以以在需要使用寡核苷酸微陣列的方法中所要使用的寡核苷酸微陣列(“DNA芯片”)的方式設(shè)計和制造根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸。

還可以使用本發(fā)明的寡核苷酸來設(shè)計和合成治療核酸，如siRNA(Angell&Baulcombe(1997)The EMBO Journal 16,12:3675-3684；and Voinnet&Baulcombe(1997)Nature 389:pg 553)；Fire A.et al.,Nature,Vol 391,(1998)；Fire(1999)Trends Genet.15:358-363,Sharp(2001)Genes Dev.15:485-490,Hammond et al.(2001)Nature Rev.Genes 2:1110-1119and Tuschl(2001)Chem.Bi℃hem.2:239-245)、核酶、適體(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase.Science.1990Aug 3；249(4968):505-10)；WO91/19813)、脫氧核酶、反義核酸、PMO、PNA、LNA或缺口聚物?；诠押塑账岬寞煼ㄔ诒绢I(lǐng)域中已知用于治療各種疾病，例如包括在病毒感染或病毒介導(dǎo)的疾病、癌癥、眼病如年齡相關(guān)性黃斑變性、預(yù)防不必要的新生血管形成、外顯子剪接缺陷癥如杜氏肌營養(yǎng)不良的治療中使用，以及用作抗膽固醇劑。針對這些治療已知或建議的寡核苷酸試劑的設(shè)計可以改性為引入本文所述的改性磷酸酯。

任選地，治療核酸可以被連接至遞送試劑如細(xì)胞穿透肽(如在WO2009/147368中所描述的)。

因此，在一個方面中，提供根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸來在藥物治療方法中使用，或在治療中使用。在另一個方面中，提供根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在制造治療所述疾病的藥物或藥物組合物的用途。在另一個方面中，提供一種治療疾病的方法，該方法包括對需要治療的患者施用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，由此治療所述疾病。

可以將根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸制劑化為藥物或藥物組合物。藥物或藥物組合物可以例如以純化或分離的形式包含本發(fā)明的寡核苷酸以及可藥用的載體、稀釋劑、賦形劑或佐劑。

可以將根據(jù)本發(fā)明的藥物和藥物組合物制劑化來通過各種途徑施用，所述途徑包括但不限于腸外,靜脈,動脈,肌內(nèi),口腔和鼻腔。該藥物或藥物組合物可以制劑化為液體或固體形式。液體制劑可以制劑化為通過注射到人體或動物體的選定區(qū)域來施用。

施用優(yōu)選以"治療有效量"進(jìn)行，其足以對個體顯示藥效。所施用的實際量和施用頻率以及時間過程取決于要治療的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療處方，如劑量的決定等由一般醫(yī)師和其它醫(yī)生負(fù)責(zé)，通常要考慮要治療的疾病、個體患者的情況、遞送位點、施用方法以及醫(yī)師所知的其它因素。以上提到的技術(shù)和方案的實例可以參見Remington’s Pharmaceutical Sciences,20th Edition,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins。

根據(jù)本發(fā)明的可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。術(shù)語“體外”是指在實驗室條件或培養(yǎng)基中對材料、生物質(zhì)、細(xì)胞和/或組織進(jìn)行試驗，術(shù)語“體內(nèi)”是對完整的多細(xì)胞器官進(jìn)行試驗或操作。

治療的受試者可以是任何動物或人。受試者優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人類。受試者可以是非人類的動物，但是更優(yōu)選為人類。受試者可以是男性或女性。受試者可以是患者。

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本發(fā)明包括所述方面和優(yōu)選特征的組合，除非該組合是明顯不允許的或明確避免的。

本文所使用的章節(jié)標(biāo)題是用于文章結(jié)構(gòu)的目的并不應(yīng)當(dāng)解釋為對發(fā)明的限定。

下面將參照附圖以實施例的方式描述本發(fā)明的方面和實施方式。其它方面和實施方式對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是清楚的。本文所提及的所有文件通過引用而并入本文。

在本說明書中，包括所附權(quán)利要求書中，除非上下文需要說明，否則詞語“包含”和其變形如“包括”和“含有”將被理解為包含所述的數(shù)量或步驟或數(shù)量組或步驟組，但不排除任何其它數(shù)量或步驟或數(shù)量組或步驟組。

必須注意，在說明書和所附權(quán)利要求書中使用時，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文有明確說明。在本文中范圍可能被表示為從“約”一個具體值,和/或到“約”另一個具體值。當(dāng)表示為這樣的范圍時，另一個實施方式包括從從一個具體值和/或到另一個具體值。類似地，當(dāng)使用前綴“約”近似地表示數(shù)值時，應(yīng)當(dāng)理解，具體數(shù)值形成另一個實施方式。

雖然已經(jīng)參照其特定的實施方式描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚在不脫離本發(fā)明真實精神和范圍的情況下可以進(jìn)行各種變換。

另外，可以進(jìn)行許多修改來使具體的情況、材料、物質(zhì)組成、方法、方法步驟適合本發(fā)明的客觀精神和范圍。所有這些修改包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

下面參照附圖通過以下非限定性實施例來描述本發(fā)明。

實施例

提供以下實施例是為了說明而不是為了限定本發(fā)明。

一般方法

改性寡核苷酸用Biosset自動DNA合成器ASM-800來合成，采用β-氰基乙基亞磷酰胺化學(xué)反應(yīng)[58]或H-膦酸酯化學(xué)反應(yīng)[66]，使用標(biāo)準(zhǔn)12μl柱子以0.2μmol的規(guī)模進(jìn)行合成。

所有反應(yīng)在具有旋蓋和橡膠O型圈的1.5ml聚丙烯管中進(jìn)行。在固相合成之后，將柱子的聚合物載體移至塑料管并用每5mg載體200μl解封溶液的量進(jìn)行處理。使用濃度(ca.33％)的氨水溶液(Soln A)或乙二胺和純乙醇的1:1vol混合物(Soln B)作為解封溶液。在解封之后，使用SpeedVac濃縮器真空蒸發(fā)上清液，并加入400μl的20mM三乙基乙酸銨,pH 7，通過離心移除載體。

通過DMTr OFF模式或DMTR ON模式的基于Agilent 1200系列色譜的反相(RP)HPLC純化改性寡核苷酸30min，在Zorbax SB-C18(5μm)柱(4.6×150mm)中采用0.02M三乙基乙酸銨中乙腈梯度0～40％,pH 7，流速2cm³min^-1。通過用100μl 80％乙酸處理15min然后用400μl 20mM三乙基乙酸銨,pH 7.0進(jìn)行中和并用SpeedVac濃縮器進(jìn)行蒸發(fā)，從而移除5’-末端DMTr基團(tuán)。然后通過添加1ml 1M LiClO₄丙酮溶液來使寡核苷酸沉淀，用丙酮清洗顆粒并在空氣中干燥20min。采用在20％聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)中的變形凝膠電泳利用Stains-All染色可視化的帶來檢查寡核苷酸的純度。通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離-飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜來確認(rèn)改性寡核苷酸的結(jié)構(gòu)，以負(fù)離子或正離子模式通過Bruker Reflex III Autoflex Speed質(zhì)譜儀進(jìn)行記錄，使用3-羥基吡啶甲酸作為基質(zhì)。

0.5M雙(二甲基氨基)疊氮碳鎓二氯磷酸鹽溶液的制備.

向雙(二甲基氨基)氯碳鎓二氯磷酸鹽的干燥MeCN(10ml)溶液(1.105g,4.1mmol)[67]中加入粉末化的干燥NaN₃(1.1當(dāng)量,288mg,4.4mmol)。將懸浮液在室溫下攪拌2h，過濾，用干燥MeCN清洗，在真空下蒸發(fā)并干燥，得到1.08g(95％)油狀產(chǎn)物。將69mg產(chǎn)物溶解于1ml DMF–Et₃N95:5(v/v)中，劇烈震蕩2min，通過以14,500rpm離心3min來分離沉淀，得到0.5M溶液，該溶液可以在室溫下保存最多一周。

制備1M 2-疊氮-1,3-二甲基咪唑啉鎓六氟磷酸鹽溶液.

在1.5ml塑料管中稱量2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓六氟磷酸鹽(139mg)和NaN₃(1.1當(dāng)量,36mg)，加入干燥乙腈(0.5ml)，將懸浮液在30℃下震蕩2h，然后通過以14,500rpm離心5min來分離沉淀，在–18℃下保存該溶液。

制備1M疊氮二吡咯碳鎓六氟磷酸鹽溶液.

在1.5ml塑料管中稱量氯二吡咯碳鎓六氟磷酸鹽(166mg)和NaN₃(1.1當(dāng)量,36mg)，加入干燥乙腈(0.5ml)，將懸浮液在30℃下震蕩2h，然后通過以14,500rpm離心5min來分離沉淀，在–18℃小保存該溶液。

實施例1.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTTpT)；這里和以下實施例中p表示改性磷酸酯基的位置。

1.1.工序(a)使用β-氰基乙基亞磷酸酯和碘.

在DNA合成器中安裝含有5mg of高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱，以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基、偶聯(lián)亞磷酰胺并封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml)。通過混合124μl N,N,N’,N’-四甲基胍(TMG),50μl N,O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)和325μl干燥吡啶來制備Soln 2，并以ca.1/4vol加入分子篩。在塑料管中混合20μl的Soln 1和2的混合試樣,加入10μl的BSA,等待1min之后將內(nèi)容物移至具有聚合物的管中。將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.

分子質(zhì)譜:calc.[M]1860.39,exp.[M+H]1860.93,[M-H]1859.14.

1.2.工序(a)使用H-膦酸酯和碘.

在DNA合成器中安裝含有5mg 5’-DMTr-dT CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol的規(guī)模啟動利用H-膦酸酯方法的自動固相DNA合成。在5’-脫三苯基和膦酸酯耦合之后中斷合成,并從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,并將附著有二核苷H-膦酸酯的載體移至塑料瓶中。通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml)。通過混合100μl TMG和400μl干燥吡啶(20％vol)來制備Soln 2,并以ca.1/4vol加入分子篩在具有載體的管中加入20μl的Soln 1和2的等分試樣，旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.分子質(zhì)譜:calc.[M]1860.39,exp.[M+H]1861.17,[M-H]1857.96.

1.3.工序(a)使用H-膦酸酯,BSA和碘.

在DNA合成器中安裝含有5mg 5’-DMTr-dT CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol的規(guī)模啟動利用H-膦酸酯方法的自動固相DNA合成。在5’-脫三苯基和膦酸酯耦合之后中斷合成,并從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,并將附著有二核苷H-膦酸酯的載體移至塑料瓶中。通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml)。通過混合125μl TMG(2M),50μl BSA(1M)和325μl干燥吡啶(20％vol)來制備Soln 2,并以ca.1/4vol加入分子篩。在具有載體的管中加入20μl的Soln 1和2的等分試樣,加入10μl BSA,并將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h。分子質(zhì)譜:calc.[M]1860.39,exp.[M+H]1861.17,[M-H]1857.96.

1.4.工序(a)使用H-膦酸酯和CCl₄.

在DNA合成器中安裝含有5mg 5’-DMTr-dT CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol的規(guī)模啟動利用H-膦酸酯方法的自動固相DNA合成。在5’-脫三苯基和膦酸酯耦合之后中斷合成,并從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,并將附著有二核苷H-膦酸酯的載體移至塑料瓶中。

通過在分子篩中保持CCl₄16h來制備Soln 1。通過混合100μl TMG和400μl干燥吡啶(20％vol)來制備Soln 2,并以ca.1/4vol加入分子篩。在具有載體的管中加入20μl的Soln 1和2的等分試樣,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩30min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.分子質(zhì)譜:calc.[M]1860.39,exp.[M+H]1860.78,[M-H]1858.67.

1.5.工序(a)使用H-膦酸酯和CCl₃Br.

在DNA合成器中安裝含有5mg 5’-DMTr-dT CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol的規(guī)模啟動利用H-膦酸酯方法的自動固相DNA合成。在5’-脫三苯基和膦酸酯耦合之后中斷合成,并從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,并將附著有二核苷H-膦酸酯的載體移至塑料瓶中。

通過在分子篩中保持CCl₃Br 16h來制備Soln 1。通過混合100μl TMG和400μl干燥吡啶(20％vol)來制備Soln 2,并以ca.1/4vol加入分子篩。在具有載體的管中加入20μl的Soln 1和2的等分試樣,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.分子質(zhì)譜:calc.[M]1860.39,exp.[M+H]1861.13,[M-H]1859.25.

1.6.工序(b)使用β-氰基乙基亞磷酸酯和雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽.

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽的等分試樣移至塑料瓶中,加入10μul BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.分子質(zhì)譜:calc.[M]1860.39,exp.[M+H]1860.35,[M-H]1857.54.

實施例2.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；襣roup(FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(TpTTTTT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在合并4個dT、5’-脫三苯基、亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入10μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,并通過5’-脫三苯基完成合成。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.分子質(zhì)譜:calc.[M]1860.39,exp.[M+H]1860.34,[M-H]1858.63.

實施例3.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷酰基胍基(FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTpTpT).

3.1.工序(a)使用H-膦酸酯,BSA和碘.

在DNA合成器中安裝含有5mg 5’-DMTr-dT CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol的規(guī)模啟動利用H-膦酸酯方法的自動固相DNA合成.在合并2個dT H-膦酸酯之后中斷合成,并從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,并將附著有三核苷二-H-膦酸酯的載體移至塑料瓶中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml).通過混合125μl TMG(2M),50μl BSA(1M)和325μl干燥吡啶(20％vol)來制備Soln 2,并以ca.1/4vol加入分子篩。在具有載體的管中加入20μl的Soln 1和2的等分試樣,加入10μl BSA,并將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩10min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.分子質(zhì)譜:calc.[M]1957.55,exp.[M+H]1958.28,[M-H]1956.34.

3.2.工序(b)使用β-氰基乙基亞磷酸酯和雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽.

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,以0.2umol規(guī)模啟動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’脫三苯基,亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將80μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽的等分試樣移至塑料瓶中,加入20μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min.將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,偶聯(lián)另一種dT亞磷酰胺并在氧化之前中斷合成。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止.

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.

分子質(zhì)譜:calc.[M]1957.55,exp.[M+H]1958.32,[M-H]1955.44.

實施例4.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(TTTpTpTpT).

4.1.工序(a)使用H-膦酸酯,BSA和碘.

在DNA合成器中安裝含有5mg 5’-DMTr-dT CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol的規(guī)模啟動利用H-膦酸酯方法的自動固相DNA合成。在組合了3個dT H-膦酸酯之后中斷合成,并從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,附著有四核苷三-H-膦酸酯的載體移至塑料瓶中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml).Soln 2was通過混合125μl TMG(2M),50μl BSA(1M)和325μl干燥吡啶(20％vol),并以ca.1/4vol加入分子篩。在具有載體的管中加入20μl的Soln 1和2的等分試樣,加入10μl BSA,并將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩10min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.分子質(zhì)譜:calc.[M]2054.72,exp.[M+H]2055.49.

4.2.工序(b)使用β-氰基乙基亞磷酸酯和雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽.

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成.在5’脫三苯基,亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將120μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入30μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合另一dT亞磷酰胺并在氧化之前中斷合成。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合另一dT亞磷酰胺并在氧化之前中斷合成。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl第三等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h。分子質(zhì)譜:calc.[M]2054.72,exp.[M+H]2054.49.

實施例5.制備具有磷酰基胍基(FIX)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTTpT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2umol的規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成在5’脫三苯基,亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml).通過在塑料管中稱量9.6mg干燥胍鹽酸鹽,加入85μl干燥吡啶,15μl 1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU),10μl BSA,并將該管旋轉(zhuǎn)5min并超聲至澄清(ca.5min)來制備Soln 2。在塑料管中混合20μl的Soln 1和2的混合試樣,加入10μl的BSA,等待1min之后將內(nèi)容物移至具有聚合物的管中。將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h。分子質(zhì)譜:calc.[M]1804.28,exp.[M+H]1804.62,[M-H]1803.25.

實施例6.制備具有磷?；一?FIX)的改性寡核苷酸5’-d(TpTTTTT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2umol的規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在合并了4個dT，5’-脫三苯基,亞磷酰胺耦合并封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中.

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml).通過在塑料管中稱量9.6mg干燥的胍鹽酸鹽,加入85μl干燥吡啶,15μl DBU,10μl BSA,并將該管旋轉(zhuǎn)5min并超聲至澄清(ca.5min)來制備Soln 2。在塑料管中混合20μl的Soln 1和2的混合試樣,加入10μl的BSA,等待1min之后將內(nèi)容物移至具有聚合物的管中。將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,通過5’-脫三苯基完成合成。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.

分子質(zhì)譜:calc.[M]1804.28,exp.[M+H]1804.76,[M-H]1803.06.

實施例7.制備具有O-甲基磷?；愲寤?FX)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTTpT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成.在5’脫三苯基,亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml).通過在塑料管中稱量8.6mg干燥的O-甲基異脲硫酸氫鹽,加入35μl干燥吡啶,15μl 1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU),5μl BSA,并將該管旋轉(zhuǎn)5min并超聲至澄清(ca.10min)然后以14,500rpm離心2min來制備Soln 2。在塑料管中混合20μl的Soln 1和2的混合試樣,加入10μl的BSA,等待1min之后將內(nèi)容物移至具有聚合物的管中。將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理16h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]1819.29,exp.[M+H]1819.59,[M-H]1818.26.

實施例8.制備具有N-β-氨基乙基磷?；一?FXI)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTTpT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2umol的規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成.在5’脫三苯基,亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml)。通過在塑料管中稱量8.6mg干燥的O-甲基異脲硫酸氫鹽,加入35μl干燥吡啶,15μl 1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU),5μl BSA,并將該管旋轉(zhuǎn)5min并超聲至澄清(ca.10min)然后以14,500rpm離心2min來制備Soln 2。在塑料管中混合20μl的Soln 1和2的混合試樣,加入10μl的BSA,等待1min之后將內(nèi)容物移至具有聚合物的管中.將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。將寡核苷酸從載體上分離，并通過Soln B在55℃下處理16h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]1847.35,exp.[M+H]1847.16,[M-H]1844.76.

實施例9.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷酰基胍基(FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(TCpA).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dA(Bz)CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成.在5’-脫三苯基,dC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽的等分試樣移至塑料瓶中,加入10μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離，并通過用Soln A在室溫下處理16小時來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]941.80,exp.[M+H]942.17,[M-H]938.97.

³¹P NMR(D₂O,δ,ppm):“快速”非對映異構(gòu)體0.37,“慢速”非對映異構(gòu)體0.21.

實施例10.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(GCGCCAAACpA).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dA(Bz)CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽的等分試樣移至塑料瓶中,加入10μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離，并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán)。寡核苷酸的HPLC曲線示于圖1.

分子質(zhì)譜:calc.[M]3103.21,exp.[M+H]3102.12,[M-H]3100.61.

實施例11.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(GCGCCAAApCpA).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dA(Bz)CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將80μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入20μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合dA亞磷酰胺，并在氧化之前中斷合成。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán)。寡核苷酸的HPLC曲線示于圖1.

分子質(zhì)譜:calc.[M]3200.38,exp.[M+H]3199.90,[M-H]3199.00.

實施例12.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷酰基胍基(FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(GCGCCAApACpA).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dA(Bz)CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將80μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入20μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min.將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,然后耦合另一dA亞磷酰胺，然后在耦合另一dA,并中斷合成，然后進(jìn)行最終氧化步驟。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止.

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]3200.38,exp.[M-H]3199.51.

實施例13.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷酰基胍基(FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(GCGCCApAACpA).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dA(Bz)CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將80μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入20μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,然后耦合2個dA亞磷酰胺，然后再耦合另一dA,并中斷合成，然后進(jìn)行最終氧化步驟。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]3200.38,exp.[M-H]3199.15.

實施例14.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷酰基胍基(FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(GCGCCAApApCpA).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dA(Bz)CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將120μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入30μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合dA亞磷酰胺，并在氧化之前中斷合成。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合dA亞磷酰胺，并在氧化之前中斷合成。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl第三等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán)。寡核苷酸的HPLC曲線示于圖1.

分子質(zhì)譜:calc.[M]3297.54,exp.[M-H]3296.80.

實施例15.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(GGAAGGGGAGAGpA).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dA(Bz)CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dG亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入10μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理16h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]4234.94,exp.[M-H]4233.84.

實施例16.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTpT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2umol的規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’脫三苯基,亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml).通過混合124μl TMG,50μl BSA和325μl干燥吡啶,并以ca.1/4vol加入分子篩來制備Soln 2。在塑料管中混合20μl的Soln 1和2的混合試樣,加入10μl的BSA,等待1min之后將內(nèi)容物移至具有聚合物的管中。將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在室溫下處理2h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]6119.16,exp.[M+H]6121.13,[M-H]6113.80.

實施例17.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTTTTTTTTpTTTTTTTTT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在組合dT接著5’-脫三苯基,再耦合dT亞磷酰胺并封端的8個循環(huán)之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml).通過混合124μl TMG,50μl BSA和325μl干燥吡啶,并以ca.1/4vol加入分子篩來制備Soln 2。在塑料管中混合20μl的Soln 1和2的混合試樣,加入10μl的BSA,等待1min之后將內(nèi)容物移至具有聚合物的管中。將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在室溫下處理2h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]6119.16,exp.[M+H]6121.54.

實施例18.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷酰基胍基(FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(TTpTTTTTTTTTTTTTTTTTT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在并入dT接著5’-脫三苯基,再耦合dT亞磷酰胺并封端的17個循環(huán)之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml)。通過混合124μl TMG,50μl BSA和325μl干燥吡啶,并以ca.1/4vol加入分子篩來制備Soln 2。在塑料管中混合20μl的Soln 1和2的混合試樣,加入10μl的BSA,等待1min之后將內(nèi)容物移至具有聚合物的管中。將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在室溫下處理2h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]6119.16,exp.[M+H]6120.01,[M-H]6114.19.

實施例19.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(TTpTTTTTTTTTTTTTTTTTpT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2umol的規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dT亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將80μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入20μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,通過組合17個dT核苷酸來恢復(fù)合成，并在耦合另一dT并封端之后但在氧化之前停止合成。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在室溫下處理2h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]6216.33,exp.[M-H]6221.11.

實施例20.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡核苷酸5’-d(TTрTTTTTTTTTpTTTTTTTTрT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dT亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將120μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入30μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,組合8個dT核苷酸在組合最后一個dT后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,組合9個dT核苷酸并在并入最后一個dT后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl第三等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,并回復(fù)合成來并入最后一個dT核苷酸。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在室溫下處理2h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]6313.49,exp.[M-H]6310.71.

實施例21.制備具有磷?；一?FIX)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTpT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在組合4個dT后進(jìn)行5’-脫三苯基,亞磷酰胺耦合以及封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml).通過在塑料管中稱量9.6mg干燥的胍鹽酸鹽，加入85μl干燥吡啶,15μl DBU,10μl BSA,并將該管旋轉(zhuǎn)5min并超聲至澄清(ca.5min)來制備Soln 2。在塑料管中混合20μl的Soln 1和2的混合試樣,加入10μl的BSA,等待1min之后將內(nèi)容物移至具有聚合物的管中。將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h.

分子質(zhì)譜:calc.[M]6063.05,exp.[M+H]6065.02,[M-H]6058.30.

實施例22.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡脫氧核糖核苷酸5’-d(TTTT)tpdT；這里及以下實施例中t表示LNA-T核苷酸的位置.

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。將組合LNA-T的耦合步驟持續(xù)至6min。在5’-脫三苯基,LNA-T亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入10μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。然后將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h。寡核苷酸的RP-HPLC曲線示于圖3。

分子質(zhì)譜:calc.[M]1888.40,exp.[M+H]1888.15,[M-H]1886.86.

實施例23.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡脫氧核糖核苷酸5’-tpd(TTTTT)；p表示改性磷酸基團(tuán)的位置；t表示LNA-T核苷酸的位置.

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。組合LNA-T的耦合步驟持續(xù)至6min。在dT組合,5’-脫三苯基,LNA-T亞磷酰胺耦合和封端的4個循環(huán)之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入10μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,并通過5’-脫三苯基完成合成。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h。寡核苷酸的RP-HPLC曲線示于圖3。

分子質(zhì)譜:calc.[M]1888.40,exp.[M+H]1888.27,[M-H]1887.44.

實施例24.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?式XIV)的改性寡核苷酸5’-d(AACGTCAGGGTCTTCCp)BHQ.這里及以下實施例中,BHQ為BlackHoleQuencher^TM(FXII).

在DNA合成器中安裝含有5mg的BHQ CPG載體(42μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入10μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。然后將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]5510.92,exp.[M-H]5509.50.

實施例25.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡核苷酸5’-Flud(GGAAGDDCCCTGACGTTp)BHQ.DD為1,12-十二烷二醇磷酸酯(FXIII),Flu為5(6)-羧基熒光素標(biāo)記(FXIV).

在DNA合成器中安裝含有5mg的BHQ CPG載體(42μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dT亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入10μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。然后將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止，使用相應(yīng)的1,12-十二烷二醇和熒光素亞磷酰胺作為改性劑。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]6078.50,exp.[M+H]6084.38.

實施例26.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?式XIV)的改性寡核苷酸5’-d(TCTCTCpFCCTTCpC).在這里以及下一實施例中F為2-羥基甲基-3-羥基四氫呋喃(脫嘌呤/脫嘧啶位點)磷酸酯(FXV).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dC(Bz)CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將80μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入20μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,組合5個核苷酸，包括dF單元，直到組合下一個dC核苷酸,中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離，并通過在室溫下用Soln A處理16h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]3857.76,exp.[M-H]3856.74.

實施例27.制備具有1,3-二甲基-2-(磷?；鶃啺坊?咪唑烷基(FXVI)的改性寡核苷酸5’-d(GCGCCAAACpA).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dA(Bz)CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’-脫三苯基,dC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在100μl 1M 2-疊氮-4,5-二氫-1,3-二甲基-1H-咪唑鎓六氟磷酸鹽中加入25μl BSA和5μl三乙胺,并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]3101.20,exp.[M-H]3101.55.

實施例28.制備具有N,N’-雙(四亞甲基)-N”-磷?；一?FXVII)的改性寡核苷酸5’-d(GCGCCAAACpA).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dA(Bz)CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成.在5’-脫三苯基,dC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在100μl 1M疊氮二吡咯碳鎓六氟磷酸鹽中加入25μl BSA和5μl三乙胺,并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]3155.29,exp.[M-H]3153.75.

實施例29.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡-2’-O-甲基核糖核苷酸5’-AUCGpU.

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-2’-OMe-rU CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相寡-2’-O-甲基核糖核苷酸合成。在5’-脫三苯基,2’-OMe-rG亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入10μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理16h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]1697.28,exp.[M+H]1697.59,[M-H]1694.77.

實施例30.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡-2’-O-甲基核糖核苷酸5’-GCGCCAAACpA.

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-2’-OMe-rA(Bz)CPG載體(60μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相寡-2’-O-甲基核糖核苷酸合成。在5’-脫三苯基,2’-OMe-rC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將40μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入10μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]3403.48,exp.[M-H]3402.55.

實施例31.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷酰基胍基(FVIII)的改性寡-2’-O-甲基核糖核苷酸5’-GCGCCAAApCpA.

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-2’-OMe-rA(Bz)CPG載體(60μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相寡-2’-O-甲基核糖核苷酸合成。在5’-脫三苯基,2’-OMe-rC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將80μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入20μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min.將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合2’-OMe-rU亞磷酰胺并中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離并通過用Soln A在55℃下處理12h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]3500.64,exp.[M+H]3199.90,[M-H]3499.75.

實施例32.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?式XIV)的改性寡-2’-O-甲基核糖核苷酸硫代磷酸酯5’-G_SA_SC_SA_SU_SC_SC_SA_SU_SU_SC_SA_SA_SA_SU_SG_SG_SU_SUрUрG；這里和以下實施例中s表示硫代磷酸酯殘基(FXVIII)

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-2’-OMe-rG(Tac)CPG載體(60μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相寡-2’-O-甲基核糖核苷酸合成。在5’-脫三苯基,2’-OMe-rU亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將80μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入20μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合2’-OMe-rA亞磷酰胺并中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,用0.1M 3-[(二甲基氨基亞甲基)亞胺基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮的干燥吡啶溶液進(jìn)行硫化來代替碘氧化，從而恢復(fù)合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，通過用Soln A在70℃下處理3h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]7436.14,exp.[M-H]7433.89.

實施例33.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡-2’-O-甲基核糖核苷酸硫代磷酸酯5’-Flu G_SA_SC_SA_SU_SC_SC_SA_SU_SU_SC_SA_SA_SA_SU_SG_SG_SU_SUрUрG；Flu表示5’-熒光素標(biāo)記(FXIXV)；s表示硫代磷酸酯殘基(FXVIII).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-2’-OMe-rG(Tac)CPG載體(60μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相寡-2’-O-甲基核糖核苷酸合成。在5’-脫三苯基,2’-OMe-rU亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將80μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入20μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合2’-OMe-rA亞磷酰胺并中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,使用0.1M 3-[(二甲基氨基亞甲基)亞胺基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮的干燥吡啶中的溶液進(jìn)行硫化來代替碘氧化，從而恢復(fù)合成直到序列結(jié)束。在DMTr ON模式下通過引入相應(yīng)的熒光素亞磷酰胺來完成合成

將寡核苷酸從載體上分離and保護(hù)基團(tuán)s removed by Soln A for 3h at70℃.

分子質(zhì)譜:calc.[M]8003.63,exp.[M-H]8001.25.

實施例34.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的改性寡-2’-O-甲基核糖核苷酸硫代磷酸酯5’-Flu G_SG_SC_SC_SA_SA_SA_SC_SC_SU_SC_SC_SG_SC_SUpUpACрCрU；Flu表示5’-熒光素標(biāo)記(FXIX)；s表示硫代磷酸酯殘基(FXVIII).

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-2’-OMe-rU CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相寡-2’-O-甲基核糖核苷酸合成.5’-脫三苯基,2’-OMe-rC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化.從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將160μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入40μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合2’-OMe-rC亞磷酰胺并終止合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合2’-OMe-rA亞磷酰胺然后耦合2’-OMe-rU并中斷合成，然后進(jìn)行最終氧化步驟。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl第三等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在45℃下震蕩1.5h at 45^℃.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合2’-OMe-rU亞磷酰胺并中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl第四等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在45℃下震蕩1.5h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,使用0.1M 3-[(二甲基氨基亞甲基)亞胺基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮的干燥吡啶溶液進(jìn)行硫化來代替碘氧化，從而恢復(fù)合成，直到序列結(jié)束。在DMTr ON模式下通過引入相應(yīng)的熒光素亞磷酰胺來完成合成。

將寡核苷酸從載體上分離，通過使用Soln A在70℃在下處理3h來移除保護(hù)基團(tuán).

分子質(zhì)譜:calc.[M]7763.48,exp.[M-H]7759.37.

實施例35.制備具有N,N,N’,N’-四甲基磷?；一?FVIII)的混合LNA-寡-2’-O-甲基核糖核苷酸硫代磷酸酯5’-Flu G_Sg_SC_Sg_SA_Sa_SA_SC_Sc_SU_SC_SC_Sc_SC_SUpUpaCрCрU；Flu表示5’-熒光素標(biāo)記(FXIX)；s表示硫代磷酸酯殘基(FXVIII).分別用小寫字母a,c和g表示LNA核苷酸A、5-Me-C和G are.

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-2’-OMe-rU CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相寡-2’-O-甲基核糖核苷酸合成。5’-脫三苯基,2’-OMe-rC亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將160μl 0.5M雙(二甲基氨基)-1-疊氮碳鎓二氯磷酸鹽等分試樣移至塑料瓶中,加入40μl BSA并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將50μl的等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合2’-OMe-rC亞磷酰胺并中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl的第二等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在40℃下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合LNA-A亞磷酰胺然后再耦合2’-OMe-rU并中斷合成，然后進(jìn)行最終氧化步驟.從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將50μl第三等分試樣移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在45℃下震蕩1.5h棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,耦合2’-OMe-rU亞磷酰胺并中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

將第四等分試樣50μl移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s，并在45℃下震蕩1.5h.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,使用0.1M 3-[(二甲基氨基亞甲基)亞胺基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮的干燥吡啶溶液進(jìn)行硫化來代替碘氧化，并使用LNA和2’-OMe亞磷酰胺恢復(fù)合成，直到序列結(jié)束。在DMTr ON模式下通過引入相應(yīng)的熒光素亞磷酰胺來完成合成。

將寡核苷酸從載體上分離，通過在70℃下用Soln A處理3小時可以移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]7793.47,exp.[M-H]7792.92.

實施例36.制備具有1,3-二甲基-2-(磷?；鶃啺坊?咪唑烷基(FXVI)的改性寡-2’-O-甲基核糖核苷酸5’-UUUUUpU.

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-2’-OMe-rU CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相寡-2’-O-甲基核糖核苷酸合成。5’-脫三苯基,2’-OMe-rU亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在100μl 1M 2-疊氮-4,5-二氫-1,3-二甲基-1H-咪唑鎓六氟磷酸鹽中加入25μl BSA和5μl三乙胺，并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h。寡核苷酸的RP-HPLC曲線示于圖4.

分子質(zhì)譜:calc.[M]1954.37,exp.[M-H]1953.37.

實施例37.制備具有N,N’-雙(四亞甲基)-N”-磷酰基胍基(FXVII)的改性寡-2’-O-甲基核糖核苷酸5’-UUUUUpU.

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-2’-OMe-rU CPG載體(40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相寡-2’-O-甲基核糖核苷酸合成。5’-脫三苯基,2’-OMe-rU亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在100μl 1M疊氮二吡咯碳鎓六氟磷酸鹽中加入25μl BSA和5μl三乙胺,并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h。寡核苷酸的RP-HPLC曲線示于圖4.

分子質(zhì)譜:calc.[M]2008.46,exp.[M-H]2007.57.

實施例38.制備改性寡核苷酸5’-d(TTTTTpT)with the N,N-二甲基磷?；?/u>group(FXX).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’脫三苯基,亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化.從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在塑料管中加入12mg的(氯亞甲基)二甲基氯化銨和4mg(1.1當(dāng)量)NaN₃,加入100μl干燥MeCN并在30℃下將管震蕩2h，以14,500rpm離心5min,加入25μl BSA,將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min，將上清液移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩30min.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，使用Soln A在55℃下處理18h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]1832.22,exp.[M-H]1831.57.

實施例39.制備具有N-磷?；纂呋?FXXI)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTTpT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在5’脫三苯基,亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

通過將碘催化劑以0.2M濃度溶解到干燥吡啶中來制備Soln 1(51mg/ml).通過在塑料管中稱量40mg干燥甲脒鹽酸鹽,加入375μl干燥吡啶,75μl DBU和50μl BSA,并將管旋轉(zhuǎn)3-4分鐘并超聲至澄清(ca.3-4min)來制備Soln 2。在塑料管中混合20μl的Soln 1和2的混合試樣,加入10μl的BSA,等待1min之后將內(nèi)容物移至具有聚合物的管中。將該管旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h。

分子質(zhì)譜:calc.[M]1789.27,exp.[M-H]1788.60.

實施例40.制備具有N-氰基亞胺基磷酸酯基(FXXII)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTTpT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2umol的規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成.在5’脫三苯基,亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化.從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中.

在20μl按照McMurry所描述的方式制備的0.25M疊氮化氰的干燥MeCN溶液中[51]加入5μl BSA并將管在室溫下保持15min,將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，通過用Soln B在70℃下處理1h來移除保護(hù)基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]1787.25,exp.[M+H]1787.27,[M-H]1785.19.

實施例41.制備具有N-氰基亞胺基磷酸酯基(FXXII)的改性寡核苷酸5’-d(TpTTTTT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。在組合dT,5’-脫三苯基,dT亞磷酰胺耦合和封端的4個循環(huán)之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在20μl按照McMurry的描述制備的0.25M疊氮化氰的干燥MeCN溶液中[51]加入5μl BSA并將管在室溫下保持15min,將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心15s并在室溫下震蕩5min。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,重復(fù)β-氰基乙基亞磷酰胺固相合成直到序列結(jié)束。

將寡核苷酸從載體上分離，并通過用Soln B在70℃下處理1h來移除保護(hù)基團(tuán)。寡核苷酸的RP-HPLC曲線示于圖5。

分子質(zhì)譜:calc.[M]1787.25,exp.[M+H]1787.19,[M-H]1785.11.

實施例42.制備具有3’-N,N’-雙(四亞甲基)-N”-胍基磷酸酯基(FXXIII)的改性核苷dTp.

在DNA合成器中安裝含有5mg的3’-磷酸酯CPG載體(30-40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。5’-脫三苯基,dT亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在100μl 1M疊氮二吡咯碳鎓六氟磷酸鹽中加入25μl BSA和5μl三乙胺,并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,并通過5’-脫三苯基來完成合成。

通過用Soln A在室溫下處理1h來使核苷酸從載體上脫離。

分子質(zhì)譜:calc.[M]471.45,exp.[M-H]471.08.

實施例43.制備具有3’-N,N’-雙(四亞甲基)-N”-胍基磷酸酯基(FXXIII)的改性寡核苷酸5’-d(TTTTTT)p.

在DNA合成器中安裝含有5mg的3’-磷酸酯CPG載體(30-40μmol g^-1)的柱,并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。5’-脫三苯基,dT亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化.從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在100μl 1M疊氮二吡咯碳鎓六氟磷酸鹽中加入25μl BSA和5μl三乙胺,并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

通過用Soln A在室溫下處理1h來使核苷酸從載體上脫離。寡核苷酸的RP-HPLC示于圖6。

分子質(zhì)譜:calc.[M]1992.44,exp.[M-H]1991.46.

實施例44.制備具有5’-N,N’-雙(四亞甲基)-N”-磷酰基胍基和熒光素標(biāo)記(FXXIV)的改性胸苷核苷.

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,以0.2μmol啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成，使用與實施例25中相同的熒光素亞磷酰胺。中斷合成，然后氧化,從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在100μl 1M疊氮二吡咯碳鎓六氟磷酸鹽中加入25μl BSA和5μl三乙胺,并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩1h.棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體，并在空氣中干燥5min。

通過使用Soln A在室溫下處理1h使核苷酸從載體脫離。寡核苷酸的RP-HPLC示于圖6.

分子質(zhì)譜:calc.[M]1263.32,exp.[M-H]1262.22.

實施例45.制備具有5’-N,N’-雙(四亞甲基)-N”-磷?；一蜔晒馑貥?biāo)記(FXXIV)的改性寡核苷酸5’-Flu pd(TTTTTT).

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,以0.2μmol啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成。組合5個dT殘基和一個熒光素標(biāo)簽Flu’(XXV)然后中斷合成，然后進(jìn)行最后的氧化步驟。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在100μl 1M疊氮二吡咯碳鎓六氟磷酸鹽中加入25μl BSA和5μl三乙胺，并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體，并在空氣中干燥5min。

通過用Soln A在室溫下處理1h來將寡核苷酸從載體上分離。寡核苷酸的RP-HPLC示于圖6.

分子質(zhì)譜:calc.[M]2784.31,exp.[M-H]2782.96.

實施例46.制備具有1,3-二甲基-2-(磷?；鶃啺坊?咪唑烷基(FXVI)的改性雜交DNA-RNA寡核苷酸5’-d(TTTT)rUpdT.

在DNA合成器中安裝含有5mg的高加載5’-DMTr-dT CPG載體(110μmol g^-1)的柱,以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相寡核苷酸合成。5’-脫三苯基,2’-TOM-rU亞磷酰胺耦合和封端之后中斷合成，然后氧化。從合成器上分離柱子,連接水泵,用MeCN沖洗,將附著有亞磷酸酯的載體移至所料管中。

在100μl 1M 2-疊氮-4,5-二氫-1,3-二甲基-1H-咪唑鎓六氟磷酸鹽中加入25μl BSA和5μl三乙胺,并將管旋轉(zhuǎn)1min,以14,500rpm離心1min并在室溫下放置30min。將內(nèi)容物移至具有載體的管中,旋轉(zhuǎn)30s,以14,500rpm離心30s并在室溫下震蕩1h。棄去上清液,用2×200μl MeCN沖洗載體,移至合成器柱中,恢復(fù)合成直到序列結(jié)束為止。

將寡核苷酸從載體上分離，并在室溫下用Soln A移除保護(hù)基團(tuán)1h。通過通過用三乙胺三氫氟酸鹽–三乙胺–NMP(4:3:6v/v/v)在65℃處理2h來移除TOM基團(tuán)。

分子質(zhì)譜:calc.[M]1860.34,exp.[M-H]1859.21.

實施例47.用自動DNA合成器制備用1,3-二甲基-N-磷?；鶃啺坊?2-咪唑烷基(FXVI)改性的寡脫氧核糖核苷酸5’-d(TTTTTрT),5’-d(TTTTpTрT),5’-d(TTTpTpTрT),5’-d(TTpTpTpTрT),5’-d(TpTpTpTpTрT)и5’-d(GpCpGpCpCpApApApCpA)的方案。

在DNA合成器中安裝含有5mg的5’-DMTr-dT或dA CPG載體(35-110μmol g^-1)的柱并以0.2μmol規(guī)模啟動自動β-氰基乙基亞磷酰胺固相DNA合成，以利用1M 2-疊氮-4,5-二氫-1,3-二甲基-1H-咪唑鎓六氟磷酸鹽的乙腈溶液進(jìn)行處理來代替序列中對應(yīng)位點(p)的碘氧化。

通過用Soln A在55℃下處理12h來使寡核苷酸從載體脫離，對于寡核苷酸5’-d(GpCpGpCpCpApApApCpA)或?qū)τ诠研剀账?，在室溫下處?h。寡核苷酸的RP-HPLC示于圖7和8。

分子質(zhì)譜:

5’-d(TTTTTрT)–calc.[M]1858.37,exp.[M-H]1857.57；

5’-d(TTTTpTрT)–calc.[M]1953.32,exp.[M-H]1952.57；

5’-d(TTTpTpTрT)–calc.[M]2048.67,exp.[M-H]2047.77；

5’-d(TTpTpTpTрT)–calc.[M]2143.82,exp.[M-H]2142.77；

5’-d(TpTpTpTpTрT)–calc.[M]2238.96,exp.[M-H]2237.97；

5’-d(GpCpGpCpCpApApApCpA)–calc.[M]3862.38,exp.[M-H]3860.50.

參考文獻(xiàn)

為了更充分地描述和公開本發(fā)明以及本發(fā)明所述的技術(shù)領(lǐng)域，本文引用了許多出版物。以下給出了這些文獻(xiàn)的完整引用信息。這些文獻(xiàn)中的每一個都通過引用將其整體并入本公開中,已達(dá)到每個獨立的參考文獻(xiàn)被具體且獨立地表明通過引用而被并入本公開的程度。

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序列表

<110> NooGen LLC

<120> 改性寡核苷酸及其制備方法

<130> RIC/FP6992291

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成改性寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..2, 2..3, 3..4, 4..5, 5..6, 6..7, 7..8, 8..9, 9..10

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<220>

<221> misc_feature

<222> 6..7, 9..10

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<220>

<221> misc_feature

<222> 7..8, 9..10

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<220>

<221> misc_feature

<222> 7..8, 8..9, 9..10

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<220>

<221> misc_feature

<222> 8..9, 9..10

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷酰基胍基

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷酰基胍基

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> 在一個實施方式中， 1,3-二甲基-2-(磷?；鶃啺坊?咪唑烷

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> 在一個實施方式中， N,N'-雙(四亞甲基)-N"-磷?；一?/p>

<400> 1

gcgccaaaca 10

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成改性寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<220>

<221> misc_feature

<222> 2..3, 19..20

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<220>

<221> misc_feature

<222> 2..3, 11..12, 19..20

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷酰基胍基

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> 在一個實施方式中， 磷?；一?/p>

<400> 2

tttttttttt tttttttttt 20

<210> 3

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成改性寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<400> 3

ggaaggggag aga 13

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成改性寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> 經(jīng)由N,N,N',N'-四甲基磷?；一矁r連接至BHQ

<400> 4

aacgtcaggg tcttcc 16

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成改性寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 連接至Flu, 5(6)-羥基熒光素標(biāo)記

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(6)

<223> 通過1,12-十二烷二醇磷酸酯連接

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> 經(jīng)由N,N,N',N'-四甲基磷酰基胍基共價連接至BHQ

<400> 5

ggaagccctg acgtt 15

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成改性寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(7)

<223> (N,N,N',N'-四甲基磷?；一? -

(2-羥基甲基-3-羥基四氫呋喃 (脫嘌呤/脫嘧啶

位點) 磷酸酯)

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<400> 6

tctctccctt cc 12

<210> 7

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成改性寡-2'-O-甲基核糖核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> 8..9, 9..10

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> 在一個實施方式中， N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<400> 7

gcgccaaaca 10

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成改性寡-2'-O-甲基核糖核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..2, 2..3, 3..4, 4..5, 5..6, 6..7, 7..8, 8..9, 9..10, 10..11

<223> 在實施例32和33的實施方式中, 硫代磷酸酯殘基

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 在實施例33的實施方式中, 連接至Flu,

5(6)-羧基熒光素標(biāo)記

<220>

<221> misc_feature

<222> 11..12, 12..13, 13..14, 14..15, 15..16, 16..17, 17..18, 18..19

<223> 在實施例32和33的實施方式中, 硫代磷酸酯殘基

<220>

<221> misc_feature

<222> 19..20, 20..21

<223> 在實施例32和33的實施方式中, N,N,N',N'-四甲基

磷酰基胍基

<400> 8

gacauccauu caaaugguuu g 21

<210> 9

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成改性的寡-2'-O-甲基核糖核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 連接至Flu, 5(6)-羧基熒光素標(biāo)記

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..2, 2..3, 3..4, 4..5, 5..6, 6..7, 7..8, 8..9, 9..10

<223> 硫代磷酸酯殘基

<220>

<221> misc_feature

<222> 10..11, 11..12, 12..13, 13..14, 14..15

<223> 硫代磷酸酯殘基

<220>

<221> misc_feature

<222> 15..16, 16..17, 18..19, 19..20

<223> N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<400> 9

ggccaaaccu ccgcuuaccu 20

<210> 10

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的混合LNA-寡-2'-O-甲基核糖核苷酸

硫代磷酸酯

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 連接至Flu, 5(6)-羧基熒光素標(biāo)記

<220>

<221> misc_feature

<222> 1..2, 2..3, 3..4, 4..5, 5..6, 6..7, 7..8, 8..9, 9..10

<223> 硫代磷酸酯殘基

<220>

<221> misc_feature

<222> 2, 4, 6, 9, 13, 17

<223> LNA base

<220>

<221> misc_feature

<222> 10..11, 11..12, 12..13, 13..14, 14..15

<223> 硫代磷酸酯殘基

<220>

<221> modified_base

<222> 9, 13

<223> m5c

<220>

<221> misc_feature

<222> 15..16, 16..17, 18..19, 19..20

<223> N,N,N',N'-四甲基磷?；一?/p>

<400> 10

ggcgaaaccu ccccuuaccu 20