【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明是關(guān)于針對cd4之單克隆抗體介導競爭型hiv進入抑制、其組合物，以及使用此組合物治療和功能性治愈hiv感染的方法。

背景技術(shù)：

獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome，aids)是一種由人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)所引起之人類免疫系統(tǒng)的疾病(http://en.wikipedia.org/wiki/hiv/aids)?；蜓芯恐赋鰄iv于十九世紀晚期或二十世紀早期起源于非洲中西部。aids最早是于1981年由美國疾病控制與預(yù)防中心所辨識，且其原因，hiv，在1980年代初被鑒別。由于疫情的開始，已有超過70萬人感染hiv，且已有35萬人死于aids。在全球，截至2011年底已有34.0萬人感染hiv(http://www.who.int/gho/hiv/en/)。

hiv感染逐漸地降低免疫系統(tǒng)的效力，且使個體容易受到機會性感染和產(chǎn)生腫瘤。hiv可透過粘膜或是具有含有hiv之體液(例如血液、精液、陰道液、射精前液體和母乳)的血液直接接觸而傳播。這種傳播可涉及肛門、陰道或口交、輸血、受污染的注射針頭、母親與嬰兒于懷孕、分娩或母乳喂養(yǎng)期間之交流，或是于上述之體液中其它方式的暴露。

30年來，科學家們認為aids是由“制造病毒”的cd4t細胞所引起，而非靜默t細胞。但是這些“制造病毒”的受感染的細胞并不足以去解釋于發(fā)展aids之患者體中t細胞的大量耗竭。greene和其同僚指出95％的靜默淋巴cd4t細胞是死于細胞焦亡(pyroptosis)，而其是由失敗的病毒感染所引發(fā)(doitsh，g.etal.2014)。此些細胞具有細胞質(zhì)病毒dna，但不像變成病毒-復(fù)制單位的t細胞，這些“hiv感染的”靜默t細胞被涉及前發(fā)炎性細胞激素釋放之程序性細胞死亡(細胞焦亡)的高度炎癥形式所自毀。此細胞蛋白，γ干擾素誘導蛋白16(interferon-gamma-inducibleprotein16，ifi16)，可辨認病毒dna并于t細胞引發(fā)一連串反應(yīng)(包含介導細胞焦亡之caspase-1酶活化，且造成細胞腫脹、細胞膜通透性和細胞質(zhì)內(nèi)容物泄漏)。靜默t細胞的自毀無益于殺死病毒。此過程最終導致hiv致病機理轉(zhuǎn)以推進病程至aids。

現(xiàn)行用以延遲aids發(fā)生之hiv感染的治療是由高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法或haart(highlyactiveantiretroviraltherapy)組成，以防止病毒復(fù)制?，F(xiàn)行優(yōu)選的haart包含聯(lián)合療法(或“雞尾酒”)，其由屬于至少兩種類抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物中的至少三個藥物所組成(聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(combinationantiretroviraltherapy，cart))。典型治療方案包含兩個核苷類似物反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nartis或nrtis)加上一個蛋白酶抑制劑或非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nnrti)。

在發(fā)達國家，當決定要何時推薦開始haart治療時，醫(yī)生會評估病毒量、cd4t細胞數(shù)量、cd4陽性細胞減少速度和患者準備就緒。一般來說，會建議對cd4t細胞數(shù)量下降至每毫升血液200-250細胞之無癥狀的患者進行治療。然而，越早開始治療(于cd4水平為350個細胞/微升下)可顯著地減少aids的風險和死亡。

在沒有治療的狀況下，評估感染hiv后之凈存活期中位數(shù)為9至11年，此取決于hiv亞型；且aids診斷后之平均存活率范圍介于6至19個月。在廣泛使用haart治療的地區(qū)，此疾病的死亡率減少了80％，其轉(zhuǎn)而增加新確診hiv感染患者的預(yù)期壽命至約20年。

haart的標準目標包括患者生活品質(zhì)的改善、并發(fā)癥的減少，以及將hiv病毒血癥減少至低于檢測極限。

然而，haart治療存在多種問題。首先，其無法治愈hiv感染的患者，一旦停止治療也無法避免大多數(shù)“haart抗藥性”的hiv回復(fù)至高血液水平。第二，haart具有包含倦怠、無力、腹瀉、頭痛、惡心和嘔吐之討人厭的副作用。從長期來看，hiv感染的患者可能經(jīng)歷神經(jīng)認知障礙癥、骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)病變、癌癥、腎病和心血管疾病。盡管較新的抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物比較舊的藥物具有較少的副作用，終生使用仍然會造成不良的結(jié)果。無法規(guī)則服藥意謂hiv反彈、抗藥性和疾病進程。第三，就達到超過50％以上患者而言，haart之表現(xiàn)遠較理想結(jié)果差，此乃因為藥物不耐癥、過去無效的抗病毒治療，以及hiv之抗藥性病毒株的感染。

越來越多研究人員研究如何治愈hiv感染，或至少達成無抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療下之長期或永久緩解。

兩種治療策略，消除性(即根除)和功能性治愈為針對hiv感染之現(xiàn)行研究(如表1所示)。消除性治愈方法目的是消除所有hiv感染的細胞，由體內(nèi)完全地清除hiv，且定義為其可減少病毒量至每毫升血液低于1個拷貝。功能性治愈目的是hiv的緩解狀態(tài)與長期控制，包含于無抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法下的低病毒量，其于永久或延長的期間內(nèi)可減少病毒量至每毫升血液低于50個拷貝。

“消除性治愈”現(xiàn)行唯一的例子是來自一名感染hiv男子的案例研究，此人被昵稱為“柏林患者”，其罹患急性骨髓性白血病，且接受來自具有ccr5基因之突變或不同形式的捐贈者的骨髓移植。于停止治療45個月后，醫(yī)生已無法于其體內(nèi)偵測到hiv。然而，采用具有ccr5突變之捐贈者的骨髓移植策略并非可行的hiv治愈方法，此策略帶來毒性和治療的復(fù)雜性?？捎诰⒌目刂普甙l(fā)現(xiàn)“功能性治愈”之自然案例。精英的控制者是指感染hiv的個體，其免疫系統(tǒng)可自然地控制病毒而無須使用抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物。此個體成功地維持穩(wěn)定的cd4(白血球)細胞數(shù)量、低或低于檢測極限的病毒量，以及于其細胞中顯著較低量之“潛伏的hiv”。

事實上，治愈的主要障礙是“潛伏hiv病毒庫”之存在，其潛伏在免疫系統(tǒng)的細胞(例如記憶細胞)內(nèi)，于抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療期間具有長的壽命，而此種治療可藉由阻斷復(fù)制作用而作用于活躍的病毒感染而非潛伏的hiv。然而，若停用此種抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療，潛伏的hiv可能會被活化，以更新hiv感染的過程。

針對此些“有問題的”潛伏hiv病毒庫的現(xiàn)行策略包含致力于haart治療下透過病毒表達之活化以耗竭潛伏病毒庫，以滅絕感染的細胞，只留下未受感染的細胞。有一群活化劑為組蛋白脫乙酰酶(histonedeacetylase，hdac)抑制劑(請參見表2)。目前，以hdac抑制劑作為情緒穩(wěn)定劑、抗癲癇藥物和抗癌治療之使用。hdac抑制劑之長期影響在于提高惡性腫瘤及/或致癌基因再活化的風險，此仍為主要問題。如果以聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(cart)可完全地抑制活躍的病毒復(fù)制，則此策略可行。到目前為止，這些努力尚未能達成長期的病毒抑制或功能性治愈。

于hiv感染之人體用以限制或減少潛伏hiv病毒庫大小的兩個計劃涉及(1)加強治療(藉由對患者治療方案加入新的art藥物)，以及(2)早期治療(藉由感染后立即地開始art)。多個試驗結(jié)果顯示，當于hiv感染的早期急性期而非慢性晚期開始cart，hiv感染細胞的數(shù)量可顯著地下降。

總之，對用于hiv治療之有效和安全的藥物具有高度需求(不論是提供作為單獨使用或是作為對cart的輔助使用)，此些藥物(1)于無細胞(cell-free)和細胞間(cell-to-cell)傳播模式中均可阻斷hiv進入，顯著地減少活化或靜默cd4t細胞(包含那些長壽的記憶t細胞)之hiv感染；(2)特異性地再活化hiv感染的靜默cd4t細胞以釋出hiv，導致潛伏感染細胞的細胞凋亡；及/或(3)當抗原/細胞激素刺激時抑制hiv感染的靜默cd4t細胞活化/發(fā)炎，此種活化發(fā)生之時可引起細胞焦亡和正常cd4陽性t細胞的大量耗竭，因而導致aids。對hiv感染之功能性或消除性治愈之一致努力以導致后續(xù)無cart下之長期或永久緩解，此為全球公共衛(wèi)生的重要議題，并正于世界各地積極地探究中，且如果可行，此將在hiv感染治療方面實現(xiàn)突破性重大變革。

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是針對用以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的組合物和方法。本發(fā)明之一方面是關(guān)于針對cd4之單克隆抗體、其組合物，以及使用此組合物以預(yù)防、治療，和功能性治愈hiv感染的方法。

本發(fā)明之一方面是關(guān)于針對cd4之抗體、其組合物，以及使用此組合物以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的方法。在某些實施方案中，此抗體可特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。于無細胞和細胞間的系統(tǒng)中，本發(fā)明抗體透過其結(jié)合至cd4的結(jié)構(gòu)域1而展現(xiàn)有效的競爭型hiv進入抑制。本發(fā)明之抗體也可抑制抗原引起的t細胞增生和cd4陽性t細胞的細胞激素制造(il2和ifn-gamma)，其涉及細胞焦亡的致病循環(huán)。本發(fā)明抗體也具有再活化靜默cd4陽性t細胞的能力。此特性對靜默t細胞中潛伏hiv病毒庫的再活化特別有用，可使這些細胞對抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療敏感。為了釋放hiv，此種對cd4高親和力之抗體可活化靜默的hiv感染細胞。hiv感染靜默cd4+t細胞的再活化允許于hiv感染患者使用合并本發(fā)明抗體與haart的合并治療，以達成功能性治愈。

本發(fā)明是針對用以治療、預(yù)防，和功能性治愈hiv感染的方法。在某些實施方案中，此劑型包含針對cd4之抗體。本發(fā)明也包含可用于治療、預(yù)防，和功能性治愈hiv感染之方法的抗病毒藥物。

在某些實施方案中，本發(fā)明是關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合，抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時，此種治療可使接受治療之受試者的病毒量減少至低于檢測極限，且只要血清抗體水平高于10μg/ml即無病毒量反彈。

在其它實施方案中，本發(fā)明是關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之hiv患者，將達成患者的功能性治愈。

【附圖說明】

圖1系競爭型與非競爭型hiv進入抑制機制。圖1a系顯示于競爭型hiv進入抑制模型中所提供理論結(jié)果的曲線圖，在此，hiv包膜蛋白gp120和抑制劑(例如抗體藥物)競爭結(jié)合于一個共同目標表面分子上的相同位置(即cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2)。在此模型中，當此抑制劑濃度達到某個閥值時可達成hiv結(jié)合/進入的100％抑制。相較之下，圖1b系顯示于非競爭型hiv進入抑制模型中所提供理論結(jié)果的曲線圖，在此，hiv和抑制劑結(jié)合至位于相同目標分子上的不同位置(例如cd4的結(jié)構(gòu)域2對于tmb-355)。在此非競爭型抑制模型中，抑制劑可減少hiv結(jié)合/進入，但不論抑制劑之濃度為何都無法達成完全抑制。不論藥物濃度為何，作為于％抑制之“高原”反映了hiv對抗體藥物的抗藥性。

圖2系來自利用tmb-355對一組涵蓋11個進化支的118種不同hiv-1env假型病毒株的hiv進入抑制的結(jié)果(pace，g，etal.，2011)。對每一種病毒而言，黑線是指當以濃度達到10μg/ml之tmb-355處理時的最大抑制百分比(mpi)(請參見左邊的y軸)；且灰線是指相對應(yīng)的ic50(請參見右邊的y軸)。tmb-355以≥50％抑制中和了92％的病毒株，且以≥95％抑制只中和了31％的病毒株。

圖3系來自利用mabb4對在10年間所收集的一組超過850種env假型hiv病毒株的hiv進入抑制的結(jié)果。mabb4于hiv進入抑制提供了廣泛性與效力，其于所有850種env假型病毒株具有接近100％最大抑制百分比(mpi)，且具有兩個ic50濃度(一個是介于0.01至1μg/ml，且第二個是約10μg/ml)。

圖4系mabdb4c7抗體fv區(qū)域之重鏈的完整氨基酸序列(seqidno：7)，其于ub-421中使用。代表衍生自其親本鼠源b4抗體之相對應(yīng)cdr1、2和3區(qū)域的序列在下方劃有底線(表4，seqidnos：1至3)?？勺儏^(qū)和恒定區(qū)分別以淺灰色和深灰色陰影表示(分別為seqidnos：11和12)。以重鏈上位于第101個氨基酸殘基asn(n)作為n-糖化點，此對于其fv區(qū)域位置具有獨特性，對b4抗體結(jié)合具有重要性。為了取代的人類igg1之fc區(qū)域序列，位于第298個氨基酸殘基asn(n)的n-糖化點乃利用氨基酸his(h)取代而加以移除(即n298h)。發(fā)現(xiàn)此突變可于抗體b4存在下消除igg介導的補體依賴型細胞毒性作用(complementdependentcytotoxicity，cdc)和cd4陽性t細胞的耗竭。

圖5系db4c7抗體fv區(qū)域之輕鏈的完整氨基酸序列(seqidno：8)，其于ub-421中使用。代表衍生自其親本鼠源b4抗體之相對應(yīng)cdr1、2和3區(qū)域的序列在下方劃有底線(表4，seqidnos：4至6)?？勺儏^(qū)和恒定區(qū)分別以淺灰色和深灰色陰影表示(分別為seqidnos：13和14)。

圖6系經(jīng)進一步改進之人源化抗體之重鏈的完整氨基酸序列(seqidno：9)，因為對位于重鏈位置第253、255和257個氨基酸的fc區(qū)域分別地將met(m)取代為tyr(y)(即m253y)、將ser(s)取代為thr(t)(即s255t)、以及將thr(t)取代為glu(e)(即t257e)，以使此抗體具有更長的半衰期。

圖7系人源化抗體mabdb4之重鏈的完整氨基酸序列(seqidno：10)，其包含于圖4和6中所討論的變異氨基酸。

圖8系顯示在對細胞經(jīng)過三次抗體繼代后mabb4對位于hpb-all細胞之表面cd4的結(jié)合親和力(抗體濃度)和結(jié)合容量(游離和結(jié)合的抗體)的曲線圖。

圖9系mabb4(---)和mabdb4(-)對涂覆于elisa微量盤上之可溶性cd4(scd4)和p2704a肽捕獲混合物之結(jié)合親和力的曲線圖比較。分別地利用mabb4和mabdb4去競爭地抑制b4-生物素和db4c7-alexa結(jié)合至捕獲混合物而加以測定結(jié)合親和力。

圖10系mabb4(---)和mabdb4(-)對位于hpb-all細胞上cd4之結(jié)合親和力的曲線圖比較。結(jié)合親和力是以facs加以測定，分別地利用mabb4和mabdb4去競爭地抑制b4-生物素和db4c7-alexa結(jié)合至位于hpb-all細胞上的表面cd4。

圖11系mabdb4(---)和gp120mn(-)對位于hpb-all細胞上cd4之結(jié)合親和力的曲線圖比較。結(jié)合親和力是以facs加以測定，利用mabdb4和gp120mn去競爭地抑制db4c7-alexa結(jié)合至位于hpb-all細胞上的表面cd4。

圖12系顯示mabdb4c7對pbmccd4+t細胞之溫度依賴性結(jié)合(mfi)的曲線圖。

圖13系顯示來自6位未受感染個體血液樣品之未被占據(jù)的cd4受體(-)和以mabdb4占據(jù)/結(jié)合之cd4受體(---)的平均百分比(±標準差)，并作為mabdb4濃度之函數(shù)的曲線圖。利用db4c7-alexa結(jié)合至位于血液cd4+t細胞表面之未被占據(jù)的結(jié)合位點以偵測未被占據(jù)的受體。然而mabdb4占據(jù)之受體是利用山羊抗-huigg-fitc加以偵測。

圖14系顯示現(xiàn)行抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(cart)藥物tenofovir于hiv無細胞和細胞間傳播上之效果的長條圖(sigal，a.，etal.，2011)。y軸代表來自于存在或缺乏tenofovir狀況下由不同感染源所分離之外周血單核細胞(pbmcs)的傳播指數(shù)(sigal，a.etal.，2011)。

圖15系顯示藉由以下刺激所引發(fā)于靜默pbmcs之病毒再活化的長條圖(其乃利用hiv-1p24gag制造加以測量)，刺激種類包含未受刺激(第1長條)、植物凝集素(pha)(第2長條)、不活化的hiv(ihiv)溶胞產(chǎn)物(第3長條)、針對cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域的單克隆抗體(第4長條)、針對cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr3區(qū)域的單克隆抗體(第5長條)、針對cd4結(jié)構(gòu)域1/2的單克隆抗體(第6長條)、可溶性cd4存在下之ihiv(第7長條)、可溶性cd4存在下針對cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域的單克隆抗體(第8長條)、可溶性cd4存在下針對cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr3區(qū)域的單克隆抗體(第9長條)，以及可溶性cd4存在下針對cd4結(jié)構(gòu)域1/2的單克隆抗體(第10長條)，如附圖說明所示(改編自briantl.，etal.，1999)。

圖16系顯示利用抗-hivrc多克隆抗體對生物素化-b4結(jié)合至rscd4之競爭型抑制的圖式，其藉由elisa加以測量。

圖17系顯示mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對位在pbmcs上之表面cd4的抗體效價測定圖式。抗體效價測定為％cd4結(jié)合對抗體濃度(μg/ml)。

圖18a至圖18g系顯示于未使用治療藥物之hiv陽性和hiv陰性受試者以mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對由超抗原seb所引起增生cd4+和cd8+t細胞之細胞激素il2和ifn-γ制造抑制的分析。對hiv陰性(圖18a)和hiv陽性(圖18b)受試者，mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對由超抗原所引起增生cd4+t細胞之il2制造的抑制如圖所示。對hiv陰性受試者和年齡一致的hiv陽性受試者(圖18c)，mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對由超抗原所引起增生cd8+t細胞之il2制造的抑制也如圖所示。對hiv陰性(圖18d)和hiv陽性(圖18e)受試者，mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對由超抗原所引起增生cd4+t細胞之ifn-γ制造的抑制如圖所示。對hiv陰性(圖18f)和hiv陽性(圖18g)受試者，mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體對由超抗原所引起增生cd8+t細胞之ifn-γ制造的抑制如圖所示。

圖19a至圖19c系顯示藉由對于hiv-1原代分離株dh12(hiv-1dh12)暴露前(圖19a)和暴露后(圖19b)投予mabb4以保護黑猩猩免于hiv感染的圖式，其藉由于感染后一段時間測定在pbmcs中的hiv-1rna拷貝/ml而加以評估。暴露于hiv-1dh12而未投予抗體之對照組動物的結(jié)果圖式(圖19c)如圖所示。向下箭頭標記試驗開始，此時mabb4是于hiv-1dh12攻毒前或后一小時投予。

圖20a和圖20b系顯示未接受治療和以mabb4治療之hiv-1感染黑猩猩的hiv病毒量的圖式，其藉由隨時間測定的hiv-1rna拷貝/ml而加以評估。圖20a系比較于黑猩猩x356(接受三次mabb4輸注(實心圓))與未接受治療的對照組黑猩猩x084(在之前試驗中先前接受mabb4的單一劑量(空心圓))之血漿病毒血癥的持續(xù)時間。

圖20b系比較于黑猩猩x356(接受三次mabb4輸注(實心圓))與未接受治療的對照組黑猩猩x259(未接受mabb4之先前用藥劑量(空心圓))之血漿病毒血癥的持續(xù)時間。

圖21系mabdb4對人類(---)和狒狒(-)cd4陽性t細胞之結(jié)合親和力的曲線圖比較。

圖22a和圖22b系顯示對在藥物增量(1、5、10和25mg/kg)之第i期臨床試驗中接受抗體藥物ub-421(mabdb4c7)單次投予的患者于hiv-1rna的平均log10變化對試驗天數(shù)的圖式。圖22a系顯示在本試驗期間每一劑量所展現(xiàn)之病毒減少的圖式。圖22b系顯示對每一劑量之平均和最大個別最低點的圖式。

圖23a至圖23c系顯示ub-421(mabdb4c7)之療效和先前報導之tmb-355(tmb-355先前稱為tnx-355；kuritzkes，d.r.，etal.，2004，圖1)療效數(shù)據(jù)的理論比較圖式。圖23a系顯示以5mg/kg之ub-421和3mg/kg之tmb-355單次投予后所觀察之病毒量下降的圖式比較。圖23b系顯示以10mg/kg之ub-421或tmb-355單次投予后所觀察之病毒量下降的圖式比較。圖23c系顯示以25mg/kg之ub-421或tmb-355單次投予后所觀察之病毒量下降的圖式比較。

圖24a和圖24b系顯示于為期8周治療期期間在接受每周10mg/kg(圖24a)或每兩周25mg/kg(圖24b)ub-421(mabdb4c7)投予之受試者的平均pbmccd4t細胞數(shù)量/mm³的圖式?？山逵舍槍d4結(jié)構(gòu)域2之生物素化抗體測得于ub-421治療的患者中穩(wěn)定的cd4t細胞數(shù)量。

圖25a至圖25d系顯示在第iia期臨床試驗期間ub-421治療之臨床療效的圖式，如利用病毒量減少(上圖)和ub-421的藥物動力學(如以μg/ml血清濃度加以測定(下圖))所測定。提供了用于以下代表性患者的相關(guān)數(shù)據(jù)：接受每周10mg/kgub-421投予的患者1-1-01(圖25a)；接受每周10mg/kgub-421投予的患者1-1-02(圖25b)；接受每兩周25mg/kgub-421投予的患者1-2-03(圖25c)；以及接受每兩周25mg/kgub-421投予的患者1-2-06(圖25d)。以整個涂滿灰色陰影之區(qū)間代表ub-421結(jié)合于pbmccd4+細胞上的持續(xù)期間。

圖26a和圖26b系顯示于使用ub-421之第iia期臨床試驗所觀察之病毒量減少對照于由他人所作之tmb-355(ibalizumab，先前稱為tnx-355)類似試驗(jacobson，j.l.，etal.，2009；toma，j.，etal.，2011；andpace，c.s.，etal.，2013)所觀察之病毒量減少的理論比較圖式。圖26a概述于以10mg/kg和25mg/kgub-421治療之受試者所觀察的病毒量變化，而圖26b概述于以相同劑量水平tmb-355治療之受試者所觀察的病毒量變化。

圖27系顯示于hiv患者群體的治療形式示意圖，此hiv患者群體是于未使用治療藥物之hiv患者和haart治療穩(wěn)定之hiv患者使用ub-421單一藥物治療以替代haart治療。

圖28系顯示于hiv患者群體的治療形式示意圖，其利用ub-421合并使用haart治療以于未使用治療藥物之hiv患者、haart治療穩(wěn)定之hiv患者，和haart治療失敗之hiv患者達成hiv感染的功能性治愈。

【具體實施方式】

本發(fā)明有關(guān)于用以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的組合物和方法。本發(fā)明之一方面是關(guān)于針對cd4之抗體、其配制劑，以及使用此配制劑以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的方法。

在此使用之章節(jié)標題僅作為組織的目的，且并非被解釋作為限制所述之專利標的。為了任何目的，此申請案引用之所有參考文獻或參考文獻之部分透過引用在此明確地被并入本文整體。

cd4

cd4(clusterofdifferentiation4)是一種糖蛋白(uniprotkb/swiss-prot：p01730.1)，其位于免疫細胞(例如輔助t細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞)(http://en.wikipedia.org/wiki/cd4)。cd4是免疫球蛋白超家族的成員，且具有暴露于細胞外表面的四個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(d1至d4)。cd4結(jié)構(gòu)域d1和d3類似免疫球蛋白可變(igv)區(qū)；而d2和d4類似免疫球蛋白恒定(igc)區(qū)。cd4使用其d1結(jié)構(gòu)域與第二型主要組織相容性復(fù)合體(mhcii)分子的β2-結(jié)構(gòu)域相互作用。因此，于其表面表達cd4分子的t細胞對mhcii所呈現(xiàn)之抗原具有特異性。包含特殊氨基酸序列的cd4短細胞質(zhì)/細胞內(nèi)尾端使其可與lck分子相互作用。

cd4的第一個細胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白共有同源性，其三個互補決定區(qū)(cdrs)與免疫球蛋白鏈相似。發(fā)現(xiàn)cd4分子細胞外區(qū)域的結(jié)構(gòu)域1和結(jié)構(gòu)域2均對mhcii分子之結(jié)合位點具有貢獻；然而，發(fā)現(xiàn)單獨結(jié)構(gòu)域1涉及hiv結(jié)合與合胞形成(syncytiaformation)。特別地，發(fā)現(xiàn)hiv包膜糖蛋白gp120之結(jié)合位點位于結(jié)構(gòu)域1的類cdr-2環(huán)(cdr2-likeloop)。

hiv-1藉由cd4進入宿主t細胞，此乃透過其病毒包膜蛋白(稱為gp120)達成。結(jié)合cd4引起gp120構(gòu)型變化以允許hiv-1結(jié)合至表達于宿主細胞上的化學激素受體ccr5或cxcr4。接著另一個病毒蛋白(gp41)結(jié)構(gòu)改變，hiv將融合肽插入宿主細胞，以允許病毒的外膜與細胞膜融合。hiv感染造成表達cd4之t細胞數(shù)量逐漸減少。

抗體

本發(fā)明之一方面是關(guān)于針對cd4之抗體、其組合物，以及使用此組合物以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的方法。

本發(fā)明抗體廣泛地包含完整的抗體分子，其包含完整的多克隆、單克隆、單特異性、多特異性、嵌合、去免疫化、人源化、人類、靈長類、單鏈、單結(jié)構(gòu)域(single-domain)、合成和重組抗體，以及具有所欲活性或功能之抗體片段。

本發(fā)明抗體可辨認cd4的結(jié)構(gòu)域1。在某些實施方案中，抗體可特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。

本發(fā)明抗體可以任何標準方法制造。在一些實施方案中，本發(fā)明抗體可藉由以重組cd4蛋白、重組cd4蛋白的片段、或是表面表達cd4的細胞免疫動物(例如：小鼠、狗、天竺鼠、豬、山羊、馬等)加以制造。或者，可化學合成抗體。

在某些實施方案中，可藉由以含有cd4結(jié)構(gòu)域1之氨基酸序列的肽免疫動物以制造抗體。例如，可藉由以含有cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域氨基酸序列的肽或其組合免疫動物以制造多克隆抗體。在某些實施方案中，含有cd4之第39-66個氨基酸的肽(稱為hiv受體復(fù)合體(“hivrc”))，如同hiv結(jié)合至cd4之此部分。在某些實施方案中，hivrc肽可藉由二硫鍵以創(chuàng)造環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

在某些實施方案中，可利用環(huán)狀hivrc肽免疫動物以制造多克隆抗體。本發(fā)明所述“抗-hivrc多克隆抗體”是指抗含有cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域第39-66個氨基酸的環(huán)狀肽的免疫血清。

在其它實施方案中，利用cd4陽性細胞免疫動物以制造抗體。例如，在某些實施方案中，以完整、未感染的cd4+人類hpb-all細胞、t細胞急性淋巴細胞性白血病細胞株(t-acutelymphoblasticleukemiacellline)免疫balb/c小鼠制造抗體。于wang的專利(美國5,912,176號和6,090,388號專利)以及wang等人于1999年發(fā)表的期刊論文對此抗體有更詳細的討論，其均透過引用以并入本文整體。

在其它實施方案中，抗體包含如序列表所列之重鏈和輕鏈的氨基酸序列。本發(fā)明包含含有序列表所列氨基酸序列之抗體的同源物和功能類似物。

本發(fā)明抗體的功能類似物包含序列變異和同源物，其保持如原抗體實質(zhì)上相同之功能特征(結(jié)合辨認、結(jié)合親和力等)。例如，作為功能類似物或同源物之抗體變異于氨基酸位置具有保留性取代；靜電荷改變；共價結(jié)合至其它官能基；或小的加入、插入、刪除或保留性取代及/或其任意組合。因此，此抗體的變異抗體功能類似物和同源物將可辨識并結(jié)合cd4，且用于受試者以治療hiv。

在一實施方案中，抗體功能類似物或同源物通常與含有揭露于序列表之氨基酸序列的抗體具有至少約50％序列相似度。在其它實施方案中，抗體功能類似物或同源物與含有揭露于序列表之氨基酸序列的抗體具有至少約50％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、或約99％相似度。

保留性取代是指一個氨基酸殘基以另一個具有相似化學特性之氨基酸殘基取代。例如，非極性(疏水性)氨基酸包含丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包含甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正電(堿性)氨基酸包含精氨酸、賴氨酸和組氨酸；以及負電(酸性)氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸。

在其它實施方案中，抗體的功能類似物可藉由對氮基端、羧基端加入或刪除氨基酸，及/或藉由插入序列中間而加以修飾。在本發(fā)明之不同實施方案中，是對肽的氮基端或羧基端加入或刪除?？蔀?、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸殘基的加入或刪除。此種加入或刪除可能構(gòu)成氨基酸序列，而此氨基酸序列未呈現(xiàn)于序列表所列之序列中，但并不改變此抗體的一般功能特征。

在某些實施方案中，以化學物質(zhì)標記或標幟本發(fā)明抗體。例如，抗體可以生物素、間隔臂、探針(例如：熒光素異硫氰酸鹽(fitc)、藻紅蛋白(pe)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tritc)、dylightfluors、alexa、綠色熒光蛋白(gfp)、r-藻紅蛋白(r-phycoerythrin)、量子點(quantumdots)等)、酶綴合物，及其組合加以標幟。在具體實施方案中，抗體是以生物素或熒光探針標幟。

在具體實施方案中，抗體透過已知的去免疫化過程加以修飾。本發(fā)明所述“去免疫化”一般是指用以修飾抗體之部分的過程，藉此使其投予動物時不引起動物體內(nèi)之免疫反應(yīng)。具體來說，此抗體于投予至特定動物時具有免疫原性(例如，t細胞抗原表位)，去免疫化涉及定位與移除抗體部分氨基酸序列的過程。此過程可藉由結(jié)合使用免疫學與分子生物學技術(shù)達成。此過程先前已揭露(例如jones，t.d.，etal.2009)。在抗體去免疫化的狀況下，可普遍地引入突變以移除t細胞抗原表位而未顯著地減少抗體的結(jié)合親和力。

本發(fā)明所述“人源化”是指修飾(去免疫化)非人類物種抗體的蛋白質(zhì)序列，藉此移除當此抗體投予人類時的免疫原性。在某些實施方案中，本發(fā)明抗體是利用以人類恒定區(qū)取代其恒定區(qū)及/或利用表達于哺乳類細胞編碼此些抗體的基因以去免疫化供人類使用。

在某些實施方案中，本發(fā)明抗體具有如表4所示之重鏈和輕鏈氨基酸序列。

本發(fā)明所述“mabb4”或“b4”或“鼠源b4”分別地是指具有seqidnos：1-6之重鏈和輕鏈的cdr1、2、3區(qū)域氨基酸序列的鼠源單克隆抗體(如表4所示)。鼠源單克隆抗體可辨識cd4并抑制hiv進入。此抗體之結(jié)構(gòu)與功能特征于實施例與下文中有更詳細之討論。

本發(fā)明所述“mabdb4“或“db4”是指衍生自mabb4之人類去免疫化抗體。人類去免疫化mabdb4分別地具有seqidnos：1-6之重鏈和輕鏈的cdr1、2、3區(qū)域之氨基酸序列(如表4所示)。在一些實施方案中，mabdb4之輕鏈具有seqidno：8之氨基酸序列(如圖5所示)。在一些實施方案中，mabdb4之重鏈具有seqidno：7之氨基酸序列(如圖4所示)。在不同實施例中，mabdb4之重鏈具有seqidno：9之氨基酸序列(如圖6所示)。mabb4可藉由于本領(lǐng)域所知悉的任何適當方法加以去免疫化。在一實施方案中，mabb4是利用依據(jù)美國7,501,494號和7,872,110號專利所述之方法去免疫化以供人類使用，其透過引用在此并入本文整體。在特殊實施方案中，人類去免疫化mabdb4是藉由移除mabb4之鼠源抗體恒定區(qū)(ch和cκ)，并以人類igg1的恒定區(qū)取代，而制造。mabdb4包含以任何適當之細胞克隆制造的db4。在具體實施方案中，mabdb4是由7號克隆所制造。

本發(fā)明所述“mabdb4c7”或“db4c7”，是指由包含重組基因b4divhv1/vk1cho#7的7號克隆所表達的mabdb4，其先前于美國7,501,494號和7,872,110號專利揭露，這些專利透過引用在此并入本文整體。顯示c7克隆可制造高品質(zhì)的mabdb4抗體。特別的是，mabb4c7為人類去免疫化抗體，其具有包含seqidno：8氨基酸序列之輕鏈(如圖5所示)和包含seqidno：7氨基酸序列之重鏈(如圖4所示)。此外，將位于mabdb4c7位置298之a(chǎn)sn(n)殘基以his(h)取代，以移除n-糖化點，因此于抗體b4存在下消除igg介導的補體依賴型細胞毒性作用(cdc)以防止cd4陽性t細胞的耗竭。

本發(fā)明所述“ub-421”是指使用于投予人類受試者之合適形式的mabdb4c7。

本發(fā)明抗體也可藉由其有趣與獨特的功能特征而加以描述。

例如，本發(fā)明之抗體可透過其結(jié)合至cd4之結(jié)構(gòu)域1而發(fā)揮有效的競爭型hiv進入抑制。特別是，本發(fā)明之抗體于測試的所有env假型病毒具有接近100％的最大抑制百分比(mpi)，具有兩個ic50濃度；一個是介于0.01至1μg/ml，且第二個是約10μg/ml。本發(fā)明抗體的結(jié)合活性較hivgpl20包膜蛋白所展現(xiàn)之cd4結(jié)合親和力高了約兩個對數(shù)(即100倍更緊密的結(jié)合)。此外，本發(fā)明抗體的平均解離常數(shù)(kd)測得為5.6x10^-11m(范圍：3.1至8.1x10^-11m)，且最大結(jié)合容量(bmax)測得為每細胞1.2x10⁶ab(范圍：0.93至1.4x10⁶)。

于無細胞和細胞間的系統(tǒng)中均顯示本發(fā)明抗體的競爭型抑制特性。本發(fā)明抗體以較hiv包膜蛋白gp120mn高至少50倍之親和力結(jié)合至cd4受體。并且，本發(fā)明抗體以相較于其它市售抗體(例如leu3a)更高的親和力與特異性結(jié)合至cd4。

本發(fā)明抗體也可抑制由抗原引起的t細胞增生和cd4陽性t細胞的細胞激素制造(il2和ifn-gamma)，其涉及細胞焦亡的致病循環(huán)。此種對cd4具高親和力之單克隆抗體可抑制抗原(例如超抗原seb(金黃色葡萄球菌b型腸毒素(staphylococcalenterotoxinb，seb))引起的cd4陽性t細胞活化和細胞激素(例如il2和ifn-γ)制造。此種抗原引起的活化導致hiv感染失敗的靜默cd4+t細胞產(chǎn)生細胞激素，造成這些靜默cd4+t細胞和附近正常靜默cd4陽性細胞的細胞焦亡，其導致之后cd4+t細胞的大量耗竭，因而導致aids。

本發(fā)明抗體也具有再活化靜默cd4陽性t細胞的能力。此特性對再活化靜默t細胞中的潛伏hiv病毒庫特別有用，可使這些細胞對抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療敏感。為了釋放hiv，此種對cd4高親和力之抗體可活化靜默的hiv感染細胞。hiv感染的靜默cd4+t細胞再活化允許hiv感染患者使用合并本發(fā)明抗體與haart之合并治療，以達成功能性治愈。

于以下實施例提供本發(fā)明抗體額外的結(jié)構(gòu)與功能特征。

劑型

本發(fā)明也針對用以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染的藥劑劑型。在某些實施方案中，劑型包含針對cd4之抗體。在具體實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含對cd4高親和力之單克隆抗體的醫(yī)藥組合物(此抗體可針對位于cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域內(nèi)或附近的位置)。此種抗體的結(jié)合活性(ecs0)較hivgp120包膜蛋白所展現(xiàn)之cd4結(jié)合親和力(對gp120之ec50＝97nm)高了約兩個對數(shù)(即100倍更緊密的結(jié)合)。

抗體蛋白質(zhì)的藥劑劑型可藉由混合抗體蛋白質(zhì)與任選的藥物學上可接受的載體而加以制備。藥物學上可接受的載體包含溶劑、分散介質(zhì)、等滲劑等。載體可為液體、半固體(例如膏狀物)或固體載體。載體的例子包含水、鹽溶液或其它緩沖液(例如磷酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液)、油類、醇類、蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白、明膠)、碳水化合物(例如單糖、雙糖，以及其它碳水化合物(包含葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇或糊精)、凝膠、脂質(zhì)、微脂體、樹脂、多孔基體、粘合劑、充填劑、涂層、穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑(包含抗壞血酸以及甲硫氨酸)、螯合劑(例如edta)；成鹽的抗衡離子(saltformingcounter-ions)(例如鈉)；非離子表面活性劑(例如tween^tm、pluronics^tm或聚乙二醇(peg)，或其組合)。

此劑型可包含至少一種的活性物質(zhì)。例如，劑型可含有用于預(yù)防和治療hiv感染之一或多個抗體及/或一或多個具有額外優(yōu)點的化合物?；钚晕镔|(zhì)可以任何方便使用的方式(例如：混合、溶液、懸浮液、乳化作用、膠囊化、吸附等)與載體結(jié)合，且可制成適用于注射、攝取、輸注等的劑型(例如：錠劑、膠囊、粉末(包含冷凍干燥粉末)、糖漿劑、懸浮液)。亦可制備成緩釋制劑。

在某些實施方案中，藥劑劑型包含供人類使用之mabdb4c7。包含mabdb4c7之藥劑劑型可配制于適當緩沖液中，包含，但不限于，檸檬酸鹽、磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(tris)、1，3-二[三(羥甲基)甲基氨基]丙烷(bis-tris)等，于介于6.0至7.0之ph值，且可包含賦形劑(例如糖類(50mm至500mm的蔗糖、海藻糖、甘露醇，或其混合))、表面活性劑(例如：0.025％-0.5％的tween20或tween80)，及/或其它試劑。在具體實施方案中，劑型包含mabdb4c7于含有20mm甘氨酸，以及0.05％(v/v)tween(polysorbate20)之磷酸鹽緩沖生理食鹽水(pbs)(ph6.5)中。在其它具體實施方案中，也可制備mabdb4之高濃度劑型以供包含皮下注射之應(yīng)用，其包含10mm組氨酸。

可制備含有不同量抗體的劑型。一般來說，用于投予受試者的劑型包含介于約0.1mg/ml至約200mg/ml。在某些實施方案中，劑型可包含介于約0.5mg/ml至約50mg/ml；介于約1.0mg/ml至約50mg/ml；介于約1mg/ml至約25mg/ml；或介于約10mg/ml至約25mg/ml的抗體。在具體實施方案中，劑型包含約1.0mg/ml，約5.0mg/ml，約10.0mg/ml，或約25.0mg/ml的抗體。

在具體實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之針對cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域之人類、人源化或嵌合、單克隆抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其展現(xiàn)競爭型hiv進入抑制與cd4+t細胞活化，作為hiv患者的免疫療法。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合，抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其作為單一藥物治療使接受治療之受試者血清抗體水平高于10μg/ml，可將病毒量降低至檢測極限以下。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合，抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其作為單一藥物治療可于為期12周治療期間使接受治療之受試者血清抗體水平高于10μg/ml，且維持穩(wěn)定的cd4t細胞數(shù)量，將病毒量降低至檢測極限以下。

在某些實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合，抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時，此種治療可于為期12周治療期間使接受治療之受試者的病毒量降低至檢測極限以下。

在另一較佳實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之hiv患者，將達成患者的功能性治愈。

在另一較佳實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予于haart下具有穩(wěn)定病毒量的患者，將達成患者的功能性治愈。

抗病毒藥物

本發(fā)明之治療、預(yù)防，和功能性治愈hiv感染的方法更包括抗病毒藥物。

抗病毒藥物包含可于哺乳類動物有效抑制hiv之形成及/或復(fù)制的任何藥物(化合物或生物的)。抗病毒藥物的例子包含，但不限于，進入/融合抑制劑(例如：maraviroc、enfuvirtide)；核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nrti)和核苷酸類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(ntrti)(例如：zidovudine、abacavir、lamivudine、emtricitabine和tenofovir)；非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nnrti)(例如：nevirapine、efavirenz、etravirine和rilpivirine)；整合酶抑制劑(也稱為整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑或instis(例如：raltegravir、dolutegravir)；蛋白酶抑制劑(例如：saquinavir、saquinavirmesylate、fosamprenavir、tipranavir、lopinavir、indinavir、nelfinavir、amprenavir、ritonavir、darunavir、atazanavir、bevirimat、vivecon)；病毒成熟抑制劑；針對hiv基因表達的藥物；針對涉及hiv復(fù)制之重要宿主細胞基因和基因產(chǎn)物的藥物；以及其它抗-hiv藥物；irna藥物；反義rna(antisenserna)；表達irna藥物或反義rna之載體；肽核酸(pna)以及抗病毒抗體；及其組合。

抗病毒藥物可以單獨或合并方式使用。以合并方式使用抗病毒藥物稱為抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(art)，聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(cart)或高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)?？狗崔D(zhuǎn)錄病毒(arv)藥物藉由藥物抑制反轉(zhuǎn)錄病毒生命周期的階段而廣泛地被分類。典型的合并使用包含以兩種nrtis作為“骨架”，以及以一種nnrti、pi或insti作為“基底”。在某些實施方案中，合并使用抗病毒藥物的方式，例如：combivir、trizivir、kaletra、epzicom、truvada、atripla、complera、stribild、triumeq。

治療、預(yù)防和功能性治愈的方法

本發(fā)明也包括用以治療、預(yù)防，和功能性治愈hiv感染的方法。在某些實施方案中，劑型包含針對cd4之抗體。

另一方面，本發(fā)明之抗體、任選的藥物學上可接受的載體可于受試者用以預(yù)防、治療，及/或功能性治愈hiv感染，以及預(yù)防hiv傳播。

本發(fā)明所述hiv感染的“治療”是指對hiv感染的有效抑制，藉此延遲發(fā)生、延緩病程、減少病毒量，及/或改善由hiv感染所引起之癥狀。治療包含對hiv暴露前和暴露后。

本發(fā)明所述hiv感染的“預(yù)防”是指延遲hiv感染之發(fā)生，及/或減少或消除hiv感染的發(fā)生率或可能性。本發(fā)明所述hiv傳播的“預(yù)防”是指減少或消除hiv由一個體傳染至另一個體(例如于懷孕、分娩或生產(chǎn)，或母乳喂養(yǎng)期間由hiv陽性之女性傳至小孩)的發(fā)生率或可能性。

本發(fā)明所述“受試者”是指任何靈長類受試者，包含人類、恒河猴、狒狒和黑猩猩受試者。

為治療及/或預(yù)防hiv感染，對有需求的受試者投予本發(fā)明抗體的治療劑量。

本發(fā)明所述“治療上有效劑量”是指抑制hiv感染效果所需劑量，藉此治療及/或預(yù)防hiv感染。抗體的劑量取決于疾病狀態(tài)和其它臨床因素，例如受試者重量和狀況、受試者對此療法的反應(yīng)、劑型的種類和給藥途徑。作為治療上有效且非有害的精確劑量可由本領(lǐng)域之技術(shù)人員所決定。

一般來說，投予成年人類之抗體的適當劑量范圍介于約3至50mg/kg受試者體重，具有范圍介于約5至25mg/kg受試者體重的典型初步范圍可供使用。適當劑量也包含約5.0mg/kg、約10.0mg/kg、或約25.0mg/kg受試者體重。

包含本發(fā)明人類單克隆抗體的治療性組合物可便于靜脈投予(例如藉由單位劑量注射)。單位劑量一般是指本發(fā)明之治療性組合物，其進一步是指對受試者適合作為單位劑量之物理上分開的單位，每一單位包含計算用以產(chǎn)生所欲治療反應(yīng)之活性物質(zhì)的預(yù)定量和所需稀釋劑(即載體或賦形劑)。

以適當劑型之方式與治療上有效劑量投予組合物。給藥量取決于所欲治療的受試者、受試者身體利用活性物質(zhì)的能力，以及所欲治療效果之程度。需要投予之活性成分的精確劑量取決于醫(yī)生之判斷與個體的差異性。然而，所揭露供系統(tǒng)性應(yīng)用之適當劑量范圍取決于給藥途徑。用于投予的適當治療方案也不盡相同，而是以于初次投予后投予重復(fù)劑量作為代表(于一或多個小時之間隔藉由之后的注射或其它投予方式)。另外，考慮在生物治療中持續(xù)靜脈輸注以維持血液中的濃度于指定范圍。

于受試者用以治療、預(yù)防，及/或功能性治愈hiv感染的方法包含投予受試者有效劑量之含有抗體的劑型。在某些實施方案中，以單次投予的方式提供劑型給受試者。在某些實施方案中，以多次投予的方式提供劑型給受試者。當以多次投予的方式提供劑型時，劑型可以每天一次、每周一次、每兩周一次(每隔一周)，或每月一次投予。在具體實施方案中，當治療時程表是以每周一次時，劑型是以約5.0mg/kg受試者體重之劑量投予受試者。在另一實施方案中，當治療時程表是以每兩周一次時，劑型是以約25.0mg/kg受試者體重之劑量投予受試者。

在某些實施方案中，當以總共8周，以5mg/kg或25mg/kg劑量以每周為基礎(chǔ)重復(fù)投予受試者時，含有單克隆抗體之劑型顯現(xiàn)高安全系數(shù)且耐受性良好。在具體實施方案中，單克隆抗體可以5mg/kg劑量在hiv感染數(shù)小時內(nèi)投予受試者，以提供hiv感染的消除性治愈。在其它實施方案中，單克隆抗體可以5mg/kg劑量于hiv感染后在數(shù)天內(nèi)投予受試者，以提供hiv感染的功能性治愈。

在某些實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合，抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其透過靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予hiv患者作為免疫療法以減少病毒量。在具體實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之針對cd4結(jié)構(gòu)域1cdr2區(qū)域之人類、人源化或嵌合單克隆抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其展現(xiàn)競爭型hiv進入抑制與cd4+t細胞活化，以作為hiv感染之患者的免疫療法。

在某些實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量透過靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予hiv患者作為免疫療法以減少病毒量。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其作為單一藥物治療可使接受治療之受試者血清抗體水平高于10μg/ml，將病毒量降低至檢測極限以下。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其作為單一藥物治療可于為期12周治療期間使接受治療之受試者血清抗體水平高于10μg/ml，且維持穩(wěn)定的cd4t細胞數(shù)量，將病毒量降低至檢測極限以下。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時，此種治療可于為期12周治療期間使接受治療之受試者的病毒量降低至檢測極限以下。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予作為單一藥物治療時，此種治療可使接受治療之受試者的病毒量降低至檢測極限以下，且只要血清抗體水平高于10μg/ml即無病毒量反彈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之hiv患者，可達成患者的功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予于haart下具有穩(wěn)定病毒量的患者，可達成患者的功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量透過靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予對haart之輔助治療中haart治療失敗之患者，可使病毒進一步減少。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為于haart替代療法的關(guān)鍵成份，藉此進行治療循環(huán)，每治療循環(huán)以抗-cd4抗體治療2至4個月作為開始，其如同對于harrt之下經(jīng)歷穩(wěn)定低于檢測極限病毒量之患者的治療假日(treatmentholiday)，之后接續(xù)haart治療，進行1至4個或更多循環(huán)的期間，可達成功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為于haart替代療法的關(guān)鍵成份，藉此進行治療循環(huán)，對于未使用治療藥物之hiv患者每治療循環(huán)以抗-cd4抗體治療2至4個月作為開始，之后接續(xù)2至4個月的haart治療，進行1至4個或更多循環(huán)的期間，可達成功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為于haart替代療法的關(guān)鍵成份，藉此進行治療循環(huán)，每治療循環(huán)以抗-cd4抗體治療2至4個月作為開始，其如同對于harrt之下經(jīng)歷穩(wěn)定低于檢測極限病毒量之患者的治療假日，之后接續(xù)haart治療，進行1至4個或更多循環(huán)的期間，以每周或每兩周之時程表以約5mg/kg或更高之劑量，可達成功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為于haart替代療法的關(guān)鍵成份，藉此進行治療循環(huán)，對于未使用治療藥物之hiv患者每治療循環(huán)以抗-cd4抗體治療2至4個月作為開始，之后接續(xù)2至4個月的haart治療，進行1至4個或更多循環(huán)的期間，以每周或每兩周之時程表以約5mg/kg或更高之劑量，可達成功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予未使用治療藥物之hiv患者，將達成患者的功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，其可作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，當以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量投予于haart下具有穩(wěn)定病毒量的患者，將達成患者的功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以每周或每兩周之時程表以約10mg/kg或更高之劑量透過靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予對haart之輔助治療中haart治療失敗之患者，使病毒進一步減少。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，于間歇模式中，對于未使用治療藥物之hiv患者，每循環(huán)以2至4個月之治療期作為開始，以及1至2個月之治療假日，進行1至4個或更多循環(huán)的期間，如同于密集haart治療模式的輔助治療，可達成患者的功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，于間歇模式中，對于未使用治療藥物之hiv患者，每循環(huán)以2至4個月之治療期作為開始，以及1至2個月之治療假日，進行1至4個或更多循環(huán)的期間，以每周或每兩周之時程表以約5mg/kg或更高之劑量，如同于密集haart治療模式的輔助治療，可達成患者的功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人源化抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予作為偕同haart之輔助治療的關(guān)鍵成份，于間歇模式中，對harrt之下經(jīng)歷穩(wěn)定低于檢測極限病毒量之患者，每循環(huán)以2至4個月之治療期作為開始，以及1至2個月之治療假日，進行1至4個或更多循環(huán)的期間，以每周或每兩周之時程表以約5mg/kg或更高之劑量，如同于密集haart治療模式的輔助治療，可達成患者的功能性治愈。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予hiv患者作為免疫療法以減少病毒量。

在其它實施方案中，本發(fā)明關(guān)于包含具有上述結(jié)合特征之單克隆人類、人源化或嵌合抗-cd4抗體的醫(yī)藥組合物，可將其以每周或每兩周之時程表以約5mg/kg或更高之劑量透過靜脈注射或皮下注射給藥途徑投予hiv患者作為免疫療法以減少病毒量。

具體實施方案

本發(fā)明包含以下具體實施方案：

(1)一種用以治療暴露于hiv感染之受試者的方法，包含：a)投予針對cd4之單克隆抗體的藥理學上有效劑量包含：seqidno：1之鼠源抗體b4之重鏈的cdr1、seqidno：2之鼠源抗體b4之重鏈的cdr2、seqidno：3之鼠源抗體b4之重鏈的cdr3、seqidno：4之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr1、seqidno：5之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr2，以及seqidno：6之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr3；b)在步驟(a)后評估受試者血液之每毫升的hivrna水平。

(2)依據(jù)(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7。

(3)依據(jù)(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9。

(4)依據(jù)(1)的方法，其中抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(5)依據(jù)(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(6)依據(jù)(1)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(7)依據(jù)(1)的方法，其中投予步驟(a)是于暴露于hiv感染24小時內(nèi)進行。

(8)依據(jù)(1)的方法，其中投予步驟(a)是于暴露于hiv感染48小時內(nèi)進行。

(9)依據(jù)(1)的方法，其中單克隆抗體的藥理學上有效劑量是以于12周之期間內(nèi)以每周或每兩周之時程表以約為10μg/ml或更高之血清水平被投予。

(10)依據(jù)(1)的方法，其中低于1個拷貝/ml之每毫升的hivrna水平數(shù)值被視為病毒的根除。

(11)依據(jù)(1)的方法，其中介于1至低于50個拷貝/ml之每毫升的hivrna水平數(shù)值被視為病毒的功能性治愈。

(12)一種用以治療hiv患者的方法，包含：a)投予組合物之藥理學上有效劑量，此組合物包含針對cd4之單克隆抗體，此針對cd4之單克隆抗體包含：seqidno：1之鼠源抗體b4之重鏈的cdr1、seqidno：2之鼠源抗體b4之重鏈的cdr2、seqidno：3之鼠源抗體b4之重鏈的cdr3、seqidno：4之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr1、seqidno：5之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr2，以及seqidno：6之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr3；以及高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)；以及b)在步驟(a)后評估受試者血液中每毫升的hivrna水平。

(13)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7。

(14)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9。

(15)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(16)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(17)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(18)依據(jù)(12)的方法，其中抗體的藥理學上有效劑量是以每周或每兩周之基礎(chǔ)以10mg/kg或更高之劑量被投予。

(19)依據(jù)(12)的方法，其中抗體是以間歇模式被投予以作為于haart治療模式中的輔助治療。

(20)依據(jù)(19)的方法，其中每循環(huán)是于約2至4個月之期間投予抗體作為haart治療模式中的輔助治療，之后為haart治療模式中1至2個月的抗體治療假日。

(21)依據(jù)(20)的方法，其中間歇方式持續(xù)一至四循環(huán)的期間。

(22)一種用以治療hiv患者的方法，包含：a)藉由活化患者體內(nèi)之潛伏感染細胞的hiv病毒表達和細胞凋亡，以減少于hiv患者體內(nèi)的潛伏hiv病毒庫；以及b)對患者投予haart的藥理學上有效劑量。

(23)依據(jù)(22)的方法，其中活化患者體內(nèi)潛伏感染細胞的hiv病毒表達和細胞凋亡是藉由對患者投予針對cd4之單克隆抗體的藥理學上有效劑量而加以執(zhí)行，包含：seqidno：1之鼠源抗體b4之重鏈的cdr1、seqidno：2之鼠源抗體b4之重鏈的cdr2、seqidno：3之鼠源抗體b4之重鏈的cdr3、seqidno：4之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr1、seqidno：5之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr2，以及seqidno：6之鼠源抗體b4之輕鏈的cdr3。

(24)依據(jù)(22)的方法，其中活化患者體內(nèi)潛伏感染細胞的hiv病毒表達和細胞凋亡是藉由對患者投予組蛋白脫乙酰酶(hdac)抑制劑而加以執(zhí)行。

(25)一種用以治療暴露于hiv感染之受試者的方法，包含：a)投予對cd4類cdr2結(jié)構(gòu)域區(qū)域(cdr2-likedomainregion)具有高度親和力之單克隆抗體的藥理學上有效劑量；以及b)在步驟(a)后評估受試者血液之每毫升的hivrna水平。

(26)依據(jù)(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7。

(27)依據(jù)(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9。

(28)依據(jù)(25)的方法，其中抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(29)依據(jù)(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：7，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(30)依據(jù)(25)的方法，其中抗體的重鏈序列包含seqidno：9，且抗體的輕鏈序列包含seqidno：8。

(31)依據(jù)(25)的方法，其中投予步驟(a)是于暴露于hiv感染24小時內(nèi)進行。

(32)依據(jù)(25)的方法，其中投予步驟(a)是于暴露于hiv感染48小時內(nèi)進行。

(33)依據(jù)(25)的方法，其中單克隆抗體的藥理學上有效劑量是于12周之期間內(nèi)以每周或每兩周之時程表以約10μg/ml或更高之血清水平被投予。

(34)依據(jù)(25)的方法，其中低于1個拷貝/ml之每毫升的hivrna水平數(shù)值被視為病毒的根除。

(35)依據(jù)(25)的方法，其中介于1至低于50個拷貝/ml之每毫升的hivrna水平數(shù)值被視為病毒的功能性治愈。

額外的具體實施方案

(1)一種用以治療暴露于hiv之受試者的方法，包含投予受試者針對cd4結(jié)構(gòu)域1之抗體的藥理學上有效劑量。

(2)依據(jù)(1)的方法，其中抗體特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。

(3)依據(jù)(2)的方法，其中抗體為單克隆抗體、多克隆抗體，或其組合。

(4)依據(jù)(2)的方法，其中抗體為人源化單克隆抗體。

(5)依據(jù)(4)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：重鏈氨基酸序列包含：seqidno：1的cdr1、seqidno：2的cdr2，以及seqidno：3的cdr3；以及輕鏈氨基酸序列包含：seqidno：4的cdr1、seqidno：5的cdr2，以及seqidno：6的cdr3。

(6)依據(jù)(4)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：11之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：13之氨基酸序列的輕鏈。

(7)依據(jù)(4)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：10之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：8之氨基酸序列的輕鏈。

(8)依據(jù)(7)的方法，其中重鏈包含seqidno：7的氨基酸序列。

(9)依據(jù)(8)的方法，其中人源化抗體是于暴露于hiv前投予受試者。

(10)依據(jù)(8)的方法，其中人源化抗體是于暴露于hiv后投予受試者。

(11)依據(jù)(10)的方法，其中人源化抗體是于暴露于hiv后48小時內(nèi)投予。

(12)依據(jù)(8)的方法，其中人源化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。

(13)依據(jù)(12)的方法，其中人源化抗體是以多次投予受試者。

(14)依據(jù)(13)的方法，其中人源化抗體是以每周或每兩周之間隔投予受試者。

(15)依據(jù)(13)的方法，更包含投予受試者抗病毒藥物之步驟。

(16)依據(jù)(15)的方法，其中抗病毒藥物為高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。

(17)依據(jù)(16)的方法，其中haart包含核苷類似物反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑合并使用蛋白酶抑制劑或非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。

(18)依據(jù)(16)的方法，其中人源化抗體是與haart同時投予。

(19)依據(jù)(16)的方法，其中在循環(huán)的期間內(nèi)投予受試者人源化抗體和haart，其中此循環(huán)包含：(i)以每周或每兩周之間隔于4個月之期間對受試者投予人源化抗體，之后為兩個月的治療假日；以及(ii)于(i)內(nèi)之六個月期間持續(xù)地對此受試者投予haart。

(20)依據(jù)(18)的方法，其中受試者是以二循環(huán)的期間治療。

(21)一種用以治療hiv感染之受試者的方法，包含投予此受試者治療方案包含：(a)針對cd4結(jié)構(gòu)域1之抗體的藥理學上有效劑量；以及(b)高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。

(22)依據(jù)(21)的方法，其中抗體特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。

(23)依據(jù)(22)的方法，其中抗體為單克隆抗體、多克隆抗體，或其組合。

(24)依據(jù)(22)的方法，其中抗體為人源化單克隆抗體。

(25)依據(jù)(24)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：重鏈氨基酸序列包含：seqidno：1的cdr1、seqidno：2的cdr2，以及seqidno：3的cdr3；以及輕鏈氨基酸序列包含：seqidno：4的cdr1、seqidno：5的cdr2，以及seqidno：6的cdr3。

(26)依據(jù)(24)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：11之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：13之氨基酸序列的輕鏈。

(27)依據(jù)(24)的方法，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：10之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：8之氨基酸序列的輕鏈。

(28)依據(jù)(27)的方法，其中人源化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。

(29)依據(jù)(21)的方法，其中在循環(huán)的期間內(nèi)投予受試者治療方案，其中此循環(huán)包含：(i)以每周或每兩周之間隔于4個月之期間對受試者投予人源化抗體，之后為兩個月的治療假日；以及(ii)于(i)內(nèi)之六個月期間持續(xù)地對此受試者投予haart。

(30)依據(jù)(18)的方法，其中此受試者是以二循環(huán)治療。

更具體實施方案

(1)一種用以治療暴露于hiv之受試者的組合物包含：針對cd4結(jié)構(gòu)域1之抗體的藥理學上有效劑量。

(2)依據(jù)(1)的組合物，其中抗體特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。

(3)依據(jù)(2)的組合物，其中抗體為單克隆抗體、多克隆抗體，或其組合。

(4)依據(jù)(2)的組合物，其中抗體為人源化單克隆抗體。

(5)依據(jù)(4)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：重鏈氨基酸序列包含：seqidno：1的cdr1、seqidno：2的cdr2，以及seqidno：3的cdr3；以及輕鏈氨基酸序列包含：seqidno：4的cdr1、seqidno：5的cdr2，以及seqidno：6的cdr3。

(6)依據(jù)(4)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：11之氨基酸序列的重鏈，以及包含seqidno：13之氨基酸序列的輕鏈。

(7)依據(jù)(4)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：10之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：8之氨基酸序列的輕鏈。

(8)依據(jù)(7)的組合物，其中重鏈包含seqidno：7的氨基酸序列。

(9)依據(jù)(8)的組合物，其中人源化抗體是于暴露于hiv前投予受試者。

(10)依據(jù)(8)的組合物，其中人源化抗體是于暴露于hiv后投予受試者。

(11)依據(jù)(10)的組合物，其中人源化抗體是于暴露于hiv后48小時內(nèi)投予。

(12)依據(jù)(8)的組合物，其中人源化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。

(13)依據(jù)(12)的組合物，其中人源化抗體是以多次投予受試者。

(14)依據(jù)(13)的組合物，其中人源化抗體是以每周或每兩周之間隔投予受試者。

(15)依據(jù)(13)的組合物，其中是以抗病毒藥物治療(或投予)受試者。

(16)依據(jù)(15)的組合物，其中抗病毒藥物為高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。

(17)依據(jù)(16)的組合物，其中haart包含核苷類似物反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑合并使用蛋白酶抑制劑或非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。

(18)依據(jù)(16)的組合物，其中人源化抗體是與haart同時投予。

(19)依據(jù)(16)的組合物，其中在循環(huán)的期間內(nèi)投予受試者人源化抗體和haart，其中此循環(huán)包含：(i)以每周或每兩周之間隔于4個月之期間對受試者投予人源化抗體，之后為兩個月的治療假日；以及(ii)于(i)內(nèi)之六個月期間持續(xù)地對此受試者投予haart。

(20)依據(jù)(18)的組合物，其中受試者是以二循環(huán)的期間治療。

(21)一種用以治療hiv感染之受試者的組合物包含：(a)針對cd4結(jié)構(gòu)域1之抗體的藥理學上有效劑量；以及(b)高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。

(22)依據(jù)(21)的組合物，其中抗體特異性地結(jié)合位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域。

(23)依據(jù)(22)的組合物，其中抗體為單克隆抗體、多克隆抗體，或其組合。

(24)依據(jù)(22)的組合物，其中抗體為人源化單克隆抗體。

(25)依據(jù)(24)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：重鏈氨基酸序列包含：seqidno：1的cdr1、seqidno：2的cdr2，以及seqidno：3的cdr3；以及輕鏈氨基酸序列包含：seqidno：4的cdr1、seqidno：5的cdr2，以及seqidno：6的cdr3。

(26)依據(jù)(24)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：11之氨基酸序列的重鏈；以及包含seqidno：13之氨基酸序列的輕鏈。

(27)依據(jù)(24)的組合物，其中人源化單克隆抗體包含：包含seqidno：10之氨基酸序列的重鏈，以及包含seqidno：8之氨基酸序列的輕鏈。

(28)依據(jù)(27)的組合物，其中人源化抗體是以至少約5mg/kg體重之劑量投予受試者。

(29)依據(jù)(21)的組合物，其中在循環(huán)的期間內(nèi)投予受試者治療方案，其中此循環(huán)包含：(i)以每周或每兩周之間隔于4個月之期間對受試者投予人源化抗體，之后為兩個月的治療假日；以及(ii)于(i)內(nèi)之六個月期間持續(xù)地對此受試者投予haart。

(30)依據(jù)(18)的組合物，其中此受試者是以二循環(huán)治療。

除非特別說明，在此使用的所有技術(shù)和科學用語如本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出，否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包含復(fù)數(shù)形式。類似地，單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明確說明。因此，“包含a或b”是指包括a，或b，或a和b。更應(yīng)被理解的是，用于給定多肽之所有的氨基酸大小和所有分子量或分子質(zhì)量值是近似的，并且被提供作為描述之用。然而類似或等同于在此描述者的方法和材料可被用于以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實踐或測試中。所有出版物、專利申請、專利和在此提及的其它參考文獻透過引用在此并入本文整體。在沖突的情況下，以本說明書(包括術(shù)語的解釋)為準。此外，材料、方法和實施例僅是說明性的而非意指加以限制。

所提供圖式和相關(guān)實施例的以下說明性解釋是用以便于理解在此頻繁使用的某些術(shù)語，特別是在實施例中。解釋是為便利性而被提供而非用以限制本發(fā)明。

【實施例】

實施例1.mabb4的免疫和功能特性

單克隆抗體b4(mabb4)為可辨識位于t細胞表面之復(fù)合hiv受體位點(cd4)的單克隆抗體。mabb4可影響和妨礙cd4和hiv共受體的相互作用。mabb4優(yōu)先地中和原代hiv-1分離株。

以下資訊總結(jié)了鼠源mabb4之發(fā)現(xiàn)與初步的特性研究，其包含引用自兩篇專利(由wang所發(fā)明的美國5,912,176號和6,090,388號專利)和wang等人于1999年發(fā)表期刊論文的資料，其均透過引用以并入本文整體。

1.衍生自hpb-all免疫之鼠源單克隆抗體

以完整、未感染的cd4+人類hpb-all細胞、t細胞急性淋巴細胞性白血病細胞株免疫balb/c小鼠以提供mabb4。

所提供之新種類的抗-cd4抗體(以mabb4表示)對位于細胞表面之cd4具有特異性，且對hiv-1的原代分離株具有廣泛的中和活性。

2.mabb4辨識位置的特征

相較于重組可溶性cd4(rscd4)，發(fā)現(xiàn)mabb4優(yōu)先地辨識位于細胞表面上的膜結(jié)合cd4(membrane-boundcd4)。

于暴露于hiv前之mabb4結(jié)合至膜結(jié)合cd4顯示可阻斷后續(xù)gp120和整個病毒附著至cd4。然而，于暴露于抗體前就已結(jié)合至gp120的膜結(jié)合cd4仍然可結(jié)合mabb4。因此，mabb4能影響gp120結(jié)合至膜結(jié)合cd4，但是gp120并不影響mabb4結(jié)合至cd4。

mabb4的辨識位置有別于其它已充分研究之抗-cd4單克隆抗體的辨識位置，包含可辨識cd4結(jié)構(gòu)域1之單克隆抗體leu3a和okt4a(chiba，y.1992；jameson，b.d.，etal.，1988)，以及可辨識cd4結(jié)構(gòu)域2之單克隆抗體5a8(burkly，etal.，1992)。

3.mabb4的體外中和活性

透過一般的定義，鼠源mabb4并非中和性抗體。反而，mabb4是藉由覆蓋宿主細胞受體，而非藉由附著至病毒，以抑制病毒進入?？山逵捎诖祟I(lǐng)域所使用之病毒中和試驗而容易地觀察到mabb4對hiv感染的效果(例如mt-2微斑中和試驗(mt-2microplaqueneutralizationassay)(sawyeretal.，1994))。鼠源mabb4的中和活性是由我們的合作者carlhanson博士(加州健康服務(wù)部)所評估，也于johnmascola博士(亨利杰克遜基金會，wrair)、davidmontefiori博士(杜克大學)和malcolmmartin博士(niaid)的實驗室中獨立地評估。以下hiv中和特性，于1995年至2010年間被廣泛地描繪，其與mabb4相關(guān)：

(1)pbmc生長的原代分離株(pbmc-grownprimaryisolates)較t細胞株適應(yīng)的分離株hiv-1iiib和hiv-1mn對藉由mabb4的中和作用更加敏感。

(2)mabb4可中和透過使用ccr5/cxcr4(雙性)和ccr5共受體之原代分離株的感染。

(3)mabb4對使用cxcr4共受體之t細胞株適應(yīng)的hiv-1分離株具有低活性。

(4)mabb4可中和代表hiv-1亞型a-g之不同合胞誘導型(syncytialinducing(si))和非合胞誘導型(non-syncytialinducing(nsi))的原代分離株，達到90％終點指標(endpoints)與高達3個對數(shù)的感染性。

(5)mabb4可中和具有雙性共受體hiv-1包膜的hiv-2、猿猴免疫不全病毒(siv)和人猴嵌合免疫缺陷病毒(shiv)。

(6)于扁桃體組織系統(tǒng)，mabb4減少了兩個對數(shù)之hiv-1原代分離株vl135(hiv-1vl135)的感染性。在活化的人類補體存在下，在此狀況下許多抗-病毒抗體展現(xiàn)抗體依賴性增強作用，少至12.5μg/ml的mabb4可完全地中和＞100tid50(50％扁桃體感染劑量)的單親細胞性(monocytotropic)分離株jr-csf。

(7)當感染后加入mabb4達48小時，mabb4于hiv-lvl135展現(xiàn)中和活性；當加入mabb4達72小時后，則具有顯著的抗-病毒效果。

a.不論是否與細胞或病毒預(yù)培養(yǎng)，其均同樣有效。

b.它的作用是藉由阻斷感染的病灶傳播至新的細胞，而非藉由進入后的機制。

c.在這些試驗中，mabb4并不有助于細胞毒性。

實施例2.hiv-1中和和抗藥性試驗

以下于1998年至2011年期間針對不同進化支之多個hiv分離株的病毒中和和抗藥性試驗是在carlhanson博士和monogram生物科學公司的實驗室中執(zhí)行。此試驗的詳細說明如以下所述。

1.hiv-1中和試驗

如每一試驗所指明收集血液或抗體樣品。使用mt-2微斑試驗或有絲分裂促進劑(pha)-刺激的pbmc試驗，于一組含有多個進化支(multi-cladepanel)的hiv-1分離株評估血清或抗體樣品。

1.1.mt-2微斑試驗

mt-2微斑試驗限于hiv的合胞誘導型分離株。本試驗于96孔盤上進行，于其藉由在微斑上合胞的熒光染色可計數(shù)到高達每孔洞25個微小空斑。在此試驗中，受感染的mt-2細胞藉由透過熔化的瓊脂糖離心形成單層，此熔化的瓊脂糖于離心期間膠化。此試驗被認為具有敏感性并具有遍布多個數(shù)量級數(shù)的動態(tài)范圍。此試驗也被視為是處理大量樣品時唯一具有效率的方法。利用電腦化統(tǒng)計分析大量復(fù)制的孔洞，以提供使用其它方式所難以達成之品質(zhì)控制與標準化的程度。

1.2.pbmc試驗

pbmc試驗是一種標準的抗原-減少試驗，于此試驗中，在受感染的細胞于96孔微量盤生長后，以抗原-捕獲elisa定量于pbmcs的p24抗原表達。此試驗的優(yōu)點在于其適用于所有的hiv病毒株與分離株。

1.3.病毒原液

用于體外與體內(nèi)中和試驗的hiv原液列于表3、表5和表6，以及圖1a、1b、3、22和23。來自亞型a至g和h之原代hiv-1病毒為：(a)分離自參加病毒和立克次體疾病實驗室(vrdl)加州健康服務(wù)部之舊金山男性健康研究的男性同性戀者；(b)由hiv分離和鑒定之世界衛(wèi)生組織網(wǎng)絡(luò)取得，(c)由美國軍方hiv研究計劃提供，以及(d)由國家過敏和傳染病研究所aids研究和參考試劑計劃所饋贈。dh-12(由患者分離，于黑猩猩外周血單核細胞(pbmc)繼代)也是由國家過敏和傳染病研究所aids研究和參考試劑計劃所提供。

1.4.b4或db4中和活性

b4或db4中和活性定義為相對于不含抗體之對照組可提供指定百分比(50-95％)之病毒減少的抗體濃度。藉由于抗體稀釋物之間的內(nèi)插法推導出在50％和90％終點指標之抗體濃度。

2.phenosensehiv進入試驗

用以測定抗藥性之phenosensehiv進入試驗是于monogram生物科學公司執(zhí)行(南舊金山，加州)。

利用從載體庫產(chǎn)生的重組病毒于不同濃度之藥物或抗體(例如b4或db4)存在下感染細胞。依據(jù)50％(ic50)或90％(ic90)測定用以抑制試驗載體之病毒復(fù)制所需的藥物量。

2.1.使用于phenosensehiv試驗之重組病毒的產(chǎn)生

phenosensehiv試驗使用之重組病毒來自于患者的樣本，此些患者是于hiv感染之縱貫性研究中所篩選出，并確定為hiv血清反應(yīng)陽性者。對于發(fā)生hiv感染者，收集臨床和血漿樣品以供實驗室評估(包括hiv病毒量和cd4細胞數(shù)量)。對于起初是血清反應(yīng)陰性但于后續(xù)約一年變成血清反應(yīng)陽性的個體，利用兩個酶免疫分析法和western印跡法之確證加以確認hiv感染。

收集來自于血清轉(zhuǎn)化期間具有亞型a、bf、c、d、e、ea、f、g或j之受試者的樣品(基于先前的hiv亞型分析，其乃利用多個雜交分析而達成)，用以建構(gòu)重組病毒(如表3所示)。由試驗樣品放大hivenv、pol區(qū)域，并克隆放大的dnas進入試驗載體。于geneseqhiv，定序載體庫以確定hiv基因型。于phenosensehiv試驗，于不同藥物濃度存在下利用從載體庫產(chǎn)生的重組病毒感染細胞。

實施例3.mabb4對所有進化支之hiv分離株的中和活性(利用monogram生物科學的phenosense試驗)

已證實mabb4可中和b進化支的所有hiv病毒。于本試驗中共計73個具代表性的非b進化支hiv分離株，將來自進化支a(n＝8)、bf(n＝1)、c(n＝18)、d(n+18)、e(n＝4)、ea(n＝10)、f(n＝8)、g(n+4)、j(n＝2)，加上三個對照組病毒92ht594、jrcsf、jrfl，制成重組病毒，并于phenosensehiv試驗中測試，以分析其對mabb4的敏感性(請參見表3)。顯示所有重組病毒對mabb4具有高度敏感性，其具有無先例的低ic50和ic90濃度，具有平均ic50＝0.018μg/ml和ic90＝0.062μg/ml。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)這些hiv病毒分離株中的多個衍生自具多重抗藥性患者，此清楚地表明mabb4或其人類對應(yīng)物在已經(jīng)對hiv藥物產(chǎn)生抗藥性之患者的治療中具有高效率。

實施例4.單克隆抗體b4的競爭型hiv進入抑制：預(yù)防治療后之hiv抗藥性突變種的不可預(yù)期效果

競爭型抑制試驗可評估抑制劑(例如，進入抑制劑抗體)與hiv包膜蛋白競爭位在cd4上相同受體結(jié)合位點從而抑制hiv進入細胞的能力和療效。理論試驗中，mabb4和hiv包膜蛋白(gp120)競爭結(jié)合cd4。圖1a顯示此試驗的預(yù)測結(jié)果，在此每一條線代表不同的病毒分離株。具體地，從此理論試驗的預(yù)期結(jié)果證明，雖然不同的病毒分離株對mabb4具有不同敏感性(ic50)，但只要mabb4存在足夠濃度下可抑制所有病毒分離株的進入，幅度達100％。

透過比較，非競爭型抑制試驗可評估抑制劑(例如，共受體拮抗劑或結(jié)合于cd4之不同部分的抗體)抑制或降低hiv包膜蛋白結(jié)合至cd4從而抑制hiv進入細胞的能力和療效。在理論試驗中，分析非競爭型抑制劑(例如，tmb-355)抑制hiv包膜蛋白(gp120)結(jié)合cd4的能力。圖1b顯示此試驗的預(yù)測結(jié)果，在此每一條線代表不同的病毒分離株。具體地，從此理論試驗的預(yù)期結(jié)果證明，不同的病毒分離株對tmb-355具有不同敏感性(ic50)，且不論tmb-355呈現(xiàn)量為何，至少一些部份的病毒分離株可進入細胞?；诖死碚撛囼灒缤谧畲笠种瓢俜直鹊摹案咴?，可預(yù)期不論ic50為何均可觀察到hiv抗藥性。

tmb-355(原tnx-355，也稱為ibalizumab)為人源化igg4單克隆抗體，設(shè)計其結(jié)合恒河猴和人類cd4之細胞外結(jié)構(gòu)域2以避免hiv結(jié)合后進入cd4+細胞(例如，burkly，lc，etal.，1992；以及kurizkes，dr，etal.，2004)。位于cd4之tmb-355抗體結(jié)合位點有別于hiv包膜蛋白gp120結(jié)合所需之位點，且有別于與主要組織相容性復(fù)合體蛋白質(zhì)相互作用所需之位點。據(jù)此，tmb-355介導非競爭型hiv進入抑制。

已顯示tmb-355對一些hiv-1病毒具有強烈的中和活性，但是當以一組廣泛的hiv-1病毒株評估時，其抑制活性與中和活性并不一致。圖2顯示tmb-355的最大抑制百分比(mpi)介于100％至15％(左邊的y軸)，伴隨由0.01μg/ml至10μg/ml之增加的ic50(右邊的y軸)，對一組118種env假型hiv病毒，以每一長條代表一種病毒分離株(song，r.，etal.，2013)。于分析的所有進化支中，進化支a和e病毒較非進化支a和e病毒對tmb-355顯著地具有敏感性。此外，發(fā)現(xiàn)來自接受tmb-355治療以減少病毒量之患者的病毒抗藥性突變種于gp120的v5區(qū)域具有突變(toma，j.，etal.，2011；pace，c.s.，etal.，2013)。以tmb-355(ibalizumab)所證明之非競爭型抑制效應(yīng)顯示在抗體治療期間有發(fā)展抗藥性hiv突變種的高度可能性，因為具有低于100％抑制的分離株會發(fā)生病毒復(fù)制。

相反地，來自一組超過850種env假型hiv病毒于10年期間收集的結(jié)果顯示，mabb4于hiv進入抑制提供了非預(yù)期之廣泛性與效力(圖3)。從這些收集的數(shù)據(jù)可見mabb4具有接近100％最大抑制百分比(mpi)，具有兩個ic50濃度，一個是介于0.01至1μg/ml，且另一個是約10μg/ml。mabb4之hiv進入抑制曲線具有競爭型抑制機制的典型特性，無論ic50為何，其對每一hiv病毒具有為～100％之mpi。鑒于mabb4之顯著強烈的競爭型hiv進入抑制特性，故在mabb4治療期間不大可能會發(fā)展出病毒抗藥性突變種。這種嚴密的競爭型抑制，如透過mabb4所展現(xiàn)者，迄今從未以任何其它測試的hiv抑制劑觀察到。

來自此實施例之mpi和ic50，與顯示衍生自多重抗藥性患者之多個hiv分離株對mabb4具有高度敏感性的數(shù)據(jù)(實施例3)相結(jié)合，顯示mabb4或其人類對應(yīng)物于haart治療失敗之抗藥性hiv患者治療上具有高效率。由mabb4所介導之中和模式提供獨特hiv藥物，其可于接受mabb4或其人類對應(yīng)相似物(具有相似fv區(qū)域)治療的hiv患者中預(yù)防抗藥性病毒突變種的產(chǎn)生。

實施例5.單克隆抗體b4的人源化

因為鼠源抗體，mabb4于人類具有免疫原性?？赏高^已知的去免疫化技術(shù)(jones，t.d.，etal.2009)之過程達到鼠源抗體的人源化。mabb4的去免疫化于lynn.，s.和wang，c.y.之美國7,501,494號專利中已詳細描述(其均透過引用以并入本文整體)，如同以下內(nèi)容所概述。

首先，完全地移除鼠源抗體b4的恒定區(qū)(ch和cκ)，并以人類igg1的恒定區(qū)(分別為seqidnos：12和14)取代，然而保留fv部分，從而制造嵌合b4抗體。接下來，為供人類使用而將鼠源mabb4之fv片段去免疫化，此是藉由辨識與除去潛在具有免疫原性之鼠源t和b-細胞抗原表位而達成。在從mabb4的可變區(qū)中辨別此種抗原表位之后移除t細胞抗原表位。為了呈現(xiàn)第二型主要組織相容性復(fù)合體結(jié)合域(mhcclassii-bindingmotifs)而利用三維“肽鏈線化”方法以分析可變區(qū)的氨基酸序列。藉由表面殘基的“鑲飾”達成由可變區(qū)移除b細胞抗原表位而不妨礙抗體辨識。此去免疫化人源化形式的mabb4稱為mabdb4。

lynn.，s.和wang，c.y.之美國7,501,494號專利討論到igg1于ch2區(qū)域中含有雙觸角復(fù)合n端結(jié)合碳水化合物，其對于效應(yīng)器作用(effectorfunctions)具有重要性，例如補體結(jié)合和抗原依賴細胞毒性作用(antigen-dependent-cellular-cytotoxicity，adcc)，可造成目標抗原的消除。因為mabb4作用于cd4受體復(fù)合體，其可透過負責結(jié)合補體之igg1的效應(yīng)器作用造成cd4+細胞的破壞和cd4+細胞功能的免疫抑制。因此，移除位于igg1之fc區(qū)域的n-糖化點可破壞igg1結(jié)合至人類fcr1的能力，以活化補體，或結(jié)合c1q，從而消除igg介導的補體依賴型細胞毒性作用(cdc)。藉由以his(h)取代氨基酸殘基asn(n)(即n298h)達成移除位于igg1之fc區(qū)域的n-糖化點。

在本說明書中所討論的氨基酸編號/位置是基于包含在序列表中的序列，此序列表為本說明書的一部分。應(yīng)該注意的是，以上所討論之位在第298個氨基酸之糖化點對應(yīng)于天然igg1分子中位于第297個氨基酸之糖化點，它是根據(jù)用于igg1的歐洲編號系統(tǒng)所編號的。因此，本申請案之第298個氨基酸對應(yīng)于美國7,501,494號專利中位于第297個氨基酸之糖化點。

fv結(jié)構(gòu)域之去免疫化mabdb4重鏈(圖4)和輕鏈(圖5)的cdr1、2和3區(qū)域分別包含seqidnos：1至6的氨基酸序列(表4)。mabdb4重鏈和輕鏈的完整氨基酸序列分別地如圖4和5所示，如seqidnos：7和8。

發(fā)現(xiàn)當突變位于抗體重鏈的某些氨基酸時可改進(延長)mabdb4的半衰期。具體來說，當位于第253(met)、255(ser)和257(thr)個重鏈fc氨基酸分別以tyr、thr和glu取代時可改進人源化抗體之半衰期。人源化mabdb4抗體經(jīng)改進之重鏈的全長序列如圖6所示，如seqidno：9。據(jù)此，經(jīng)改進之人源化抗體mabdb4包含具有seqidno：8氨基酸序列之輕鏈，以及具有seqidno：9氨基酸序列之重鏈。

鼠源mabb4和人源化mabdb4之序列和結(jié)構(gòu)的獨特特性為存在位于第101個氨基酸位置(asn101)的糖類結(jié)合殘基asn，于fv的重鏈中。此糖類結(jié)合位點對其fv區(qū)域位置是獨特的，其意外地隱藏于fv結(jié)構(gòu)域內(nèi)，且只可藉由整個抗體分子的變性而曝露出來供酶裂解。起初于fv區(qū)域呈現(xiàn)此糖類使抗體特性復(fù)雜化。然而，對糖鏈或結(jié)合位點進行修飾會破壞抗體對cd4的結(jié)合親和力。因此，此位于fv區(qū)域之獨特的n-糖化點對抗體結(jié)合至cd4是具關(guān)鍵性的。

圖7說明mabdb4之完整長度的重鏈氨基酸序列，其強調(diào)圖4和6于上述所討論的糖化、取代和突變位置。

實施例6.利用mt-2微斑、pbmc中和試驗和phenosense進入試驗證明mabdb4和其親本mabb4間的生物相等性

進行廣泛的比較研究，以評估去免疫化/人源化，fc-無糖基化的mabdb4和親本鼠源mabb4的生物相等性，以確保人源化形式可在靈長類動物和人類供進一步毒性/安全性和療效研究。來自這些比較研究的結(jié)果概述于下文。

(1)高靈敏性的hiv-1中和試驗，分別以來自進化支a、b、c、d和e，以及來自進化支c和e之具代表性的hiv分離株，于mt-2微斑和有絲分裂促進劑(mitogen)刺激的pbmc試驗中進行。利用去免疫化技術(shù)將鼠源mabb4人源化形成mabdb4抗體后并未造成hiv中和活性的喪失。比較結(jié)果如mt-2微斑(表5)和基于pbmc之試驗(表6)所示。

(2)因為測得對來自所有進化支之所有hiv分離株的ic50s和ic90s彼此間落于兩倍以內(nèi)，因此證明鼠源mabb4和mabdb4間的生物相等性。

(3)在表達雙重受體(cxcr4和ccr5或x4/r5)的細胞株u87和具有各種向性之經(jīng)挑選hiv分離株(包含jrcsf(r5)、hxb2(x4)、92th594(r5/x4)、原代分離株#5(r5)、原代分離株#6(r5)和原代分離株#7(r5))上進行，以評估藉由mabb4、mabdb4和其它兩個已知針對hiv-env之單克隆中和性抗體(2f5和2g12hiv)的hiv進入抑制。在此試驗中，hiv進入抑制是由monogram生物科學利用假型病毒(假型病毒攜帶來自數(shù)百個hiv病毒株之任一者的包膜糖蛋白和熒光酶(1uciferase))而加以評估。定量于u87-cd4+/ccr5+/cxcr4+細胞產(chǎn)生之生物發(fā)光以測定抗體的中和作用，此細胞是利用生物工程于hivtat控制下表達熒光酶。此試驗的結(jié)果如表7所示，其證明：

a.當與兩個最具效力之抗-hivenv抗體2f5(第1列)和2g12(第2列)相比較時，鼠源mabb4(mub4；第4列)于hiv進入抑制上較二者更具效力。對不同hiv分離株之相對應(yīng)的ic50s分別為0.04vs4和0.8；0.4vs0.07和0.5；0.05vs3和1.3；0.05vs50和20；0.05vs2和3；0.03vs≥100和2；以及

b.當以各種向性之相同具代表性的hiv分離株測試時，鼠源mabb4(mub4；第4列)和mabdb4(第3列)于其ic50s出人意料地相等。

因此充分證明鼠源mabb4和去免疫化的mabdb4(二者在重鏈和輕鏈具有相同cdrs)為生物等效性的，且兩種抗體的功能特性在不同的體外和體內(nèi)試驗中可為代表彼此的。

實施例7.(a)對hpb-all細胞之db4和mabb4結(jié)合活性；(b)對pbmccd4陽性細胞之db4結(jié)合活性；(c)對重組cd4之db4結(jié)合活性，以及(d)對hpb-all細胞之db4和gp120結(jié)合活性的特性

1.背景

盡管抗原結(jié)合和功能特性的定性方面是已知的，如同藉由中和試驗所證明，對mabdb4及其親本鼠源mabb4而言如先前實施例所示，但先前尚未研究過于cd4+t淋巴細胞之mabb4和mabdb4定量的細胞結(jié)合曲線。

測試鼠源mabb4和其人源化，fc-無糖基化的igg1單克隆抗體mabdb4在正常人類血液cd4+t淋巴細胞和在cd4+t-白血病hpb-all細胞之細胞結(jié)合曲線。使用hpb-all細胞是因為如實施例1所討論是透過以hpb-all細胞免疫接種小鼠而選出mabb4。一般的細胞結(jié)合是利用流式細胞儀(facs)分析方法評估，且結(jié)果是基于平均熒光強度(mfi)記述為ec50或ic50數(shù)值。除了評估抗體一般的細胞結(jié)合，也研究天然db4igg1分子對hpb-all細胞之絕對結(jié)合親和力(kd)和最大結(jié)合容量(bmax)。

2.材料

2.1.培養(yǎng)液和試劑

培養(yǎng)hpb-all細胞之rpmi-1640培養(yǎng)液和胎牛血清是來自gibco(貨號分別為11875-093和10091-148)。牛血清白蛋白(bsa)是來自applicchem(貨號a-0850)。細胞與測試抗體之培養(yǎng)是在nunc的v型底96孔盤(貨號249662)上進行。供樣品制備的微量稀釋管(1.2ml)是來自bertec(貨號1710-00)。以2％甲醛固定細胞；樣品以含有0.05％bsa和0.05％疊氮化鈉之pbs(ph7.4)稀釋；且清洗液為含有0.05％疊氮化鈉之pbs(ph7.4)。

分別利用山羊抗-鼠igg-fitc(sigma，貨號f8264)和山羊f(ab’)2抗-人iggfcγ-fitc(jacksonimmunoresearch，貨號109-096-098)追蹤鼠源mabb4和人源化mabdb4之結(jié)合。db4-alexa488綴合物(整篇文章以縮寫的“db4-alexa”表示)為于聯(lián)合生物醫(yī)學公司(ubi)內(nèi)部制造(ubi批號0102143)。b4-生物素綴合物來自ubi(批號051807)。綿羊抗-higg-hrp來自thebindingsite(貨號ap004)；extravidin-hrp來自sigmaaldrich(貨號e2886)；以及可溶性rcd4來自r&dsystem(貨號514-cd-050)。肽p2704ahiv包膜來自ubi，重組gp120mn來自immunodiagnostics(貨號1021-2)。利用抗-cd4(d2)-fitc抗體(ancell，貨號148-020)選取血液cd4⁺t細胞供結(jié)合之追蹤使用。利用來自linearflow^tmgreenflowcytometryintensitycalibrationkits(molecularprobe)的熒光珠作為參考標準，以定量標幟細胞的相對熒光。使用的其它熒光偵測器為：fitc-chrompure山羊igg、f(ab′)2片段(jacksonimmunoresearch，貨號005-090-006)；cd3pe(asr)(bdbiosciences，貨號340662)；cd45percp(asr)(bdbiosciences，貨號340665)。

2.2.hpb-all細胞和周邊血液cd4⁺t細胞

由dsmzacc提供hpb-all細胞株(人類胸腺衍生急性淋巴細胞性白血病細胞株)。pbmccd4⁺t細胞(由健康的供血者新鮮地采血至edta-真空采血管內(nèi))衍生自以含有氯化銨之低滲溶液(8.3g/l氯化銨、0.84g/l碳酸氫鈉以及29.4mg/ledta于ph7.4之混合液)分解紅血球后的外周血白細胞(pbl)。

2.3.鼠源mabb4和人源化db4mab

透過以hpb-all細胞作為免疫原之雜交瘤操作提供鼠源單克隆b4igg1(ubi批號120197)。藉由n298h使b4-衍生的人源化db4igg1成為fc-無糖基化(實施例5)。

2.4.elisa和facs偵測

96孔盤來自nalgenuncinternational，平底(cat.442404)的供光學測定，v型底的供細胞培養(yǎng)(cat.249570)。光學密度是于versamax微量盤分析儀上讀取(moleculardevices)。以bdfacscaliburscanner(dbbiosciences)偵測熒光染劑；并透過相關(guān)的cellquest軟體獲得結(jié)果的數(shù)據(jù)。將來自elisa和facs的結(jié)合數(shù)據(jù)導入到sigmaplot11軟體進行定量分析。

3.方法

3.1.db4對hpb-all細胞的結(jié)合

3.1.1.平衡時間試驗

于v型底的微量盤上，添加每孔洞0.1ml內(nèi)含2x10⁵個細胞的溶液，離心，并丟棄液體。于長達180分鐘之各種持續(xù)時間，將細胞在冰上以100μl高達100ng/ml之各種濃度的db4溶液加以培養(yǎng)。于培養(yǎng)時間收集上清液以測定游離、未結(jié)合的抗體藥物。利用添加之總藥物濃度扣除游離的部份而計算出結(jié)合的部份。

利用elisa定量于結(jié)合溶液中的游離db4濃度。簡而言之，此試驗涉及涂覆于nuncmaxisorp微量盤之綿羊抗-higl(0.5μg/ml)混合液的使用，并以綿羊抗-huigg-hrp(1/1000稀釋)作為檢測蛋白質(zhì)?；?.14-18.5ng/ml范圍內(nèi)之校正標準測定于未知樣品中的游離db4濃度。

3.1.2.與db4直接結(jié)合試驗

于v型底的微量盤上，添加每孔洞0.1ml內(nèi)含2x10⁵個細胞的溶液，離心，并丟棄液體。將細胞在冰上以100μl高達2000ng/ml之各種濃度的db4溶液培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)之后，移除db4，并加入與起始培養(yǎng)所使用相同濃度之db4的新鮮溶液至細胞中，并在冰上再培養(yǎng)細胞1小時。重復(fù)此步驟一次。研究來自三次培養(yǎng)(繼代)的細胞。在第三次培養(yǎng)后，洗滌細胞一次，以300g離心5分鐘，以100μl之山羊f(ab)2抗-huiggfc-fitc(250ng/ml)于冰上染色30分鐘。洗滌細胞一次并于離心后丟棄液體。對每一孔洞加入200μl的結(jié)合溶液，并將其移至微量稀釋管供流式細胞檢測分析?；诿恳粯悠?,000個細胞的進樣，于facs上測定結(jié)合強度(平均熒光強度，mfi)。

3.1.3.db4的結(jié)合親和力試驗

在離心管內(nèi)，加入濃度為3.1-2000ng/ml(0.5ml)之db4抗體至數(shù)量為4x10⁵個細胞的hpb-all細胞(0.5ml)中，并于和緩的搖動下于冰上培養(yǎng)1小時。測定于飽和結(jié)合時之絕對結(jié)合親和力，在此以elisa定量溶液中的游離db4濃度([f])，且如以上平衡試驗所述計算結(jié)合部分([b])。以基于等式[b]＝bmax·{[f]/([f]+kd)}的曲線擬合于sigmaplot上分析所得之飽和的游離-vs-結(jié)合濃度曲線，在此個別的[b]和[f]代表結(jié)合和游離的濃度。

3.1.4.db4和b4與b4-生物素的競爭

于涂覆scd4(0.5μg/ml)和p2704a肽(2.0μg/ml)混合液之平底微量盤上，于b4-生物素(10μg/ml)存在下加入0.1ml之db4或b4溶液(濃度為0.78-100μg/ml)，并于室溫下培養(yǎng)1小時。以下對捕獲混合物之競爭型結(jié)合，是以extravidin-hrp偵測結(jié)合的b4-生物素并以elisa分析儀測定。

3.1.5.db4和b4與db4-alexa的競爭

于v型底微量盤上，添加每孔洞0.1ml內(nèi)含2x10⁵個細胞的溶液，離心，并丟棄液體。細胞于db4-alexa(250ng/ml)存在下與100μl之db4或b4溶液(濃度高達2000ng/ml)在冰上培養(yǎng)1小時。洗滌細胞一次并于離心后丟棄液體。對每一孔洞加入200μl的結(jié)合溶液，并將其移至微量稀釋管供流式細胞檢測分析。基于每一樣品5,000個細胞的進樣，于facs上測定結(jié)合強度(平均熒光強度，mfi)。

3.1.6.db4c7和gp120mn與db4c7-alexa的競爭

于v型底微量盤上，添加每孔洞0.1ml內(nèi)含2x10⁵個細胞的溶液，離心，并丟棄液體。細胞于db4-alexa(250ng/ml)存在下與100μl之db4c7或gp120mn溶液(濃度高達200nm，～30μg/ml)在冰上培養(yǎng)1小時。洗滌細胞一次并于離心后丟棄液體。對每一孔洞加入200μl的結(jié)合溶液，并將其移至微量稀釋管供流式細胞檢測分析?；诿恳粯悠?,000個細胞的進樣，于facs上測定結(jié)合強度(平均熒光強度，mfi)。

3.2.db4對血液cd4+t淋巴細胞的結(jié)合

3.2.1.db4的溫度依賴性結(jié)合試驗

為了模擬生理環(huán)境，在此于靜脈注射后db4(ub-421)結(jié)合(覆蓋或占據(jù))位于cd4⁺t細胞上之cd4受體，將由實驗室人員新鮮采取的edta-血液溶液與等量之db4于稀釋緩沖液中在37℃下進行培養(yǎng)(db4濃度高達100μg/ml)。為了作比較，其它樣品組同時于冰上進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)1小時后，樣品以20倍體積之紅血球裂解緩沖液于室溫下裂解10分鐘以產(chǎn)生外周血白細胞(pbl)部分。

離心pbl部份，洗滌，并接著以等量之含有1.0％bsa和疊氮化鈉的pbs緩沖液再制(例如，0.1ml血液和0.1ml稀釋緩沖液)。以0.1ml之山羊f(ab)2抗-higgfc-fitc、抗-cd3-pe和抗-cd45percp混合液于冰上染色pbl樣品30分鐘。洗滌之后，以2％甲醛固定樣品，并基于10,000個細胞的進樣對樣品進行facs分析。利用抗-cd3-pe選取t淋巴細胞群。

3.2.2.直接結(jié)合

于三個男性和女性受試者中分析db4對血液cd4+t細胞的直接結(jié)合，在此將新鮮抽取之edta-血液與db4于37℃下培養(yǎng)1小時。mabdb4結(jié)合至cd4+t細胞，且發(fā)現(xiàn)達到濃度范圍為0.2-200ng/ml之表觀飽和度(apparentsaturation)。利用抗-cd3-pe選取t淋巴細胞群。此實驗步驟與上述之溫度依賴性結(jié)合試驗的步驟相同，在此利用山羊f(ab)2抗-higgfcγ-fitc染細胞以追蹤db4之結(jié)合。

3.2.3.未被占據(jù)的結(jié)合位點

類似于上述之直接結(jié)合試驗，在對三個男性和三個女性之每一個體于相同場合下研究db4結(jié)合后所留下未被占據(jù)之結(jié)合位點的程度(在完全受體占據(jù)之前)。此實驗步驟與上述之直接結(jié)合試驗的步驟相同，除了其使用固定量之db4-alexa(濃度250ng/ml)以顯現(xiàn)未被占據(jù)的、空閑結(jié)合位點的程度。

3.2.4.校正微珠

為了同時調(diào)查直接結(jié)合和未被占據(jù)的結(jié)合位點，利用兩種molecularprobes的linearflow^tmkits(貨號l14821和l14823)之組合在六個不同場合中的每一個產(chǎn)生log(mfi)-vs-log(bead％)標準曲線。此試劑盒組合于流式細胞儀實驗中提供高和低強度標準之寬廣的校正范圍。作為參考標準，利用這些熒光珠定量位于藉由山羊f(ab)2抗-higgfcr-fitc或db4-alexa標幟之細胞上的相對熒光。

4.結(jié)果和討論

4.1.db4的結(jié)合曲線和其于cd4-陽性hpb-all細胞之絕對結(jié)合親和力(kd)的測定

4.1.1.對hpb-all細胞之結(jié)合活性的平衡

在完全描述配體-受體結(jié)合反應(yīng)特征之前，定義對不同濃度配體達到平衡的時間長度，即高原狀態(tài)，在此結(jié)合速率等于解離速率。通常已知的狀況為較低的濃度需要越長時間達到平衡。

在于冰上培養(yǎng)cd4-陽性hpb-all細胞之db4-cd4相互作用的例子中，對2.0ng/ml濃度要花約60分鐘，且對50ng/ml濃度要花約15分鐘，以達到％結(jié)合數(shù)值中的高原。對db4濃度為100ng/ml(0.1μg/ml)和更高的水平可觀察到幾乎瞬間達到高原狀態(tài)。

這些結(jié)果指出對寬的濃度范圍(例如，濃度≥2.0ng/ml)而言，db4結(jié)合反應(yīng)可于1小時達成。結(jié)合試驗可在冷的及/或在0.05％疊氮化合物存在下進行，以避免配體-受體復(fù)合體之可能的內(nèi)噬作用。于室溫或于37℃下培養(yǎng)可較快達到反應(yīng)的高原狀態(tài)。在上述進展的狀況下，hpb-all細胞，以三個不同細胞繼代，于冰上與db4培養(yǎng)1小時。收集上清液以供游離藥物濃度的elisa測定，且藉由從總數(shù)扣除提供結(jié)合的部分。利用如圖8所示之結(jié)合曲線計算絕對結(jié)合親和力和結(jié)合容量。

4.1.2.對hpb-all細胞的直接結(jié)合

在三個不同場合(細胞繼代)，2x10⁵個hpb-all細胞于冰上與db4(高達～2000ng/ml)培養(yǎng)1小時，抗體展現(xiàn)4-參數(shù)羅吉函數(shù)(logitfunction)的飽和結(jié)合曲線，在此結(jié)合的程度是利用山羊f(ab)2抗-huiggfc-fitc測得并以平均熒光強度(mfi)表示。于濃度為200ng/ml(0.2μg/ml)和以上者之結(jié)合接近飽和。平均結(jié)合ecs0測得為42.2ng/ml(表8)，具有小的繼代代數(shù)間的差異(between-passagevariation)(n＝3)。也標準化絕對mfi數(shù)值為％mfi以供繼代代數(shù)間的比較。因此使標準差減到最小，且ec50數(shù)值基本上保持不變；對兩個平均曲線之總平均結(jié)合ec50數(shù)值測得為42.9ng/ml(表8)。

4.1.3.于hpb-all細胞之結(jié)合親和力(kd)和結(jié)合容量(bmax)

收集培養(yǎng)之后的上清液(冰上培養(yǎng)1小時)供利用elisa測定游離(未結(jié)合)db4濃度[f]，且因此透過由加入(總)濃度扣除測得結(jié)合濃度[b]。利用如表9所示之游離藥物-vs-結(jié)合藥物數(shù)據(jù)圖表評估對db4的絕對結(jié)合親和力。平均解離常數(shù)(kd)測得為5.6x10^-11m(范圍：3.1至8.1x10^-11m)，且最大結(jié)合容量(bmax)測得為每細胞1.2x10⁶ab(范圍：0.93至1.4x10⁶)。這些結(jié)果指出db4以特別高的親合力結(jié)合至位于hpb-all細胞上的cd4受體，且hpb-all細胞具有高密度，最高每個細胞對db4具有超過一百萬個結(jié)合位點(表9)。位于hpb-all細胞上之cd4受體密度較位于血液cd4+t淋巴細胞者高至少20倍，其為每細胞約3.2-6.1x10⁴個結(jié)合位點。

4.2.db4和b4于結(jié)合至hpb-all細胞的比較

面臨的難題在于利用使鼠源b4抗體成為db4之去免疫化方法以人源化是否改變了結(jié)合親和力，故于使用競爭設(shè)計的兩個技術(shù)報告上徹底研究此難題。

首先，于以可溶性cd4(scd4)和p2704a肽之捕獲混合物涂覆的elisa微量盤上調(diào)查mabb4和mabdb4的結(jié)合親和力。p2704a肽模擬cd4-ccr5受體復(fù)合體，因為其包含位在ccr5上的抗原表位序列，而hiv-1系住ccr5以進入cd4細胞。當以elisa分析時可見，于各種濃度之mabb4或mabdb4存在下，b4-生物素對涂覆之scd4/p2704a混合物的結(jié)合受到抑制。當mabb4或mabdb4抗體共存且與b4-生物素競爭對捕獲蛋白質(zhì)混合物之結(jié)合時，b4-生物素之結(jié)合受到抑制，b4和db4之ic50數(shù)值分別為5539ng/ml和8191ng/ml(圖9)。b4對db4之ic50比率為0.68，顯示人源化db4具有相當于鼠源b4抗體的結(jié)合親和力。

再者，也利用cd4-陽性hpb-all細胞研究相對結(jié)合親和力，在此b4或db4抗體共存且與db4-alexa競爭對細胞cd4受體之結(jié)合。利用facs分析，db4-alexa結(jié)合受到抑制，b4和db4之ic50數(shù)值分別為135和197ng/ml(圖10)。b4對db4之ic50比率為0.69，如利用elisa范例所證明為實質(zhì)上相同，再次顯示人源化db4利用相當于鼠源b4抗體的親和力結(jié)合cd4受體。

比較性的競爭型結(jié)合抑制試驗，利用親本抗體b4和其人源化抗體db4c7(ub-421)，提供對cd4陽性t細胞(hpb-all)的抗體結(jié)合曲線，其如同以平均熒光強度(mfi)對一系列抗體濃度(由100至104ng/ml)所測得。此試驗進一步驗證表5和表6所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)，此兩個抗體的個別中和活性于mt2和pbmc試驗系統(tǒng)中具有相當?shù)闹泻涂贵w活性。

當與其親本鼠源抗體b4比較時，這些比較性試驗所提供之結(jié)果指出利用去免疫化技術(shù)以人源化并未顯著地減少db4c7(ub-421)對cd4受體的結(jié)合親和力。

4.3.mabdb4對cd4的結(jié)合特征

評估m(xù)abdb4對cd4的結(jié)合特征。

4.3.1.mabdb4對可溶性cd4和對細胞結(jié)合之cd4的結(jié)合

如以上討論，如利用elisa所評估，db4抑制b4-生物素對scd4/p2704a之結(jié)合，其ic50為8191ng/ml(圖9)，且如利用facs測試，db4抑制db4-alexa對hpb-all細胞之結(jié)合，其ic50為197ng/ml(圖10)。這些數(shù)據(jù)有趣地證明，相較于可溶性cd4(scd4)，db4對cd4-陽性t細胞具有更高的結(jié)合親和力。具體來說，這兩項試驗之ic50數(shù)值的比較顯示db4對cd4陽性t細胞的結(jié)合親和力較可溶性cd4高超過40倍。

4.3.2.db4和gp120mn于hpb-all細胞結(jié)合之比較

執(zhí)行競爭試驗以比較db4和hivgp120mn對結(jié)合于cd4-陽性t細胞之cd4的結(jié)合親和力。具體來說，比較db4和gp120mn抑制db4-alexa結(jié)合至位于hpb-all細胞上之cd4的能力(圖11)。在第一個試驗中，db4抑制db4-alexa結(jié)合至位于hpb-all細胞上之cd4，其ic50為1.8nm。在比較試驗中，gp120mn抑制db4-alexa結(jié)合至位于hpb-all細胞上之cd4，其ic50為97.2nm。依照此結(jié)果，發(fā)現(xiàn)db4較gp120mn對位于hpb-allt細胞上之cd4具有實質(zhì)上更高的結(jié)合親和力。具體來說，這兩項試驗之ic50數(shù)值的比較顯示db4對cd4的結(jié)合親和力較gp120mn高至少50倍。

4.3.3.db4和gp120mn對cd4之結(jié)合親和力的比較

如以上討論，mabdb4結(jié)合至cd4具有約5.6x10^-11m的結(jié)合親和力(表9)。他人先前已發(fā)現(xiàn)，透過結(jié)晶學研究，hiv-1gpl20結(jié)合于cd4分子結(jié)構(gòu)域1附近，具有約5x10^-9m的高結(jié)合親和力(kd)(myszka，d.g.，etal.，“energeticsofthehivgp120-cd4bindingreaction”procnatlacadsciusa.aug1，2000；97(16)：9026-9031)。因此，比較db4和gp120之kd數(shù)值顯示，db4對cd4之結(jié)合親和力較gp120的結(jié)合親和力高約100倍。此結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)(基于ic50數(shù)值的比較，db4結(jié)合hpb-all細胞較gp120mn強至少50倍)一致。

體外結(jié)果整體顯示，上述討論證明藉由避免或關(guān)閉hiv病毒進入，使db4足以阻斷或減少hiv-1感染。

4.4.db4(ub-421)對血液cd4+t細胞的溫度依賴性結(jié)合

研究于正常體溫(37℃)下db4對人類血液中之cd4+t細胞的結(jié)合，以測定是否可有效地投予db4作為治療藥物給人類受試者。為了模擬人體的生理環(huán)境，db4c7(ub-421)與新鮮抽取的血液于37℃下培養(yǎng)1小時，且利用紅血球裂解步驟提供外周血白細胞(pbl)樣品。同時執(zhí)行于冰上(4℃)的培養(yǎng)。之后以山羊f(ab)2抗-huigg-fitc染色pbl部分，以顯現(xiàn)db4對位于cd4-選取t細胞上之cd4受體的直接結(jié)合。

與于4℃下培養(yǎng)比較(數(shù)據(jù)未示)，指出以db4于37℃下細胞培養(yǎng)1小時并不會造成配體-受體的內(nèi)噬作用，如同觀察到于鼠抗-cd4(d2)-fitc之mfi無變化。鼠抗-cd4(d2)-fitc(供cd4+t細胞選取，濃度為50-1000ng/ml)和db4(目標為cd4受體之d1結(jié)構(gòu)域，濃度高達200ng/ml)并不會競爭結(jié)合。

如同來自一女性個體之血液樣品所示(圖12)，于兩種不同溫度(37℃或4℃)下將外周血單核細胞(pbmc)與db4培養(yǎng)1小時。染色選取的cd4+t細胞供于facs上觀察db4結(jié)合。圖12顯示db4于37℃下較于4℃下以5倍高之親合力結(jié)合至cd4受體，此乃基于分別為4.8ng/ml和23.0ng/ml的ic50數(shù)值。如同預(yù)期，db4于兩種溫度狀況下均可達到相同之最大結(jié)合mfi。mfi數(shù)值反映受體占據(jù)的程度，特別是當標準化這些數(shù)值并以％mfi表示時。

4.4.1.db4對血液cd4+t細胞的直接結(jié)合

研究于正常體溫(37℃)下db4對人類血液中之cd4+t細胞的結(jié)合曲線。利用從六個成人(三個男性和三個女性)新鮮抽取的血液于六個不同場合下評估db4對血液cd4+細胞的直接結(jié)合活性(表10)。在1小時培養(yǎng)后，分離外周血白細胞，以山羊f(ab)2抗-huiggfc-fitc染色，并以facs分析db4-結(jié)合之cd4-選取的t細胞。以參考珠校正樣品以供熒光讀取。發(fā)現(xiàn)結(jié)合(ec50)數(shù)值介于2.6ng/ml至5.7ng/ml，其平均ec50為4.1ng/ml。同樣地，最大％mfi數(shù)值介于68％至93％，其平均值為77.8％(表10)。這些結(jié)果分別地反映于結(jié)合親和力和受體密度上具微小意義的受試者間差異。

4.4.2.在以mabdb4占據(jù)受體后之未被占據(jù)的cd4結(jié)合位點

連同于4℃下db4對血液cd4+細胞的直接結(jié)合(如同以山羊抗-higg偵測)，利用db4-alexa評估位于cd4+細胞上之未被占據(jù)，空閑的cd4結(jié)合位點。

在沒有db4的狀況下，單獨db4-alexa綴合物于濃度為約250ng/ml時可接近其最大結(jié)合的～100％(圖13)。濃度高于500ng/ml時，db4-alexa綴合物可逐出約10％或更多的結(jié)合的db4(數(shù)據(jù)未示)。具體來說，當以250ng/ml之接近飽和程度的db4占據(jù)受體時，db4-alexa(于250ng/ml)對cd4受體之結(jié)合被完全地阻斷。

與db4-alexa結(jié)合上升的同時可觀察到受體占據(jù)隨著db4存在之下降而下降。受體占據(jù)程度與未被占據(jù)之結(jié)合位點的程度以對稱方式同步化，且二曲線于濃度約4.0ng/ml處交錯(圖13)，此與其結(jié)合ec50數(shù)值一致(表10)。

因此整體結(jié)果指出于體外使用250ng/ml的db4-alexa和mfi以及％mfi可作為適當之范例，用以研究對人類受試者投予db4c7(ub-421)后之體內(nèi)的受體占據(jù)。

5.結(jié)論

(1)mabdb4與位于hpb-all細胞上之cd4受體相互作用，其具有獨特地高活性，在濃度高于50ng/ml時于冰上達到立即的平衡。絕對結(jié)合親和力(kd)測定為5.6x10^-11m，且最高時1.2x10⁶個db4分子(bmax)可結(jié)合至單一個hpb-all細胞，其較于正常血液cd4+t細胞者具有至少高于20倍的受體密度。

(2)人源化鼠源b4成為db4mab并未顯著地改變對cd4受體之db4結(jié)合親和力。藉由結(jié)合抑制的設(shè)計，利用基于分子的elisa(涂覆scd4和含有ccr5抗原表位之肽p2704a)和與hpb-all細胞之基于細胞的facs，兩種抗體同等地阻斷示跡劑(示跡劑為b4-生物素或db4-alexa)的結(jié)合，于此二實驗中觀察到b4-vs-db4之ic50比率約為0.7。

(3)db4抗體以高于hiv-1包膜蛋白gp120mn至少50倍之親和力結(jié)合cd4受體。具體來說，利用hpb-all細胞之結(jié)合抑制試驗證明db4和gp120mn分別以1.8和97.2nm之ic50數(shù)值抑制示跡劑db4-alexa之結(jié)合。此結(jié)果也與db4的高結(jié)合親和力(kd)(其于先前報導較重組gp120高約100倍)一致。

(4)mabdb4以與對hpb-all細胞相似之結(jié)合親和力結(jié)合血液cd4+t細胞。在低溫環(huán)境(4℃)下，db4之ec50為約23.0ng/ml。且在正常體溫(37℃)下，db4以約5倍高之親和力結(jié)合血液cd4+t細胞，結(jié)合ecs0為4.8ng/ml。

(5)由來自六個人類受試者之血液樣品的試驗證明db4濃度和cd4受體占據(jù)間具有直接(成反比的)相關(guān)性。如圖13所示之相反的曲線，交叉于約4.0ng/ml，其與對cd4之db4的平均ec50結(jié)合數(shù)值一致。這些整體結(jié)果指出于體外使用db4-alexa(濃度250ng/ml)和以熒光珠校正之％mfi之測定可作為適當之范例，用以研究對人類受試者投予db4c7(ub-421)后之體內(nèi)的受體占據(jù)。

實施例8.抗體b4有效地抑制hiv之無細胞和細胞間傳播

hiv顆粒典型地藉由無細胞傳播散布全身，在此病毒擴散于血流和局部環(huán)境中以感染細胞。病毒也藉由需要親密細胞間接觸的機制以具有直接地由受感染細胞轉(zhuǎn)移至未受感染細胞的能力。此種傳播發(fā)生于當受感染的細胞與未受感染的細胞形成穩(wěn)定的接觸點時，并直接地將hiv顆粒傳播給未受感染的細胞。相較于無細胞傳播，細胞間傳播具有較高效率，速度較快，且不需要擴散至血流。

sigal，a.，等人于2011年報導，于抗病毒藥物tenofovir存在下，起源于無細胞病毒的感染激烈地下降，于共培養(yǎng)試驗中涉及細胞間傳播之感染卻顯著地對藥物較不具敏感性(圖14)。敏感性的降低在藥物的存在下足以阻止多輪感染的終止。作者使用隨機感染模型在臨床藥物濃度的存在下研究來自細胞間傳播的復(fù)制，并發(fā)現(xiàn)復(fù)制是間歇性的，無突變的實質(zhì)積累。如果細胞間傳播在體內(nèi)具有相同的特性，它可能具有對免疫系統(tǒng)的不良后果，具有危險因子以導致個體的治療失敗，并可能有助于病毒的持久性，因此，其為治療hiv感染的障礙。

因此，為了評估其于治療上的潛在影響，重要的是評估用以抑制hiv細胞間傳播之mabb4和mabdb4相關(guān)抗體的能力及效力。

1.用以測定hiv細胞間傳播之抗體介導抑制的試驗

1.1.材料和方法

1.1.1.細胞和病毒

選擇jurkat-ingluc克隆(來自美國國立衛(wèi)生研究所aids研究和參考試劑計劃)，其具有利用基因工程置入于hiv-1基因體中的報導基因(luciferase)，選擇其作為供體細胞(原因在于在利用目標原代cd4+t細胞之共培養(yǎng)試驗中，表面cd4之低度表達可使供體-vs-供體感染減到最少)。報導基因luciferase可以在受感染的細胞中表達并作為病毒感染之標志?？蓽y定于受感染細胞中的這些病毒表達報導者以定量hiv-1感染。以原代cd4⁺t細胞作為目標細胞。于此試驗中使用進化支d的病毒ug266和ug046。

1.1.2.病毒細胞間傳播試驗

在本試驗，在與指明的hiv-1病毒株混合之前，將供體與連續(xù)稀釋之抗體b4預(yù)培養(yǎng)，并于幾天后使用(當～10-75％的細胞為gag⁺時)。之后以于200μl中為1.5×10⁶細胞/ml之最終濃度在96孔盤上以1∶2比率混合供體和cd4陽性pbmc目標細胞。于48小時后，針對細胞內(nèi)gag進行細胞染色并以流式細胞儀分析。利用bioluxgaussialuciferaseassay套組(newenglandbiolabs)和bertholdtechnologies冷光測定儀偵測累積于培養(yǎng)上清液中的gluc。

1.1.3.ic50和ic90的校正

透過擬合數(shù)據(jù)至s形的劑量-反應(yīng)曲線(多變的斜率)繪制劑量-反應(yīng)抑制曲線。抑制的百分比定義為(未處理之目標細胞的信號百分比-抗體處理之細胞的信號百分比)/(未處理之目標細胞的信號百分比)×100。依此計算ic50和ic90。

2.結(jié)果和討論

表11顯示，當透過嚴格的90％進入抑制標準測定時，抗體b4可等效地抑制hiv(進化支c的病毒株ug266和ug046)之細胞間和無細胞傳播。具體來說，分別地發(fā)現(xiàn)對ug266和ug046病毒株于細胞間傳播試驗中的融合抑制效價為1∶140和1∶245，其相當于在無細胞傳播中和試驗中為1∶136和1∶234之中和效價。當以50％進入抑制標準測定時，相較于相對應(yīng)之無細胞傳播，在對細胞間傳播觀察到對此兩種病毒株較高的融合抑制效價。

這些結(jié)果證明，當與迄今所測定之所有其它針對hivenv蛋白質(zhì)的中和單克隆抗體或其它art-藥物相比較時，抗體b4于其在抑制hiv之細胞間和無細胞傳播的能力方面均具有獨特的特性。這些結(jié)果顯示，只有mabb4和mabdb4相關(guān)抗體具有資格可在個體中預(yù)防hiv病毒的無細胞和細胞間傳播。

實施例9.抗體ub-421(db4c7或db4)介導在hiv感染個體中用于增強病毒復(fù)制之靜默pbmcs的再活化

1.背景

hiv-1感染靜默的外周血單核細胞(pbmcs)卻保持不活化直到后續(xù)的細胞活化。利用體外模型(此體外模型是利用細胞培養(yǎng)條件和允許靜默t細胞非增值性感染之方法，模擬藏匿于靜默pbmcs中的靜默hiv-1)，以研究熱滅活的hiv-1(ihiv-1)或gp120-抗-gp120免疫復(fù)合物對這些靜默pbmcs的刺激效應(yīng)(briant，l.，etal.，1996)。

此證明偕同熱滅活hiv-1(ihiv-1)或gpl20-抗-gpl20免疫復(fù)合物之包膜糖蛋白的cd4接合(cd4engagement)足以透過交聯(lián)以刺激控制nf-κb(即核轉(zhuǎn)位)和ap-1活化的信號傳遞路徑，其依次涉及cd4的細胞外結(jié)構(gòu)域1(d1)和細胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域與幾種激酶(lck、raf-1、mek和erk)，以誘導細胞周期進程、促進活化標志cd25的細胞表面表達，以及刺激原病毒整合和使細胞產(chǎn)生病毒。

由than等人(than，etal.，1997)之獨立的科學發(fā)現(xiàn)進一步證實，利用抗-cd4單克隆抗體于gp120結(jié)合位點之cd4分子的交聯(lián)可誘導來自hiv感染患者之潛伏受感染的pbmcs以促進病毒復(fù)制。此試驗中使用的抗-cd4mab為leu3a，其可結(jié)合cd4之d1的cdr2-環(huán)。具體來說，leu3是針對線性抗原表位，而此線性抗原表位代表具有cd4結(jié)構(gòu)域1內(nèi)之第47-64個氨基酸的肽(chiba，y.1992)。

此外，發(fā)現(xiàn)藉由針對cd4結(jié)構(gòu)域1(d1)之cdr2-環(huán)的單克隆抗體可特異性地誘導于靜默pbmcs之病毒的再活化，且此并非藉由針對其它抗原表位(例如位于d1之cdr3或接近d1/d2接合點區(qū)域(briant，l.，eta1.，1999))的抗體(參見圖15，比較第4長條與第5和6長條)?？衫每扇苄詂d4(scd4)事先吸附cdr2-環(huán)配體以預(yù)防此種病毒再活化(參見圖15，比較第4長條和第8長條)。

因此，重要的是要評估抗體db4c7(ub-421)(其對cd4結(jié)構(gòu)域1附近區(qū)域具有高結(jié)合親合力)是否可介導在hiv感染個體中用于增強病毒復(fù)制之靜默pbmcs的再活化。

2.位于cd4之d1附近之b4/db4構(gòu)型結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)精算

2.1.藉由mabb4對黑猩猩cd4陽性pbmcs之leu3a結(jié)合的競爭型順序結(jié)合抑制

于此試驗中使用分離自兩名受試者(x282和x301)的黑猩猩pbmc細胞、mabb4(利用fitc標幟)和leu3a(以pe標幟)。以個別的抗體順序地染色pbmcs并進行細胞熒光顯影(cytofluorography)的分析。由此實驗所提供之數(shù)據(jù)如表12所描述，并于下文中討論。

于單一標幟的對照組樣品，只利用以leu3a染色的細胞測試呈現(xiàn)leu3a-pe結(jié)合陽性者；只利用以mabb4染色的細胞測試呈現(xiàn)b4-fitc結(jié)合陽性者。具體來說，于未受感染之黑猩猩樣品(x282和x301)的cd4+細胞(如利用leu3a所偵測)分別為25.5％和44.0％，其與那些以mabb4偵測者(26.1％和45.5％)相似。

事先結(jié)合leu3a之后暴露于mabb4導致雙重染色的(leu3a+/b4+)pbmc細胞數(shù)量與單獨只利用leu3a或b4染色之單一標幟的對照組細胞相似(即對x282和x301分別為24.5％和46.7％)。

相反地，事先結(jié)合mabb4之后暴露于leu3a導致在單一或雙重染色過程中只有無leu3a陽性染色之mabb4染色的pbmcs。

整體來說，這些結(jié)果證明藉由針對leu3a-pe之抗體b4-fitc的單向抑制。也就是說，藉由事先leu3a結(jié)合未能阻斷b4結(jié)合；然而，事先b4結(jié)合可阻斷l(xiāng)eu3a結(jié)合。結(jié)論為mabb4辨識涵蓋cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域的構(gòu)型抗原表位(抗體leu3a可辨識此區(qū)域)，且mabb4以相較于抗體leu3a之較高的親和力結(jié)合cd4的此區(qū)域。而這些數(shù)據(jù)支持此結(jié)論。

2.2.利用針對hivrc肽(第39-66個氨基酸)之免疫血清對b4結(jié)合至rscd4進行競爭型抑制(elisa方法)

透過利用針對cd4結(jié)構(gòu)域1cdr2區(qū)域之免疫血清的競爭型抑制試驗，評估m(xù)abb4對完整重組可溶性cd4(rscd4)的結(jié)合親合力。

2.2.1.抗-hivrc多克隆抗體

利用包含cd4第39-66個氨基酸的環(huán)狀肽免疫天竺鼠以制備針對cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域的多克隆抗體。此環(huán)狀肽于本試驗中稱為hiv受體復(fù)合體肽(hivrc肽)，且如同先前于wang等人在2002年所描述之肽p2240c。

具體來說，第0周是配制于完全弗氏佐劑者，且第3和6周是配制于不完全弗氏佐劑者，接著在此之后以配制于不完全弗氏佐劑者每月加強，以每劑量0.5ml中內(nèi)含100μg者肌肉注射免疫接種4-6周齡的duncanhartley天竺鼠后，于特定時間點收集針對hivrc肽之天竺鼠血清。

提供的多克隆抗體稱為“抗-hivrc多克隆抗體”。

2.2.2.藉由抗-hivrc多克隆抗體對b4結(jié)合rscd4進行競爭型抑制

利用每孔洞以體積0.1ml濃度0.08μg/ml之完整rscd4涂覆的96孔微量盤進行競爭型抑制實驗。在利用生物素化b4-抗體結(jié)合前，將天竺鼠血清(在利用針對hivrc肽(cd4的第39-66個氨基酸)之免疫原免疫接種后第0、3、6、9、12、14、16和19周收集天竺鼠血清)以1∶30的比例稀釋與孔洞培養(yǎng)，之后利用與抗生物素蛋白(avidin)-hrp之結(jié)合作為示跡劑。也對從整個試驗同期所收集來自未免疫接種之天竺鼠的陰性對照血清(rc同型)進行測試。

圖16顯示藉由于初次免疫后第6周所提供之抗-hivrc多克隆抗體可顯著地抑制生物素化-b4結(jié)合至rscd4，藉由于初次免疫后第9周所提供之抗-hivrc多克隆抗體可達到近乎完全的抑制。

此競爭型結(jié)合抑制試驗進一步證明mabb4的結(jié)合位點是位于cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2環(huán)附近，雖然藉由mabb4直接結(jié)合至此肽并非顯著地是因為mabb4對膜結(jié)合cd4之構(gòu)型結(jié)構(gòu)的偏好性結(jié)合。

2.3.于mabdb4交聯(lián)時在hiv感染個體中用于增強病毒制造之靜默cd4陽性t細胞的再活化

藉由利用mabdb4處理細胞與觀測tnf-α產(chǎn)量、病毒量和細胞增生，以評估m(xù)abdb4活化靜默cd4+細胞的能力。

在此試驗中，藉由將培養(yǎng)盤與200μl山羊抗-人igg(jacksonimmunoresearch)在37℃下培養(yǎng)1小時，以將人類igg涂覆于8孔培養(yǎng)盤。將涂覆的培養(yǎng)盤保存于4℃冰箱中直到本試驗進一步使用。

依照標準作法將來自hiv患者之pbmc解凍1.5小時。如下所述，利用mabdb4(實驗組)、pma+pha(陽性對照組)或只有培養(yǎng)液(陰性對照組)處理pbmc，以評估靜默cd4+細胞的活化。

2.3.1.mabdb4處理

以mabdb4(濃度為3μg/10⁶細胞/ml)于4℃下處理細胞1小時以引發(fā)細胞上cd4的交聯(lián)。細胞以mabdb4處理，之后洗滌，并以rpmi培養(yǎng)液和10％胎牛血清于涂覆的48孔培養(yǎng)盤上培養(yǎng)7天。以未涂覆之孔洞作為陰性對照組。于第0天、第2天和第7天冷凍培養(yǎng)上清液供之后的評估。于4℃處理30分鐘后由細胞移除上清液，以提供作為mabdb4樣品之時間點第0天。

2.3.2.pma+pha處理

以0.1μm植物凝集素(phytohaemagglutinin，pha)加上15μg/ml豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(phorbolmyristateacetate，pma)(sigma)(pma+pha)于涂覆的48孔培養(yǎng)盤上和rpmi培養(yǎng)液與10％胎牛血清處理細胞7天，作為再活化之靜默cd4+細胞的陽性對照組。利用未涂覆之孔洞作為陰性對照組。于第0天、第2天和第7天冷凍培養(yǎng)上清液供之后的評估。于4℃處理30分鐘后由細胞移除上清液，以提供作為pma+pha樣品之時間點第0天。

2.3.3.只有培養(yǎng)液

如同陰性對照組，于涂覆的48孔培養(yǎng)盤上以rpmi培養(yǎng)液和10％胎牛血清培養(yǎng)細胞7天(只有培養(yǎng)液)。利用未涂覆之孔洞作為額外的陰性對照組。于第0天、第2天和第7天冷凍培養(yǎng)上清液供之后的評估。于4℃下在培養(yǎng)液中培養(yǎng)30分鐘后由細胞移除上清液，以提供作為只有培養(yǎng)液樣品之時間點第0天。

2.3.4.cd4+再活化的分析

藉由評估tnf-α產(chǎn)量、病毒量和細胞增生以測定cd4+細胞的再活化。于表13概述來自本試驗之結(jié)果。

使用標準方法分析來自所有樣品之溶液，項目包含：(1)利用定量的elisa分析tnf-α濃度；(2)利用rtpcr分析hiv病毒量；(3)細胞數(shù)量；以及(4)利用錐蟲藍(trypanblue)分析存活率。

具體來說，數(shù)據(jù)顯示，相較于只有培養(yǎng)液的陰性對照組(低于檢測極限)和以pma+pha刺激的細胞(較mabdb4覆蓋之細胞高約3至5倍)，mabdb4交聯(lián)所覆蓋之來自hiv患者的pbmc細胞可引起tnf-α的中度生成。

同樣地，mabdb4樣品以與只有培養(yǎng)液之陰性對照組相似的速率增生；然而，pma+pha刺激的細胞具有相較于以mabdb4交聯(lián)之細胞更大程度的增生(在第7天時，于pma+pha培養(yǎng)組別之細胞數(shù)量為mabdb4培養(yǎng)組的5倍高)。

然而，相較于培養(yǎng)液對照組和pma+pha刺激的細胞，于以mabdb4交聯(lián)之細胞的hiv病毒量顯著地增加。具體來說，當于第2和7天與只有培養(yǎng)液之陰性對照組相比較時，以mabdb4交聯(lián)之細胞于病毒量分別地具有151％和220％的增加；然而，pma+pha培養(yǎng)具有次佳的病毒量產(chǎn)生(于第2和7天分別為55％和78％)，盡管其細胞增生有5倍量的增加。

3.結(jié)論

(1)發(fā)現(xiàn)鼠源mabb4可辨識位于cd4上的構(gòu)型位置，且此構(gòu)型位置接近抗體leu3a所辨識的位置(位于cdr2區(qū)域第47-64個氨基酸)?；谠趯嵤├?所描述之比較性試驗，預(yù)期mabdb4具有如同在此所述之對于mabb4而言相同的辨識特性。

(2)利用多克隆抗體(此多克隆抗體是針對含有cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域第39-66個氨基酸的環(huán)狀肽(hivrc肽))可抑制鼠源mabb4對完整rscd4之結(jié)合。這些結(jié)果顯示mabb4辨識cd4第39-66個氨基酸，其對應(yīng)至cd4之d1的cdr2環(huán)?；谠趯嵤├?所描述之比較性試驗，預(yù)期mabdb4具有如同在此所述之對于mabb4而言相同的辨識特性。

(3)發(fā)現(xiàn)cd4與mabdb4交聯(lián)于hiv感染的pbmccd4+t細胞可活化病毒制造。具體來說，mabdb4誘導tnf-α產(chǎn)生，并增強hiv制造，而未誘導細胞增生(如表13所示)。

(4)基于此實施例所提供之結(jié)果，mabdb4(包含ub-421)能介導在hiv感染個體中用于增強病毒制造之靜默pbmcs的再活化。

實施例10.mabdb4c7和抗-hivrc多克隆抗體抑制抗原所引發(fā)的t細胞增生和cd4陽性t細胞的細胞激素(il2和ifn-γ)制造，因此破壞細胞焦亡的hiv致病循環(huán)

1.背景

最近的報告顯示，當hiv病毒感染允許(permissive)、活化的cd4+t細胞時，細胞死亡透過caspase-3依賴性的細胞凋亡默默地發(fā)生(doitsh，g，etal.，2014)。相反地，當r5或x4-向性hiv失敗地感染來自淋巴組織之非允許(non-permissive)、靜默的cd4+t細胞時，這些細胞透過caspase-1依賴性的細胞焦亡而死亡，其為程序性細胞死亡之強烈的炎癥形式。被視為宿主dna感測器的干擾素誘導因子16(ifi16)可識別不完整的hiv反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，進而引發(fā)caspase-1的活化(monroe，k.m.，etal.，2013)。在大多數(shù)的人類淋巴組織(包含扁桃體、淋巴結(jié)和脾臟)中，活化和允許的細胞次群體代表了cd4t細胞總數(shù)中的5％或更少數(shù)量，而非允許靜默細胞則代表了遭遇hiv之目標中的95％或更多數(shù)量。因此，caspase-1介導的細胞焦亡似乎主要地負責在這些淋巴組織感染hiv后驅(qū)使cd4t細胞死亡，而非caspase-3介導的細胞凋亡。分析來自以r5-向性hiv感染之受試者的新鮮淋巴結(jié)進一步支持這些發(fā)現(xiàn)，其中在富含靜默cd4t細胞的皮質(zhì)區(qū)可偵測到caspase-1和il-1β，而發(fā)現(xiàn)在解剖學上不同的生發(fā)中心(在此發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)性感染細胞)可偵測到caspase-3活性。

細胞焦亡極可能透過前發(fā)炎性細胞激素的釋放和內(nèi)生性危險信號，藉由移除細胞內(nèi)復(fù)制的小生境(niches)和增強宿主的防御反應(yīng)，促進各種細菌性感染的快速清除。然而，在致病的慢性炎癥，例如hiv感染，細胞焦亡不是保護性反應(yīng)且并不會導致原發(fā)性感染的清除。事實上，細胞焦亡似乎制造了惡性的致病循環(huán)，在此瀕死cd4t細胞釋放炎癥信號以吸引更多細胞進入受感染的淋巴組織，進而死亡并產(chǎn)生更多的炎癥。這些事件建立了炎癥的慢性狀態(tài)，其刺激病程和組織損傷。慢性炎癥也可能促進潛伏hiv病毒庫的維持，而潛伏hiv病毒庫可刺激記憶cd4t細胞的恒定性增生。

cd4t細胞的耗竭和慢性炎癥的發(fā)展是推動疾病進展之hiv致病機制中的特征過程，且細胞焦亡提供了這兩種疾病-促進過程之間意外的連結(jié)。

以上資料顯示，透過抑制由cd4+細胞之抗原刺激所引發(fā)的cd4+細胞增生及/或發(fā)炎性細胞激素制造的機制可能可以減輕或減少發(fā)生于hiv感染期間在淋巴組織的細胞焦亡。

2.實驗

進行研究以確定是否mabdb4可藉由于hiv感染個體抑制慢性炎癥發(fā)展以破壞由細胞焦亡所引起的致病循環(huán)。抑制由抗原刺激所引發(fā)之細胞激素制造有助于緩解許多靜默t細胞(靜默t細胞已經(jīng)有失敗的hiv感染)之細胞焦亡的負擔，從而破壞起因于細胞激素所造成cd4陽性t細胞耗竭的hiv病理。

利用金黃色葡萄球菌b型腸毒素(seb)之體外模型評估m(xù)abdb4c7(ub-421)在正常和hiv感染個體中抑制pbmct細胞增生的能力。seb是一種超抗原，其具有刺激帶有特定t細胞抗原受體(tcr)之所有t細胞的能力，并可誘導大量的細胞激素制造。

透過與huyencao和mohamedelrefaei博士的合作，進行了正常人類供體(n＝3)和hiv感染供體(n＝6，未使用art治療的患者，cd4+數(shù)量＞200，病毒量＞10,000)的功能分析，以評估m(xù)abdb4c7(ub-421)或針對cd4之d1的cdr2區(qū)域的抗-hivrc多克隆抗體(實施例9)是否可以抑制細胞增生和細胞激素(il2和ifn-γ)的產(chǎn)生。

2.1.研究對象和樣品

從reachcohort(舊金山)招募hiv-陽性未使用art治療的志愿者(n＝6)。也將三個年齡一致的hiv-血清反應(yīng)陰性對照組的志愿者納入此試驗中。將pbmc分離并冷凍保存在液態(tài)氮中直到試驗的時間。

2.2.使用mabdb4c7或純化的抗-hivrc多克隆抗體的飽和濃度

首先在間接免疫熒光試驗中分別以mabdb4c7igg或抗-hivrc多克隆抗體igg染色cd4+t淋巴細胞，之后再用alexa-山羊抗-huigg或alexa-山羊抗-天竺鼠igg進行染色。為了偵測陽性細胞百分比，透過流式細胞儀分析所得之染色的細胞。mabdb4c7和抗-hivrc多克隆抗體于2倍稀釋所測得之效價介于50μg/ml和0.0025μg/ml。mabdb4和抗-hivrc抗體的抗體效價測定為％cd4結(jié)合對抗體濃度(μg/ml)。在于hiv感染和正常個體進行t細胞功能測試使用之前評估這些抗體效價。

圖17顯示于功能試驗中所使用各試劑的飽和濃度，mabdb4(db4c7)為1μg/ml和抗-hivrc多克隆抗體為25μg/ml。

2.3.cd4+或cd8+t細胞的增生

利用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxy-fluoresceinsuccinimidylester，cfse)熒光試驗分析細胞增生，其在細胞分裂時產(chǎn)生羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxy-fluoresceindiacetate，succinimidylester，cfda-se)染色的減少。利用cfse作為³h-胸腺嘧啶(增生)測試的代用品。

以mabdb4c7或純化的抗-hivrc多克隆抗體之飽和濃度與pbmcs培養(yǎng)，以覆蓋位于細胞表面上的cd4受體。細胞也分別與抗-hivrc同型(濃度為25μg/ml)和pha(10μg/ml；sigma-aldrich)培養(yǎng)作為陰性和陽性對照組。

于pbs中以cfda-se(molecularprobes，eugene，or)標幟pbmcs，之后以100％fcs(sigma-aldrich，st.louis，mo)進行熒光淬熄。在以pbs洗滌后，將細胞再懸浮于具有10％fcs的rpmi1640(sigma-aldrich)中。

之后在seb抗原(1μg/ml)存在下，將細胞于37℃含5％co2之條件下培養(yǎng)5天，并分析表面標志的表達。

利用流式細胞儀圈選cd3+(amcyan)細胞群中cd4+(pe，d2)及cd8+(percpcy5.5)細胞群進行分析，并針對％cfse陽性細胞(作為％增生細胞)進一步測定此細胞群。利用lsrii(bdbiosciences，mountainview，ca)獲得每個樣品四萬(40,000)個淋巴細胞，并利用flowjo軟體(treestar，sancarlos，ca)分析。結(jié)果測定為分裂的cd4(或cd8)t細胞的百分比。所有試驗參與者證明于pha刺激后之顯著的細胞增生。cd4t細胞在無seb抗原刺激下之細胞增生為＜0.5％(陰性對照組)。

2.4.用以測定細胞激素(il2和ifn-γ制造)的細胞內(nèi)染色試驗

pbmc(0.5x10⁶個細胞)與seb抗原(1μg/ml)于37℃含5％co2之條件下培養(yǎng)2小時。以含有0.1％fcs之pbs(洗滌緩沖液)洗滌細胞，將細胞再懸浮于裂解緩沖液(bdbiosciences)中于室溫下反應(yīng)10分鐘進行固定。細胞以洗滌緩沖液洗滌一次，之后將細胞再懸浮于0.5ml的膜通透劑2(bdbiosciences)中并于室溫下培養(yǎng)10分鐘進行透化處理。接著以洗滌緩沖液洗滌細胞，并以抗-il-2apc、抗-ifn-γ(pecy7)以及抗-cd3(amcyan)、抗-cd4(pe，d2)或抗-cd8(percpcy5.5)(bdpharmingen)染色。利用lsrii(bdbiosciences)獲得每個樣品四萬(40,000)個淋巴細胞，并利用flowjo軟體(treestar)分析。在無抗原刺激下之細胞激素-制造cd4或cd8t細胞的百分比為<0.05％(陰性對照組)。結(jié)果表示為表達ifn-γ或il2之cd4+(或cd8+)t細胞的百分比。

2.5.統(tǒng)計分析

利用配對t檢定進行統(tǒng)計分析和比較。

3.結(jié)果

此seb抗原引發(fā)之t細胞增生試驗所提供的結(jié)果顯示，在未使用hivart治療的患者和年齡一致的正常個體中，mabdb4c7(1μg/ml)和抗-hivrc多克隆抗體(25μg/ml)在飽和狀態(tài)下均可減少cd4+t細胞增生，而非cd8+t細胞增生(數(shù)據(jù)未示)。

mabdb4(1μg/ml)和純化的抗-hivrc多克隆抗體(25μg/ml)于其個別的飽和pbmc表面cd4結(jié)合濃度下，于hiv陰性(圖18a)和hiv陽性(圖18b)個體均可抑制由超抗原seb所引發(fā)增生cd4+t細胞的il2生成。于來自相同hiv陽性和陰性個體的cd8+t細胞中則未發(fā)現(xiàn)此種抑制(圖18c)。

mabdb4(1μg/ml)和純化的抗-hivrc抗體(25μg/ml)在其個別的飽和濃度下，于hiv陰性(圖18d)和hiv陽性(圖18e)個體也均可抑制由超抗原seb所引發(fā)增生cd4+t細胞的ifn-gamma生成。于來自相同hiv陰性(圖18f)和陽性(圖18g)個體的cd8+t細胞中則未發(fā)現(xiàn)此種抑制。

4.結(jié)論

抗體mabdb4c7(ub-421)和抗-hivrc多克隆抗體，二者針對cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域，發(fā)現(xiàn)可抑制超抗原seb所引發(fā)藉由cd4陽性t細胞的t細胞增生和細胞激素(il2和ifn-γ)生成，而非藉由cd8陽性t細胞的t細胞增生和細胞激素(il2和ifn-γ)生成。發(fā)現(xiàn)db4c7和抗-hivrc多克隆抗體可抑制cd4+t細胞增生和相關(guān)細胞激素(il2和ifn-γ)生成，顯示此抗體可能對其它cd4陽性細胞相關(guān)的細胞激素生成展現(xiàn)相似的抑制效果，具有破壞細胞焦亡之hiv致病循環(huán)的潛力。

在此與先前實施例所觀察到，其對cd4陽性t細胞增生和相關(guān)細胞激素(il2和ifn-γ)生成的抑制效果為高度顯著，其中在此所述之針對cdr2區(qū)域的抗體對cd4細胞可能展現(xiàn)同時發(fā)生的相反效果，包括：(1)靜默hiv感染之cd4陽性t細胞的再活化，以引發(fā)由其潛伏狀態(tài)釋出hiv(實施例9)；(2)藉由靜默cd4+t細胞的再活化，競爭型抑制和預(yù)防hiv從新釋出的病毒進入未受感染的cd4陽性t細胞(實施例4和6)；以及(3)當(超)抗原刺激時藉由cd4陽性t細胞抑制t細胞增生和細胞激素生成(此實施例)。

針對hiv結(jié)合之特定位置(即cd4結(jié)構(gòu)域1的cdr2區(qū)域)的mabdb4和抗-hivrc多克隆抗體的獨特生物特征和免疫反應(yīng)的引發(fā)可提供功能性治愈hiv感染所需的特性，即能夠(1)透過進入抑制阻止hiv感染；(2)于靜默t細胞再活化病毒制造；以及(3)直接地改變細胞激素生成。

實施例11.于以進化支b之hiv原代分離株hiv.-1dh12攻毒的黑猩猩利用mabb4對hiv感染的暴露前和暴露后預(yù)防和治療

已證明針對cd4結(jié)構(gòu)域1之cdr2區(qū)域的b4相關(guān)高親和力抗體具有許多獨特的體外特性，重要的是要在最像人類的動物模型中測試b4抗體于預(yù)防及/或治療hiv感染的療效。已使用黑猩猩作為人類病毒、細菌和寄生蟲感染的模型超過100年了。于黑猩猩所精心制定的攻毒模型中，使用進化支b之hiv原代分離株hiv-1dh12展開攻毒試驗，以評估m(xù)abb4于暴露前和暴露后模式中對hiv-1感染提供被動性免疫的潛力。具體來說，評估m(xù)abb4所能提供的能力，包含(1)針對感染用以保護受暴露之受試者的消除性免疫，和(2)于證實感染后幾天投予抗體時對受暴露的受試者進行治療。

1.于黑猩猩利用mabb4對hiv感染的暴露前和暴露后預(yù)防

評估m(xù)abb4于攻毒前和攻毒后(暴露于hiv-1)模式對hiv-1感染提供被動性免疫的潛力。

1.1.方法

1.1.1試驗使用之動物

本試驗總共使用4只黑猩猩。使用一只黑猩猩作為暴露前治療動物(x084)，使用兩只黑猩猩作為暴露后治療動物(x356和x357)，以及使用一只黑猩猩作為對照組(x259)。

1.1.2動物對以hiv-1dh12病毒原液感染的敏感性

在治療和感染前利用其pbmc之體外感染測定動物對以hiv-1dh12病毒原液感染的敏感性。在暴露于病毒3天內(nèi)可感染所有培養(yǎng)物。

1.1.3mabb4抗體

制備供輸注使用之mabb4作為高度純化的抗體制劑(濃度為5mg/ml)。

1.1.4攻毒前預(yù)防/治療

于hiv-1dh12攻毒前1小時利用5mg/kg的mabb4對黑猩猩x084進行靜脈輸注。

1.1.5攻毒后預(yù)防/治療

于hiv-1dh12攻毒后1小時利用5mg/kg的mabb4對黑猩猩x356和x357進行靜脈輸注。

1.1.6對照組動物

以hiv-1dh12攻毒黑猩猩x259而未以mabb4抗體進行輸注。

1.1.7以hiv-1dh12攻毒

以hiv-1dh12的100tcid50(其取自預(yù)先制備的病毒原液，并已于西南生物醫(yī)學研究基金會在黑猩猩pbmc中測定效價)靜脈攻毒四只黑猩猩。

1.1.8hiv-1dh12病毒的偵測

利用gag序列的dnapcr放大、共培養(yǎng)、p24捕獲elisa和免疫印跡法，藉由血漿病毒血癥、細胞相關(guān)病毒量和對hiv之免疫反應(yīng)的偵測，以監(jiān)測于黑猩猩的感染確立。利用來自所有黑猩猩于50周研究期期間內(nèi)所收集之所有血液樣品的hiv-1rna拷貝/ml，以測定hiv感染的血清病毒血癥指標。利用病毒分離和dnapcr試驗(dnapcr試驗是用以偵測對應(yīng)gag的原病毒dna)于黑猩猩pbmc中偵測hiv-1dh12病毒。利用p24抗原捕獲elisa(coulter)評估病毒制造。制備黑猩猩pbmc和淋巴結(jié)細胞之1×10⁶至1×10²個細胞的連續(xù)稀釋，于il-2培養(yǎng)液中與來自3日齡之pha刺激的母細胞(數(shù)量為2×10⁶個細胞)進行共培養(yǎng)。選取導致p24制造之最高稀釋度的孔洞作為終點指標。

1.1.9動物飼養(yǎng)

經(jīng)機構(gòu)iacuc的批準并依照國家研究委員會的指導方針，將黑猩猩飼養(yǎng)在西南生物醫(yī)學研究基金會。

1.2.結(jié)果

利用mabb4對接受hiv-1dh12攻毒之黑猩猩提供消除性免疫。在hiv-1攻毒前以mabb4抗體輸注的動物中(x084)(圖19a)，或在于hiv-1攻毒后1小時以mabb4抗體輸注的兩只動物中(x356和x357)(圖19b)，在攻毒后后續(xù)的32周期間內(nèi)未偵測到感染的標志。

相反地，在攻毒后第1周開始由對照組動物(x259)從pbmc(圖19c)和在攻毒后第2周時由血漿可輕易地分離出病毒。也可于第4和20周由x259活組織切片的淋巴結(jié)細胞分離出病毒。于包含細胞數(shù)量范圍介于1×10⁴至1×10⁶的稀釋物中，可偵測到于pbmc和淋巴結(jié)隔間之受感染的細胞。在第4周于動物x259發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。

在利用抗體治療的黑猩猩x084、x356和x357發(fā)現(xiàn)在血液循環(huán)中所呈現(xiàn)的游離、未結(jié)合之mabb4迅速下降。來自接受治療之黑猩猩的cd4+和cd8+次群體在攻毒后20周期間的監(jiān)測下無cd4+耗竭的證據(jù)。到第32周期間，黑猩猩pbmc對有絲分裂促進劑(pha、商陸果實分裂素(pokeweedmitogen)和刀豆素(concanavalina))的增生反應(yīng)無抑制作用。

此試驗結(jié)果指出mabb4對hiv感染可以提供預(yù)防或消除性治愈，透過從攻毒日起甚至一年之血清病毒血癥和其它參數(shù)的廣泛隨訪可證明此試驗結(jié)果。

1.3.結(jié)論

在黑猩猩試驗中，可藉由暴露之前或暴露之后于短暫時間間隔之內(nèi)的mabb4投予以中止藉由致病性原代分離株的hiv感染。過繼免疫(transferredimmunity)被消除，且無暫時、減少或延遲的病毒血癥證據(jù)。透過mabb4被捕捉在位于周邊血液和淋巴組織的cd4+細胞上，盡管mabb4抗體從血漿中快速清除，但完整的保護是明顯的。

精心執(zhí)行的試驗進一步指出，使用5mg/kg之mabb4或相關(guān)抗體的治療方案可供(i)遭受hiv患者于數(shù)小時內(nèi)，或(ii)由血清反應(yīng)陽性母親所生下之嬰兒于生產(chǎn)時，以達到消除性治愈。

1.4.藉由mabb4對暴露后預(yù)防的應(yīng)用

美國公共衛(wèi)生服務(wù)指南對意外地暴露于hiv后之醫(yī)護人員推薦使用抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物的暴露后預(yù)防。然而，美國公共衛(wèi)生服務(wù)指南對暴露后預(yù)防目前可用藥物的毒性持保留態(tài)度。

在此試驗所獲得的結(jié)果證明使用mabb4作為暴露后預(yù)防性治療以代替或合并使用現(xiàn)行暴露后治療方法的潛力。mabb4的低毒性和療效證明此抗體較抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物更為廣泛有效的潛力。

這些結(jié)果進一步指出mabb4可用于從母親到孩子之hiv垂直傳播的預(yù)防。hiv的母嬰傳播(mother-to-childtransmission(mtct))也稱為周產(chǎn)期或垂直傳播，發(fā)生于懷孕、分娩，及/或生產(chǎn)或母乳喂養(yǎng)期間，將hiv從hiv+的婦女傳播給其嬰兒。對未接受針對病毒之治療的hiv+婦女在懷孕、分娩和生產(chǎn)期間的mtct機率約為25％。在以母乳喂養(yǎng)其嬰兒之未經(jīng)治療的hiv+婦女，mtct有額外12％的機會。在全世界，在2001年，1.8萬名婦女感染hiv，且大約80萬名兒童也成為hiv感染者，其中多數(shù)是經(jīng)由mtct。在全世界被新診斷為hiv之大部分的人是介于15-24歲之間。mtct預(yù)防的一個非常重要的構(gòu)成要素是必須針對年輕人進行hiv預(yù)防，尤其是女孩和年輕婦女在其變得性生活頻繁之前，并對那些已感染者進行治療。關(guān)于mtct的額外訊息可以在http://caps.ucsf.edu/archives/factsheets/mother-to-child-transmission-mtct#sthash.dtryms46.dpuf找到。利用mabb4所得到的結(jié)果指出，可藉由對hiv+婦女之新生兒提供5mg/kg或更多之mabdb4的單次投予，以在分娩和生產(chǎn)階段期間預(yù)防m(xù)tct。

2.于黑猩猩利用mabb4治療hiv感染

2.1.方法

2.1.1試驗中使用的動物

黑猩猩x084、x356和x357在先前預(yù)防試驗中使用且接受5mg/kg之mabb4的單次投予，以保護其免于hiv-1dh12的感染，其以治療模式于此攻毒試驗中再次使用。

2.1.2動物對以hiv-1dh12病毒原液感染的敏感性

在抗體治療和hiv攻毒之前，從動物制備pbmcs以測定其對以hiv-1dh12感染的敏感性。利用病毒于預(yù)防接種的3天內(nèi)感染所有的體外培養(yǎng)物。

2.1.3mabb4抗體

制備供輸注使用之mabb4作為高度純化的抗體制劑(濃度為5mg/ml)。

2.1.4以hiv-1dh12攻毒

以hiv-1dh12的100tcid50(其取自預(yù)先制備的病毒原液，并已于西南生物醫(yī)學研究基金會在黑猩猩pbmc中測定效價)靜脈攻毒所有動物(x084、x356和x357)。

2.1.5攻毒后治療

黑猩猩x084沒有任何攻毒后治療。在攻毒后第14天以5mg/kg的mabb4輸注黑猩猩x357，此時于供hiv感染治療之受攻毒的動物中的hiv病毒血癥為最高。在攻毒后第14、18和22天以5mg/kg的mabb4輸注黑猩猩x356。

2.2.結(jié)果的概述

利用輸注5mg/kg鼠源mabb4進行被動性免疫治療試驗，以于具有急性期hiv感染之黑猩猩測定mabb4的療效。以hiv-1dh12靜脈注射(i.v.)預(yù)防接種三只黑猩猩(x084、x356和x357)，并基于病毒檢測(未示出)和定量rt-pcr證實感染確立。

于所有黑猩猩(x084、x356和x357)在暴露后7天利用rt-pcr檢測來自hiv-1dh12的rna(基線以上)。利用病毒分離和利用hiv-1dh12整合偵測的dna-pcr，于14天內(nèi)在來自所有三只動物之pbmcs和淋巴結(jié)細胞中檢測細胞相關(guān)病毒。

在感染后第14天，利用mabb4(5mg/kg，靜脈注射)輸注受感染黑猩猩中的2只(x356和x357)。在感染后第18和22天，一只動物(x356)接受額外兩劑的抗體(5mg/kg，靜脈注射)。對前12周以每周間隔和之后直到感染后40周每月地利用rt-pcr試驗監(jiān)測病毒量。在感染后第14天時，以mabb4輸注黑猩猩x356和x357，病毒rna已經(jīng)處于一個快速上升的階段。相較于未接受治療的黑猩猩(x084)(圖20a，空心圓)，接受抗體的兩只黑猩猩之后在第20天時經(jīng)歷于其病毒量快速且顯著的下降(下降幅度為1-2個對數(shù))，以及于初期病毒血癥期持續(xù)時間的顯著降低(初期病毒血癥期持續(xù)時間由4周降至1周)(圖20a，實心圓)。

圖20a和圖20b比較于未接受治療的對照組黑猩猩x084(來自本試驗，其先前接受mabb4的單次暴露前投藥)與未接受治療的對照組x259(來自先前試驗，其未接受mabb4的投藥)和接受mabb4三次輸注之黑猩猩x356的血漿病毒血癥持續(xù)時間。于病毒攻毒后，如血清hiv-1rna拷貝所檢測，在無任何干預(yù)下利用hiv-1dh12攻毒黑猩猩x084(圖20a，空心圓)和x259(圖20b，空心圓)，并顯示早在第3天開始病毒血癥。血清hiv-1病毒血癥的持續(xù)時間約42天，為hiv-1dh12感染的特征。黑猩猩x356(圖20a和20b，實心圓)接受mabb4的三次投予，且hiv-1病毒血癥急劇下降，之后在或約在第21天達到低于檢測極限。比較x356和x084與x259之間的病毒量數(shù)據(jù)顯示，從hiv-1dh12感染之特有的病毒血癥持續(xù)時間減少了21天。

如上所述，來自本試驗之未接受治療的對照組黑猩猩x084于先前試驗中接受了mabb4的單次暴露前投予；而來自先前試驗之未接受治療的對照組黑猩猩x259則未接受任何mabb4投予。有趣的是，比較x084(圖20a，空心圓)與x259(圖20b，空心圓)所提供之數(shù)據(jù)顯示，相較于x259，在試驗期間x084具有整體較低的病毒量。因此，雖然在此試驗中未接受治療的動物(x084)的病毒量顯著高于mabb4治療的動物(x356)，于x084對mabb4之先前暴露似乎顯著地減少整體病毒量，特別是在hiv感染的急性期期間(比較x084與x259)。整體來說，這些結(jié)果指出于hiv暴露前之mabb4的任何投予可減少在感染急性期期間之病毒量程度，其可能進一步降低感染后從個體至個體的病毒傳播。

另外，進行細胞表面染色發(fā)現(xiàn)，在第14天時于投予mabb4單一劑量的動物(x357)中，mabb4結(jié)合至cd4+細胞維持了至少七天。且于投予此抗體之多劑量的動物(x356)中，mabb4結(jié)合至cd4+細胞持續(xù)了至少14天。相反地，只在輸注后三天之動物中于血液循環(huán)內(nèi)偵測到游離mabb4，如利用針對hiv-1dh12分離株之中和活性所測得。如同在黑猩猩的預(yù)防試驗中，這符合藉由結(jié)合至cd4+細胞而已經(jīng)將mabb4由血液循環(huán)中移除。

利用對于cd4/b4抗原表位的體外免疫染色，facs分析在40周期間可于所有樣品中偵測到cd4+細胞而無顯著的耗竭。在前21天的期間于pbmc之上完成輸注mabb4的免疫染色。pbmc樣品之有絲分裂促進劑所誘導的增生反應(yīng)(利用刀豆素、pwm或pha)在抗體治療前和后是不同的，且似乎不受mabb4輸注所影響。這些觀察指出mabb4能夠破壞病毒感染，且減少病毒量及病毒血癥期，而無不適當?shù)拿庖叨拘浴?/p>

實施例12.ub-421制劑，于狒狒之臨床前藥理學/毒性試驗和在人體組織的交叉反應(yīng)性

簡介

于前述實施例所討論之細胞培養(yǎng)和黑猩猩試驗中所獲得的數(shù)據(jù)證實，有足夠的科學價值證明進一步發(fā)展供人類使用之含有mabdb4的藥物制劑是有理的。制備含mabdb4c7(ub-421)的藥物制劑，并為臨床使用而于大量生產(chǎn)上進行一般的安全性測試。

另外，進行一組臨床前安全性試驗以提供針對候選藥物ub-421的藥效學、藥物動力學、毒性和安全性資訊。

在狒狒(papiospecies)進行單次與多次投予以及劑量依賴性(低和高劑量)試驗，以協(xié)助第一期臨床試驗的設(shè)計，用以評估在無癥狀hiv-1感染的人類受試者中ub-421之劑量依賴性的安全性、耐受性和免疫毒性。于臨床前藥理/毒性試驗使用狒狒作為動物模型，原因為狒狒的cd4+t細胞具有與人類相似的對mabdb4c7結(jié)合親合力，如圖21所示(即對人類和狒狒分別為ec50＝0.33μg/ml和0.29μg/ml)。與krishnamurthy博士(西南生物醫(yī)學研究基金會，病毒學暨免疫學部門，圣安東尼奧，德州)合作以開始與執(zhí)行在狒狒的非人類靈長類動物藥理和毒性試驗。

此外，執(zhí)行交叉反應(yīng)性試驗，以評估ub-421是否具有任何非預(yù)期性的反應(yīng)性，和對有別于預(yù)定目標之人類組織之細胞毒性的可能位置。

如以下進一步詳細討論者，從這些臨床前試驗所得到的數(shù)據(jù)顯示具有足夠的科學價值證明進一步發(fā)展ub-421作為在人體臨床試驗之試驗性新藥是有理的。

1.藥劑劑型

為了供人類使用而制備含有mabdb4c7的藥劑劑型。一般來說，包含mabdb4c7之藥劑劑型可配置于適當?shù)木彌_液中包含，但不限于，檸檬酸鹽、磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(tris)、1，3-二[三(羥甲基)甲基氨基]丙烷(bis-tris)等，于介于6.0至7.0之ph值，且可包含賦形劑(例如糖類(50mm至500mm的蔗糖、海藻糖、甘露醇，或其混合))、表面活性劑(例如：0.025％-0.5％的tween20或tween80)，及/或其它試劑。

ub-421是指定為于磷酸鹽緩沖生理食鹽水(pbs)(ph6.5)中包含10mg/mlmabdb4c7、20mm甘氨酸，以及0.05％(v/v)tween(polysorbate20)的醫(yī)藥組合物。

mabdb4之高濃度劑型也可供包含皮下注射的應(yīng)用而加以制備，其包含10mm組氨酸。

制造之后，執(zhí)行一般的安全性和毒性試驗以確保制造的藥物產(chǎn)品對投予人類和動物受試者是安全的。

2.一般的安全性試驗

2.1.ub-421生產(chǎn)批次和安全標準

以兩個大規(guī)模生產(chǎn)(p/nz807，批號225711和225758)制備ub-421藥物產(chǎn)品供臨床試驗使用，并評估一般的安全性。

若在7天的測試期間符合下列條件(1)整個測試期間所有的動物存活；(2)未觀察到毒性的明顯征象；以及(3)于投予醫(yī)藥組合物之時間直到試驗期結(jié)束的期間內(nèi)沒有動物具有明顯的體重減少，則將ub-421的大規(guī)模批次制造視作對臨床使用上為安全且可接受的。

2.2.實驗動物

小鼠：(白化，balb/cbyjnarl品系(家鼷鼠(musmusculus))，無特殊病原，雄性(國研院動物中心(nlac)，臺灣)。(實驗編號bio-003.90)。

天竺鼠：(白化，hartley品系(天竺鼠(caviaporcellus))，無特殊病原，雄性(臺大醫(yī)院(ntuh)，動物中心，臺灣)。(實驗編號bio-003.91)。

2.3.方法

透過腹腔投予方式對兩只小鼠和兩只天竺鼠注射各批次的ub-421。對照組的小鼠和天竺鼠則是透過腹腔投予方式注射等滲氯化鈉溶液(“s.t.”，批號1oc0206)。每只小鼠接受0.5毫升的總體積，而每只天竺鼠接受5.0毫升的總體積。在給藥前(第0天)和結(jié)束前(第7天)記錄動物體重。針對一般健康情況和毒性的臨床征象每天觀察每只動物。

2.4.分析和結(jié)論

來自一般的安全性試驗結(jié)果針對分析標準產(chǎn)生了以下令人滿意的結(jié)果：

(1)用于一般安全性試驗的所有動物在測試期間內(nèi)存活。

(2)在ub-421治療的動物中未觀察到明顯征象的毒性。

(3)試驗期間內(nèi)無動物體重減少。

鑒于上述情況，將此些批次視為無未預(yù)期，不可接受的外來雜質(zhì)。

這些發(fā)現(xiàn)證實了ub-421的大規(guī)模制造批次(批號225711和225758)無未預(yù)期或不可接受的外來雜質(zhì)。據(jù)此，視這兩個批次于人類臨床試驗使用上為安全和可接受的。

3.試驗a：于狒狒之ub-421的單次投予毒性試驗

3.1.方法

試驗a評估為期42天ub-421之低劑量(5mg/kg體重)或高劑量(25mg/kg體重)單次投予的藥效學、藥物動力學和安全性，如表14a所示。在這項試驗中，于30分鐘期間內(nèi)以5mg/kg或25mg/kg體重透過靜脈輸注投予ub-421。在0、0.5、1、2、4、8、12、24小時，以及在2、3、5、7、10、14、21、28、35、42天，收集用于藥物動力學(pk)分析的血液樣品。

利用流式細胞儀分析法分析血液樣品，利用以下標志監(jiān)測cd4+t淋巴細胞的存在，標志包含：cd4結(jié)構(gòu)域1(抗-cd4+d1)和cd4結(jié)構(gòu)域2(抗-cd4+d2)。利用alexa-db4作為標志和用于競爭型cd4結(jié)合的示跡劑(競爭型cd4結(jié)合是利用單克隆抗體ub421，且單克隆抗體ub421和alexa-db4均針對cd4結(jié)構(gòu)域1和2)。利用alexa-山羊抗-huigg作為針對cd4結(jié)構(gòu)域1和2之單克隆抗體的示跡劑。此外，利用針對cd3和cd14的抗體監(jiān)測于pbmc制備中的總t細胞(cd3)和單核細胞(cd14)數(shù)量。

3.2.結(jié)果簡述

未于藥效學、藥物動力學和安全性試驗中發(fā)現(xiàn)ub-421不應(yīng)該于人類進行第一期臨床試驗之負面看法。對于評估的所有參數(shù)而言，在對照組和實驗組動物均觀察到發(fā)現(xiàn)每一資料點顯著地高于或低于平均值(“超出正常范圍”)。

對來自以低劑量(5mg/kg)和高劑量(25mg/kg)ub-421單次投予治療之狒狒所提供的血液樣品評估ub-421之初始藥物動力學(pk)性質(zhì)。

此試驗結(jié)果顯示，以ub-421治療導致來自外周血單核細胞(pbmc)或由淋巴結(jié)活檢樣品細胞懸浮液所分離的cd3+cd4+t淋巴細胞和cd14+cd4+單核細胞之偵測顯著減少。因此懷疑這些細胞的減少是由于以ub-421“覆蓋”cd4+細胞，而不是因為動物體之cd4+細胞耗竭。發(fā)現(xiàn)當利用針對抗-cd4+d2標志的抗體時，所偵測之cd4+t淋巴細胞的百分比沒有變化，其證實了此項懷疑。此種在輸注后于cd4+細胞上以ub-421“覆蓋”的持續(xù)時間于接受低劑量之動物中為至少3天，而于接受高劑量之動物中則為至少7天。當于動物的血漿中不再偵測得到ub-421時，cd4+細胞上的“覆蓋”減少，且cd4+細胞(如利用抗-cd4+d1偵測)回復(fù)到與利用抗-cd4+d2偵測者相同的百分比。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ub-421是安全的，且當以低劑量ub-421投予時，ub-421可完全覆蓋cd4陽性細胞達至少3天，當以高劑量ub-421投予時則達至少7天?；谙惹皩嵤├懻摰慕Y(jié)果，當完全覆蓋cd4+細胞時，預(yù)期可完全地排除hiv進入細胞，此將產(chǎn)生病毒量減少的結(jié)果。

4.試驗b：于狒狒之多次投予毒性試驗

4.1.方法

試驗b評估為期56天(8周)之ub-421的低劑量(5mg/kg體重)或高劑量(25mg/kg體重)重復(fù)投予的藥效學、藥物動力學和毒性，如表14b所示。在此試驗中，一個治療期包含以每周的間隔(每周投予一次)投予ub-421共8次。在8周治療期結(jié)束時，對半數(shù)之接受治療的動物進行尸體剖檢與評估(表14b，第1部分)。其余的動物隨后經(jīng)過一個12周的恢復(fù)期，期間維持動物供觀察和收集血液與淋巴結(jié)樣品(表14b，第2部分)之用。在治療期期間的0*、1、3、7*、14、21、28、35*、42、49、56*天，以及在恢復(fù)期期間的63*、70、77、91、105*、133天，由動物收集血液樣品(和淋巴結(jié)活檢*)供分析之用。此試驗系統(tǒng)使用成年雄性(m)和雌性(f)的狒狒(n＝20；年齡：7至18歲)。

4.2.結(jié)果簡述

來自一組大規(guī)模臨床前試驗所提供對ub-421之低劑量(5mg/kg)和高劑量(25mg/kg)多次投予的藥物動力學、藥效學、毒性和安全性資訊。

整體來說，由試驗b第1部分和第2部分所提供之數(shù)據(jù)指出ub-421候選藥物具有供進一步發(fā)展的科學價值以作為試驗性新藥。未于藥效學、藥物動力學和安全性研究中發(fā)現(xiàn)ub-421不應(yīng)該于人類進行第一期臨床試驗之負面看法。對于評估的所有參數(shù)而言，在對照組和實驗組動物均觀察發(fā)現(xiàn)到每一資料點顯著地高于或低于平均值(“超出正常范圍”)。

4.2.1血液和活檢分析

從利用低劑量和高劑量ub-421多次投予治療之動物中所得到樣品進行一組大規(guī)模的試驗。這些試驗的結(jié)果總結(jié)在表15和17，并于以下內(nèi)容進一步討論。

利用ubielisa試驗(實施例7)和mt-2試驗(實施例2)發(fā)現(xiàn)，于接受低劑量(5mg/kg)ub-421之動物中可于其血漿偵測到ub-421達至少3天，而于接受高劑量(25mg/kg)ub-421之動物中則達至少7天。在最后一次輸注后，于某些接受高劑量之動物的血漿中檢測到過量ub-421達至少14天。

在接受ub-421的16個動物中的任一個內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)針對ub-421的狒狒抗體，證實本候選藥物于接受治療之動物中不具有免疫原性。

所有狒狒在第0和28天免疫接種b型肝炎病毒(hbv)疫苗(merck)。在4只對照組(1b)動物中的4只、接受低劑量(2b)ub-421的8只狒狒中的6只，以及接受高劑量(3b)ub-421的8只狒狒中的3只，在第56天可觀察到可檢測水平的狒狒抗-hbsag抗體。這些結(jié)果指出cd4+細胞之ub-421“覆蓋”可能造成某些動物對抗原預(yù)防接種的低反應(yīng)性。然而，發(fā)現(xiàn)此種低反應(yīng)性的效應(yīng)為可逆的，因為在ub-421治療中斷和以hbv疫苗額外免疫接種后，這些動物都能夠發(fā)展出抗-hbsag抗體。

4.2.2觀察和尸體剖檢的結(jié)果

將本試驗中接受治療之狒狒的肉眼和顯微鏡分析總結(jié)在表16和17。

在一般情況下，于此試驗中評估取自所有狒狒的組織(第1和2部份)，未顯示可能歸因于以低或高劑量水平投予ub-421之任何獨特或一致的病理變化。

對所有第3b組(高劑量)動物(n＝8)于輸注前之收案時進行眼睛觀察，并于最后輸注后一周，于治療期結(jié)束時再次眼睛觀察。從這些動物的眼科報告指出，對在治療期結(jié)束時執(zhí)行的所有測試而言，兩眼均保持在正常范圍內(nèi)。

取得來自所有動物(n＝20)在完成投予每一劑量之前、期間和之后的心電圖觀察記錄。從所有試驗動物的心電圖報告推斷所發(fā)現(xiàn)的心電圖變化是在正常的逐日差異的范圍內(nèi)。

4.2.3ind-enabling毒理試驗結(jié)果

除了對hbv疫苗接種的免疫反應(yīng)下降之外，ub-421處理組(2b和3b)和對照組(1b)之間于免疫毒性結(jié)果并無顯著差異。臨床檢查結(jié)果、眼科報告、心電圖記錄和組織病理學結(jié)果支持結(jié)論，結(jié)論為于成年狒狒在接受劑量水平高達25mg/kg之8周輸注后，ub-421是安全且耐受性良好的，治療法可有效地覆蓋目標細胞而不造成細胞耗竭。

5.于人體組織的交叉反應(yīng)性

如先前實施例所討論的，mabdb4抗體，包含mabdb4c7(ub-421候選藥物的主要成分)，證明其對cd4具有高結(jié)合親合力，特別是位于t細胞上之膜結(jié)合cd4。以下的臨床前試驗利用來自30個人體器官組織的一種陣列評估是否mabdb4c7可結(jié)合其它細胞種類。本試驗的目的是評估是否mabdb4c7具有任何意料之外的反應(yīng)性，以及其對有別于預(yù)期目標人體組織之細胞毒性的可能位置。

5.1.方法

使用含有30個器官之共90個組織核心的fda標準的冷凍組織陣列進行免疫組織化學試驗，其每一組織取自3個正常人類個體捐贈者(美國biomax組織微陣列(tma)切片，洛克維爾，md)。個別人類樣本之額外的冷凍切片也納入人體組織調(diào)查對象中，如表18所述。利用生物素化mabdb4c7和對照組試劑(生物素化山羊抗-兔igg)篩選人體組織調(diào)查對象供免疫反應(yīng)之用，用以評估特異性和非所欲之自體反應(yīng)性。

5.2.結(jié)果

藉由于phenopath實驗室(西雅圖，華盛頓)經(jīng)認證的臨床病理學家復(fù)審在成人正常組織切片所觀察到的染色模式，并針對反應(yīng)性進行評分。在胸腺和位于扁桃體(和淋巴結(jié))之t細胞依賴區(qū)觀察到強陽性的表面細胞膜染色，于脾臟則注意到弱陽性反應(yīng)。偶發(fā)的單核細胞與淋巴細胞或巨噬細胞一致，以一個預(yù)期模式在多種組織中染色陽性。也注意到于肝臟之局部微弱的庫氏細胞(kupffercell)染色。除了在某些組織中內(nèi)源性生物素的微弱染色，測試的所有其它人體組織均呈現(xiàn)陰性。扁桃體部分與未標幟的mabdb4c7抗體預(yù)培養(yǎng)可阻斷特定染色模式。未觀察到預(yù)期外的交叉反應(yīng)性。

這些結(jié)果證實mabdb4c7(ub-421的主要成分)不具有可能會對有別于預(yù)定目標之人類組織導致細胞毒性的任何意料外的交叉反應(yīng)性。

實施例13.第i期，開放性，單次投予，劑量依賴性試驗，以評估ub-421于無癥狀hiv-1感染之成年人的安全性和藥物動力學

1.目標

主要目標是要評估于無癥狀之人類免疫缺陷病毒-1(hiv-1)感染的受試者以ub-421遞增劑量單次靜脈輸注的安全性和耐受性，次要目標為確定于無癥狀之hiv-1感染的受試者以ub-421遞增劑量單次靜脈輸注的藥物動力學。(臨床試驗識別碼：nct01140126)。

2.方法

開放性，單次投予，劑量依賴性(劑量遞增)，二中心，非比較性。

3.受試者人數(shù)

總共收案20個受試者(于每個劑量組有5位受試者)。

4.診斷和納入的主要標準

為了參與這項試驗，受試者必須滿足以下所有標準。

(1)hiv-1血清反應(yīng)陽性；

(2)年齡20歲(含)以上；

(3)對于方案版本mar-09-2010：無癥狀，如同試驗主持人于篩選訪視(visit1，v1)根據(jù)疾病史、生理學檢查、心電圖(ecg)，以及凝血試驗和臨床化學和血液學試驗結(jié)果所判定，此些項目結(jié)果必須一直維持在正常范圍±10％內(nèi)；

(4)對于方案版本jul-01-2010：無癥狀，定義為患者在篩選訪視(visit1，v1)前24周內(nèi)無急性或有癥狀的病毒性肝炎，且無aids-界定疾病的病史，其是由試驗主持人根據(jù)疾病史、生理學檢查、ecg，以及實驗室值所判定；

(5)對于方案版本mar-09-2010：在篩選訪視(visit1，v1)所獲得cd4+t細胞數(shù)量＞350個細胞/mm³和hiv-1病毒量＞5,000個拷貝/ml；

(6)對于方案版本jul-01-2010：在篩選訪視前4周內(nèi)或于篩選訪視(visit1，v1)所獲得cd4+t細胞數(shù)量＞350個細胞/mm³和hiv-1病毒量＞5,000個拷貝/ml；

(7)未使用治療藥物者即事前和目前未接受抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的受試者；

(8)非哺乳中婦女；

(9)受試者于對具生育能力婦女之篩選訪視時必需具有陰性的血清妊娠試驗結(jié)果；

(10)受試者必須同意在試驗期間使用屏障避孕法(女性或男性保險套)；以及

(11)受試者在接受任何研究程序前應(yīng)簽署知情同意書。

5.試驗用藥品和干預(yù)方法

以濃度為10mg/ml(100mg于10ml藥瓶)提供ub-421(db4c7mab)。

把受試者分成4個劑量組，每一劑量組包含5名受試者，此基于其所接受ub-421的劑量。每個納入的受試者在第0天(visit2，v2)以以下的劑量水平之一接受ub-421的單次靜脈輸注：1mg/kg體重(第1劑量組)、5mg/kg體重(第2劑量組)、10mg/kg體重(第3劑量組)或25mg/kg體重(第4劑量組)?；谔囟▌┝亢褪茉囌唧w重計算ub-421的適當體積。使用無菌生理食鹽水調(diào)整每個個別劑量的體積，藉此以藥物之等量輸注體積輸注一個劑量組內(nèi)的每個個別受試者。之后使用輸注幫浦輸送ub-421的劑量。

6.療程：

從篩選、治療和隨訪的時間范圍：62至90天。從輸注到試驗結(jié)束的時間范圍：60天。

7.評估標準：

7.1.主要安全性終點：

(1)生理學檢查(pe)

(2)生命征象

(3)臨床化學和血液學試驗

(4)不良事件(ae)/嚴重不良事件(sae)的發(fā)生率

(5)心電圖(ecg)

7.2.次要安全性終點：

(1)在給藥后第0天(輸注前)、第14天、第28天和第60天所展現(xiàn)之抗-ub-421抗體的血清濃度(ub-421的免疫原性)。

(2)初始cd4+t細胞數(shù)量是在篩選訪視(v1)時評估，或是基于篩選訪視前4周內(nèi)所提供的預(yù)篩選數(shù)據(jù)。

(3)在給藥后第60天評估隨訪的cd4+t細胞數(shù)量。

8.療效終點

以于hiv-1病毒量從基線之改變評定療效終點。將基線的hiv-1病毒量定義為在篩選訪視v1時所評估的病毒量。

9.藥物動力學(pk)

針對ub-421評估以下藥物動力學(pk)參數(shù)：

(1)cmax：給藥后所觀察到的最高血清藥物濃度。

(2)tmax：達到cmax的時間。

(3)λz：排除(末端)速度常數(shù)。

(4)t1/2：排除(末端)半衰期。

(5)auc(0→last)：從時間零至最終樣品評估時間之血清藥物濃度-時間曲線下的面積。

(6)auc(0→∞)：從時間零至無限大之血清藥物濃度-時間曲線下的面積。

(7)cl：從身體之藥物的血清清除率。

(8)vβ：于消除相之分布的體積。

(9)vss：于穩(wěn)定狀態(tài)(steady-state)之分布的體積。

(10)mrt(0→∞)：外推到無限大的平均滯留時間(mrt(0→t))。

10.統(tǒng)計方法

10.1.主要安全性終點

(1)生理學檢查：利用藉由中心、天數(shù)、劑量組或整體之敘述統(tǒng)計概述生理學異常。也呈現(xiàn)從基線至最終訪視的轉(zhuǎn)變表。

(2)生命征象：藉由每一訪視利用敘述統(tǒng)計概述生命征象。也藉由中心、天數(shù)、劑量組或整體呈現(xiàn)相對于基線值的轉(zhuǎn)變。

(3)臨床化學和血液學試驗：利用敘述統(tǒng)計于適用的訪視概述臨床化學和血液學試驗的結(jié)果。根據(jù)試驗主持人的專業(yè)判斷和在每個研

究地點的正常范圍標準，將測試結(jié)果分為四個類別：正常、異常且無臨床意義(ncs)、異常且有臨床意義(cs)，以及異常且有典型的臨床意義(cst)。在轉(zhuǎn)變表中也呈現(xiàn)從基線至最終訪視之實驗室檢測結(jié)果異常的改變。

(4)不良事件(ae)的發(fā)生率：將治療前不良事件、治療相關(guān)緊急不良事件(teae)、以及藥物相關(guān)不良事件概述于頻率分布。每個報導的不良事件與一個國際通用醫(yī)學術(shù)語辭典(meddra)編碼和一器官系統(tǒng)分類相關(guān)?？蓪疫^敏癥與傳染病研究所愛滋病分部(daids)的不良事件分級表第1.0版用于嚴重度分級。

(5)心電圖(ecg)：利用敘述統(tǒng)計概述于適用之訪視所提供的心電圖紀錄數(shù)據(jù)。

10.2.次要安全性終點

(1)抗-ub-421抗體的血清濃度：利用適用的訪視概述抗體濃度。

(2)cd4+t細胞數(shù)量：利用分布統(tǒng)計對適用的訪視概述細胞數(shù)量和細胞百分比。也概述了于cd4+t細胞數(shù)量和百分比之相對于基線至最終訪視的改變。

10.3.療效終點

(1)hiv-1病毒量：于每一訪視利用敘述統(tǒng)計概述hiv-1病毒量。也利用中心、天數(shù)、治療劑量組和整體呈現(xiàn)相對于基線數(shù)值之改變＝(于治療后訪視的數(shù)值-于基線訪視的數(shù)值)。

10.4.藥物動力學評估

于每一訪視利用敘述統(tǒng)計概述藥物動力學參數(shù)。

根據(jù)方案和統(tǒng)計分析方案(sap)，安全性終點是在意圖治療(intent-to-treat，itt)群體進行分析，然而療效分析會在itt和療效群體二者中進行。至于藥物動力學評估，因為只有在臺北榮民總醫(yī)院(tvgh)的受試者有樣品可收集作為pk數(shù)據(jù)分析之用，故定義這些受試者為pk群體。pk評估只在tvgh的受試者進行。

11.結(jié)論的摘要

11.1.療效、藥物動力學和安全性結(jié)果

11.1.1療效結(jié)果

如圖22a所示，利用測量在整個試驗中于不同時間點之hiv-1病毒量的變化以評估ub-421的療效。療效分析顯示在ub-421輸注后于來自第2劑量組(5mg/kg)、第3劑量組(10mg/kg)和第4劑量組(25mg/kg)的受試者，而非于第1劑量組(1mg/kg)的受試者，可發(fā)現(xiàn)于平均hiv-1病毒量之顯著的凈變化。

藉由在單次投予后病毒量下降至2.25log10(來自10mg/kg組別)可證明抗體藥物ub-421(mabdb4c7)的療效(圖22b)。將對每一劑量組之hiv-1病毒量的最大平均下降概述如下，并在圖22b顯示：

第1劑量組(1mg/kg)：于第6天(v5)為0.29log10個拷貝/ml。

第2劑量組(5mg/kg)：于第6天(v5)為0.97log10個拷貝/ml。

第3劑量組(10mg/kg)：于第10天(v6)為1.58log10個拷貝/ml。

第4劑量組(25mg/kg)：于第14天(v7)為1.63log10個拷貝/ml。

hiv-1抑制的持續(xù)時間與劑量水平相關(guān)，其中相較于較低劑量之劑量組的受試者，在較高劑量之劑量組的受試者顯示hiv-1病毒量下降的持續(xù)時間較長(圖22a)。對以最高劑量ub-421(第4劑量組，25mg/kg)輸注受試者之hiv-1病毒量抑制的持續(xù)時間維持最長，約28天。

總之，發(fā)現(xiàn)ub-421抗體在5、10和25mg/kg的劑量水平以劑量-依賴關(guān)系具有強的抗病毒效應(yīng)。也就是說，在可比較的投藥下，相對于tmb-355，利用ub-421治療時有更高百分比的患者于血清hiv-1rna水平達到＞1log10的減少。

針對tmb-355(tmb-355先前稱為tnx-355；kuritzkes，d.r.，etal.，2004，圖1)先前報導的療效數(shù)據(jù)評估來自本試驗使用ub-421之療效數(shù)據(jù)的理論比較，如圖23a至圖23c所示?；诖吮容^，于評估的100％的受試者中，接受10mg/kg或25mg/kg單次投予時，ub-421可達到于病毒量的10倍減少；然而tmb-355只可于使用相同劑量之83％的受試者中達到于病毒量的10倍減少。

11.1.2藥物動力學結(jié)果

針對此試驗中所使用ub-421的每個劑量(1、5、10和25mg/kg)評估以上列出的藥物動力學(pk)參數(shù)。表19概述了在每一劑量組來自3個受試者所評估的多個pk參數(shù)(cmax、auc(0→∞)、t1/2和mrt)的結(jié)果。結(jié)果顯示每個pk參數(shù)和投予ub-421劑量的數(shù)據(jù)值之間具有相關(guān)性。也就是說，ub-421的劑量由1mg/kg增加至25mg/kg可對應(yīng)至所評估之pk參數(shù)的增加。具體來說，cmax由28.6μg/ml增加至462.5μg/ml；auc(0→∞)由201μg-小時/ml增加至51367μg-小時/ml；t1/2由14.4小時增加至85.4小時；且mrt(0→∞)由21.6小時增加至97.4小時。

11.1.3安全性結(jié)果

透過生理學檢查、生命征象、臨床化學和血液學試驗、ae/sae的發(fā)生率和心電圖評估ub-421的安全性特征。也測定cd4+t細胞數(shù)量和抗-ub-421抗體濃度以提供進一步的安全性評估。

針對總共30個事件，將teaes的凈發(fā)生率以嚴重度分級為65.0％(20個受試者中的13個)。報導的三個受試者具有六件治療相關(guān)的不良事件與嚴重度分級：于受試者b-001-001(投予1mg/kg劑量的ub-421)為第1級(輕度)“搔癢”和“癤瘡”；于受試者a-015-009(投予10mg/kg劑量的ub-421)為第1級(輕度)“淋巴細胞數(shù)量增加”、“嗜中性球數(shù)量減少”和“血小板數(shù)量下降”；且于受試者b-015-008(投予25mg/kg劑量的ub-421)為第2級(中度)“麻疹樣疹”。于受試者b-015-008之麻疹樣疹的發(fā)生為未預(yù)期之嚴重藥品不良反應(yīng)(suspectedunexpectedseriousadversereaction，susar)；此受試者在5天護理之后從醫(yī)院出院。報導的一位受試者具有另外的sae，其與ub-421無關(guān)，于受試者a-012-005(投予5mg/kg劑量的ub-421)為肛門廔管和痔瘡；在生命征象或心電圖的結(jié)果則未發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)的異常。于治療僅有一個劑量；因此，尚未發(fā)生治療中斷或劑量變化。

在三個受試者(分別來自第2、3和4劑量組的一位受試者)中在第14天(v7)檢測到抗-ub-421抗體，其水平略高于0.4μg/ml的實驗檢測極限。在經(jīng)過第60天(試驗結(jié)束)的任何后續(xù)的訪視中未檢測出抗-ub-421抗體。沒有相關(guān)的不良事件或其它生理學異常與抗-ub-421抗體的出現(xiàn)有關(guān)。

此外，cd4+t細胞數(shù)量和細胞百分比在60天的治療期和無治療隨訪期期間為相對穩(wěn)定的。

總而言之，當以介于1和25mg/kg的劑量范圍透過靜脈內(nèi)(iv)輸注投予單劑量時，ub-421對hiv-1感染的成人是安全且耐受性良好的。

12.結(jié)論

此第i期試驗，以劑量范圍從1至25mg/kg的ub-421單次靜脈輸注，證明ub-421對hiv-1感染的成人是安全且耐受性良好的。大部分的不良事件為輕度或與試驗藥物無關(guān)的。麻疹樣疹之susar的唯一發(fā)生是發(fā)生在第4劑量組(25mg/kg劑量)，但目前還不清楚這起事件是否與試驗藥物有關(guān)。在三個受試者中只于第14天(v7)檢測到對ub-421的暫時性免疫反應(yīng)，其抗體水平僅略高于0.4μg/ml的實驗檢測極限，證明此抗體的出現(xiàn)為輕微的臨床意義。關(guān)于此試驗藥物的藥物動力學概況，主要參數(shù)的趨勢與劑量水平相關(guān)。此外，hiv-1病毒量抑制的程度和持續(xù)時間與5、10和25mg/kg之ub-421劑量水平顯著地正相關(guān)，但在1mg/kg劑量組并非如此明顯。

考慮到從此試驗所獲得的安全性和療效結(jié)果，在治療無癥狀hiv-1感染的成年人中許可至少為5mg/kg劑量水平ub-421的進一步發(fā)展。

實施例14.第iia期，開放性，多次投予，劑量依賴性試驗以研究ub-421于無癥狀hiv-1感染之成年人的安全性和療效

1.試驗?zāi)康?/p>

(1)評估于無癥狀hiv-1感染受試者之ub-421二劑量治療方案之多次投予的安全性和耐受性。

(2)獲得于這些受試者之ub-421二劑量治療方案之多次投予的抗病毒活性證據(jù)。

(3)評估抗病毒活性和安全性概況以確定最佳ub-421給藥和劑量治療方案。

(臨床試驗識別碼：nct01668043)。

2.試驗設(shè)計

這是利用ub-421之重復(fù)靜脈內(nèi)給藥的開放性試驗。為了可受試性(eligibility)而篩選對hiv-1血清反應(yīng)陽性且無癥狀之受試者。二十九位納入的受試者接受兩個劑量水平(每周10mg/kg(第1劑量組)或每兩周25mg/kg(第2劑量組))之一的試驗藥物(ub-421)之多次靜脈輸注，共為期8周的治療期?；谑瞻疙樞蛲高^地點且輪流地將受試者分配到兩個試驗劑量組之一。在8周的治療期之后隨訪受試者額外的八周。此試驗在第16周結(jié)束。

3.納入的標準

受試者必須滿足以下標準才有資格參與第iia期試驗：

(1)無癥狀，未接受抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者(antiretroviraltherapyhiv-1血清反應(yīng)陽性

(2)cd4+t細胞數(shù)量＞350個細胞/mm³

(3)hiv-1病毒量＞5,000個拷貝/ml

(4)無需要立即治療的感染癥(hiv-1除外)

(5)無使用免疫調(diào)節(jié)藥物或全身化療

(6)無需高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)。

當依據(jù)對hiv/aids診斷與治療的現(xiàn)行指導方針由試驗總主持人視作必需時，在這項試驗完成后，受試者于門診遵循例行的監(jiān)測時程表(無抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物)或接受標準治療之抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(例如haart)。允許于使用ub-421之第i期試驗所納入的個體和符合第iia期試驗之進入標準的個體參與此次試驗。

4.試驗用藥品

以濃度為10mg/ml(100mg于10ml藥瓶)提供ub-421(db4c7mab)。

每個納入的受試者接受利用以下劑量水平之一的ub-421的多次靜脈輸注：每周10mg/kg(第1劑量組)或每兩周25mg/kg(第2劑量組)，為期8周。ub-421的適當體積是基于特定劑量和受試者體重。使用無菌生理食鹽水調(diào)整每個個別劑量的體積，藉此利用藥物之等量輸注體積輸注一個劑量組內(nèi)的每個個別受試者。對10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100ml，而對25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200ml。每次給藥的輸注時間為約一到兩小時。

5.評估標準：

5.1.主要安全性和療效終點：

直到第16周(試驗結(jié)束)評估ub-421的以下安全性和耐受性參數(shù)：

(1)生理學檢查(pe)

(2)生命征象

(3)臨床化學和血液學試驗

(4)不良事件(ae)/嚴重不良事件(sae)的發(fā)生率

在試驗期(從v2至v12)期間對每一個劑量組評估ub-421的以下療效參數(shù)：

(1)個別最大病毒量下降

(2)平均最大病毒量下降

5.2.次要病毒學終點

在試驗期(從v2至v12)期間評估以下病毒學反應(yīng)：

(1)在每一試驗劑量組內(nèi)和之間根據(jù)次群組的個別最大病毒量下降和平均最大病毒量下降。

(2)具有病毒量<50個拷貝/ml之受試者的比例；

(3)具有病毒量<200個拷貝/ml之受試者的比例；

(4)具有病毒量下降＞0.5log10個拷貝/ml之受試者的比例；

(5)具有病毒量下降＞1log10個拷貝/ml之受試者的比例；

(6)分別地對第1劑量組和第2劑量組在最終完成試驗藥物投予后直到7天和14天具有病毒反彈(于病毒量從最低點有超過0.5log10的增加)之受試者的比例；

(7)抗-ub-421抗體的血清濃度(ub-421的免疫原性)；

(8)cd4+和cd8+t細胞數(shù)量的變化；

(9)ub-421的藥物動力學參數(shù)(cmax、auc(0→∞)和auc(0→last))。

6.分析群體

意圖治療(itt)群體：29個受試者，其接受試驗藥物的至少一次給藥。

第1劑量組和第2劑量組的itt群體分別為14個受試者和15個受試者。

依方案執(zhí)行臨床試驗的群體(per-protocol(pp)population)：18個受試者，其接受試驗藥物的所有給藥，具有有效的基線和至少一個有效的治療后療效測定(hiv-1病毒量試驗)，且無重大違反方案規(guī)定。第1劑量組和第2劑量組的pp群體分別為7個受試者和11個受試者。

安全性和免疫原性群體：將29個受試者納入意圖治療(itt)群體。

藥物動力學群體：是基于安全性和免疫原性群體中的次群體。

于安全性和免疫原性群體分析基線數(shù)據(jù)和安全性終點，然而療效分析是在itt和pp群體二者中進行。在藥物動力學群體進行藥物動力學分析。

7.試驗期的持續(xù)時間

篩選期：＜4周

治療期：8周

隨訪期：治療期結(jié)束后接著的8周

visit0代表初始篩選，而試驗期間的每一次訪視代表1周期間。隨訪期通常以每周間隔執(zhí)行。

8.結(jié)果的概述

8.1.試驗群體

在臺灣的兩個試驗地點篩選總共33個無癥狀之hiv感染的成年人。其中29個受試者通過了篩選標準并被選擇進行試驗。所有符合資格的29個受試者均為男性。

8.2.安全性和耐受性結(jié)果

所有29名受試者在試驗期間經(jīng)歷至少1件不良事件，共計128件不良事件。其中，114例(在所有29個受試者中有89.06％)為治療相關(guān)緊急不良事件(teaes)和14例(在5個受試者中有10.94％)為治療前不良事件。于29個受試者中未觀察到嚴重不良事件(saes)。所有治療前不良事件均與ub-421無關(guān)，且這些事件中無事件被視為saes。報導teaes中的大多數(shù)(78.95％)為輕度，17.54％為中度，且3.51％(于一個受試者)是重度的。

最常見的(＞10％)teae是皮疹和蕁麻疹。除了不良事件，在22個受試者中觀察到于血液學(于22個受試者中的154個事件)和生物化學(于6個受試者中的32個事件)之實驗室異常檢測結(jié)果。然而，大多數(shù)的變化是輕微且不具有臨床意義的。生理學檢查結(jié)果和生命征象在試驗期期間大多為正?；驘o臨床意義。

如臨床試驗方案所說明，ub-421在試驗期期間為耐受性良好的，其于8周治療期的整體治療耐受性為73.84％。

8.3.藥效學

8.3.1cd4⁺t和cd8⁺t細胞數(shù)量

在8周治療期和8周隨訪期之后，平均cd4⁺t細胞數(shù)量從基線略微減少了55.10±117.97個細胞/mm³，而平均cd8⁺t細胞數(shù)量從基線增加了193.31±459.34個細胞/mm³。第1劑量組受試者之代表的cd4⁺t細胞數(shù)量和平均cd4t細胞數(shù)量如表22a和圖24a所示。第2劑量組受試者之代表的cd4⁺t細胞數(shù)量和平均cd4t細胞數(shù)量如表22b和圖24b所示。

8.3.2以ub-421覆蓋cd4受體

利用熒光結(jié)合的ub-421透過流式細胞儀偵測cd4受體覆蓋的程度。從四個代表受試者所提供之結(jié)果，兩個來自第1劑量組和兩個來自第2劑量組，分別如圖25a至25b和圖25c至25d所示。此試驗的靈敏度為0.15μg/ml。以每周10mg/kg或每兩周25mg/kg重復(fù)給藥時，ub-421的臨床療效顯示，當作為單一藥物治療時，于＞10μg/ml之ub-421血清水平存在下可使病毒減少至低于檢測極限。只要pbmccd4+細胞被完全覆蓋(即db4c7-alexa結(jié)合百分比接近0)就沒有病毒反彈。

在以兩個劑量水平投予ub-421二至三次后可達成以ub-421完全覆蓋位于pbmc上之cd4受體。此外，于整個治療期期間可保持以ub-421完全覆蓋cd4+t細胞(圖25a-25d，上圖)。在大多數(shù)受試者中，如同利用熒光db4c7mab(db4c7-alexa)之結(jié)合所測定，在最終ub-421輸注的三周內(nèi)，結(jié)合至cd4受體的ub-421減少并回復(fù)至基線數(shù)值。

評估試驗期間于受試者血清中所呈現(xiàn)之ub-421的濃度，以決定足以達成完全cd4覆蓋和hiv-1病毒抑制之ub-421的血清濃度。基于所獲得的數(shù)據(jù)，只要ub-421血清濃度維持在高于10μg/ml，則可利用ub-421達成持續(xù)的cd4+t細胞的完全覆蓋和hiv-1病毒抑制(圖25a-25d，下圖)。

8.4.藥物動力學

在第1劑量組中觀察到平均auc從17300±10000μgx小時/ml(visit1-2)增加至23900±10700μgx小時/ml(visit8-9)，然后在visit11-12回復(fù)至基線。在第1劑量組中所觀察到的平均auc(0→last)是171000±70300μgx小時/ml。

在第2劑量組中觀察到平均auc從56500±19500μgx小時/ml(visit1-3)增加至61100±20700μgx小時/ml(visit7-9)，然后在visit11-12回復(fù)至基線。在第2劑量組中所觀察到的平均auc(0→last)是239000±73900μgx小時/ml。

這些數(shù)據(jù)證明，如同利用auc(0→last)所測定，相較于接受每周10mg/kgub-421輸注者(第1劑量組，171000±70300μgx小時/ml)，平均血清藥物濃度以在投予每兩周25mg/kgub-421輸注的受試者中較高(第2劑量組，239000±73900μgx小時/ml)。

8.5.療效結(jié)果

此試驗招募29個hiv-1感染的受試者，其接受至少一劑的ub-421(itt群體)。招募的29個受試者中，共計18個受試者完成了8周的治療期，其接受試驗藥物的所有給藥(pp群體)。于試驗期間透過評定所納入無癥狀hiv-1感染受試者的個別和平均最大病毒量下降，以評估ub-421多次投予的療效，且將第1和2劑量組之itt和pp群體的結(jié)果概述于表20。

發(fā)現(xiàn)平均最大病毒量下降在itt或pp群體的兩個劑量水平之間并無顯著差異。具體來說，在第1劑量組于itt群體之病毒量減少了2.27±0.60log10個拷貝/ml，而在第2劑量組于itt群體之病毒量減少了2.45±0.46log10個拷貝/ml。于pp群體，在第1劑量組病毒量減少了2.73±0.34log10個拷貝/ml，而在第2劑量組病毒量減少了2.47±0.45log10個拷貝/ml。

在治療期期間，于所有(n＝29，100.00％)試驗受試者觀察到≥0.5log10個拷貝/ml的病毒量下降；且于所有(n＝29，100.00％)試驗受試者觀察到≥1log10個拷貝/ml的病毒量下降。

于以下內(nèi)容揭露在治療期期間所獲得之數(shù)據(jù)的進一步評估：

在第1劑量組，于itt之8/14(57.14％)的受試者和于pp之5/7(71.43％)的受試者具有≤200個拷貝/ml的病毒量；此外，于itt之3/14(21.43％)的受試者和于pp之3/7(42.86％)的受試者具有<50個拷貝/ml的病毒量。

在第2劑量組，于itt之10/15(66.67％)的受試者和于pp之7/11(63.64％)的受試者具有≤200個拷貝/ml的病毒量；且于itt之3/15(20.00％)的受試者和于pp之2/11(18.18％)的受試者具有<50個拷貝/ml的病毒量。

來自第1和2劑量組受試者之代表的病毒量下降數(shù)據(jù)如表21a至21c和圖25a至25d(上圖)所示。在每一劑量組之內(nèi)、每一劑量組之間，或在每一劑量組內(nèi)的次群體之間，于具有病毒量下降之受試者的比例并無統(tǒng)計上顯著的差異。此外，在8周治療期期間，在第1和2劑量組分別有43％和18％受試者的病毒量減少至低于目前實驗檢測極限(20個拷貝/ml)的水平。在所有受試者中，當以ub-421完全覆蓋cd4+t細胞時可使病毒量持續(xù)下降。在隨訪期結(jié)束時，于兩個劑量組的病毒量回復(fù)至基線水平。此外，在治療期期間于任何的試驗受試者中未觀察到病毒反彈。來自兩個劑量組之患者于整個治療期中未偵測到可計量的抗-ub421抗體(表21a至21c)。

8.6.ub-421和tmb-355的比較

針對由他人(jacobson，j.l.，eta1.，2009；toma，j.，etal.，2011；andpace，c.s.，etal.，2013)所執(zhí)行tmb-355(ibalizumab，先前稱為tnx-355)的相似試驗所提供的結(jié)果，以評估ub-421于此試驗所提供之結(jié)果。圖26a顯示在具有cd4+細胞完全覆蓋的ub-421存在下，有高達＞3log10之優(yōu)異的病毒量下降而無病毒量反彈。相反地，甚至在cd4+細胞完全覆蓋存在下，從治療起只有一周之后，接受tmb-355治療的患者便遭遇到病毒反彈，此為抗藥性病毒突變種發(fā)展的象征(圖26b)。

這兩種治療方案的比較，如圖所示，證明了利用ub-421治療hiv感染的受試者具有較tmb-355治療明顯的優(yōu)勢。具體來說，ub-421在整個治療期中提供了于hiv病毒量的持續(xù)性下降，且甚至在進入到隨訪期的一或兩周仍具有＞3log10的最大病毒量下降。相反地，tmb-355藉由第一次投予只提供了暫時性的病毒量下降，以及接近1log10之最大病毒量下降。

此外，使用tmb-355之先前試驗發(fā)現(xiàn)，盡管血清tmb-355之呈現(xiàn)和cd4陽性t細胞之完全覆蓋，hiv病毒反彈仍在進入治療的一周后發(fā)生(jacobson，j.l.，etal.，2009)。這結(jié)果與于上述實施例4之先前預(yù)測一致，非競爭型進入抑制機制，如tmb-355(ibalizumab)所介導者，在抗體治療期期間可提供抗藥性hiv突變種發(fā)展的高度可能性。實際上，發(fā)現(xiàn)來自接受tmb-355治療以減少病毒量之患者的病毒抗藥性突變種于gp120的v5區(qū)域上辨別出突變(toma，j.，etal.，2011；pace，c.s.，etal.，2013)。

9.結(jié)論

發(fā)現(xiàn)于無癥狀hiv-1感染的受試者以ub-421進行8周治療具有良好的耐受性。此外，分別來自第1和2劑量組對個別受試者之代表的cd4+t細胞數(shù)量(表22a和22b)和平均cd4t細胞數(shù)量(圖24a和24b)在整個為期兩個月的監(jiān)測中保持穩(wěn)定。

更重要的是，以ub-421治療導致在所有受試者中顯著的病毒量下降(100％接受治療的受試者以≥1log10個拷貝/ml之最大下降作出反應(yīng))。兩種治療方案，每周10mg/kg(第1劑量組)和每兩周25mg/kg(第2劑量組)輸注，顯示于病毒量下降之類似療效。在第1劑量組于itt群體之平均最大病毒量下降達到2.27±0.60log10個拷貝/ml，而在第2劑量組于itt群體之平均最大病毒量下降達到2.45±0.46log10個拷貝/ml。利用ub-421所觀察到的病毒減少療效比迄今所測試的任何其它的小分子抗hiv藥物優(yōu)越。

從此周密進行之ub-421的多劑量第iia期所得到的臨床試驗結(jié)果證明在治療期期間不具有病毒反彈之作為單一藥物治療的高耐受性、安全性，和于病毒量下降之空前的療效。在這試驗中所獲得的結(jié)果是意想不到的，且與此領(lǐng)域中長期抱持之懷疑(結(jié)合cd4結(jié)構(gòu)域1的抗-cd4單克隆抗體是免疫抑制的，因為其對于第二型主要組織相容性復(fù)合體所介導之免疫功能的干擾，且此種療法對于hiv疾病之治療并不合適(jacobson，j.l.，etal.，2009))相矛盾。此結(jié)果進一步指出利用ub-421合并使用正交的(orthogonal)haart及/或其它hiv病毒庫激活劑(例如hdaci)之hiv療法的額外形式可達到hiv感染的功能性治愈。

實施例15.利用ub-421單一藥物治療的治療形式作為于hiv-1感染成年人之抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法的替代品

圖27說明利用ub-421單一藥物治療對各種hiv患者群體的治療形式以作為抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法的替代品。詳細的目的和方案于以下內(nèi)容所述。

1.適用的患者群體

藉由穩(wěn)定的高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(haart)而具有病毒抑制之對hiv-1為血清反應(yīng)陽性的受試者有資格進行此種治療。

符合資格的患者在4個月的初期透過iv或sc途徑接受ub-421投予，之后是haart治療的另一個循環(huán)?！癶aart-ub-421”交替治療循環(huán)可重復(fù)多次，直到停用ub-421和haart治療時不再觀察到病毒反彈為止，從而達成對hiv感染的功能性治愈。

更具體地，這些受試者分別地于為期8周和16周的治療期，以兩個劑量水平(每周10mg/kg或每兩周25mg/kg)之一，接受試驗藥物(ub-421)的多次靜脈輸注。在第一次ub-421輸注的前一天停用haart治療。在ub-421投予之前，依照試驗總主持人所判斷，給予受試者預(yù)防用藥(治療前給藥)，包含類固醇和抗組織胺藥物，以預(yù)防輸注反應(yīng)。在完成最后一次排程的ub-421給藥后，所有受試者在同一天重啟其原先或其它適當之病毒敏感的抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法。haart治療方案之使用是由試驗總主持人所判斷。在治療期期間和在治療期結(jié)束后6個月監(jiān)測來自所有患者的病毒量和cd4細胞數(shù)量。

2.納入標準

若受試者滿足以下所有標準則可納入此治療形式：

(1)hiv血清反應(yīng)陽性；

(2)年齡20歲(含)以上；

(3)已接受haart治療，定義為至少2個核苷類/核苷酸類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nrtis)加上1個非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nnrti)、整合酶抑制劑，或蛋白酶抑制劑，達至少2年；此治療在進入本試驗之前一年內(nèi)

是不間斷的且無藥物更換。

(4)在篩選訪視前1年內(nèi)具有cd4+t細胞數(shù)量≥500個細胞/mm³或cd4百分比≥28％的兩個測量值；

(5)在篩選訪視前4周內(nèi)或于篩選訪視時所提供具有cd4+t細胞數(shù)量≥500個細胞/mm³；

(6)篩選訪視前至少1年之hiv-1血漿rna保持在低于檢測極限，每年具有至少2個病毒量測定。病毒量在篩選訪視前4周內(nèi)或于篩選訪視時也是低于檢測極限；在篩選訪視前4周以前的可檢測hiv血漿rna的單次事件將不排除參與。

3.排除標準

為了以下任何的理由可將受試者排除在此治療形式之外：

(1)需要立即治療的任何感染癥(hiv除外)；

(2)根據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心(cdc)對hiv感染分類系統(tǒng)按照第b類和第c類條件之任何先前確診或現(xiàn)行的aids-界定疾病；

(3)體重＞80kg；

(4)在篩選前12周內(nèi)任何紀錄的cd4+t細胞數(shù)量<250個細胞/mm³或cd4+t細胞百分比≤14％；

(5)先前納入于ub-421的第i期或第iia期試驗，或呈現(xiàn)抗-ub-421抗體的任何病史；

(6)在試驗藥物ub-421第一次給藥前12周內(nèi)對單克隆抗體的任何先前暴露；

(7)任何顯著疾病(除了hiv-1感染)或臨床上顯著的發(fā)現(xiàn)，包括精神和行為問題，根據(jù)篩選、病史及/或生理學檢查決定，由試驗主持人判定，將受試者排除參加此項試驗；

(8)在試驗藥物第一次給藥前8周內(nèi)的任何疫苗接種；

(9)在試驗藥物第一次給藥前12周內(nèi)的任何免疫調(diào)節(jié)治療(包含干擾素)、全身化療；

(10)少于12個月的預(yù)期余命；

(11)在試驗藥物第一次給藥前12周內(nèi)的任何非法靜脈注射吸毒；

(12)由于病毒學失敗和先前的非何杰金氏淋巴瘤或卡波西氏肉瘤之不只一次的haart治療方案改變；

(13)任何當前之酒精或非法毒品的使用，由試驗主持人判定，會妨礙受試者去遵從投藥和訪視時程表以及方案評估的能力。

4.藥品成品

以濃度為10mg/ml(100mg于10ml藥瓶)提供藥品成品ub-421(db4c7mab)。受試者利用靜脈輸注接受10mg/kgub-421的8次每周劑量或25mg/kgub-421的8次每兩周劑量。

ub-421的適當體積是基于特定劑量和受試者體重。使用無菌生理食鹽水調(diào)整每個個別劑量的體積，藉此利用藥物之等量輸注體積輸注一個劑量組內(nèi)的每個個別受試者。對10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100ml，而對25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200ml。每次給藥的輸注時間為約一到兩小時。

實施例16.利用ub-421合并使用haart的治療形式供hiv-1感染的功能性治愈

圖28說明利用抗體ub-421合并使用haart對各種hiv患者群體的治療形式可供hiv-1感染的功能性治愈。適用的患者群體：(1)未使用治療藥物之hiv患者；(2)haart治療穩(wěn)定的hiv患者；以及(3)haart治療失敗之hiv患者。

更具體地，于受感染之受試者供hiv功能性治愈的臨床方案之達成是藉由在初期(為期4個月)透過iv或sc途徑投予ub-421，初期(為期4個月)之后是治療假日(為期2個月)，其作為在兩個完整循環(huán)(為期一年)中的一個治療循環(huán)(為期6個月)。這些相同的受試者也在ub-421治療之兩個完整循環(huán)的期間開始和持續(xù)haart治療。在兩個完整循環(huán)結(jié)束時，停用haart和ub-421(a組(arma))以評估發(fā)生病毒反彈所需的時間，如果有病毒反彈的話。對照組中，包含在haart治療停用之前透過相同的12個月期間單獨以haart治療的受試者，其也被評估以評定發(fā)生病毒反彈的時間，如果有病毒反彈的話(b組(armb))。

在同時發(fā)生ub-421和haart治療的二個循環(huán)期間和治療期后6個月，共計18個月，監(jiān)測來自所有患者的病毒量及cd4細胞數(shù)量。

a組：以haart治療合并使用每周10mg/kg或每兩周25mg/kg的ub-421投予。b組：單獨以haart治療。

1.于功能性治愈之ub-421治療的設(shè)計(表23)

ub-421勝過haart藥物的潛在優(yōu)勢：

(1)ub-421可阻斷hiv-1病毒的細胞間傳播

(2)ub-421交聯(lián)cd4的類cdr-2環(huán)并活化細胞，且因此從潛伏誘導和釋放hiv-1

2.目標

(1)利用ub-421合并使用haart，藉由阻斷hiv之無細胞和細胞間傳播，以提供hiv感染的受試者有效的治療和保護。

(2)于hiv感染的受試者提供對hiv的功能性治愈。

3.適用的患者群體

(1)haart治療穩(wěn)定的hiv患者；(2)未使用haart治療之hiv患者；以及(3)haart治療失敗之hiv患者。

4.藥品成品ub-421

以濃度為10mg/ml(100mg于10ml藥瓶)提供藥品成品ub-421(db4c7mab)。受試者利用靜脈輸注接受10mg/kgub-421的8次每周劑量或25mg/kgub-421的8次每兩周劑量。

ub-421的適當體積是基于特定劑量和受試者體重。使用無菌生理食鹽水調(diào)整每個個別劑量的體積，藉此利用藥物之等量輸注體積輸注一個劑量組內(nèi)的每個個別受試者。對10mg/kg劑量組的輸注總體積為約100ml，而對25mg/kg劑量組的輸注總體積為約200ml。每次給藥的輸注時間為約一到兩小時。

5.分配干預(yù)

分配以下的干預(yù)措施：

5.1.a組-ub-421和haart治療的合并使用

受試者以適當?shù)膆aart療法持續(xù)地治療，并也以持續(xù)一年之兩個完整循環(huán)的ub-421治療。ub-421治療的每個循環(huán)包括在4個月的期間以每周10mg/kgub-421投予或以每兩周25mg/kgub-421投予，之后接續(xù)無ub-421治療的兩個月。

在1年的治療期結(jié)束后，停用haart和ub-421治療。進行額外的觀察試驗(藉由于缺乏haart和ub-421狀況下未見任何病毒反彈)以確保hiv感染的功能性治愈。

5.2.b組-單獨以haart治療

作為對照組，于同樣期間內(nèi)利用適當?shù)膆aart療法而未以ub-421治療用以持續(xù)地治療一組個別的受試者。

在1年的治療期結(jié)束后，停用haart治療并針對病毒反彈對受試者進行監(jiān)測。

所有說明書中所揭示之發(fā)明技術(shù)特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術(shù)特點可以提供相同、等同或相似目的之其它方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。

由上述可知，熟習此技藝者能輕易地了解本發(fā)明之必要特征，在不脫離其精神與范圍之下能就本發(fā)明做許多改變與調(diào)整以應(yīng)用于不同用途與條件。

表1.在hiv治療上未滿足的醫(yī)療需求：功能性治愈和根除

表2.目前發(fā)展中供hiv感染靜默t細胞之再活化的hdac抑制劑的列表

表3.單克隆抗體b4的hiv進入抑制活性(monogram生物科學phenosense^tm試驗)

表4.來自鼠源抗體b4重鏈和輕鏈序列的相對應(yīng)cdr1、2、3序列

表5.相較于親本b4之去免疫化b4(db4c7)的中和活性(mt-2微斑試驗)

表6.相較于親本b4之去免疫化b4(db4c7)的中和活性(pbmc試驗)

表8.db4c7對hpb-all細胞之結(jié)合親和力(ec50)

表9.db4c7對hpb-all細胞之絕對結(jié)合親和力(kd)和最大結(jié)合容量(bmax)

表10.利用(1)山羊抗-huigg-fitc和(2)db4c7-alexa結(jié)合至血液cd4+t細胞所測得之db4c7的結(jié)合活性(ec50)

表11.單克隆抗體b4阻斷hiv的無細胞和細胞間傳播

表12.利用facs分析的順序性染色-陽性pbmc百分比

表13.于pbmc培養(yǎng)物的tnf-α水平和hiv-1病毒量

nd：低于檢測極限

表14a.試驗a：于狒狒的單次投予臨床前試驗

表14b.試驗b：于狒狒的多次投予臨床前試驗

¹為期8周每周投予

²劑量：mg(ub-421)/kg(體重)

表15.于狒狒的血液和活檢結(jié)果

表16.于狒狒的觀察和尸體剖檢結(jié)果

表17.ub-421的臨床前概述：于狒狒的ind-enabling毒理試驗

表18.利用生物素化的mabdb4c7評估組織的交叉反應(yīng)性

¹觀察到強陽性表面膜染色

²與未標幟的mabdb4c7預(yù)培養(yǎng)可阻斷染色

³觀察到弱陽性

⁴觀察到偶而陽性的染色

⁵局部微弱的庫氏細胞染色

表19.關(guān)于在第i期試驗單一劑量ub-421的pk參數(shù)

¹結(jié)果為來自3個受試者的平均值

表20.在第iia期試驗于多次投予ub-421后的病毒量下降

itt：意圖治療群體(intent-to-treatpopulation)

pp：依方案執(zhí)行臨床試驗的群體(per-protocolpopulation)

vl：病毒量(viralload)

表21a.第iia期臨床療效數(shù)據(jù)顯示病毒量減少至低于檢測極限：患者1-1-01(第1劑量組：每周10mg/kg)

nq：無法定量

斜線：未評估

表21b.第iia期臨床療效數(shù)據(jù)顯示病毒量減少至低于檢測極限：患者1-1-02(第1劑量組：每周10mg/kg)

nq：無法定量

斜線：未評估

表21c.第iia期臨床療效數(shù)據(jù)顯示病毒量減少至低于檢測極限：患者1-2-03(第2劑量組：每兩周25mg/kg)

nq：無法定量

斜線：未評估

表22a.第1劑量組ub-421治療之患者的平均cd4t細胞數(shù)量(每周10mg/kg)

表22b.第2劑量組ub-421治療之患者的平均cd4t細胞數(shù)量(每兩周25mg/kg)

表23.于功能治愈之ub-421治療的設(shè)計

【序列表】

<110>美國聯(lián)合生物醫(yī)學公司(unitedbiomedical,inc.)

王長怡

<120>藉由針對cd4之單克隆抗體介導競爭型hiv進入抑制之hiv感染的治療和功能性治愈

<130>1004263.213wo(2034wo)

<150>us62/051,200

<151>2014-09-16

<150>pct/us2014/065048

<151>2014-11-11

<160>14

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>5

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(5)

<223>鼠源抗體b4之重鏈的cdr1

<400>1

asptyrvalilehis

15

<210>2

<211>17

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(17)

<223>鼠源抗體b4之重鏈的cdr2

<400>2

gluiletyrproglyserglyseralatyrserasnalalysphelys

151015

asp

<210>3

<211>9

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(9)

<223>鼠源抗體b4之重鏈的cdr3

<400>3

argglyasnglythrglyphealatyr

15

<210>4

<211>15

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(15)

<223>鼠源抗體b4之輕鏈的cdr1

<400>4

lysalaglyglnservalasptyraspglyaspsertyrmetasn

151015

<210>5

<211>7

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(7)

<223>鼠源抗體b4之輕鏈的cdr2

<400>5

valalaserasnleugluser

15

<210>6

<211>9

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(9)

<223>鼠源抗體b4之輕鏈的cdr3

<400>6

glnglnsertyrlysaspproleuthr

15

<210>7

<211>448

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(448)

<223>具有與衍生自來自親本鼠源b4抗體重鏈序列相對應(yīng)之cdrs1、2、3的相似cdrs1、2、3的去免疫化人類抗體b4[ub421]的重鏈

<400>7

glnvalglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

valilehistrpvallysglnalathrglyglnglyleuglutrpile

354045

glygluiletyrproglyserglyseralatyrserasnalalysphe

505560

lysaspargvalthrmetthralaasplysserserasnthralatyr

65707580

metgluleuserserleuthrseraspaspthralavaltyrphecys

859095

alaargargglyasnglythrglyphealatyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser

195200205

asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthr

210215220

histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser

225230235240

valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg

245250255

thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro

260265270

gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

275280285

lysthrlysproargglugluglntyrhisserthrtyrargvalval

290295300

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

305310315320

lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr

325330335

ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu

340345350

proproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcys

355360365

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

370375380

asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp

385390395400

seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser

405410415

argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala

420425430

leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys

435440445

<210>8

<211>218

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(218)

<223>具有與衍生自來自親本鼠源b4抗體輕鏈序列相對應(yīng)之cdrs1、2、3的相似cdrs1、2、3的去免疫化人類抗體b4[ub421]的輕鏈

<400>8

aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly

151015

glnargalathrilethrcyslysalaglyglnservalasptyrasp

202530

glyaspsertyrmetasntrptyrglnglnlysproglyglnpropro

354045

lysleuleuiletyrvalalaserasnleugluserglyileproala

505560

argpheserglyserglyserglythraspphethrleuasnilehis

65707580

provalglugluasnaspalaalathrtyrtyrcysglnglnsertyr

859095

lysaspproleuthrpheglyglnglythrlysleugluilelysarg

100105110

thrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglugln

115120125

leulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyr

130135140

proargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnser

145150155160

glyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthr

165170175

tyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulys

180185190

hislysleutyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserpro

195200205

valthrlysserpheasnargglyglucys

210215

<210>9

<211>448

<212>prt

<213>鼠源抗體

<220>

<221>結(jié)構(gòu)域

<222>(1)..(448)

<223>具有m253y/s255t/t257e取代之去免疫化人類抗體b4[ub421]的重鏈

<400>9

glnvalglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr

202530

valilehistrpvallysglnalathrglyglnglyleuglutrpile

354045

glygluiletyrproglyserglyseralatyrserasnalalysphe

505560

lysaspargvalthrmetthralaasplysserserasnthralatyr

65707580

metgluleuserserleuthrseraspaspthralavaltyrphecys

859095

alaargargglyasnglythrglyphealatyrtrpglyglnglythr

100105110

leuvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproser

195200205

asnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthr

210215220

histhrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproser

225230235240

valpheleupheproprolysprolysaspthrleutyrilethrarg

245250255

gluprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro

260265270

gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

275280285

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290295300

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

305310315320

lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr

325330335

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340345350

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355360365

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405410415

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420425430

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435440445

<210>10

<211>448

<212>prt

<213>人源化抗體

<220>

<221>尚未歸類的特征

<222>(253)..(253)

<223>m或y

<220>

<221>尚未歸類的特征

<222>(255)..(255)

<223>s或t

<220>

<221>尚未歸類的特征

<222>(257)..(257)

<223>t或e

<220>

<221>尚未歸類的特征

<222>(298)..(298)

<223>n或h

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151015

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505560

lysaspargvalthrmetthralaasplysserserasnthralatyr

65707580

metgluleuserserleuthrseraspaspthralavaltyrphecys

859095

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115120125

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130135140

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165170175

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340345350

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355360365

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

370375380

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420425430

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435440445

<210>11

<211>118

<212>prt

<213>鼠源抗體

<400>11

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151015

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202530

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354045

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505560

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100105110

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115

<210>12

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<212>prt

<213>人類抗體

<220>

<221>尚未歸類的特征

<222>(135)..(135)

<223>m或y

<220>

<221>尚未歸類的特征

<222>(137)..(137)

<223>s或t

<220>

<221>尚未歸類的特征

<222>(139)..(139)

<223>t或e

<220>

<221>尚未歸類的特征

<222>(180)..(180)

<223>n或h

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151015

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245250255

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305310315320

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<210>13

<211>111

<212>prt

<213>鼠源抗體

<400>13

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151015

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202530

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<212>prt

<213>人類抗體

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202530

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100105