發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于在小鼠中表達(dá)的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及這些構(gòu)建體在產(chǎn)生僅有重鏈的抗體中的應(yīng)用，所述僅有重鏈的抗體例如，在輕鏈(l-鏈)和重鏈(h-鏈)基因座的表達(dá)方面受損(compromised)的小鼠中產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及來源于所述僅有重鏈的抗體的單個(gè)vh結(jié)構(gòu)域的分離和應(yīng)用。引言大部分天然抗體或免疫球蛋白(ig’s)通常包含兩條重(h)鏈和兩條輕(l)鏈。h-鏈通過位于柔性鉸鏈結(jié)構(gòu)域附近的二硫鍵彼此連接，并且每條h-鏈具有與其n端區(qū)域鍵合的l-鏈二硫化物，從而形成h2l2異四聚體。每條l-鏈具有可變(vl)結(jié)構(gòu)域和恒定(cl)結(jié)構(gòu)域，而每條h-鏈包含可變結(jié)構(gòu)域(vh)、第一恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)或三個(gè)另外的恒定結(jié)構(gòu)域(ch2、ch3以及任選地ch4)。在正常的二聚體抗體(h2l2)中，每個(gè)vh與vl結(jié)構(gòu)域的相互作用形成抗原結(jié)合區(qū)(還已知在ch1結(jié)構(gòu)域與cl結(jié)構(gòu)域之間的相互作用促進(jìn)重鏈與輕鏈之間的功能性締合)。已知幾種不同種類的天然ig。這些種類(或同種型)的區(qū)別在于它們h-鏈的恒定結(jié)構(gòu)域，其又影響ig的功能。在哺乳動(dòng)物中，五種ig同種型為iga，igd，ige，igg和igm。iga包含由cα基因節(jié)段編碼的ch結(jié)構(gòu)域，并且在粘膜免疫中起主要作用。分泌性的iga是含有通過一個(gè)j鏈連接的兩個(gè)h2l2單位的二聚體，并且通常大量存在于分泌物中，如乳汁和初乳中。血清iga以h2l2單體存在于人中。igd包含由cδ基因節(jié)段編碼的ch結(jié)構(gòu)域，是單體的，并且作為b細(xì)胞(即，負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞)上的抗原受體起作用。ige具有由cε基因節(jié)段編碼的ch結(jié)構(gòu)域，也是單體的，并且在與肥大細(xì)胞上的高親和性fcε受體結(jié)合時(shí)，能夠由引發(fā)細(xì)胞因子和組胺釋放(變態(tài)反應(yīng))的變應(yīng)原交聯(lián)。在人中，igg以四種不同的亞型存在，全部這些亞型都是單體的并且包含由cγ基因節(jié)段編碼的ch結(jié)構(gòu)域。igg同種型包括大部分基于成熟抗體的(體液)免疫應(yīng)答。最后，igm具有由cμ基因節(jié)段編碼的ch結(jié)構(gòu)域，并且(類似于igg，a和e)在b細(xì)胞表面上表達(dá)并且還以分泌形式表達(dá)。分泌的igm是五聚體的并且作為早期體液應(yīng)答的一部分在清除病原體中起關(guān)鍵作用。b細(xì)胞中正常的ig表達(dá)涉及有序的一系列基因重排。通過組裝vh、多樣性(d)和連接(jh)節(jié)段在體內(nèi)構(gòu)建編碼h-鏈可變區(qū)的外顯子。l-鏈的可變區(qū)以等效方法通過組裝vl和jl節(jié)段編制。重排的vdj區(qū)最初與cμ基因節(jié)段締合轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致igmh-鏈的合成。隨后，在周圍，轉(zhuǎn)換重組(switchrecombination)使得其他下游ch基因節(jié)段(δ，γ，α或ε)靠近vdj外顯子，導(dǎo)致ig種類轉(zhuǎn)換。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過h-鏈的伴侶分子締合來防止表達(dá)h-鏈而不表達(dá)l-鏈的b細(xì)胞的成熟。然而，如果h-鏈缺失ch1，這一控制被去除，并且h-鏈能夠不受阻礙地移動(dòng)到細(xì)胞表面并被分泌。事實(shí)上，我們之前已經(jīng)表明，非常出乎意料地，無需任何進(jìn)一步的遺傳操作，l-/-(κ-/-λ-/--缺陷型)小鼠在血清中產(chǎn)生多種僅有h鏈的抗體，并且由于從h-鏈轉(zhuǎn)錄本自發(fā)丟失ch1外顯子，它們以相對(duì)低的水平產(chǎn)生。在胼足亞目(tylopoda)或駱駝科(camelids)(單峰駝(dromedaries)、駱駝(camels)和美洲駝(llamas))中，除了常規(guī)的h2l2抗體之外，作為針對(duì)抗原的正常體液免疫應(yīng)答的一部分產(chǎn)生僅由成對(duì)的重鏈構(gòu)成的主要的ig類型(僅有重鏈的抗體，hcab)(padlan，e.a.1994，mol.immunol.31：169-217)。引起這些動(dòng)物中的hcab表達(dá)的發(fā)育過程是未知的，然而，已知它們使用特定種類的vh(vhh)和cγ基因，其產(chǎn)生比常規(guī)重鏈更小的缺少ch1結(jié)構(gòu)域(通過rna轉(zhuǎn)錄體的交替剪接去除)的重鏈。在一些原始魚類中也存在重鏈抗體；例如，在護(hù)士鯊(nurseshark)中的新抗原受體(newantigenreceptor，nar)和在銀鮫(ratfish)中的專門的重鏈(cos5)(greenberg等人，1996，eur.j.immunol.26：1123-1129，rast等人，1998，immunogenetics，47：234-245)。同樣地，這些重鏈ig缺少ch1-型結(jié)構(gòu)域。基于它們針對(duì)靶抗原的極度的選擇性、特異性和功效，常規(guī)抗體長(zhǎng)久以來被視為是有效的工具。實(shí)際上，現(xiàn)在它們被充分確立為高度有效的治療劑，在2012年銷售額為540億美元，預(yù)計(jì)在未來幾年內(nèi)繼續(xù)顯著增長(zhǎng)。然而，為了得到下一代基于抗體的治療候選物，對(duì)于開發(fā)備選形式和更小的片段的益處存在日益增長(zhǎng)的需求。vh或vhh片段是免疫球蛋白分子保留靶標(biāo)特異性和功效的最小部分，并且是在穩(wěn)定性、溶解性、改造和制備容易性方面最穩(wěn)健的抗體片段。這使得它們成為高度有吸引力的治療劑，特別是對(duì)于開發(fā)用于區(qū)域和局部遞送的產(chǎn)品、純的拮抗劑和雙特異性藥或多特異性藥(multi-specifics)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。特別地，關(guān)于要用作潛在藥物產(chǎn)品的駱駝科vhh結(jié)構(gòu)域的潛力已經(jīng)吸引了眾多關(guān)注。然而，它們不具有人氨基酸序列的事實(shí)是妨礙駱駝科vhh結(jié)構(gòu)域成為最佳藥物候選物的一個(gè)主要特征，原因在于，當(dāng)施用給人(特別是疾病適應(yīng)證需要長(zhǎng)期施用的情形)時(shí)，它們具有引發(fā)抗-藥物抗體反應(yīng)的可能。結(jié)果，對(duì)于產(chǎn)生作為治療候選物的人vh(或vl)結(jié)構(gòu)域已有大量的興趣。公知來源于常規(guī)抗體的vh結(jié)構(gòu)域需要vl結(jié)構(gòu)域的陪伴(當(dāng)其不存在時(shí)，它們難以表達(dá)，通常是不溶的并且失去針對(duì)靶抗原的結(jié)合親和性和特異性)。因而，為了增強(qiáng)溶解性和穩(wěn)定性，來源于用在存在配偶體(partner)結(jié)構(gòu)域的條件下開發(fā)的結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的體外展示文庫(kù)的分離的人vh(或vl)結(jié)構(gòu)域需要大量的改造。本發(fā)明起因于下述令人驚訝的發(fā)現(xiàn)(見下述實(shí)施例)：通過在敲除小鼠中表達(dá)嵌合核酸構(gòu)建體能夠產(chǎn)生多種不具有ch1的hcab，所述嵌合核酸構(gòu)建體包含至少10個(gè)以其天然構(gòu)型存在的功能性的人的且未改造的v基因。在本發(fā)明的小鼠(其具有整合到其基因組中的人的或嵌合重鏈基因座)中產(chǎn)生hcab在治療劑的制備中提供了多種優(yōu)點(diǎn)。所述hcab抗體包含全人vh結(jié)構(gòu)域，在體內(nèi)其在不存在配偶體vl結(jié)構(gòu)域的條件下成熟。來源于所述hcab的vh結(jié)構(gòu)域是高度有效的、可溶的、穩(wěn)定的并且能夠以高水平表達(dá)?，F(xiàn)有技術(shù)公開了在免疫球蛋白輕鏈已被功能性沉默且其中h-鏈轉(zhuǎn)錄本天然經(jīng)歷自發(fā)的ch1外顯子丟失的小鼠中產(chǎn)生僅有重鏈的抗體(us12/455,913)?，F(xiàn)有技術(shù)還記載了使用包含駱駝科vhh基因的構(gòu)建體產(chǎn)生hcab(例如，參見wo2006/008548)。本發(fā)明目的在于提供用于轉(zhuǎn)化小鼠并且產(chǎn)生人vh結(jié)構(gòu)域的改良的構(gòu)建體。發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明涉及包含下述各項(xiàng)的載體：a)至少10個(gè)功能性的人重鏈v基因，其中至少10個(gè)功能性的人重鏈v基因以其天然構(gòu)型存在；b)至少一個(gè)人重鏈d基因和至少一個(gè)人重鏈j基因；c)缺少ch1外顯子的鼠c區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含鼠3’增強(qiáng)子區(qū)或基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鼠3’增強(qiáng)子區(qū)或基因的大小為至少約42kb。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鼠3’增強(qiáng)子區(qū)包含選自增強(qiáng)子元件hs3a、hs1.2、hs3b、hs4、hs5、hs6和hs7的一種或多種增強(qiáng)子元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鼠3’增強(qiáng)子區(qū)包含增強(qiáng)子元件hs3a、hs1.2、hs3b、hs4、hs5、hs6和hs7。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的載體的鼠宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明所述的載體或宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因小鼠。優(yōu)選地，小鼠是不產(chǎn)生任何功能性內(nèi)源輕鏈或重鏈的三重敲除小鼠。在另一方面，本發(fā)明涉及在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的或可從本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的僅有重鏈的抗體或vh結(jié)構(gòu)域。在另一方面，本發(fā)明涉及用于制備hcab、其片段或來源于其的抗體的方法，所述方法包括在小鼠中引入并表達(dá)本發(fā)明的載體。例如，所述片段是vh結(jié)構(gòu)域。在另一方面，本發(fā)明涉及包含人vh區(qū)和鼠恒定區(qū)、缺少ch1區(qū)的僅有重鏈的抗體。在另一方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法得到的或可通過本發(fā)明的方法得到的vh結(jié)構(gòu)域。在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠在構(gòu)建文庫(kù)、例如未免疫文庫(kù)(library)中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠來制備文庫(kù)、例如未免疫文庫(kù)的方法。在另一方面，本發(fā)明涉及用于制備文庫(kù)的方法，其包括離體免疫本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠或離體免疫本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠的組織或細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及包含通過本發(fā)明的方法得到的vh結(jié)構(gòu)域或可通過本發(fā)明的方法得到的vh結(jié)構(gòu)域的組合物。所述組合物單獨(dú)包含或與另一種vh結(jié)構(gòu)域、蛋白或其他治療有益的分子組合包含vh結(jié)構(gòu)域。附圖在下述非限制性附圖中進(jìn)一步描述本發(fā)明。圖1：人bac。圖2：小鼠bac。圖3：具有克隆的a1和a2的pyac3。圖4：通過tar克隆將bac轉(zhuǎn)換成yac。圖5：經(jīng)由bit連接兩個(gè)yac。l：lys2；a：ade2；t：trp1；u：ura3；k：kanr。圖6：小鼠eμ-sμ區(qū)的擴(kuò)增。圖7：具有缺失的ch1的小鼠cγ1片段的擴(kuò)增。圖8：pynot載體。圖9：用于產(chǎn)生hy-his3-端粒yac臂的載體phkt-hy。圖10：本發(fā)明的構(gòu)建體。yac1：從左到右，端粒-酵母trp1標(biāo)記基因-著絲粒-10個(gè)人v基因-人d基因-人j基因-小鼠μ增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)換(switch)-小鼠cγ1(ch1δ)基因-小鼠3’增強(qiáng)子-潮霉素抗性基因-酵母標(biāo)記基因his3-端粒。yac2：從左到右；端粒-酵母trp1標(biāo)記基因-著絲粒-23個(gè)人v基因-人d基因-人j基因-小鼠μ增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)換-小鼠cγ1(ch1δ)基因-小鼠3’增強(qiáng)子-潮霉素抗性基因-酵母標(biāo)記基因his3-端粒。yac3：從左到右，端粒-酵母trp1標(biāo)記基因-著絲粒-23個(gè)人v基因-人d基因-人j基因-小鼠μ增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)換-小鼠cγ1(ch1δ)基因-小鼠cγ2b(ch1δ)基因-小鼠cγ2a(ch1δ)基因-小鼠3’增強(qiáng)子-潮霉素抗性基因-酵母標(biāo)記基因his3-端粒。圖11：使用來自具有或不具有靶向的內(nèi)源性免疫球蛋白鏈基因座的小鼠的gdna的基因分型pcr反應(yīng)。圖12：血清中小鼠免疫球蛋白的elisa。tko小鼠在血清中沒有小鼠重鏈。tko小鼠在血清中沒有小鼠重鏈-輕鏈復(fù)合物。tko小鼠在血清中沒有小鼠輕鏈。圖13：轉(zhuǎn)基因程序的示意性圖示。圖14：在es克隆內(nèi)靶向構(gòu)建yac轉(zhuǎn)基因的示意圖。圖15：來自前核顯微注射后出生的幼仔的基因組dna的pcr篩選和從f0到f1代的種系傳遞的檢測(cè)。a)yac1，b)凝膠電泳，c)結(jié)果。圖16：插入的yac轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。圖17：噬菌粒載體的圖譜。圖18：由重排的轉(zhuǎn)基因基因座產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本的實(shí)例。圖19：a)和b)克隆的vh序列的多樣性。從單個(gè)未免疫()的轉(zhuǎn)基因yac1小鼠分離的轉(zhuǎn)錄本的序列分析。分析的序列總數(shù)：409。不同的cdr3的數(shù)量：346。平均cdr3長(zhǎng)度：13.24。使用了全部的v基因。圖20：檢測(cè)血清中的hcab的elisa。圖21：使用染色的骨髓細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)。圖22：a)至c)顯示脾細(xì)胞染色的流式細(xì)胞術(shù)。圖23：在用蘇木精和曙紅染色后脾切片的免疫組織化學(xué)。圖24：檢測(cè)針對(duì)免疫的hcab反應(yīng)的elisa。在(預(yù)取血)免疫前以及在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)從用不同抗原免疫的小鼠采集血清，并且在elisa中檢測(cè)與靶抗原的結(jié)合。圖25：噬菌體展示選擇過程的示意圖。圖26：在來自免疫的小鼠的克隆的vh的噬菌體選擇之前和之后his-標(biāo)記的粗vh制劑的elisa。圖27：來自免疫的小鼠的選擇前和選擇后文庫(kù)的序列a).在選擇之前的文庫(kù)大小和序列多樣性。由4只免疫的小鼠構(gòu)建噬菌體文庫(kù)，并且，在針對(duì)抗原進(jìn)行選擇之前，從這些文庫(kù)之一中取樣少數(shù)(n＝69)的克隆并測(cè)序。顯示了在這些克隆中cdr3長(zhǎng)度的分布和每種cdr3序列存在的頻率。具有4個(gè)構(gòu)架區(qū)的克隆1(seqidno.143，144，145，146，147和cdr)顯示在b)中。c).顯示了導(dǎo)致elisa中的較高親和性結(jié)合的體內(nèi)體細(xì)胞超變的實(shí)例。使用噬菌體展示從免疫的小鼠分離的抗原-結(jié)合vh家族的總結(jié)。圖28：針對(duì)所選的vh的結(jié)合動(dòng)力學(xué)的biacore測(cè)量。圖29：vh介導(dǎo)的對(duì)配體與受體結(jié)合的抑制。圖30：a)和b)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的培養(yǎng)的克隆的vh的產(chǎn)量。圖31：純化的重組vh的解鏈溫度(meltingtemperature)。圖32：純化的vh的hplc分析。圖33：elisa證明在三重ko背景下攜帶yac2的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生沒有內(nèi)源性輕鏈污染的hcab。任何內(nèi)源性輕鏈(hc-/-，κ-/-，λ+/-或hc-/-，κ+/-，λ-/-或hc-/-，κ+/-，λ+/-)的存在導(dǎo)致hcab與輕鏈的配對(duì)。圖34：從用3種不同抗原免疫的小鼠分離的812個(gè)抗原-結(jié)合vh克隆的kabat和wu變異性圖(variabilityplot)。繪制了每個(gè)氨基酸位置處的變異性％。在每個(gè)所示的氨基酸位置，有5條線條，依次表示vh1(16個(gè)克隆)，vh2(14個(gè)克隆)，vh3(514個(gè)克隆)，vh4(163個(gè)克隆)和vh6(105個(gè)克隆)家族序列。形成cdr1、cdr2和cdr3環(huán)的序列用方框框出。圖35：未免疫文庫(kù)。vh1，2，3，4和6文庫(kù)由113只未免疫的yac1小鼠的脾產(chǎn)生。i.)每個(gè)文庫(kù)中的克隆數(shù)目。ii)來自每個(gè)未免疫文庫(kù)的樣品的序列分析顯示良好的多樣性。iii.)來自每個(gè)未免疫文庫(kù)的序列樣品中cdr3氨基酸長(zhǎng)度的頻率。發(fā)明詳述現(xiàn)在將進(jìn)一步描述本發(fā)明。在下述篇幅中，更詳細(xì)地定義本發(fā)明的不同方面。除非有清楚的相反指示，這樣的定義的每個(gè)方面可以與任意另一個(gè)方面或多個(gè)方面組合。具體地，證明是優(yōu)選的或有利的任意特征可以與證明是優(yōu)選的或有利的任意另一種特征或多種特征組合。除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)施將利用常規(guī)的免疫學(xué)、分子生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)的技術(shù)和重組dna技術(shù)，這些技術(shù)屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。所述技術(shù)在文獻(xiàn)中充分闡釋。酵母人工染色體(yac)是可以用于在酵母中克隆非常大的dna插入物的載體。除了包含用于如天然酵母染色體一樣表現(xiàn)所需要的所有三個(gè)順式作用結(jié)構(gòu)元件(自主復(fù)制序列(ars)，著絲粒(cen)和兩個(gè)端粒(tel))之外，它們接受大dna插入物的能力允許它們達(dá)到在酵母細(xì)胞中的染色體樣穩(wěn)定性和傳遞的保真性所需要的最小尺寸(150kb)。yac的構(gòu)建和使用在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(例如，bruschi，c.v.和gjuracic，k.yeastartificialchromosomes，encyclopediaoflifesciences2002macmillanpublishersltd，naturepublishinggroup/www.els.net)。本發(fā)明人已經(jīng)制備了一系列用于在小鼠中表達(dá)的酵母人工染色體(yac)(圖10)。這些yac編碼能夠在轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行體細(xì)胞重組的人重鏈基因座，從而產(chǎn)生僅有b細(xì)胞重鏈的抗體組庫(kù)(repertoire)。該系列的yac具有增加的復(fù)雜性，與yac2或yac3相比，yac1具有較少的vh基因節(jié)段，并且yac3具有可用的另外的免疫球蛋白恒定區(qū)基因。如本文所述，該系列的yac能夠形成其他具有另外的vh基因的yac構(gòu)建體的基礎(chǔ)，使得v(n)具有至少10個(gè)與鼠恒定區(qū)組合的種系構(gòu)型的人vh。技術(shù)人員將清楚，另外的特征，例如，輔助向胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染構(gòu)建體、es的選擇和篩選或在轉(zhuǎn)基因過程中促進(jìn)限定的整合，也可以包括在本發(fā)明的yac構(gòu)建體內(nèi)。技術(shù)人員將清楚，可以使用除yac外的載體。如本文所述，本發(fā)明的載體、載體構(gòu)建體、構(gòu)建體或轉(zhuǎn)基因可以用于在轉(zhuǎn)基因小鼠中響應(yīng)抗原攻擊(challenge)產(chǎn)生完全功能性的、抗原特異性的、高親和性的所選種類的hcab或vh結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法中。本發(fā)明的表達(dá)載體具有包含人和鼠源序列的嵌合的重鏈基因座。因此，所述載體包含異源重鏈基因座。所述載體包含不編碼ch1結(jié)構(gòu)域的重鏈恒定區(qū)。所述載體可以用于在嚙齒動(dòng)物中表達(dá)異源重鏈基因座。當(dāng)在嚙齒動(dòng)物中表達(dá)時(shí)，例如，在小鼠中表達(dá)時(shí)，所述基因座能夠形成穩(wěn)定的且可溶性的hcab或vh結(jié)構(gòu)域。在本文所述的本發(fā)明多個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是yac。然而，按照本發(fā)明，也可以使用技術(shù)人員已知的其他載體，諸如bac。在第一方面，本發(fā)明涉及包含下述各項(xiàng)的載體：a)至少10個(gè)功能性的人重鏈v基因，其中至少10個(gè)功能性的人重鏈v基因以其天然構(gòu)型存在；b)至少一個(gè)人重鏈d基因和至少一個(gè)人重鏈j基因；c)缺少ch1外顯子的鼠c基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含鼠3’增強(qiáng)子區(qū)或基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鼠3’增強(qiáng)子區(qū)或基因的大小為至少約42kb。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鼠3’增強(qiáng)子區(qū)包含選自增強(qiáng)子元件hs3a、hs1.2、hs3b、hs4、hs5、hs6和hs7的一種或多種增強(qiáng)子元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鼠3’增強(qiáng)子區(qū)包含增強(qiáng)子元件hs3a、hs1.2、hs3b、hs4、hs5、hs6和hs7。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含多于一種鼠c基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鼠c基因是鼠cγ1基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含鼠μ增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)換μ元件或轉(zhuǎn)換γ元件。因此，所述轉(zhuǎn)換μ元件或轉(zhuǎn)換γ元件位于鼠μ增強(qiáng)子的下游，并且這些元件由此以它們的天然構(gòu)型存在。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含下述各項(xiàng)的載體：a)至少10個(gè)功能性的人重鏈v基因，其中至少10個(gè)功能性的人重鏈v基因基本上以其天然構(gòu)型存在；b)至少一個(gè)人重鏈d基因和至少一個(gè)人重鏈j基因；c)鼠μ增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)換μ元件或轉(zhuǎn)換γ元件；d)缺少ch1外顯子的鼠cγ1基因，和e)包含增強(qiáng)子元件hs3a、hs1.2、hs3b、hs4、hs5、hs6和hs7的鼠3’增強(qiáng)子基因。a)至e)中所述的元件以5’→3’的順序存在。本發(fā)明的載體是嵌合的，并且包含人和鼠序列。人序列位于載體的5’端并且包含重鏈v、d和j基因。位于人j基因下游的載體3’區(qū)包含鼠源的序列并且不包含人源的序列。如其他地方提及的，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是yac。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含至少約0.5mb的人序列。按照本發(fā)明，所述載體包含至少10個(gè)以基本上天然構(gòu)型存在的功能性人重鏈v基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體可以包含至少10個(gè)至全部的功能性人v基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，v基因的數(shù)目是10個(gè)至約44個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能性v基因的數(shù)目是10-20個(gè)、10-30個(gè)或10-44個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能性v基因的數(shù)目是10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，2526，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，28，29，40，41，42，43或44個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，功能性v基因的數(shù)目是10-23個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體可以包含功能性v基因的串聯(lián)重復(fù)。每個(gè)串聯(lián)重復(fù)包含至少10個(gè)基本上以其天然構(gòu)型存在的人重鏈v基因。因此，所述載體可以包含至少10個(gè)至數(shù)百個(gè)功能性v基因，例如，10個(gè)至約50個(gè)，10個(gè)至約100個(gè)，10個(gè)至約200個(gè)或更多。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體可以包含多于10個(gè)功能性v基因。在每個(gè)串聯(lián)重復(fù)中，至少10個(gè)功能性v基因基本上以其天然構(gòu)型存在。例如，根據(jù)本發(fā)明所述的分別具有10個(gè)或23個(gè)功能性人重鏈v基因的載體在圖10中顯示為yac1、2和3。然而，技術(shù)人員將理解，本發(fā)明不限于圖10所示的yac，并且可以包括另外的功能性v基因，條件是不損害根據(jù)本發(fā)明所述的載體的其他設(shè)計(jì)特征。v基因是人源的并且有功能的。因此，所述v基因編碼基因產(chǎn)物并且不是假基因(盡管在構(gòu)建體內(nèi)可以存在假基因，但是，當(dāng)確定功能性v基因的數(shù)目時(shí)不計(jì)算在內(nèi))。并且，按照本發(fā)明的載體構(gòu)建體，存在于所述載體中的至少有10個(gè)功能性v基因基本以其天然構(gòu)型存在。換言之，本發(fā)明的構(gòu)建體包含至少10個(gè)基本上以未重排的天然構(gòu)型存在的功能性人v基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體包含至少10個(gè)以未重排的天然構(gòu)型存在的功能性人v基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語天然構(gòu)型是指基因順序和/或dna序列。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在本發(fā)明的載體中的人v基因中的至少10個(gè)功能性人v基因以與它們?cè)谌朔N系中可能存在的順序次序相同的順序次序存在。換言之，本發(fā)明的構(gòu)建體包含至少10個(gè)未重排順序的功能性人v基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含10個(gè)未重排順序的功能性人v基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含多于10個(gè)功能性人v基因，并且這些中的10個(gè)以未重排順序存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含多于10個(gè)功能性人v基因，其中全部以未重排順序存在。由此本發(fā)明不包括下述情況：組合至少10個(gè)不同的功能性人v基因，其中選擇并組合人v基因使得它們不再以其天然順序存在。所述以其天然順序存在的至少10個(gè)v基因還包含間插序列。此外，至少10個(gè)功能性人v基因及其間插區(qū)的序列基本上與它們?cè)谌朔N系中可能存在的序列一樣。例如，所述序列表現(xiàn)出與在人種系中可能存在的序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。所述間插區(qū)是重要的，原因在于它們影響對(duì)v基因的接近并且決定怎樣利用它們產(chǎn)生抗體組庫(kù)。技術(shù)人員應(yīng)該理解，在構(gòu)建本發(fā)明的載體構(gòu)建體的過程中，由于酵母中的重組事件，可能發(fā)生序列中的小差異。因此，優(yōu)選地，按照本發(fā)明，用于本發(fā)明的構(gòu)建體的至少10個(gè)功能性人v基因不通過靶向操作進(jìn)行修飾而去除或改變位于功能性v基因之間的一個(gè)或多個(gè)間插序列。所述靶向操作排除在構(gòu)建本發(fā)明的載體構(gòu)建體過程中由于酵母中的重組事件引起的序列中的小差異。由此，本發(fā)明的構(gòu)建體包含至少10個(gè)以基本上天然序列存在的功能性人v基因。此外，優(yōu)選地，所述v基因不被改造而改變殘基以增加溶解性。換言之，所述v基因是天然存在的。實(shí)施例中顯示了用在本發(fā)明的載體(例如yac)中的功能性人v基因的特定組合。然而，不要求v基因的任何特定組合，并且任何功能性人v基因都可以用于hcab的高效表達(dá)，條件是所述載體中包含的至少10個(gè)功能性人v基因以與它們?cè)谌朔N系中可能存在的順序相同的順序存在。如上文所述，所述載體包括人重鏈d和j基因。由此，在本發(fā)明的構(gòu)建體中存在至少一個(gè)、優(yōu)選多個(gè)人重鏈d基因以及至少一個(gè)、優(yōu)選多個(gè)人j基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包括1-19個(gè)，例如至少5個(gè)，至少10個(gè)，至少15個(gè)或更多個(gè)人重鏈d基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包括至少5個(gè)，至少10個(gè)，至少15個(gè)或更多個(gè)人重鏈j基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18或19個(gè)人重鏈j和d基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體包括全部人重鏈d基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體包括全部人重鏈j基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人重鏈d和j基因基本上以其天然構(gòu)型存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人重鏈d和j基因以與它們?cè)谌朔N系中可能存在的順序相同的順序存在。因此，優(yōu)選地，按照本發(fā)明，用于本發(fā)明的構(gòu)建體的d和j基因不通過靶向操作進(jìn)行修飾而去除或改變一個(gè)或多個(gè)間插序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體構(gòu)建體還包括鼠μ增強(qiáng)子，igh基因轉(zhuǎn)錄和vdj重組的主要調(diào)節(jié)子和鼠轉(zhuǎn)換μ元件。轉(zhuǎn)換元件是種類轉(zhuǎn)換必不可少的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體還包含至少一個(gè)或多個(gè)鼠c區(qū)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述c區(qū)基因選自cγ1、cγ2b和/或cγ2a。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含cγ1、cγ2b和cγ2a。由此，本發(fā)明的載體構(gòu)建體包括缺少ch1外顯子的小鼠cγ1基因。然而，所述載體構(gòu)建體可能還包含另外的c基因或區(qū)域。此外，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體包含鼠3’增強(qiáng)子區(qū)。優(yōu)選地，這是大小約為42kb的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，該區(qū)域包含增強(qiáng)子元件hs3a、hs1.2、hs3b、hs4和預(yù)測(cè)的含有元件hs5、hs6和hs7的絕緣子區(qū)(garrett等人，2005；chatterjee等人，2011)。如在實(shí)施例中所示，這是包含多個(gè)指示調(diào)節(jié)元件存在的dna酶i高敏感性(hs)位點(diǎn)的大小約為42kb的區(qū)域。表明3’增強(qiáng)子是b細(xì)胞發(fā)育過程中的種類轉(zhuǎn)換重組過程和igh表達(dá)必不可少的(lieberson等人，1995；vincent-fabert等人，2010)。通過體外測(cè)定經(jīng)測(cè)量人β-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄鑒定大鼠3’增強(qiáng)子中的747bp區(qū)域具有增強(qiáng)子活性(pettersson等人，1990)。具有每個(gè)個(gè)體增強(qiáng)子元件hs3a、hs1.2、hs3b和hs4的靶向缺失的小鼠在種類轉(zhuǎn)換方面與野生型對(duì)照不可區(qū)分(cogne等人，1994；manis等人，1998；zhang等人，2007；vincent-fabert等人，2009；bebin等人，，2010)。然而，所有四種hs元件的組合缺失消除了向所有同種型的種類轉(zhuǎn)換(vincent-fabert等人，2010)。預(yù)測(cè)絕緣子區(qū)將igh基因座與位于下游或其他地方的非igh基因隔開(chatterjee等人，2011)。因此，在本發(fā)明的yac構(gòu)建體中包含完整大小的3’增強(qiáng)子提供了所有具有豐富且協(xié)同作用的增強(qiáng)子元件以及保護(hù)其余基因座的絕緣子的來源。所述載體還可以包含標(biāo)記基因，例如，酵母標(biāo)記基因trp1、his3和/或ade2，和/或潮霉素抗性基因。可以包括另外的選擇標(biāo)記。如在實(shí)施例中所示，根據(jù)本發(fā)明所述的具有10個(gè)或更多個(gè)功能性人v基因的載體構(gòu)建體可以在體外或在體內(nèi)產(chǎn)生。例如，對(duì)于在體內(nèi)產(chǎn)生，將圖10所示的yac1引入到小鼠es細(xì)胞中，并且通過在es細(xì)胞中的靶向基因敲入而擴(kuò)充v基因的數(shù)目。簡(jiǎn)言之，利用具有添加的v基因以及現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因的同源區(qū)域的靶向載體經(jīng)由同源重組事件擴(kuò)充轉(zhuǎn)基因。包含本發(fā)明的載體作為載體轉(zhuǎn)基因的es細(xì)胞可以通過經(jīng)轉(zhuǎn)染將載體dna直接引入到es細(xì)胞中或通過來自攜帶轉(zhuǎn)基因的小鼠的es細(xì)胞的衍生而得到。再衍生的es細(xì)胞將攜帶與小鼠相同的拷貝數(shù)和相同的基因組位置的轉(zhuǎn)基因，而轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可能具有變化的拷貝數(shù)且可能整合到小鼠基因組中的任何位置，除非特異性靶向。本發(fā)明所述的yac或其他載體可以作為轉(zhuǎn)基因引入到小鼠細(xì)胞或小鼠中，用于產(chǎn)生hcab或其片段。由此，本發(fā)明還涉及本文所述的載體在制備hcab的方法中的應(yīng)用。如下文所闡釋的，可以在小鼠中產(chǎn)生可溶的、不聚集且基本上單體的vh結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如下文詳述。本發(fā)明還涉及本文所述的載體在產(chǎn)生生產(chǎn)hcab的小鼠和由所述小鼠產(chǎn)生vh結(jié)構(gòu)域中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)基因鼠宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化有本文所述的本發(fā)明的載體，并且如本文所述由此表達(dá)異源重鏈基因座。由此，在一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化有包含下述各項(xiàng)的yac或其他載體的轉(zhuǎn)基因小鼠：a)至少10個(gè)功能性的人重鏈v基因，其中至少10個(gè)功能性的人重鏈v基因以其天然構(gòu)型存在；b)至少一個(gè)人重鏈d基因和至少一個(gè)人重鏈j基因；c)鼠μ增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)換μ元件或轉(zhuǎn)換γ元件；d)缺少ch1外顯子的鼠c基因，和e)鼠3’增強(qiáng)子元件。所述鼠3’增強(qiáng)子元件如其他地方所述。所述載體的其他特征也在其他地方記載。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是yac。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鼠c基因是鼠cγ1基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鼠3’增強(qiáng)子元件包含增強(qiáng)子元件hs3a，hs1.2，hs3b，hs4，hs5，hs6和hs7。由此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化有包含下述各項(xiàng)的yac的轉(zhuǎn)基因小鼠或鼠宿主細(xì)胞：a)至少10個(gè)功能性的人重鏈v基因，其中至少10個(gè)功能性的人重鏈v基因基本上以其天然構(gòu)型存在；b)至少一個(gè)人重鏈d基因和至少一個(gè)人重鏈j基因；c)鼠μ增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)換μ元件或轉(zhuǎn)換γ元件；d)缺少ch1外顯子的鼠cγ1基因，和e)包含增強(qiáng)子元件hs3a、hs1.2、hs3b、hs4、hs5、hs6和hs7的鼠3’增強(qiáng)子元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是鼠宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因小鼠具有降低的表達(dá)內(nèi)源性抗體基因的能力。由此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠具有降低的表達(dá)內(nèi)源性輕鏈和/或重鏈抗體基因的能力。因此，所述小鼠可以包含另外的修飾以破壞內(nèi)源性輕鏈和/或重鏈抗體基因的表達(dá)，從而不產(chǎn)生功能性的輕鏈和/或重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠可以包含非功能性λ輕鏈基因座。由此，所述小鼠不產(chǎn)生功能性的內(nèi)源λ輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述λ輕鏈基因座部分或完全缺失，或經(jīng)由插入變成非功能性的。例如，至少恒定區(qū)基因c1、c2和c3可以被缺失或經(jīng)由插入而變成非功能性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因座在功能上是沉默的，使得所述小鼠不產(chǎn)生功能性的λ輕鏈。此外，所述小鼠可以包含非功能性的κ輕鏈基因座。由此，所述小鼠不產(chǎn)生功能性的內(nèi)源性κ輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述κ輕鏈基因座部分或完全缺失或經(jīng)由插入變成非功能性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因座在功能上是沉默的，使得所述小鼠不產(chǎn)生功能性的κ輕鏈。例如，具有功能性沉默的內(nèi)源性λ和κl-鏈基因座的小鼠可以如wo2003/000737中公開那樣產(chǎn)生，其通過引用整體上結(jié)合在本文中。此外，所述小鼠可以包含非功能性的重鏈基因座。由此，所述小鼠不產(chǎn)生功能性的內(nèi)源性重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重鏈基因座部分或完全缺失或經(jīng)由插入變成非功能性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因座在功能上是沉默的，使得所述小鼠不產(chǎn)生功能性的重鏈。例如，如在wo2004/076618中所述，在小鼠中不存在全部8種內(nèi)源性重鏈恒定區(qū)免疫球蛋白基因(μ，δ，γ3，γ1，γ2a，γ2b，ε和α)，或部分不存在到它們是非功能性的程度，或者不存在基因δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b和ε并且側(cè)翼基因μ和α部分不存在到它們變成非功能性的程度，或者不存在基因μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b和ε并且α部分不存在到其變成非功能性的程度，或者不存在δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε和α并且μ部分不存在到其變成非功能性的程度。wo2004/076618通過引用整體結(jié)合在本文中。部分缺失意指內(nèi)源性基因座基因序列已被刪除或破壞(例如，通過插入)至該基因座不編碼功能性的內(nèi)源性基因產(chǎn)物的程度，即，由該基因座不表達(dá)功能性的產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因座在功能上是沉默的。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)本發(fā)明的載體的小鼠包含非功能性的重鏈基因座、非功能性的λ輕鏈基因座和非功能性的κ輕鏈基因座。因此，所述小鼠不產(chǎn)生任何功能性的內(nèi)源性輕鏈或重鏈。由此，所述小鼠是三重敲除(tko)小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生，如實(shí)施例中所示(參見圖13)。兩種最有特點(diǎn)的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的途徑是通過將遺傳物質(zhì)原核顯微注射到剛受精的卵母細(xì)胞中或通過將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞引入到桑椹胚或胚泡期的胚胎中。攜帶轉(zhuǎn)基因的es細(xì)胞系在體外產(chǎn)生或來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎。通過同源重組或利用插入載體可以向轉(zhuǎn)基因中引入新的特征。利用(例如)脂轉(zhuǎn)染(lipofection)、電穿孔或本領(lǐng)域已知的其他方法將構(gòu)建體引入到es細(xì)胞中。挑取攜帶選擇抗性標(biāo)記的克隆并篩選成功的整合。構(gòu)建體和es細(xì)胞二者都可以用分子特征修飾，以輔助需要的構(gòu)建體的整合以及正確靶向的es克隆的篩選和選擇。轉(zhuǎn)基因改造可以包括下述特征中的一種或多種，所有這些都是本領(lǐng)域中已知的：·選擇標(biāo)記：bsd，zeo，puro，hyg，它們可以以任意組合使用·負(fù)選擇標(biāo)記：胸苷激酶(tk)。負(fù)選擇可以與一種或多種選擇標(biāo)記組合使用·標(biāo)記和/或載體序列可以側(cè)連loxp、變體loxp、frt或變體frt位點(diǎn)。成對(duì)的位點(diǎn)可以相同或不相同。可以使用多于兩個(gè)位點(diǎn)?！な褂弥亟M酶(cre，flp)來刪除、倒置或替換序列·例如，經(jīng)由下述各項(xiàng)在限定的序列產(chǎn)生基因組雙鏈斷裂，：○鋅指○talens○crispr○mega核酸酶(歸巢內(nèi)切核酸酶(homingendonucleases))靶向的建立可以以一個(gè)或多個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)。序列可以經(jīng)由同源重組插入，并且選擇標(biāo)記通過后續(xù)重組酶介導(dǎo)的缺失而被去除。備選地，第一修飾步驟可能引入諸如重組酶識(shí)別位點(diǎn)和任選地負(fù)選擇標(biāo)記的特征，其可以用于通過重組介導(dǎo)的盒交換(recombinationmediatedcassetteexchange)引入序列。用于靶向建立的策略可以包括置換型載體(replacementvector)、插入型載體或重組介導(dǎo)的盒交換(rmce)。可以在每個(gè)步驟引入和/或缺失dna。引入的dna可以是人、細(xì)菌、酵母或病毒來源的。dna可以被引入到轉(zhuǎn)基因內(nèi)的任意位置。轉(zhuǎn)基因改造可以利用周圍的基因組序列。靶向的建立將產(chǎn)生這樣的轉(zhuǎn)基因基因座：其中v、d和j基因以與在天然人igh基因座中相同的順序和間隔存在，并且其中c區(qū)與在天然小鼠基因座中一樣?？赡軐?dǎo)致多態(tài)性，包括由重組工程(recombineering)引起的最小的變化(如瘢痕(scars)或小缺失)。不管怎樣引入遺傳物質(zhì)，將操作的胚胎轉(zhuǎn)移到假孕雌性接受體中，在其中繼續(xù)妊娠并且生下候選的轉(zhuǎn)基因幼仔。這些寬泛的方法之間的主要不同在于可以在將es克隆用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之前廣泛地篩選所述es克隆。另外，轉(zhuǎn)基因可以在確定的位置整合到es細(xì)胞中、或隨機(jī)整合。相反，原核顯微注射依賴于在其引入后其整合到宿主基因組中的遺傳物質(zhì)，并且一般來說，直到幼仔出生后才能驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因的成功結(jié)合和功能。本領(lǐng)域中已知多種輔助并確定是否發(fā)生轉(zhuǎn)基因的成功整合的方法。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過多種方式產(chǎn)生，包括構(gòu)建體隨機(jī)整合到基因組中，位點(diǎn)特異性的整合，或同源重組。有多種工具和技術(shù)可以用于驅(qū)動(dòng)和選擇轉(zhuǎn)基因整合和后續(xù)的修飾，包括使用藥物抗性標(biāo)記(正選擇)、重組酶、重組介導(dǎo)的盒交換、負(fù)選擇技術(shù)和核酸酶，從而改善重組效率。這些方法中的大部分常用于es細(xì)胞的修飾。然而，一些技術(shù)可以用于提高經(jīng)由原核注射介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因發(fā)生。進(jìn)一步的精細(xì)化可以用于在需要的背景內(nèi)提供更有效的轉(zhuǎn)基因品系生成。如上文所述，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，內(nèi)源性小鼠免疫球蛋白表達(dá)被沉默，從而僅允許hcab表達(dá)，以用于藥物發(fā)現(xiàn)。如上文所述，可以使用遺傳操作的小鼠，例如，所有內(nèi)源性免疫球蛋白基因座(小鼠重鏈、小鼠κ鏈和小鼠λ鏈)沉默的tko小鼠。將任意引入的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到該tko背景可以通過繁殖實(shí)現(xiàn)(常規(guī)的，或包括ivf步驟，以提供方法的有效比例縮放)。然而，在轉(zhuǎn)基因發(fā)生過程中包括tko背景也是可能的。例如，對(duì)于顯微注射，卵母細(xì)胞可以來源于tko供體。類似地，我們還從tko胚胎得到es細(xì)胞(見下文)用于轉(zhuǎn)基因發(fā)生。此外，如上文提及的，由于yac1是存在于備選構(gòu)建體中的共有核心結(jié)構(gòu)(圖10中所述)，來源于yac1轉(zhuǎn)基因小鼠的es細(xì)胞可以用于靶向添加，從而產(chǎn)生具有如在yac2、3或其他帶有核心yac1設(shè)計(jì)的yacs中的特征相同的特征的轉(zhuǎn)基因。所述多種轉(zhuǎn)基因發(fā)生的選擇方案總結(jié)在圖13中。本發(fā)明的另一方面是本文所述的表達(dá)本發(fā)明的載體的小鼠在制備缺少功能性ch1結(jié)構(gòu)域的hcab中的應(yīng)用。這優(yōu)選是本文所述的三重敲除小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述hcab可以是嵌合抗體，例如，包括來源于嚙齒動(dòng)物和人的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的小鼠用于制備可溶性vh結(jié)構(gòu)域的方法中。由此，可以使用本發(fā)明的小鼠產(chǎn)生可溶性vh結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的小鼠還可以用于構(gòu)建文庫(kù)，諸如體外展示文庫(kù)。這顯示在非限制性實(shí)例中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的小鼠用于構(gòu)建未免疫文庫(kù)。由此，本發(fā)明涉及本發(fā)明的小鼠在構(gòu)建文庫(kù)中的應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述文庫(kù)是未免疫文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫是離體的。還提供產(chǎn)生用于產(chǎn)生hcab的鼠細(xì)胞或小鼠的方法，所述方法包括將本文所述的載體引入到小鼠中。優(yōu)選地，所述小鼠包含非功能性重鏈基因座、非功能性λ輕鏈基因座和非功能性κ輕鏈基因座。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括由所述小鼠產(chǎn)生未免疫文庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠被免疫，例如，通過離體免疫進(jìn)行免疫。本發(fā)明還提供用于從小鼠獲得hcab或其片段(例如，vh結(jié)構(gòu)域)的方法，所述方法包括下述步驟：(i)引入本發(fā)明的載體，例如yac；(ii)允許在所述小鼠中形成缺少功能性ch1結(jié)構(gòu)域的hcab或抗原結(jié)合分子；并且(iii)從小鼠血清獲得所述hcab或抗原結(jié)合分子。優(yōu)選地，所述小鼠包含非功能性重鏈基因座、非功能性λ輕鏈基因座和非功能性κ輕鏈基因座。當(dāng)在小鼠中表達(dá)時(shí)，v、d和j基因節(jié)段能夠重組，形成vdj編碼序列。此外，當(dāng)在小鼠中表達(dá)時(shí)，異源基因座能夠形成任意種類的功能性免疫球蛋白分子，其恒定基因包含在引入到小鼠中的載體中?？贵w種類將由構(gòu)建體中存在的c基因控制。由此，抗體的同種型選自igg、iga、igd、ige或igm或其混合物。優(yōu)選地，同種型是igg。igg可以選自任意亞組。由此，本發(fā)明提供一種有效改造種類特異性的hcab和單結(jié)構(gòu)域抗體、特別是可溶性vh結(jié)構(gòu)域的方式。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明的方法得到的或可通過使用本發(fā)明的方法得到的分離的產(chǎn)生hcab的或產(chǎn)生vh結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞。細(xì)胞的選擇和分離可以利用流式細(xì)胞術(shù)或其他細(xì)胞分離法，例如，用于鑒定和分離其中產(chǎn)生缺少功能性ch1結(jié)構(gòu)域的抗原-特異性的hcab的b220int/+，黏結(jié)蛋白聚糖+脾來源的血漿細(xì)胞。然而，熟練的技術(shù)人員將知曉生產(chǎn)不限于這些類型的b細(xì)胞或方法。本發(fā)明這一方面的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以分離自周圍淋巴器官(secondarylymphoidorgan)。例如，周圍淋巴器官可以是非脾器官，例如，由下述各項(xiàng)組成的組中的任一種：淋巴結(jié)，扁桃體，和粘膜相關(guān)的淋巴組織(mucosa-associatedlymphoidtissue，malt)，包括腸相關(guān)的淋巴組織(gut-associatedlymphoidtissue，galt)，支氣管相關(guān)的淋巴組織(bronchus-associatedlymphoidtissue，balt)，鼻相關(guān)的淋巴組織(nose-associatedlymphoidtissue，nalt)，喉相關(guān)的淋巴組織(larynx-associatedlymphoidtissue，lalt)，皮膚相關(guān)的淋巴組織(skin-associatedlymphoidtissue，salt)，血管相關(guān)的淋巴組織(vascular-associatedlymphoidtissue，valt)，和/或結(jié)膜相關(guān)的淋巴組織(conjunctiva-associatedlymphoidtissue，calt)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述產(chǎn)生抗體的細(xì)胞是腹膜細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明這一方面的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以分離自骨髓。本發(fā)明的小鼠提供缺少功能性ch1結(jié)構(gòu)域的hcab或vh結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的抗體可以是分離的和純化的形式。所述抗體可以使用本領(lǐng)域公知的方法分離和/或表征。一旦表征，可以使用在本領(lǐng)域中也是公知的重組或合成方法來制備所述hcab或vh結(jié)構(gòu)域。對(duì)于適用的現(xiàn)有技術(shù)的方法，參見下文列出的參考文獻(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶包含hcab的重鏈b細(xì)胞組庫(kù)，所述hcab可以用來產(chǎn)生針對(duì)治療靶標(biāo)的分離的人vh結(jié)構(gòu)域。所述vh結(jié)構(gòu)域可以以多種方式分離。例如，可以從來自轉(zhuǎn)基因小鼠的多個(gè)淋巴來源提取包含b細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群體，并且甚至可以在鑒定靶標(biāo)特異性vh之前在體外進(jìn)行選擇或刺激。文庫(kù)可以由克隆的離體轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建，并且使用多種體外展示平臺(tái)篩選抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述體外展示平臺(tái)包括，但不限于噬菌體和核糖體展示。此類文庫(kù)可以由未免疫小鼠或由免疫的包含針對(duì)特定靶抗原反應(yīng)的親和力成熟的免疫組庫(kù)的動(dòng)物構(gòu)建。按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生hcab可以包括從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞表達(dá)，通過表達(dá)在細(xì)胞表面上或分泌(即，從細(xì)胞釋放抗體)進(jìn)行表達(dá)。優(yōu)選地，所述hcab或vh結(jié)構(gòu)域可以在小鼠中以生理水平產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述hcab或vh結(jié)構(gòu)域可以以高于野生型中的水平產(chǎn)生。如在圖20中所示，當(dāng)已經(jīng)引入轉(zhuǎn)基因時(shí)，可以在三重敲除小鼠的血清中產(chǎn)生游離的hcab。此外，如在實(shí)施例中所示，按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的hcab或vh結(jié)構(gòu)域是可溶的并且穩(wěn)定的。所述hcab或vh結(jié)構(gòu)域可以被修飾以增加溶解性，例如，通過一種或多種編碼抗體的基因的遺傳改造進(jìn)行。由此，本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的小鼠產(chǎn)生可溶性vh結(jié)構(gòu)域的方法。所述vh結(jié)構(gòu)域是可溶的，不聚集，具有高的熱穩(wěn)定性和親和性。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生可溶性vh結(jié)構(gòu)域的方法包括下述步驟：a)在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)本發(fā)明的載體，b)分離表達(dá)hcab的細(xì)胞或組織，c)由來源于所述分離的細(xì)胞或組織的mrna克隆編碼vh結(jié)構(gòu)域的序列，d)由克隆的轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建文庫(kù)，并且e)分離所述vh結(jié)構(gòu)域。如其他地方所闡釋的，所述小鼠優(yōu)選是不產(chǎn)生任意功能性內(nèi)源性輕鏈或重鏈的三重敲除小鼠。構(gòu)建的文庫(kù)可以用于展示選擇技術(shù)用來分離vh結(jié)構(gòu)域。展示選擇技術(shù)包括噬菌體展示、酵母或核糖體展示。在另外的步驟中，所述vh結(jié)構(gòu)域可以在表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，例如，在微生物或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。在另外的步驟中，可以測(cè)定vh結(jié)構(gòu)域的親和性。這可以通過多種本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行，包括，但不限于elisa和biacore。另外，與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合可以通過熒光激活的細(xì)胞分選(fluorescenceactivatedcellsorting，facs)進(jìn)行測(cè)量。分離的vh結(jié)構(gòu)域針對(duì)靶抗原的親和力是決定候選vh結(jié)構(gòu)域是否可能進(jìn)一步繼續(xù)到作為治療候選物開發(fā)的決定性參數(shù)。親和力通常通過解離常數(shù)kd(kd＝[抗體][抗原]/[抗體/抗原復(fù)合物])(以摩爾(m)單位)測(cè)量。高的kd值表示具有相對(duì)低的針對(duì)靶抗原的親和力的抗體。相反，通常在納摩爾(nm)以下的范圍內(nèi)的低的kd表示高親和力抗體。除了對(duì)靶抗原的結(jié)合強(qiáng)度，還可以測(cè)定vh影響給定靶標(biāo)的功能的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括用靶抗原免疫動(dòng)物從而引發(fā)免疫應(yīng)答的步驟，所述免疫應(yīng)答包括抗原-特異性的抗體產(chǎn)生。然而，也可以由未免疫動(dòng)物構(gòu)建文庫(kù)?？梢允褂枚喾N免疫流程來驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物內(nèi)的hcab反應(yīng)。最常用的方法依賴于與佐劑聯(lián)合施用基于蛋白的靶標(biāo)。靶標(biāo)通常是純化的形式，但是也可以使用粗抗原制劑。也可以使用細(xì)胞作為抗原的來源，其中天然地或由于遺傳操作由所述細(xì)胞表達(dá)需要的靶標(biāo)。dna也可以用作免疫原的來源。在這一情形中，與分子或細(xì)胞因子佐劑組合的表達(dá)質(zhì)粒通常用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生蛋白免疫原。在免疫過程中和在免疫后，可以通過使用(例如)血清-elisa或elispot技術(shù)監(jiān)測(cè)hcab反應(yīng)。除了基于文庫(kù)的發(fā)現(xiàn)方法，可以使用雜交瘤技術(shù)，其中將離體b細(xì)胞(在淋巴群體內(nèi)或預(yù)先選擇的)與配偶體骨髓瘤細(xì)胞融合，以產(chǎn)生生產(chǎn)hcab的單克隆雜交瘤，可以針對(duì)需要的結(jié)合特性對(duì)其進(jìn)行篩選。然后，可以從雜交瘤克隆vh序列，并且轉(zhuǎn)換成需要的終形式。由此，在另一方面，本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生可溶性vh結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括下述步驟：a)在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)本發(fā)明的載體，b)分離表達(dá)hcab的細(xì)胞或組織，c)由所述細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤，d)分離所述vh結(jié)構(gòu)域。按照本發(fā)明還提供可通過將本文定義的產(chǎn)生hcab的細(xì)胞或產(chǎn)生vh結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞與b細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系融合得到的雜交瘤。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，用于形成雜交瘤的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞是非脾周圍淋巴器官細(xì)胞(見上文)。公知的產(chǎn)生和選擇用于產(chǎn)生單克隆抗體的單個(gè)克隆雜交瘤的方法可以適用于本發(fā)明的應(yīng)用。按照本發(fā)明還提供通過本文所述的方法得到的或可通過本文所述的方法得到的hcab、來源于其的抗體或其片段。因此，本發(fā)明提供在小鼠中制備的hcab、或獲自或來源于表達(dá)本發(fā)明的載體的小鼠的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，來源于本發(fā)明的小鼠、優(yōu)選轉(zhuǎn)基因tko小鼠的片段是vh結(jié)構(gòu)域。所述hcab或vh結(jié)構(gòu)域可以特異性針對(duì)抗原。所述hcab或vh結(jié)構(gòu)域可以被改造成具有一種或多種特異性的二價(jià)或多價(jià)抗體。所述hcab可以是單克隆抗體、igg-樣抗體或igm-樣抗體。通過本發(fā)明的方法和小鼠產(chǎn)生的hcab或vh結(jié)構(gòu)域可以用作診斷、預(yù)后或治療成像劑。所述hcab或vh結(jié)構(gòu)域可以另外或備選地用作細(xì)胞內(nèi)結(jié)合劑或抗體酶(abzyme)。還提供包含本文所述的hcab或vh結(jié)構(gòu)域和任選地藥用載體的藥物、藥物制劑或組合物。典型地在施用給患者之前，用公知方法配制所述藥物。由此，本發(fā)明涉及包含通過本發(fā)明的方法得到的或可通過本發(fā)明的方法得到的vh結(jié)構(gòu)域的組合物。所述組合物單獨(dú)或與另一種vh結(jié)構(gòu)域、蛋白或其他有治療益處的分子組合包含vh結(jié)構(gòu)域。非限制性的實(shí)例如下文所列。在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合可以是與有毒的結(jié)構(gòu)部分(有效負(fù)載物)綴合，從而形成抗體藥物綴合物(adc)，或與放射線核素綴合，以形成放射線免疫綴合物，其目的是利用人vh結(jié)構(gòu)域與其靶抗原在體內(nèi)的結(jié)合而將有毒的結(jié)構(gòu)部分遞送到細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的位置。因此，所述vh結(jié)構(gòu)域?qū)⒂卸镜挠行ж?fù)載物導(dǎo)向靶細(xì)胞(其可以是癌細(xì)胞)，在其中所述有效負(fù)載物可以展現(xiàn)其細(xì)胞毒性活性并且殺傷所述細(xì)胞。所述有毒的結(jié)構(gòu)部分可以直接與vh結(jié)構(gòu)域融合。在另一個(gè)實(shí)例中，所述有毒的結(jié)構(gòu)部分可以直接或通過接頭與vh結(jié)構(gòu)域化學(xué)偶聯(lián)。所述接頭可以包括肽、寡肽、或多肽，它們中的任一種可以包含天然的或非天然的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)例中，所述接頭可以包括合成的接頭。所述接頭可以是可分裂的或不是可分裂的。典型地，接頭通過賴氨酸殘基的氨基、或通過半胱氨酸殘基上的硫醇基團(tuán)連接到抗原結(jié)合分子上。技術(shù)人員已知多種接頭，例如，這些記載在ducry等人，bioconjugatechem.2010，21，5-13和wo2004/01095中。這兩篇參考文獻(xiàn)通過引用都結(jié)合在本文中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，vh結(jié)構(gòu)域與fc區(qū)或其部分融合。在組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)vh結(jié)構(gòu)域線性融合在一起或通過本領(lǐng)域已知的方法偶聯(lián)或綴合。vh結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合相同的靶抗原或不同的抗原。由此，所述vh結(jié)構(gòu)域可以作為藥物用于治療疾病。由此，本發(fā)明涉及治療醫(yī)學(xué)病況的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本發(fā)明的vh結(jié)構(gòu)域。對(duì)使用根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的治療敏感的疾病包括，但不限于：傷口愈合，細(xì)胞增生病癥(cellproliferativedisorders)，包括贅生物(neoplasm)，黑素瘤(melanoma)，肺、結(jié)直腸、骨肉瘤(osteosarcoma)、直腸、卵巢、肉瘤(sarcoma)、子宮頸、食道、乳腺、胰腺、膀胱、頭頸和其他實(shí)體瘤；骨髓增生病癥(myeloproliferativedisorders)，諸如白血病(leukemia)，非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkinlymphoma)，白血球減少癥(leukopenia)，血小板減少癥(thrombocytopenia)，血管發(fā)生病癥(angiogenesisdisorder)，卡波西肉瘤(kaposis′sarcoma)；自身免疫/炎性病癥(autoimmune/inflammatorydisorders)，包括變態(tài)反應(yīng)(allergy)，炎性腸病(inflammatoryboweldisease)，關(guān)節(jié)炎(arthritis)，銀屑病(psoriasis)和呼吸道炎癥(respiratorytractinflammation)，哮喘(asthma)，免疫病癥(immunodisorders)和器官移植排斥(organtransplantrejection)；心血管和血管病癥(cardiovascularandvasculardisorders)，包括高血壓(hypertension)，水腫(oedema)，心絞痛(angina)，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)，血栓形成(thrombosis)，敗血癥(sepsis)，休克(shock)，再灌注損傷(reperfusioninjury)，和缺血(ischemia)；神經(jīng)病癥(neurologicaldisorders)，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(centralnervoussystemdisease)，阿爾茨海默病(alzheimer′sdisease)，腦損傷(braininjury)，肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis)，和疼痛(pain)；發(fā)育障礙(developmentaldisorders)；代謝紊亂(metabolicdisorders)，包括糖尿病(diabetesmellitus)，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)，和肥胖(obesity)，aids和腎??；傳染病，包括病毒感染，細(xì)菌感染，真菌感染和寄生蟲感染，與胎盤相關(guān)的病理學(xué)病癥和其他病理學(xué)病癥。適宜的給藥途徑是技術(shù)人員所知的。此外，本發(fā)明涉及缺少功能性ch1結(jié)構(gòu)域、包含人vh和小鼠恒定區(qū)的hcab。本發(fā)明包括本文之前參考附圖中的一幅或多幅所述的載體構(gòu)建體。在一方面，本發(fā)明涉及如圖10所示的載體。毫無疑問，技術(shù)人員將想到許多其他有效的備選方案。應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于所述的實(shí)施方案，并且包括對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的且在后附的權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)的改進(jìn)。本文提及的所有文件和公布通過引用都完全結(jié)合在本文中?！昂?或”在用于本文時(shí)應(yīng)該理解為具體公開了兩個(gè)特定的特征或成分中的每一個(gè)與或不與另一個(gè)。例如，“a和/或b”應(yīng)該理解為下述每一種的具體公開：(i)a，(ii)b和(iii)a與b，正如同每一種在本文中單獨(dú)所述一樣。除非上下文另外指明，上文所述的特征的描述和定義不限于本發(fā)明的任何特定的方面或?qū)嵤┓桨?，并且同等適用于所述的所有方面和實(shí)施方案。在下述非限制性實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1：yac的構(gòu)建1.1材料載體：pyac3(來自bruschi，icgeb，yeastmoleculargeneticsgroup，trieste，意大利)pynot(衍生自pyac3，用leu2標(biāo)記替代ura3。來自bruschi，icgeb，yeastmoleculargeneticsgroup，trieste，意大利)phtk(衍生自pynot，用his3標(biāo)記替代leu2)phkt-hy(插入到phkt中的潮霉素(hy)抗性基因)pyes1l(invitrogen)酵母菌株：ylbw1(hamer等人，1995)，ab1380(markie，2006).1.2將bac轉(zhuǎn)換成yacbac(環(huán)形形式的細(xì)菌人工染色體)是本領(lǐng)域公知的促進(jìn)大小為～150kbp-350kbp的dna節(jié)段的操作(例如，測(cè)序和克隆)的工具(methodsinmolecularbiology，卷54和349)。包含來源于人或小鼠的重鏈免疫球蛋白基因座的dna的bac有多種并且在本領(lǐng)域中是公知的。此類bac的實(shí)例(也在圖1和2中列出)包括，但不限于下述各項(xiàng)：人：·rp11-1065n8·rp11-659b19·rp11-14117·rp11-72n10·rp11-683l4·rp11-12f16鼠：·rp23-354l16·rp24-72m1本領(lǐng)域公知bac可以用于促進(jìn)包含重疊(互補(bǔ))序列的多個(gè)dna節(jié)段的順次分子結(jié)合，從而產(chǎn)生大得多的dna分子。用于實(shí)現(xiàn)此的一種這樣的方法，即bit(橋誘導(dǎo)的易位(bridgeinducedtranslocation))，需要首先必須在酵母中將bac轉(zhuǎn)換成非重疊的線性形式作為酵母人工染色體(yac)。通過轉(zhuǎn)化相關(guān)的重組(tar)克隆的bac轉(zhuǎn)換bac轉(zhuǎn)換和yac操作是本領(lǐng)域中記載的得到確認(rèn)的技術(shù)，例如，在y4cprotocols(methodsinmolecularbiology，卷54和349)中描述，其中詳細(xì)描述了關(guān)于營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記、酵母選擇、培養(yǎng)基、酵母轉(zhuǎn)化、yac篩選、yac轉(zhuǎn)移、yac修飾和擴(kuò)增的配方和方法。簡(jiǎn)言之，通過pcr擴(kuò)增兩個(gè)錨定序列，即錨定子1(a1)和錨定子2(a2)，其側(cè)連要從bac中保留用于后續(xù)連接的非重合序列，在pcr引物的末端具有改造的限制性位點(diǎn)(sali和sphi)，該位點(diǎn)用于克隆到pyac3(http：//genome-www.stanford.edu/vectordb/vector_descrip/complete/pyac3.seq.html)載體(圖3)中。關(guān)于所述錨定序列的設(shè)計(jì)要求在本領(lǐng)域中是公知的(例如，alasdairmackenzie，2006，yacprotocols，第2版)。將限制性酶消化的a1和a2順次克隆到pyac3(圖3)中。然后，將pyac3-a1-a2載體用sphi和bamhi消化，產(chǎn)生兩個(gè)yac臂，即a1-ura3-端粒和a2-著絲粒-trp1-端粒。用這兩個(gè)yac臂轉(zhuǎn)化攜帶原始bac的酵母，涂布在不含色氨酸和尿嘧啶的酵母培養(yǎng)基上，并且在30℃溫育三天。在所述錨的位置處的yac臂與bac之間的同源重組產(chǎn)生轉(zhuǎn)換的yac(圖4)。通過連接處的pcr以及通過關(guān)于尺寸的脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pfge)篩選轉(zhuǎn)化子中正確轉(zhuǎn)換的產(chǎn)物。然后通過bit組裝包含要連接的鄰近dna序列的非重合的yac。通過bit連接兩個(gè)非重合的yac通過向每個(gè)末端添加frt位點(diǎn)和特異性針對(duì)兩個(gè)yac末端的用于連接的65bp的yac同源序列片段而建立卡那霉素抗性基因kanr盒(圖5)。將該盒轉(zhuǎn)化到包含兩個(gè)要連接的yac的酵母中。通過pcr和dna印跡(southernblot)進(jìn)一步表征卡那霉素抗性克隆，以證實(shí)成功的連接。然后用flp重組酶選出kanr基因。將在連接區(qū)域的dna進(jìn)行測(cè)序，并且證實(shí)在該連接位點(diǎn)處存在含有frt序列的dna‘瘢痕’(dna‘scar’)。在yac操作的每個(gè)步驟，應(yīng)用pfge來證實(shí)yac的大小。利用包含來自原始人免疫球蛋白重鏈基因座的鄰近序列的yac的順次連接來產(chǎn)生多種yac構(gòu)建體，其分別具有人c-、d-和j-基因和增加數(shù)量的v-基因。1.3使用小鼠元件進(jìn)行c區(qū)構(gòu)建為了提高由yac構(gòu)建體驅(qū)動(dòng)的免疫應(yīng)答的效率，將它們隨后分別進(jìn)行修飾，以用鼠重鏈恒定區(qū)的元件替換人c-區(qū)基因。利用酵母占用并且有效地重組重合的dna片段的能力(gibson等人，2008)，使用多個(gè)重合片段將鼠μ增強(qiáng)子、鼠μ轉(zhuǎn)換和鼠恒定γ1基因(后者缺失ch1結(jié)構(gòu)域)添加到最后的人j基因的3’端，從而產(chǎn)生具有單個(gè)恒定基因的yac構(gòu)建體。隨后，采用相似的方法產(chǎn)生包含多個(gè)全部缺失ch1結(jié)構(gòu)域的鼠恒定基因cγ1、cγ2b和cγ2a的yac構(gòu)建體。1.3.1具有單個(gè)鼠c-基因的yac制備用于酵母轉(zhuǎn)化的dna片段小鼠μ增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)換μ元件正向引物：gacattctgccattgtgattactactactactacggtatggacgtctgggggcaagggaccacggtcaccgtctcctcaggtaagaat(seqidno.1)。該引物的前69bp來自人j6(id：j00256，http：//www.imgt.org/imgtlect/？query＝201+j00256)。該引物的后24bp與在j43’的小鼠序列互補(bǔ)。反向引物：ttgaggaccagagagggataaaagagaaatg(seqidno.2)，該引物與小鼠ighμch15’的區(qū)域反向互補(bǔ)(圖6)。使用bacrp23-354l16作為模板，利用這兩種引物pcr，產(chǎn)生5.8kb的片段，該片段涵蓋小鼠μ增強(qiáng)子和μ轉(zhuǎn)換區(qū)，一個(gè)末端與人j6區(qū)同源。具有缺失的ch1的小鼠cγ1基因正向引物：agaggacgtatagggaggaggggttc(seqidno.3)；反向引物：aacaccttcagcgatgcagac(seqidno.4)。使用bacrp23-354l16作為模板利用這兩個(gè)引物的7.8kbpcr產(chǎn)物涵蓋除ch1外顯子外的完整的小鼠cγ1轉(zhuǎn)錄區(qū)(圖7)。橋接非重合的eμ、cγ1和yac臂片段的接頭用于eμ和cγ1片段的接頭1：tcatgcccctagagttggctgaagggccagatccacctactctagaggcatctctccctgtctgtgaaggcttccaaagtcacgttcctgtggctagaaggcagctccatagccctgctgcagtttcgtcctgtataccaggttcacctactaccatatctagccctgcctgccttaagagtagcaacaaggaaatagcagggtgtagagggatctcctgtctgacaggaggcaagaagacagattcttacccctccatttctcttttatccctctctggtcctcagaagaggacgtatagggaggaggggttcactagaggtgaggctcaagccattagcctgcctaaaccaaccaggctggacagccatcaccaggaaatggatctcagcccagaagatcgaaagttgttcttctcccttctggagatttctatgtcctttacactcattggttaatatcctgggttggattcccacacatcttgacaaacagagacaattgagtatcaccagccaaaagtcatacccaaaaacagcctggcat(seqidno.5)。為了制備接頭1，使用bacrp23-354l16作為模板，合成pcr1(313bp，引物1f：tcatgcccctagagttggctg；引物1r：gaacccctcctccctatacgtcctctttgaggaccagagagggataaaagagaaatg(seqidno.6))和pcr2(258bp，引物2f：agaggacgtatagggaggaggggttc(seqidno.7)；引物2r：atgccaggctgtttttgggta(seqidno.8))。使用引物1f和引物2r通過融合pcr將具有重合序列的pcr1和pcr2組裝成接頭1。用于cγ1和yac臂片段的接頭2：tacatcttttttcctctctgtctgcatcgctgaaggtgtttcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaact(seqidno.9)yac臂通過用pshai和bamhi限制性酶消化pynot載體(圖8，衍生自pyac3，用leu2標(biāo)記替換ura3)產(chǎn)生5.7kb具有l(wèi)eu2基因標(biāo)記的yac臂。通過酵母同源重組用小鼠c-區(qū)替換人c-區(qū)使用酵母原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化(sanchez和lanzer，2006)，將5個(gè)片段(鼠eμ，鼠cγ1，yac臂，接頭1和接頭2)引入到攜帶包含人c-區(qū)的yac的酵母ylbw1菌株中。在不含色氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。在人j6處的重合序列之間的同源重組導(dǎo)致小鼠eμ和cγ1替換了人基因。通過連接位點(diǎn)的pcr和測(cè)序表征新的yac。添加3’增強(qiáng)子將42kb的3’增強(qiáng)子片段克隆到bac-yac載體中小鼠3’增強(qiáng)子包含元件hs3a，hs1.2，hs3b，hs4，hs5，hs6和hs7，這些元件分散在最后的恒定基因cα的3’的42kb區(qū)域內(nèi)。為了向cγ1基因的3’位點(diǎn)添加完整的增強(qiáng)子，按照invitrogen提供的使用說明，將涵蓋所有增強(qiáng)子元件的42kbmfei片段亞克隆到bac-yac載體pyes1l(invitrogen)中。將該構(gòu)建體通過pcr、pfge和測(cè)序進(jìn)行充分表征。mfei消化從所述載體釋放該42kb片段，用于后續(xù)的酵母轉(zhuǎn)化。制備潮霉素-his3yac臂通過向phkt(衍生自pynot，用his3標(biāo)記替換leu2)中插入潮霉素(hy)抗性基因而構(gòu)建yac載體(phkt-hy，圖9)。用spei和bamhi雙重消化該載體產(chǎn)生6.2kb的包含hy-his3-端粒的yac臂片段。橋接3’增強(qiáng)子片段與小鼠cγ1基因以及hy-his3yac臂的接頭用于小鼠cγ1和42kb3’增強(qiáng)子的接頭1(626bp)acggctcaggaggaaaaggcactctgtgtggagctcttcagtgggtatgaaatggtgatggagaagcccaggtgcactgaaaatccaggagctgaatttgatcaccaggacgcatatggtagagaggaaaatgaattgattcccaaatgttctcctctatgtgtgcaccgtggcatgtgcatgcacacaattacacataaacacattcaacataaatacaacacacatatacacgctgcacacacatacacacacagaacacacaccacacacacacaccacacacaatcacacacatattccacacagtacaccacaaacatctatacacaccacacacacacagacacacacacacacacattcatacacagcacaacacaaacatctatacacaacacacacacaatacacatagtcacacgcatattcactcacacacatattcacccacacacaatcatacatagacacattcaacataaacacaacaccacacacacacacacttgcacacacaaatgtaatgatttttttaaggactacatcttttttcctctctgtctgcatcgctgaaggtgttcaattgccaaaatcacaggtgagcccagatgcatacccgggac(seqidno.10)。為了制備接頭1，使用bacrp23-354l16作為模板，合成pcr1(604bp，引物1f：acggctcaggaggaaaaggcac(seqidno.11)；引物1r：tcacctgtgattttggcaattgaacaccttcagcgatgcagac(seoidno.12))。然后通過引物1f和引物r：gtcccgggtatgcatctgggctcacctgtgattttggcaattg(seqidno.13)，將pcr1延伸至626bp。用于42kb3’增強(qiáng)子和hy-his3yac臂的接頭2(766bp)gaggtacagggggctcatgggtttataagttcaggtttataccaaggtttcggggggtagcctgaggctcatgtaccttcttgtggtagcccccaggttctgtgcatggtactgctcagttactggcatggcttctgggaaggctgggctcccacgtcccctgtggacacatggttacgccaagaacagaactacaaagttaggagttaccattcccacctgcacctgtatctccagtacctgggtttctaagacgtagtgagtcctcttgccaaccagggtctgccacaatggtcaggcacagctgtgggccggtcagccccatcaggtcacaccagcaggtcccaggagcacagagcttaaatgccccctagtgtccctagtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgc(seqidno.14)。為了制備接頭2，使用bacrp23-354l16和bacrp24-72m1作為模板，分別合成pcr1(379bp，引物1f：gaggtacagggggctcatgggt(seqidno.15)；引物1r：agcctcactagggacactagggggcatttaagc(seqidno.16))和pcr2(387bp，引物2f：ccctagtgtccctagtgaggctccggtgcccgt(seqidno.17)；引物2r：gcgcaaggcctcgaactctc(seqidno.18))。使用引物1f和引物2r通過融合pcr組裝具有重合序列的pcr1和pcr2，產(chǎn)生接頭2。酵母轉(zhuǎn)化通過酵母原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化，將4個(gè)片段(3’增強(qiáng)子，hy-his3-端粒yac臂，接頭1和接頭2)引入到含有yac的酵母ylbw1株中，用于添加3’增強(qiáng)子。在不含色氨酸和組氨酸的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。所述重合片段之間的同源重組導(dǎo)致對(duì)所選的yac添加3’增強(qiáng)子和hy-his3-端粒臂，產(chǎn)生crescendoyac1或yac2(圖10)。通過連接位點(diǎn)的pcr和測(cè)序表征新的yac。通過pfge和dna印跡驗(yàn)證新的yac的大小。1.3.2具有多個(gè)恒定基因的yac除了包含小鼠cγ1基因的yac之外，設(shè)計(jì)其他yac，從而包含多種恒定基因-小鼠恒定基因cγ1、cγ2b和cγ2a，它們?nèi)烤哂腥笔У腸h1結(jié)構(gòu)域(圖10)。產(chǎn)生45kb包含缺失的cn1的cγ2b和cγ2a的片段。使用下文列出的引物，使用rp24-72m1作為模板，擴(kuò)增7個(gè)重合pcr片段。通過融合pcr合成片段3，其具有cγ2b(缺失ch1)；并且通過融合pcr合成片段6，其具有cγ2a(缺失ch1)。用于7次pcr的引物：片段1：45k-18057bp正向：ggttggattctatcttcgcatgg(seqidno.19)反向：tgggtcctgtctttctacctttg(seqidno.20)片段2：45k-28304bp正向：gctccttgctgggtcttaatgtt(seqidno.21)反向：ttagaaccgtgtcttctacaattga(seqidno.22)片段3：45k-31.3kbch1δ45k-3-左正向：gggtaggaggttgttggtta(seqidno.23)反向：cccgctgggctctgcaagagaggagaatgtgtga(seqidno.24)45k-3-右正向：ctctcttgcagagcccagcgggcccatttca(seqidno.25)反向：gcttgtttttatatcgagcttgc(seqidno.26)片段4：45k-48412bp正向：tcagtctcacttgcctggtcgt(seqidno.27)反向：ctttgtagcacatgcgtcatcc(seqidno.28)片段5：45k-59012bp正向：tgaaggcatgaaggagttgagc(seqidno.29)反向：acaaccccctatcctacacatt(seqidno.30)片段6：45k-62274bch1δ45k-6-左正向：gggtcctggcaacattagcg(seqidno.31)反向：cactctgggctctgcaagaaaggaggatgtgtga(seqidno.32)45k-6-右正向：ctttcttgcagagcccagagtgcccataacac(seqidno.33)反向：tggtgttcagcaggctaatttg(seqidno.34)片段7：45k-79968bp正向：caggccccacttctttacctaa(seqidno.35)反向：ttgttagttcatcacagggcaattc(seqidno.36)將這7個(gè)pcr產(chǎn)物和在末端具有針對(duì)片段1和7的重合序列的線性化bac-yac載體轉(zhuǎn)化到酵母中進(jìn)行同源重組。通過連接物的pcr、pfge和測(cè)序證實(shí)45kb-yac。pmei限制性酶從環(huán)形yac中釋放該45kb片段。產(chǎn)生58kb包含缺失cii1的cγ1、cγ2b和cγ2a的片段。將小鼠μ增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)換μ片段、具有缺失的ch1和接頭1的cγ1片段(1.3.1)、45kb含有cγ2b和cγ2a的pmei限制性片段和在末端具有與μ增強(qiáng)子片段的5’和與所述45kb片段的3’重合的序列的線性的bac-yac載體轉(zhuǎn)化到酵母中，用于同源重組。通過連接物的pcr、pfge和測(cè)序證實(shí)58kb-yac。pmei限制性酶從環(huán)形yac中釋放該58kb片段。具有多個(gè)恒定基因的yac的酵母轉(zhuǎn)化通過原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化，將包含yac的酵母中引入兩個(gè)片段，即一個(gè)是包含cγ1-cγ2b-cγ2a的58kb片段，另一個(gè)是具有與所述58kb片段的3’末端的重合序列的yac臂，目的是添加cγ1-cγ2b-cγ2a基因。依賴于在yac臂上攜帶的營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記，在去除氨基酸的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。重合的片段之間的同源重組導(dǎo)致在所選的yac中添加所述cγ1-cγ2b-cγ2a片段和新的yac臂。新的yac通過連接位點(diǎn)的pcr和測(cè)序進(jìn)行表征。新的yac的大小通過pfge和dna印跡進(jìn)行證實(shí)。隨后，添加42kb的小鼠3’增強(qiáng)子(如上文所述)，產(chǎn)生crescendoyac3(圖10)。實(shí)施例2：敲除小鼠的產(chǎn)生用于沉默小鼠重鏈基因座(wo2004/076618+ren，l.，等人，genomics84(2004)，686-695)、小鼠λ基因座(zou，x.，等人，eji，1995，25，2154-2162和wo2003/000737)和κ基因座(zou，x.，等人，ji2003170，1354-1361和wo2003/000737)的方法在之前已有記載。簡(jiǎn)言之，小鼠重鏈恒定區(qū)和小鼠λ鏈基因座的大規(guī)模缺失導(dǎo)致這兩種免疫球蛋白鏈的沉默。κ輕鏈通過新霉素抗性盒的靶向插入而被沉默。a)重鏈和輕鏈ko小鼠的雜交通過常規(guī)育種產(chǎn)生內(nèi)源性輕鏈(κ和λ)雙重沉默的小鼠(zou，x.，等人，ji2003170，1354-1361)。這些輕鏈-ko小鼠進(jìn)一步與重鏈ko小鼠繁育產(chǎn)生三重雜合子動(dòng)物，用于繁殖產(chǎn)生三重敲除(tko)品系。證明該品系是可育的，并且保持為純育品系。b)雜交后代的基因分型設(shè)計(jì)引物，以允許對(duì)內(nèi)源性重鏈、κ和λ輕鏈區(qū)域中的每一個(gè)區(qū)分野生型和沉默的基因座。從取自幼仔的尾或耳活組織檢查樣品提取基因組dna并在pcr反應(yīng)內(nèi)用作模板dna。gdna使用充分描述的方法(例如，使用viagen直接pcr裂解試劑(viagendirectpcrlysisreagent)(尾)目錄號(hào)102-t，按照供應(yīng)商的使用說明)提取。在pcr反應(yīng)中使用下述引物(購(gòu)自sigma)：重鏈引物pcr產(chǎn)物大?。簑t：1027bpko：613bphet：1027和613bpκ引物tpmokforccatcttcccaccatccagtgagc(seqidno.40)tpmokrevgcaacagtggtaggtcgcttgtgg(seqidno.41)κpcr產(chǎn)物大小：wt：400bpko：1700bphet：400bp和1700bpλ引物lj2bfwggagatcaggaatgagggacaaac(seqidno.42)lc1rvgcctttcccatgctcttgctg(seqidno.43)lamgenwtrev2ggcaggaaagaagggttaagat(seqidno.44)λpcr產(chǎn)物大?。簑t：1127bpko：686bphet：1127bp和686bp這些引物可以與多種dna聚合酶和緩沖液一起使用，并且可以調(diào)整循環(huán)條件以適應(yīng)特定的酶。作為一個(gè)實(shí)例，可以如下所述使用fermentasdreamtaq-readymix(#k1081)：ul/反應(yīng)2xdreamtaq10引物(10um)每種0.2(x5)加h2o至19ul8反應(yīng)使用1ul的模板。在待基因分型的樣品中總是包括陽(yáng)性對(duì)照和水對(duì)照。對(duì)于這種特定的酶，使用下述循環(huán)條件：pcr反應(yīng)后，在1％瓊脂糖凝膠上電泳之后使用dna染色顯現(xiàn)產(chǎn)物。圖11顯示了從2只具有野生型(wt)、重鏈ko、輕鏈ko或tko基因型的動(dòng)物提取的基因組dna的代表性基因分型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。c)在tko小鼠中缺少內(nèi)源性免疫球蛋白的表達(dá)使用特異性針對(duì)小鼠重鏈、重鏈/輕鏈復(fù)合物和輕鏈的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)證實(shí)tko小鼠的無效表型(nullphenotype)。簡(jiǎn)言之，將免疫吸附平板(例如，nuncmaxisorb96f孔平板，目錄號(hào)443404)用稀釋在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中的5ug/ml的捕獲抗體溶液包被。用pbs/0.05％吐溫、pbs洗滌并用3％奶粉溶液封閉后，將血清稀釋液(在3％奶粉/pbs中)應(yīng)用到所述平板上。洗掉未結(jié)合的蛋白后，使用適當(dāng)?shù)纳锼鼗?檢測(cè)抗體溶液(以預(yù)先確定的最佳稀釋液使用)檢測(cè)結(jié)合的蛋白，然后用中性親和素(neutravidin)-hrp顯現(xiàn)。多種可商購(gòu)的抗體可以用于這些elisa。表1給出了此類抗體的實(shí)例。表1用于elisa的抗體如在圖12中所示，證明tko小鼠沒有可檢測(cè)的內(nèi)源性免疫球蛋白鏈。測(cè)定了來自2只野生型和2只tko小鼠中的每一只的血清樣品。d)es細(xì)胞的分離和培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的分離已有記載(ying，q.l.等人，nature，453，519-523，2008，nichols，j.等人，development，1136，3215-3222，2009，nagy，k.&nichols，j.，“derivationofmurineescelllines”，第431-455頁(yè)，在“advancedprotocolsforanimaltransgenesis”.anisttmanual.ed.shirleypease&thomasl.saunders中)。2i方法利用阻斷fgf/erk信號(hào)傳導(dǎo)途徑的小分子抑制劑，將es細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)。并且，在包含這些抑制劑的培養(yǎng)基中溫育早期胚胎將胚胎的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)(intracellularmass)轉(zhuǎn)向上胚層譜系，阻礙分化誘導(dǎo)的下胚層的發(fā)育。這提供了富集的上胚層區(qū)室，由此能夠更容易地衍生出es細(xì)胞系。es細(xì)胞系已經(jīng)來源于tko胚胎。如在引用的方法中所定義那樣，將早期tko胚胎由冷凍保藏解凍并且培養(yǎng)，直到它們達(dá)到胚泡期。然后，在釋放上胚層之前，將它們?cè)倥囵B(yǎng)2天，上胚層的釋放通過使用抗-小鼠血清和補(bǔ)體去除滋養(yǎng)外胚層而實(shí)現(xiàn)。然后，在胰蛋白酶溶液中去聚集和擴(kuò)增得到的es細(xì)胞系之前，將上胚層擴(kuò)增。用于es細(xì)胞系和克隆增殖的培養(yǎng)基是充分描述的。在本情形中，將es細(xì)胞系保持在2i培養(yǎng)基中，或者隔離到(weanedonto)補(bǔ)充有l(wèi)if和血清的培養(yǎng)基。實(shí)施例3：轉(zhuǎn)基因發(fā)生a)原核顯微注射原核顯微注射dna產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)是充分記載的(例如，參見k.becker&b.jerchow“generationoftransgenicmicebypronuclearmicroinjection”第99-115頁(yè)，在“advancedprotocolsforanimaltransgenesis”.anisttmanual.ed.shirleypease&thomasl.saunders.springerprotocols2011中)。簡(jiǎn)言之，從已經(jīng)與配種雄性交配的超排卵的雌性小鼠分離受精的卵母細(xì)胞。為了提供超排卵，在第-2天，對(duì)雌性腹膜內(nèi)注射100ul含有5i.u.懷孕母體血清促性腺素(pregnantmare’sserumgonagotropin，pmsg)的pbs。46-48小時(shí)后，施用(腹膜內(nèi)(i.p.))在100ulpbs中的5i.u.人絨毛膜促性腺素(hcg)，并且使雌性與配種雄性交配。次日上午，從收集的輸卵管采集卵匠復(fù)合物(cumuluscomplexes)并通過用透明質(zhì)酸酶溶液消化而釋放卵母細(xì)胞?？梢猿晒Φ厥褂枚喾N小鼠品系來產(chǎn)生用于顯微注射的受精卵母細(xì)胞。使用c57bl6xcbaf2野生型(wt)小鼠，采用上述程序引入純化的yacdna。如在轉(zhuǎn)基因發(fā)生概括(圖13)中所示，當(dāng)使用tko小鼠時(shí)，采用類似的程序。為了促進(jìn)它們的純化以用于顯微注射，將yac轉(zhuǎn)化到所謂的‘窗口’菌株酵母中(hamer等人，pnas，1995，92(25)，11706-10)。‘窗口’菌株酵母是利用內(nèi)源性染色體的策略性分裂產(chǎn)生的一系列宿主酵母，使得在進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，過客yac以不含酵母內(nèi)源性染色體的尺寸遷移。備選地，適當(dāng)?shù)摹按翱凇笔鞘褂眠m當(dāng)?shù)囊锖蚿cr策略分裂酵母染色體從頭產(chǎn)生的。由此，使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pfge)，然后第二凝膠電泳洗脫過程，來純化用于顯微注射的yac。該程序由a.fernandez，d.munoz&l.montoliu記載在“generationoftransgenicanimalsbyuseofyacs(使用yac產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)”中，在“advancedprotocolsforanimaltransgenesis”(anisttmanual.ed.shirleypease&thomasl.saunders.springerprotocols2011)中第137-158頁(yè)。在收集受精的卵母細(xì)胞后，使用拉玻璃制成的顯微注射針將純化的yacdna溶液注射到原核中。所有的工作都在帶有加熱臺(tái)并且封固在隔振臺(tái)上的顯微鏡下使用顯微操作器進(jìn)行。顯微注射后，允許卵母細(xì)胞恢復(fù)多至24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到假孕代孕母親的輸卵管中。假孕的雌性通過在轉(zhuǎn)移日期前24小時(shí)將雌性與切除輸精管的配種雄性交配而產(chǎn)生。幼仔通常在19-21天后分娩。由于它們的大小，yac的顯微注射是一個(gè)要求高的過程，并且插入效率低于使用較小的bac或質(zhì)粒所觀察到的效率。表2總結(jié)了來源于使用2個(gè)相關(guān)的yac構(gòu)建體進(jìn)行的顯微注射項(xiàng)目的統(tǒng)計(jì)學(xué)。表2經(jīng)由原核顯微注射純化的yac的轉(zhuǎn)基因發(fā)生b.es細(xì)胞存在將yac構(gòu)建體引入到es細(xì)胞中的多種途徑(下文所述)。不管選擇哪種途徑，目的是獲得已經(jīng)成功整合了轉(zhuǎn)基因的es克隆。與原核顯微注射技術(shù)相比，es-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的優(yōu)點(diǎn)在于，es克隆能夠在它們用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因品系之前被充分表征。對(duì)es克隆進(jìn)行的表征基本上與用于篩選來源于原核注射的f0和f1動(dòng)物的那些(見下文)相同。還可以應(yīng)用原位雜交來確定整合的染色體。如果es細(xì)胞是野生型的而不是tko的，這可能是部分合乎需要的；僅有在缺少內(nèi)源性小鼠免疫球蛋白基因座的染色體上整合了yac的es克隆將被選擇用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因品系。這種預(yù)先選擇將確保不存在可能妨礙與tko背景有效回交的連鎖的基因座。今后，支持es細(xì)胞體外分化為b細(xì)胞譜系的過程的研發(fā)可以允許在轉(zhuǎn)基因發(fā)生之前功能性檢測(cè)引入的轉(zhuǎn)基因基因座。然而，目前，這在技術(shù)上是不可行的。i)純化的yac的轉(zhuǎn)染yac可以基本上如之前所述進(jìn)行純化((參見上文，“用于顯微注射的yac的制備”)。例如，使用脂轉(zhuǎn)染(例如，使用invitrogenlipofectamine試劑)將純化的yac引入到es細(xì)胞中，然后使用潮霉素(可以使用備選的選擇試劑，如yac設(shè)計(jì)所示)對(duì)所述es細(xì)胞進(jìn)行選擇。挑取并篩選克隆，使用適當(dāng)?shù)目寺懋a(chǎn)生轉(zhuǎn)基因品系。可以將多種特征引入到構(gòu)建體和/或靶向的es細(xì)胞中，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)染的es克隆的衍生(參見下文)。ii)原生質(zhì)球融合方法一種將yac引入到es細(xì)胞中的備選方法是通過原生質(zhì)球融合。該方法提供這樣的優(yōu)點(diǎn)：使大構(gòu)建體的操作減至最少，由此限制通過剪切對(duì)構(gòu)建體發(fā)生損害的可能性。原生質(zhì)球融合技術(shù)已有記述(davies，n.，等人，“humanantibodyrepertoiresintransgenicmice：manipulationandtransferofyacs(在轉(zhuǎn)基因小鼠中的人抗體組庫(kù)：yac的操作和轉(zhuǎn)移)”第59-76頁(yè)，在“antibodyengineering.apracticalapproach(抗體改造。實(shí)踐方法)”中，mccafferty等人編，irlpressatoxforduniversitypress，1996)。簡(jiǎn)言之，通過酶解酶(zymolyase)消化酵母細(xì)胞壁產(chǎn)生酵母原生質(zhì)球。將去聚集的es細(xì)胞與該原生質(zhì)球混合，并且通過加入聚乙二醇溶液而實(shí)現(xiàn)融合。在重懸在培養(yǎng)基中后，洗滌es細(xì)胞，并如下文所述進(jìn)行選擇培養(yǎng)、克隆和篩選。iii)tg/tkoes細(xì)胞的靶向建立向yac1轉(zhuǎn)基因(其包含所有后續(xù)yac構(gòu)建體所共有的核心結(jié)構(gòu))中加入另外的特征的備選策略，是進(jìn)行位于es細(xì)胞系中的yac1轉(zhuǎn)基因的靶向延伸(圖14)。攜帶yac1轉(zhuǎn)基因的es細(xì)胞系在體外產(chǎn)生或來源于yac1轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎。新的特征可以通過同源重組或使用本文其他地方所述的插入載體而引入到轉(zhuǎn)基因中。實(shí)施例4：建立者的表征和篩選a)轉(zhuǎn)基因的存在和種系傳遞檢查所有在轉(zhuǎn)移顯微注射的卵母細(xì)胞后出生的幼仔在它們的基因組dna中是否存在yac。對(duì)于es細(xì)胞-來源的轉(zhuǎn)基因幼仔，也可以利用毛色遺傳與適當(dāng)?shù)呐吲莨w動(dòng)物的選擇組合，以允許根據(jù)它們的毛皮顏色容易地鑒定嵌合的幼仔。下述篩選實(shí)例使用來源于原核顯微注射轉(zhuǎn)基因發(fā)生的同窩仔。然而，可以在轉(zhuǎn)基因發(fā)生之前對(duì)es克隆進(jìn)行類似的分析，對(duì)得到的同窩仔進(jìn)行篩選以得到確定的結(jié)果。yac轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)涉及從尾或耳組織活檢樣品中純化gdna和使用pcr反應(yīng)檢測(cè)yac的多個(gè)區(qū)域。gdna的分離和pcr方法之前已有記載(參見上文)。進(jìn)行靶向yac的每個(gè)末端的區(qū)域的pcr反應(yīng)，然后使用設(shè)計(jì)用來擴(kuò)增yac轉(zhuǎn)基因的不同內(nèi)部區(qū)域的其他引物篩選具有針對(duì)兩個(gè)區(qū)域的陽(yáng)性整合體的任意樣品。在表3中列出了用于這些篩選的pcr引物。然后，使任意給出pcr陽(yáng)性結(jié)果的建立者小鼠(f0)交配，以檢查轉(zhuǎn)基因的種系傳遞，并且還用以證明pcr篩選結(jié)果是由于完整的yac的存在而不是片段的存在；在后一種情形中，最可能的情景是所述片段位于不同的染色體上，并且由此通過它們?cè)趂1代中獨(dú)立的分離而鑒定出來。篩選建立者及其種系傳遞的一個(gè)實(shí)例顯示在圖15中。表3用于篩選轉(zhuǎn)基因的存在和種系傳遞的pcr引物b)yac轉(zhuǎn)基因的指紋分析在所有的情形中，轉(zhuǎn)基因基因座攜帶人基因組dna序列。因此，可能篩選人dnaalu元件g15n2(genbankx55929.1)的存在，該元件是存在于人序列中的重復(fù)基序。用限制性酶消化人gdna的給定區(qū)域在使用alu探針進(jìn)行dna印跡分析后產(chǎn)生特有的條帶模式。由此，將yac的alu指紋與由提取自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的gdna獲得的那些進(jìn)行比較，以提供轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)完整性的指示。預(yù)測(cè)完整的yac轉(zhuǎn)基因提供與在酵母中存在的yac相似的指紋。所述alu探針使用下述引物由克隆的序列(genbankx55929.1)或gdna制備：下述循環(huán)條件是：將探針用放射性或非放射性方法標(biāo)記(例如，在pcr步驟過程中使用dig探針合成試劑盒(rochecat#11636090910)，以添加dig-dutp殘基)。然后，通過加入堿性磷酸酶-標(biāo)記的抗-洋地黃毒苷抗體，接著加入適當(dāng)?shù)牡孜?例如，cdp-star發(fā)光底物，sigmac0712)，調(diào)控探測(cè)的-dna印跡的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。c)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)可能的是，在轉(zhuǎn)基因小鼠(或選擇的es克隆)的基因組中可能存在多于一個(gè)拷貝的yac。這可以存在于不同的整合位點(diǎn)或者以重復(fù)方式存在于單個(gè)染色體位置。獨(dú)立分離的整合位點(diǎn)的數(shù)目可以由基因遺傳模式和孟德爾遺傳學(xué)應(yīng)用的研究推導(dǎo)。例如，單個(gè)整合位點(diǎn)將導(dǎo)致后代中50％的遺傳模式，而2個(gè)整合位點(diǎn)將產(chǎn)生3∶1的轉(zhuǎn)基因∶非轉(zhuǎn)基因遺傳。使用基于q-pcr的方法利用看家基因的pcr反應(yīng)來比較來自yac的區(qū)域的擴(kuò)增子的相對(duì)量。使用多路反應(yīng)進(jìn)行拷貝數(shù)評(píng)估，在所述多路反應(yīng)中使用獨(dú)立的染料報(bào)告參比擴(kuò)增子和轉(zhuǎn)基因擴(kuò)增子。例如，使用taqman探針技術(shù)(或適當(dāng)?shù)膫溥x方案)，其使用對(duì)看家二倍體基因(例如，小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；invitrogen目錄號(hào)4458366)和yac的區(qū)域(例如，轉(zhuǎn)基因的人j區(qū)；taqman拷貝數(shù)測(cè)定idhs03892805_cn或潮霉素選擇基因；測(cè)定idmr00661678)特異性的測(cè)定。對(duì)于這些反應(yīng)，使用可商購(gòu)的試劑(例如，taqman基因分型主混合物(taqmangenotypingmastermix)400rxns，目錄號(hào)4371355)使用基于供應(yīng)商所推薦的那些的條件設(shè)置q-pcr，并且在同一個(gè)pcr反應(yīng)中測(cè)量每個(gè)擴(kuò)增子的ct值?？截悢?shù)分析的實(shí)例顯示在圖16中。在該實(shí)例中，顯示了來自對(duì)yac2雜合的(單拷貝整合體)或?qū)ac2轉(zhuǎn)基因純合的(2個(gè)拷貝)小鼠的dna的q-pcr分析。實(shí)施例5：針對(duì)tko的育種a)常規(guī)育種將在野生型背景上產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠與tko品系回交，從而將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到該需要的背景下。這通過常規(guī)育種使用順次的育種步驟實(shí)現(xiàn)，選擇仔細(xì)基因分型的后代用于每個(gè)育種計(jì)劃。b)結(jié)合ivf的回交將轉(zhuǎn)基因品系帶到tko背景是一個(gè)長(zhǎng)時(shí)間的過程，每一輪育種需要9-12周完成。然而，使用ivf將育種擴(kuò)大到這樣的規(guī)模：仔細(xì)安排時(shí)間，可以在從tg/wt與tko品系的初始交配起的～15周內(nèi)完成回交，提供相當(dāng)大的tg/tko幼仔團(tuán)體。表5包含來自所述ivf-增強(qiáng)的育種項(xiàng)目的數(shù)據(jù)。可以使用類似的ivf步驟快速擴(kuò)展已經(jīng)在tko背景上產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因品系(例如，從tko/es細(xì)胞或從原核顯微注射到tko卵母細(xì)胞)。確定允許tko小鼠用于提供大量用來用來源于轉(zhuǎn)基因供體雄性小鼠的精子受精的卵母細(xì)胞的條件。簡(jiǎn)言之，將8-12周齡的雌性小鼠用激素處理，以誘導(dǎo)超排卵(見實(shí)施例3)。將卵母細(xì)胞用來自配種轉(zhuǎn)基因雄性的精子受精，并且將受精的卵母細(xì)胞在4-24小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)移到假孕雌體中或冷凍保藏用于以后的轉(zhuǎn)移。表5來自yac1品系的ivf育種的數(shù)據(jù)實(shí)施例6：轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的評(píng)價(jià)在b細(xì)胞發(fā)育過程中，發(fā)生免疫球蛋白基因座的體細(xì)胞重組，產(chǎn)生抗體組庫(kù)(例如，關(guān)于綜述參見kubyimmunology，第六版；t.j.kindt，r.a.goldsby，b.a.osborne，jkuby.由w.h.freemanandcompany出版，newyork，2007.)。對(duì)于重鏈，該過程涉及v-d-j區(qū)重組。這些基因節(jié)段的不精確連接增加了天然組庫(kù)的潛在可獲得的多樣性。剪接的vdj基因片段產(chǎn)生vh結(jié)構(gòu)域并且這與由恒定區(qū)基因編碼的其他結(jié)構(gòu)域連接。重排的gdna在b細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生rna轉(zhuǎn)錄物，并且這些被翻譯，提供膜表達(dá)的和分泌的hcab分子二者。由此，當(dāng)尋找yac轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄物的功能活性時(shí)，對(duì)b細(xì)胞和血清蛋白二者進(jìn)行測(cè)定。以下部分描述可以用于確定引入的轉(zhuǎn)基因是否是功能性的多種分子、蛋白和細(xì)胞測(cè)定中的一些。a)分子分析；轉(zhuǎn)錄物-rt-pcr，克隆和測(cè)序淋巴樣品獲自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，血液樣品，脾)。使用可商購(gòu)的試劑(例如，rneasyqiagen試劑盒，目錄號(hào)74106)從所述淋巴樣品分離rna，并用適當(dāng)?shù)囊?下文詳述)或寡dt(oligodt)引物(gibco)用supercriptiii酶(gibco)反轉(zhuǎn)錄。所有相關(guān)的緩沖液和條件如供應(yīng)商所推薦的。使用對(duì)vh結(jié)構(gòu)域特異性的引物(一些具有改變，用于以后的文庫(kù)產(chǎn)生(onwardlibrarygeneration)-見下文)或使用用于vh前導(dǎo)序列和恒定區(qū)的引物(表6)，將由此得到的cdna用在pcr反應(yīng)中，從而擴(kuò)增vh區(qū)。表6用于轉(zhuǎn)基因小鼠分析的引物在下述實(shí)施例中，pcr反應(yīng)使用校正酶(proof-readerenzymes)(例如，phusion高保真度dna聚合酶，目錄號(hào)f530s)和“遞降”pcr循環(huán)條件。實(shí)例遞降程序；純化pcr產(chǎn)物并克隆到可商購(gòu)的克隆載體(例如pjet1.2，fermentask1231)中或在克隆到噬菌粒載體中之前用ncoi和xhoi消化或利用基于pcr的克隆策略結(jié)合到噬菌粒載體中(關(guān)于噬菌粒載體的詳情參見圖17和下文)。對(duì)克隆測(cè)序并分析，以確定是否存在來源于所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄物。由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆的轉(zhuǎn)錄物的實(shí)例顯示在圖18中。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中vh組庫(kù)的可用的多樣性還可以由所述序列分析估測(cè)(盡管可能例如由取樣過程或包括特定的pcr擴(kuò)增步驟導(dǎo)致偏見)。在圖19所示的實(shí)例中，從個(gè)體未免疫轉(zhuǎn)基因小鼠克隆vh。清楚的是，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物攜帶多樣性的b細(xì)胞組庫(kù)，盡管在克隆步驟中使用聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增，但是發(fā)現(xiàn)很少?gòu)?fù)本序列。根據(jù)該單個(gè)小鼠分析，寬范圍的cdr3長(zhǎng)度是明顯的。將序列與種系vh序列比較，并且構(gòu)建變異性圖。來源于未免疫小鼠的vh主要是種系的，在cdr3區(qū)之外很少變異。除了上述常規(guī)克隆和測(cè)序之外，例如，可以使用下一代測(cè)序來分析vh組庫(kù)，從而探尋轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄物組。b)蛋白分析-血清e(cuò)lisa夾心elisa技術(shù)在之前已有記載(參見tko小鼠的表征)。使用適當(dāng)?shù)目贵w對(duì)進(jìn)行捕獲和檢測(cè)，在轉(zhuǎn)基因小鼠的血清中檢測(cè)由轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白。用于夾心elisa的試劑是可商購(gòu)得到的。轉(zhuǎn)基因小鼠的分析顯示在圖20中，其中使用elisa檢測(cè)血清中的hcab。我們還檢驗(yàn)了三重敲除背景對(duì)轉(zhuǎn)基因平臺(tái)產(chǎn)生使用人vh基因的hcab的表現(xiàn)的重要性。為此，我們使用elisa尋找hcab和重鏈/輕鏈復(fù)合物在敲除了內(nèi)源性重鏈基因但是具有多種內(nèi)源性免疫球蛋白輕鏈基因敲除背景的小鼠的血清中的存在(見圖33)。對(duì)于捕獲抗體，使用多克隆山羊抗-小鼠igg(h+l)(jackson，cat#415-005-166)，其具有最小程度的與人、牛、馬、兔、和大鼠血清蛋白的交叉反應(yīng)性。由于其不能直接與用于測(cè)定的檢測(cè)抗體(生物素-大鼠抗-小鼠ig，κ輕鏈，克隆87.1，bdpharmingencat#559750，生物素-大鼠抗-小鼠ig，λ1，λ2和λ3輕鏈，克隆r26-46，bdpharmingencat#553433，和生物素-sp-綴合的affini-pure山羊抗-小鼠igg，fc-γ片段特異性的，jacksoncat#115-065-008)結(jié)合，選擇該抗體。由此，檢測(cè)到任何信號(hào)可能歸因于檢測(cè)抗體與捕獲的重鏈蛋白的結(jié)合，而不歸因于與夾心elisa中的捕獲抗體的結(jié)合。簡(jiǎn)言之，對(duì)于elisa，小鼠血清中的抗體通過包被的抗-小鼠igg抗體捕獲。在洗滌后，使用生物素化的-抗-小鼠igg重鏈-特異性的抗體或生物素化的-抗-小鼠κ輕鏈ab或生物素化的-抗-小鼠λ鏈ab檢測(cè)捕獲的重鏈蛋白或復(fù)合的輕鏈。檢測(cè)抗體使用tmb底物顯現(xiàn)，其中比色反應(yīng)由與檢測(cè)抗體的生物素標(biāo)簽結(jié)合的中性親和素-hrp復(fù)合物引發(fā)。如之前所示(見圖12)，缺少轉(zhuǎn)基因的tko小鼠在其血清中沒有抗體。然而，當(dāng)存在yac2轉(zhuǎn)基因時(shí)，在所有情形中都可以發(fā)現(xiàn)hcab，而與內(nèi)源性免疫球蛋白輕鏈基因背景無關(guān)。如果存在有功能的內(nèi)源性κ基因座，可能在捕獲的重鏈上檢測(cè)到κ輕鏈，這表明存在轉(zhuǎn)基因hcab，其與內(nèi)源性κ輕鏈復(fù)合。類似地，如果存在有功能的λ基因座，可能檢測(cè)到與捕獲的重鏈締合的λ輕鏈，這表明存在轉(zhuǎn)基因hcab，其與內(nèi)源性λ輕鏈蛋白復(fù)合。當(dāng)存在內(nèi)源性的κ和內(nèi)源性的λ輕鏈基因座二者時(shí)，優(yōu)先使用κ鏈，這在通過成功地產(chǎn)生κ輕鏈蛋白而防止λ重排的小鼠中是正常的。由此，在這一情形中，λ輕鏈更難檢測(cè)到與轉(zhuǎn)基因嵌合hcab締合。這些elisa的結(jié)果證明具有三重敲除背景、不能產(chǎn)生任意內(nèi)源性免疫球蛋白對(duì)于提供能夠僅產(chǎn)生僅有hc的抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的必要性。實(shí)施例7：細(xì)胞分析-流式細(xì)胞術(shù)b細(xì)胞發(fā)育途徑可以利用使用多種充分表征的試劑和與特定發(fā)育步驟相關(guān)的標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如，早期的前b細(xì)胞表達(dá)c-kit和il7r，隨著所述細(xì)胞進(jìn)展成成熟的表面ig-陽(yáng)性的b細(xì)胞，得到其他標(biāo)記，諸如cd43，cd19，b220(例如cd19，b220)或得到并下調(diào)所述其他標(biāo)記(例如cd43)(見圖21)。并且，在b細(xì)胞組庫(kù)中，標(biāo)記可以用于區(qū)分b-2b細(xì)胞(cd23+，cd5-)與其他b細(xì)胞亞組，前者能夠參與獲得性體液免疫應(yīng)答(見圖22)。對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)分析，從淋巴組織(例如骨髓，脾)制備單細(xì)胞混懸液，封閉(例如，用fc片段(rockland))后在facs緩沖液(pbs/1％bsa/0.01％nan2)中用針對(duì)表面標(biāo)記的抗體或同種型對(duì)照染色。使用適當(dāng)?shù)逆溍褂H和素綴合物(例如，pe-cy7鏈霉親和素)檢測(cè)生物素-綴合的抗體。染色后，將細(xì)胞用3.7％甲醛溶液固定，并用流式細(xì)胞儀(例如，facscalibur或lsrii機(jī)器)使用適當(dāng)?shù)碾妷汉托拚O(shè)置進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)使用多種軟件包進(jìn)行分析，包括flowjo&winmdi，一種免費(fèi)的程序(見圖21和22)。用于在流式細(xì)胞術(shù)分析之前染色的試劑在本領(lǐng)域中是公知的(例如，參見http：//www.bd.com/uk/products/main.asp)。實(shí)施例8：脾的免疫組織化學(xué)脾具有有組織性的構(gòu)造，具有紅色和白色的髓區(qū)(pulpareas)，后者包含富含b細(xì)胞和t細(xì)胞的區(qū)域。使用取自甲醛固定的石蠟包埋的組織的組織切片的蘇木精和曙紅染色來揭示這種構(gòu)造，并且顯示野生型、三重ko、和tg/tko小鼠的比較圖像(圖23)。對(duì)于這些，明顯的是，在tko小鼠中，該構(gòu)造被損壞，濾泡中具有更少的細(xì)胞并且在濾泡周圍不存在邊緣區(qū)。這些特征與在tko小鼠中不存在b細(xì)胞相一致。關(guān)于對(duì)tg小鼠顯示的圖像，構(gòu)造得到恢復(fù)，濾泡更致密地存在并且被明顯的邊緣區(qū)圍繞。實(shí)施例9：vh結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)生使用用來源于免疫的或來源于未免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的rna產(chǎn)生的展示文庫(kù)分離靶標(biāo)特異性的vh結(jié)構(gòu)域。a)免疫使用本領(lǐng)域公知的多種免疫流程中的一種，將不同靶抗原的集合(selection)施用給轉(zhuǎn)基因小鼠。血清e(cuò)lisa的實(shí)例顯示在圖24中。夾心elisa與上文所述的那些類似。簡(jiǎn)言之，將吸附平板用抗原包被，并在洗滌和封閉后，加入來自動(dòng)物的血清的稀釋液。在用生物素化的抗-fcab然后中性親和素-hrp溫育和加入底物后，檢測(cè)與抗原包被的平板結(jié)合的任何hcab。b)未免疫文庫(kù)使用來自yac1轉(zhuǎn)基因小鼠的113個(gè)脾，構(gòu)建每種vh家族的大文庫(kù)。每個(gè)脾單獨(dú)進(jìn)行處理，并且使用個(gè)體rna的等分試樣進(jìn)行不同vh家族文庫(kù)的構(gòu)建，如上文所述。該文庫(kù)的特性的總結(jié)顯示在圖35未免疫文庫(kù)(libraries)中。該文庫(kù)由大約3.81x1010個(gè)克隆組成，并且來自每個(gè)家族的測(cè)序樣品表明高克隆多樣性，大部分克隆僅在樣品內(nèi)被單次分離。cdna文庫(kù)的構(gòu)建和應(yīng)用從未免疫的和經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建展示文庫(kù)。簡(jiǎn)言之，收集之后轉(zhuǎn)換成rna的淋巴組織，然后進(jìn)行機(jī)械勻漿和裂解。備選地，新鮮的淋巴組織、血液或另一種b細(xì)胞來源(包括雜交瘤)可以用作rna的來源。提取rna(總或信使rna)后，制備cdna。然后，使用pcr擴(kuò)增vh序列，添加適當(dāng)?shù)你暯幼?adapter)以允許克隆到噬菌粒載體中?？梢允褂枚喾N策略來克隆vh。在本情形中，使用針對(duì)轉(zhuǎn)基因中存在的前導(dǎo)序列的簡(jiǎn)并引物聯(lián)合針對(duì)j/h連接的簡(jiǎn)并引物。備選的方法依賴于使用末端脫氧轉(zhuǎn)移酶添加重復(fù)的脫氧核苷酸堿基尾或錨定子，從而用于替換前導(dǎo)序列。擴(kuò)增之后，將vh產(chǎn)物用ncoi和xhoi消化并且連接到載體中，或用作引物并使用基于pcr的策略結(jié)合到噬菌粒載體中。所述噬菌粒載體內(nèi)部構(gòu)建(見圖17)。具有添加的銜接序列(adaptionsequences)的引物記載在之前的部分中(參見分子分析；轉(zhuǎn)錄物-rt-pcr，克隆和測(cè)序)。然后將這樣構(gòu)建的文庫(kù)用在噬菌體展示選擇中(參見圖25的過程示意圖)?？梢允褂眠@種技術(shù)的變化形式，包括，但不限于，可溶性選擇，解離速率(off-rate)或結(jié)合速率(on-rate)偏向選擇，和競(jìng)爭(zhēng)性選擇。通過elisa篩選每個(gè)選擇過程的輸出，并且在噬菌體選擇之前和之后的一些文庫(kù)篩選的實(shí)例顯示在圖26中。在這種情形中，從經(jīng)免疫的小鼠克隆vh文庫(kù)，并且在針對(duì)免疫的抗原選擇之前和之后都通過elisa篩選所述文庫(kù)。按照公布的方法(antibodyengineering，由bennylo編，第8章，第161-176頁(yè)，2004)，使用從大腸桿菌(e.coli)周質(zhì)純化的vh，通過elisa鑒定特異性針對(duì)免疫原的vh抗體。明顯的是，離體文庫(kù)包含低頻率的免疫原結(jié)合物(binder)。這與轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)b細(xì)胞的挖掘(mining)(響應(yīng)的和未免疫的)一致。噬菌體選擇后，富集結(jié)合抗原的vh(圖26)。事實(shí)上，如圖27所示，在預(yù)先選擇的文庫(kù)中，高多樣性是明顯的，并且在通過噬菌體展示一輪嚴(yán)格選擇后，發(fā)現(xiàn)結(jié)合抗原的vh屬于50個(gè)序列家族，其按照cdr3多樣性分組。并且，根據(jù)cdr1、cdr2和cdr3序列的檢查，體細(xì)胞超變的跡象是明顯的，并且分離多種親緣序列(siblingsequences)，推測(cè)是種系中心(germinalcentres)內(nèi)體內(nèi)體細(xì)胞超變的結(jié)果(見圖27a)i))。體細(xì)胞超變導(dǎo)致增加的針對(duì)抗原的親和力的事實(shí)得到四種親緣序列的選擇組的證實(shí)，其中也顯示了與抗原的結(jié)合(見圖27a)i)。導(dǎo)致vh的序列多樣化的體細(xì)胞超變的其他證據(jù)顯示在圖34中-kabat和wu，antigenbinders(抗原結(jié)合物)。在這一情形中，分析105個(gè)與三種抗原中的一種結(jié)合的vh，并且繪制與種系序列相比較，在每個(gè)氨基酸位置處的變異。通過與來自未免疫小鼠的類似的圖的比較(見圖19)，明顯的是，已經(jīng)積聚了大量的突變，在cdr1和2區(qū)域中的突變是普遍存在的。除了按照已知的技術(shù)和上述所述分離vh結(jié)構(gòu)域之外，測(cè)定vh結(jié)構(gòu)域，以確定針對(duì)靶抗原的親和力(圖28)。這可以通過本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)進(jìn)行，包括，但不限于，elisa和biacore。另外，與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合可以通過熒光激活的細(xì)胞分選(facs)進(jìn)行檢測(cè)。除了與靶抗原的結(jié)合強(qiáng)度之外，還可以測(cè)定vh影響給定靶標(biāo)的功能的能力(例如，這將包括對(duì)配體：受體結(jié)合的抑制作用)。圖29顯示了通過包含特異性針對(duì)配體的vh對(duì)配體/受體相互作用的抑制的實(shí)例。實(shí)施例10：vh的特性攜帶上述yac構(gòu)建體中的一種的轉(zhuǎn)基因小鼠提供顯著的用于發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量藥物候選物的益處。與分離自常規(guī)來源(例如，人cdna)的vh結(jié)構(gòu)域不同，所述vh結(jié)構(gòu)域在不存在輕鏈的條件下形成(develop)和成熟。由此，來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的vh結(jié)構(gòu)域不依賴配偶體輕鏈的存在而穩(wěn)定它們的折疊或保持它們的溶解性。其證據(jù)來源于將分離自未免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的vh與在體外來源于人cdna文庫(kù)的那些進(jìn)行比較的實(shí)驗(yàn)。如之前所述，將vh序列克隆到噬菌粒載體中，并且在大腸桿菌中進(jìn)行小規(guī)模(50ml)表達(dá)研究。進(jìn)行這些，無需序列優(yōu)化，無需使用使蛋白產(chǎn)量最大化的專用方法。在用iptg誘導(dǎo)之后，確定可溶性vh的表達(dá)。使用來自匹配的v-基因家族的vh，觀察到僅有47％(15/32個(gè)克隆)人cdna-來源的vh克隆能夠從大腸桿菌來源的周質(zhì)提取物中提供至少10ug的可溶性蛋白。通過比較，由未免疫的轉(zhuǎn)基因yac1/tko小鼠克隆的vh的79％(27/34)提供超過10ug的可溶性表達(dá)產(chǎn)量。并且，由圖30中所示的結(jié)果表明，在群體基礎(chǔ)上，與來源于人cdna文庫(kù)的那些(平均值＝37.6ug/50ml)(我們假設(shè)其與配偶體輕鏈締合形成)相比，使用在不存在輕鏈的條件下在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)形成的vh(平均值＝176ug/50ml)，明顯有更高的產(chǎn)量。因此，盡管來自每種來源的vh能夠以可溶形式表達(dá)，但是在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)形成的群體表現(xiàn)出提高的溶解性，提高整體高約5-倍的可溶性蛋白產(chǎn)量。對(duì)于從免疫后的小鼠克隆的體內(nèi)親和性成熟的vh，提高的產(chǎn)量是顯而易見的。在這一情形中，小的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)生～10mg/升，這是使用沒有任何優(yōu)化的噬菌粒表達(dá)系統(tǒng)獲得的。蛋白的解鏈溫度(tm)可以用作該蛋白穩(wěn)定性的替代量度。在純化它們之后，使用差示掃描熒光測(cè)定(differentialscanningfluorimetry，dsf)測(cè)量上述vh克隆集合的tm。人cdna-來源的vh中有多種不能檢測(cè)，原因在于它們異常少的生產(chǎn)產(chǎn)量，并且，因此，關(guān)于該克隆群體的平均tm值可能表示最好的情形(best-casescenario)。簡(jiǎn)言之，該技術(shù)依賴于對(duì)來自報(bào)告染料的熒光的檢測(cè)，所述報(bào)告染料在成功與暴露的疏水殘基結(jié)合時(shí)發(fā)射信號(hào)。由此，當(dāng)?shù)鞍妆患訜岵⒔庹郫B時(shí)，報(bào)告染料能夠結(jié)合并且可以檢測(cè)到熒光。圖31中所示的結(jié)果是使用蛋白熱轉(zhuǎn)換試劑盒(proteinthermalshiftkit)(appliedbiosytems，目錄號(hào)4461146)和使用蛋白熱轉(zhuǎn)換軟件(目錄號(hào)4466037)進(jìn)行分析產(chǎn)生的。報(bào)告來源于boltzmann擬合的tm值(圖31)，并且明顯的是，與分離自人cdna的那些相比，分離自轉(zhuǎn)基因小鼠的vh群體提供顯著更高的tm(對(duì)于轉(zhuǎn)基因小鼠來源的vh為57.9℃，相比之下，從人來源克隆的vh為54.1℃)。應(yīng)該注意，這些數(shù)據(jù)是來自未免疫的小鼠，并且表示主要是種系序列并且沒有進(jìn)行親和性成熟的vh。與本文所示的那些相比，在免疫之后，抗原-特異性的、親和性成熟的vh通常表現(xiàn)出顯著升高的tm。來自經(jīng)免疫的小鼠的vh不表現(xiàn)出聚集傾向性(見圖32)。進(jìn)行純化的vh的hplc大小排阻分析。簡(jiǎn)言之，在tsk凝膠g2000swxl(tosoh)柱(在280nm檢測(cè))上，使用waters2795分離模塊，使用10％異丙醇、90％pbs或100mm磷酸鹽緩沖液ph6.8，150mmnacl作為移動(dòng)相，和以0.5-0.7ml/min的流速，分析vh溶液。對(duì)于一些vh制劑，所用的特定的大腸桿菌菌株允許讀取到噬菌粒載體中的基因iii序列，并且少量的vh-基因iii融合產(chǎn)物是明顯的。然而，存在可忽略的量的二聚體的或聚集的vh。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)證明，與同重排的配偶體輕鏈締合形成的那些相比，來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的人vh具有提高的溶解性和穩(wěn)定性。參考文獻(xiàn)bébinag，carrionc，marquetm，cognén，lecardeurs，cogném，pinaude(2010).invivoredundantfunctionofthe3′ighregulatoryelemenths3binthemouse(在小鼠中3′igh調(diào)節(jié)元件hs3b的體內(nèi)的豐富功能).jimmunol.184：3710-7.brownsteinbh，silvermanga，littlerd，burkedt，korsmeyersj，schlessingerd，olsonmv(1989).isolationofsingle-copyhumangenesfromalibraryofyeastartificialchromosomeclones(從酵母人工染色體克隆文庫(kù)分離單拷貝的人基因).science，244：1348-51.chatterjees，juz，hassanr，volpisa，emelyanovav，birshteinbk(2011).dynamicchangesinbindingofimmunoglobulinheavychain3′regulatoryregiontoproteinfactorsduringclassswitching(在種類轉(zhuǎn)換過程中，免疫球蛋白重鏈3′調(diào)節(jié)區(qū)與蛋白因子的結(jié)合中的動(dòng)態(tài)變化).jbiolchem.286：29303-12.cogném，lansfordr，bottaroa，zhangj，gormanj，youngf，chenghl，altfw(1994).aclassswitchcontrolregionatthe3′endoftheimmunoglobulinheavychainlocus(在免疫球蛋白重鏈基因座3′端的種類轉(zhuǎn)換控制區(qū)).cell.199477：737-47.daviesnp，rosewellir，brüggemannm(1992).targetedalterationsinyeastartificialchromosomesforinter-speciesgenetransfer(在酵母人工染色體中用于物種間基因轉(zhuǎn)移的靶向改變).nucleicacidsres.20：2693-8.garrettfe，emelyanovav，sepulvedama，flanaganp，vblpis，lif，loukinovd，eckhardtla，lobanenkovvv，birshteinbk(2005).chromarinarchitecturenearapotential3′endoftheighlocusinvolvesmodularregulationofhistonemodificationsduringb-celldevelopmentandinvivooccupancyatctcfsites(在b細(xì)胞發(fā)育和體內(nèi)占據(jù)ctcf位點(diǎn)過程中，在igh基因座潛在的3′端附件的染色質(zhì)構(gòu)造包括組蛋白修飾的模塊調(diào)節(jié)).molcellbiol.25：1511-25.gibsondg，bendersga，axelrodkc，zaverij，algirema，moodiem，montaguemg，venterjc，smithho，hutchisonca3rd(2008).one-stepassemblyinyeastof25overlappingdnafragmentstoformacompletesyntheticmycoplasmagenitaliumgenome(在酵母中25個(gè)重組dna片段一步組織形成完整的合成的生殖器支原體基因組).procnatlacadsciusa.105：20404-9.hamerl，johnstonm，greened(1995).isolationofyeastartificialchromosomesfreeofendogenousyeastchromosomes：constructionofalternatehostswithdefinedkaryotypicalterations(分離不含內(nèi)源性酵母染色體的酵母人工染色體：構(gòu)建具有確定的核型變化的備用宿主).procnatlacadsciusa.92：11706-10.liebersonr，ongj，shix，eckhardtla(1995).immunoglobulingenetranscriptionceasesupondeletionofadistantenhancer(當(dāng)缺失遠(yuǎn)端增強(qiáng)子時(shí)，免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)錄停止).emboj.14：6229-38.manisjp，vanderstoepn，tianm，ferrinir，davidsonl，bottaroa和altfw(1998).classswitchinginbcellslacking3′immunoglobulinheavychainenhancers(在缺少3′免疫球蛋白重鏈增強(qiáng)子的b細(xì)胞中的種類轉(zhuǎn)換).j.exp.med.188，1421-1431markied(2006).markers，selection，andmediainyeastartificialchromosomecloning(在酵母人工染色體克隆中的標(biāo)記、選擇和培養(yǎng)基).methodsmolbiol.349：1-12.neubergerms(1983).expressionandregulationofimmunoglobulinheavychaingenetransfectedintolymphoidcells(轉(zhuǎn)染到淋巴細(xì)胞中的免疫球蛋白重鏈基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)).emboj.2：1373-8.petterssons，cookgp，brüggemannm，williamsgt，neubergerms(1990).asecondbcell-specificenhancer3′oftheimmunoglobulinheavy-chainlocus(免疫球蛋白重鏈基因座3′的第二b細(xì)胞特異性的增強(qiáng)子).nature.344：165-8.sanchezcp和lanzerm(2006).constructionofyeastartificialchromosomelibrariesfrompathogensandnonmodelorganisms(從病原體和非模式生物體構(gòu)建酵母人工染色體文庫(kù)).yacprotocols，2nd.methodsinmolecularbiology.卷349，13-26.tosatov，waghmaresk，bruschicv(2005).non-reciprocalchromosomalbridge-inducedtranslocation(bit)bytargeteddnaintegrationinyeast(在酵母中通過靶向的dna整合的非相互性染色體橋-誘導(dǎo)的易位(bit)).chromosoma.114(1)：15-27.vincent-fabertc，fiancetter，pinaude，truffinetv，cognén，cogném，denizoty(2010).genomicdeletionofthewholeigh3′regulatoryregion(hs3a，hs1，2，hs3b，andhs4)dramaticallyaffectsclassswitchrecombinationandigsecretiontoallisotypes(完整igh3′調(diào)節(jié)區(qū)(hs3a，hs1，2，hs3b，和hs4)的基因組缺失顯著影響種類轉(zhuǎn)換重組和所有同種型的ig分泌).blood.116：1895-8.vincent-fabertc，truffinetv，fi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