本發(fā)明涉及用于處理水凝膠微滴中的樣品、特別是生物樣品的微流體方法。本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行這種方法的裝置和涉及通過(guò)進(jìn)行這種方法獲得的樣品的產(chǎn)品。

背景技術(shù)：

從guo、rotem、heyman和weitz，“dropletmicrofluidicsforhigh-throughputbiologicalassays”，lab.chip.12(2012)中已知，微流體系統(tǒng)中的液滴(或“微滴”)可用于包含化學(xué)反應(yīng)或生物反應(yīng)。在這些系統(tǒng)中，可以當(dāng)液滴在聚焦激光器前面通過(guò)時(shí)觀察液滴的熒光來(lái)測(cè)定這些液滴的含量。然而，在不將這些液滴從微流體裝置中提取出來(lái)時(shí)，這些系統(tǒng)不能觀察這些液滴的含量隨時(shí)間的變化。

關(guān)于微滴中的個(gè)體化細(xì)胞的研究也是已知的，例如來(lái)自joensson,h.n.和anderssonsvahn,h.，“dropletmicrofluidics-atoolforsingle-cellanalysis”，angew.chem.int.ed.engl.51,12176-12192(2012)。事實(shí)上，這些微滴形成了明確界定的隔室，其例如使得能夠分離出諸如細(xì)胞的生物樣品。該文獻(xiàn)特別教導(dǎo)可以通過(guò)在培養(yǎng)室中、在細(xì)長(zhǎng)通道中或在靜態(tài)捕集阱中積聚液滴來(lái)控制包封細(xì)胞群體的定位。該文獻(xiàn)還教導(dǎo)細(xì)胞可以被包封在被油相包圍的官能化水凝膠中。

然而，在這種裝置中細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或更一般的生物感興趣的分子的供應(yīng)被證明是有限的，并且使用的方法(例如通過(guò)電融合或皮升注射)證明是復(fù)雜的。因此，這些裝置對(duì)細(xì)胞行為的研究具有許多限制，特別是在時(shí)間方面。

此外，從l.yu，m.c.w.chen和k.c.chang，“droplet-basedmicrofluidicsystemformulticellulartumorspheroidformationandanticancerdrugtesting”，labchip(2010)，已知一種處理含有多細(xì)胞球體的水凝膠微滴的方法。根據(jù)該方法，在第一微流體系統(tǒng)中產(chǎn)生包括細(xì)胞的水凝膠微珠。然后將它們回收并在浴中洗滌，然后注入包含捕集阱的第二微流體系統(tǒng)，使得可以固定微滴。

然而，這種方法是復(fù)雜的，總共需要兩個(gè)單獨(dú)的微流體系統(tǒng)和三個(gè)裝置。另外，不能連續(xù)觀察樣品。特別地，它不能觀察到液滴的形成和其捕獲之間的初始時(shí)刻。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，需要一種用于處理含有樣品的微滴的方法，該方法更簡(jiǎn)單并且還允許對(duì)樣品進(jìn)行大范圍的測(cè)試。還需要一種用于處理微滴的方法，該方法能夠更有效地分選微滴。

為此，本發(fā)明提出了一種用于在微流體系統(tǒng)中處理包含樣品的微滴的方法，包括以下步驟：

i)在油中形成含有樣品的水溶液的微滴，油和水溶液中的至少一者包含膠凝劑，

ii)通過(guò)預(yù)先布置在捕集區(qū)中的表面張力捕集阱捕集微滴，和

iii)將來(lái)自捕集區(qū)中的至少一部分油和至少一部分被捕集的微滴中的至少一者膠凝化。

因此，根據(jù)本發(fā)明，為了對(duì)感興趣的微滴(也就是說(shuō)含有感興趣的樣品的微滴)進(jìn)行分選，這些微滴首先被捕集在表面張力捕集阱(或毛細(xì)管捕集阱)中，然后一些微滴和/或其周圍的一部分油被膠凝化。微滴和/或其周圍的油的膠凝化通過(guò)提高捕集阱中捕集微滴的強(qiáng)度有助于分選。換言之，膠凝化步驟使得可以防止感興趣的微滴損失。

此外，這種膠凝化使得可以防止微滴融合，該融合將引起這些微滴的樣品的混合。

表面張力捕集阱旨在表示微流體系統(tǒng)的捕集區(qū)，其幾何形狀與微滴的界面張力可以使微滴固定就位。

該方法的所有步驟在單個(gè)微流體系統(tǒng)中進(jìn)行。微流體系統(tǒng)旨在表示其部分是根據(jù)微細(xì)加工工藝制造的系統(tǒng)。這種系統(tǒng)具有導(dǎo)管，該導(dǎo)管的至少一個(gè)維度通常小于一毫米。

可以控制微滴的形狀。對(duì)微滴形狀的這種控制可以與控制微滴或其周圍的一部分油膠凝化的時(shí)刻相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)各種應(yīng)用，特別是在細(xì)胞操控方面。

細(xì)胞旨在表示真核細(xì)胞(例如植物細(xì)胞、傘菌細(xì)胞、酵母菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)和原核細(xì)胞(例如細(xì)菌)。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，區(qū)分非錨定依賴性細(xì)胞(例如血細(xì)胞系的一些細(xì)胞和高度轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞)和錨定依賴性細(xì)胞(大多數(shù)其它細(xì)胞類型)，其中一些亞型會(huì)組織成球狀體形式。球狀體旨在表示以微組織形式組織的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其功能類似于衍生自器官的組織的功能。

根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的方法單獨(dú)或組合地包括以下特征的一個(gè)或多個(gè)：

-步驟iii)為將捕集區(qū)的至少一部分油膠凝化，而不將微滴膠凝化；

-步驟iii)為將至少一部分微滴膠凝化，而不將捕集區(qū)中的微滴周圍的油膠凝化；

-樣品是一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞(特別是細(xì)胞的球狀體)、一個(gè)或多個(gè)捕集分子的珠(珠特別是由塑料制成)、或一個(gè)或多個(gè)分子中的一者；

-步驟iii)在被捕集的微滴中的樣品(特別是細(xì)胞樣品)沉降之后、特別是在形成球狀體之后進(jìn)行；

-步驟iii)在被捕集的微滴中的樣品沉降之前進(jìn)行；

-該方法還包括以下步驟：

iv)用水溶液代替膠凝化的微滴周圍的油；

-代替油的水溶液含有生物化學(xué)溶液，生物化學(xué)溶液優(yōu)選包含一種或多種ph緩沖液或鹽緩沖液、一種或多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、一種或多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、一種或多種抗體、一種或多種抗原、一種或多種分子(特別是藥劑分子)、一種或多種細(xì)胞、脂質(zhì)、碳水化合物(特別是以單體形式或多糖形式的碳水化合物)、氨基酸和/或蛋白質(zhì)中的至少一者；

-捕集區(qū)由包含表面張力捕集阱的微流體芯片形成；

-步驟i)為：

a)將含有樣品和在適當(dāng)?shù)那闆r下含有膠凝劑的水溶液注入捕集區(qū)上游的區(qū)域，

b)將在適當(dāng)?shù)那闆r下含有膠凝劑的油注入捕集區(qū)上游的區(qū)域，以將含有樣品的水溶液驅(qū)向捕集區(qū)的出口，注入油以形成含有樣品的微滴，然后

c)將微滴移至捕集區(qū)并將微滴捕集在捕集區(qū)中；

-通過(guò)進(jìn)行以下操作而同時(shí)在捕集區(qū)中進(jìn)行步驟i)和步驟ii)：

-用含有樣品和在適當(dāng)?shù)那闆r下含有膠凝劑的水溶液填充捕集區(qū)，然后

-將在適當(dāng)?shù)那闆r下含有膠凝劑的油注入捕集區(qū)，以將含有樣品的水溶液驅(qū)向捕集區(qū)的出口，使表面張力捕集阱適于使含有樣品的微滴在表面張力捕集阱處破裂；

-步驟iii)為以下項(xiàng)中的至少一者：

-冷卻或加熱微滴和/或油，

-注入含有化學(xué)膠凝劑的溶液，

-將微滴和/或油暴露于引起膠凝化的光，所述光特別是uv光；

-油含有表面活性劑，該方法優(yōu)選地包括在步驟iv)之前洗滌表面活性劑的步驟；

-該方法包括在步驟i)之前根據(jù)微滴的期望形狀來(lái)選擇表面張力捕集阱的形狀的步驟；

-捕集區(qū)和捕集阱被選擇以：

-形成具有平坦的底部的被捕集的微滴，或

-形成具有非平坦的、特別是彎曲的、優(yōu)選凸起的底部的被捕集的微滴；

-該方法包括在步驟iii)之后的步驟v)，優(yōu)選在步驟iv)之后的步驟v)，該步驟v)為使步驟iii)中膠凝化的至少一些微滴去膠凝化；

-該方法包括在步驟v)之后的步驟vi)，步驟vi)為將去膠凝化的微滴和/或包含在這些去膠凝化的微滴中的樣品從捕集區(qū)排出；

-該方法包括對(duì)包含在至少一部分被捕集的、膠凝化或未膠凝化的微滴中的樣品施加刺激的步驟；以及

-該方法包括在步驟iii)之后的步驟，該步驟iii)之后的步驟為使周圍的油未膠凝化的微滴離開(kāi)捕集區(qū)，以便在捕集區(qū)中僅保留那些周圍的油被膠凝化的微滴。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于執(zhí)行如上所描述的以其所有組合的方法的裝置，包括：

-形成含有樣品的微滴的構(gòu)件，

-用于在預(yù)定位置處捕集微滴的捕集區(qū)，特別是微流體芯片，以及

-用于膠凝化至少一部分被捕集的微滴和/或至少一部分油的構(gòu)件。

該膠凝化構(gòu)件可以包括用于將化學(xué)試劑注入捕集區(qū)的元件。

該裝置還可以包括用于使至少一些膠凝化的水凝膠微滴和/或一部分膠凝化的油去膠凝化的構(gòu)件。

本發(fā)明還涉及具有膠凝化的微滴的產(chǎn)品，其包括用于捕集微滴的區(qū)域、特別是微流體芯片，以及各自包含樣品并且被捕集在捕集區(qū)中的膠凝化的微滴，該膠凝化的微滴優(yōu)選被冷凍保存。

為此，并且考慮到儲(chǔ)存和/或分配該微滴產(chǎn)物，生物化學(xué)溶液可以含有冷凍保護(hù)劑(dmso、甘油、海藻糖等)以使樣品能夠冷凍保存。

膠凝化的微滴也可以被浸入流體中，優(yōu)選浸入水溶液中或浸入油中，流體和微滴優(yōu)選被冷凍保存。

本發(fā)明還涉及具有微滴的產(chǎn)品，包括捕集區(qū)、特別是微流體芯片，以及各自包含樣品并且被捕集在捕集區(qū)中的微滴，微滴浸入膠凝化的油中，微滴和膠凝化的油優(yōu)選被冷凍保存。

樣品可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu)選除人類細(xì)胞外的來(lái)自哺乳動(dòng)物的細(xì)胞)、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或在生物過(guò)程中使用的其它細(xì)胞、分子、或在表面捕集分子的珠。

附圖說(shuō)明

根據(jù)附圖，閱讀本發(fā)明的示例性實(shí)施方式的以下描述將更好地理解本發(fā)明，其中：

-圖1示意性地示出微流體芯片；

-圖2示意性地示出圖1的微流體芯片，其中一些捕集阱被含有樣品的水凝膠微滴占據(jù)；

-圖3示意性地示出含有水凝膠和待測(cè)試樣品的混合物的圖1的微流體芯片；

-圖4至圖6示意性地示出了用于將捕集在微流體芯片中的水凝膠微滴中包含的一部分樣品從該微流體芯片排出的裝置；

-圖7至圖12示意性地示出表面張力捕集阱的幾何形狀和它們使得可以獲得的微滴形狀的示例；以及

-圖13至圖15示意性地示出水凝膠微滴中樣品沉降的示例。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及一種處理包含待測(cè)試樣品的水凝膠微滴的方法。

下文將更特別地涉及細(xì)胞形式的樣品，但是當(dāng)然可以使用其它類型的樣品。

該方法基本上包括三個(gè)步驟，全部在單個(gè)微流體系統(tǒng)中進(jìn)行，所述三個(gè)步驟為：

-在油中形成含有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的液體水溶液的微滴，所述油和/或所述水溶液包含膠凝劑，

-通過(guò)預(yù)先布置在捕集區(qū)中的表面張力捕集阱捕集液體微滴，以及

-將油和至少一部分被捕集的微滴中的至少一者膠凝化。

下文將更特別涉及其中水溶液是水凝膠溶液、油不包含膠凝劑的情況，以及其中上述最后步驟為將至少一部分被捕集的微滴膠凝化，而油本身未被膠凝化的情況。在這種情況下，在上述三個(gè)步驟之后，可以通過(guò)進(jìn)行不同的步驟來(lái)繼續(xù)該方法，特別是取決于希望進(jìn)行的測(cè)試。

該方法可以特別地通過(guò)用水溶液代替膠凝化微滴周圍的油而不將微滴從表面張力捕集阱移除的步驟來(lái)繼續(xù)進(jìn)行。水溶液可以含有具有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、抗體、藥劑分子和ph緩沖液和/或鹽緩沖液中的至少一者的生物化學(xué)溶液。

根據(jù)另一方面，該方法使得可以控制在微流體通道和/或表面張力捕集阱中的水凝膠珠的三維形狀，其主要應(yīng)用是將細(xì)胞包封在這些微滴中。因此，根據(jù)微滴的形狀和每個(gè)微滴的細(xì)胞濃度，細(xì)胞包封在水凝膠中使得在例如向其輸入生物化學(xué)溶液或?qū)ζ涫┘游锢泶碳?例如熱或光)時(shí)，能夠進(jìn)行其培養(yǎng)或分析。

凝膠旨在表示主要由液體組成并含有分子或顆粒的介質(zhì)，分子或顆?？杀唤M織以賦予凝膠固體外觀，例如在其穩(wěn)定狀態(tài)下不存在流動(dòng)。該溶液可以以液態(tài)處理，然后可以通過(guò)化學(xué)方法或物理方法“膠凝化”。在某些情況下，膠凝化可以是可逆的。當(dāng)液體是水時(shí)，涉及水凝膠。

如上所述，所提出的微流體方法包括在油中形成含有生物細(xì)胞的水凝膠微滴的第一步驟。

在這種情況下，微滴(或微珠)的直徑為微米級(jí)，特別是直徑在10微米和1000微米之間。

水凝膠是例如包含膠凝劑的水溶液。用戶根據(jù)應(yīng)用選擇膠凝劑?？梢晕锢砟z凝化的膠凝劑的實(shí)例是瓊脂糖，其在室溫下為液體，并且其在低溫下膠凝化?？梢曰瘜W(xué)膠凝化的膠凝劑例如是藻酸鹽，其在溶液中為液體，并且當(dāng)供應(yīng)鈣離子ca²⁺時(shí)膠凝化。

在生物學(xué)水平上，水凝膠的生物化學(xué)性質(zhì)和生物力學(xué)性質(zhì)可以使錨定敏感細(xì)胞與由此形成的基質(zhì)建立特異性的相互作用。這些相互作用對(duì)于錨定依賴性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的存活是必需的，并且在調(diào)節(jié)其表型中起作用?；|(zhì)的性質(zhì)例如可以使得能夠觀察細(xì)胞遷移或蛋白水解(由細(xì)胞消化基質(zhì))。使用瓊脂糖、藻酸鹽和peg-da(聚乙二醇二丙烯酸酯)、也使用明膠、i型膠原或進(jìn)行特別有說(shuō)服力的實(shí)驗(yàn)。例如，含有各種蛋白、糖胺聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)的其它組分(例如i型膠原、明膠或)的水凝膠表現(xiàn)出其維持活力、支持增殖的能力以及遷移和維持某些錨定依賴性細(xì)胞群體的表型的能力。應(yīng)當(dāng)注意，可以通過(guò)例如提供連續(xù)的微滴來(lái)組合凝膠。所提及的每個(gè)水凝膠具有特定的相應(yīng)膠凝化程序。一些水凝膠(例如peg-da)也可以通過(guò)以下被功能化以使細(xì)胞存活和/或發(fā)育：摻入模擬肽(例如水凝膠可以用rgd型共有序列功能化，一些類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞與該rgd型共有序列可以建立特異性相互作用，或者對(duì)金屬蛋白酶特異的prcg[v/n]pd或hexghxxgxxh共有序列)、或通過(guò)摻入抗體或適配體的特異性分子的傳感器，例如原位捕獲由包封的淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。通過(guò)改變例如它們的交聯(lián)度和/或它們的濃度，這些水凝膠的力學(xué)性能也可以被改變用于不同的應(yīng)用。所有這些物理化學(xué)性質(zhì)可以在捕集區(qū)內(nèi)的一個(gè)捕集阱與另一個(gè)捕集阱之間不同。在捕集的水凝膠微滴中建立嚴(yán)格梯度使得例如干細(xì)胞可控分化成不同的細(xì)胞類型。最后，在混合或者在捕集阱中膠凝化核心周圍連續(xù)形成若干個(gè)層之后，多種水凝膠可以在相同的微滴中共存。

先驗(yàn)地在形成微滴之前，細(xì)胞與水凝膠混合。然而，在形成微滴之前，水凝膠和細(xì)胞可以在微流體裝置中直接混合。

已經(jīng)提出了許多方法在流動(dòng)相(諸如油)中形成這種微滴。例如，可以提及以下示例方法：

-稱為“流動(dòng)聚焦”的方法，例如在s.l.anna,n.bontoux和h.a.stone，“formationofdispersionsusing‘flow-focusing’inmicrochannels”，appl.phys.lett.82,364(2003)中所描述的，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文，

-“t連接”方法，例如在“dynamicpatternformationinavesicle-generatingmicrofluidicdevice”由t.thorsen,r.w.roberts,f.h.arnoldets.r.quake,phys.rev.lett.86,4163–4166(2001)中所描述的，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文，或者

-“約束梯度”方法，例如在申請(qǐng)fr-a-2958186中所描述的，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

這些方法使得可以形成具有基本相等尺寸的微滴。

在形成這些微滴之后，微滴通過(guò)微通道從其形成的區(qū)域輸送到捕集區(qū)，該微通道由油流和/或由斜坡或軌道承載。已經(jīng)觀察到，這種輸送有助于在微滴中形成球狀體。然后由布置在捕集區(qū)中、特別是在微流體芯片中的表面張力捕集阱將微滴捕集。捕集區(qū)(或微流體芯片10)通過(guò)疏水表面處理進(jìn)行處理，并填充含有表面活性劑的油。使用表面活性劑能夠使微滴穩(wěn)定及再現(xiàn)微滴的形成。表面活性劑還可以在從生產(chǎn)裝置輸送到捕集區(qū)的捕集阱期間如果發(fā)生接觸則防止微滴的聚結(jié)。

如圖1所示的微流體芯片10由可能數(shù)平方厘米的培養(yǎng)室組成，包含以表格或矩陣形式組織的許多表面張力捕集阱。表面張力捕集阱12可以具有各種形狀。例如，在圓柱形捕集阱的情況下，根據(jù)所需的應(yīng)用，它們的直徑可以從幾十微米到幾百微米。對(duì)于單個(gè)細(xì)胞或在微滴中個(gè)體化的細(xì)胞的包封，捕集阱的直徑可以是例如50微米，其對(duì)應(yīng)于每平方厘米大約5000個(gè)捕集阱的密度。對(duì)于大的細(xì)胞聚集體或球狀體的研究，該直徑可以達(dá)到250微米，則其對(duì)應(yīng)于每平方厘米大約250個(gè)捕集阱的捕集阱密度。

如圖1所示，在微流體芯片10外部形成的包括生物細(xì)胞16的微滴14例如通過(guò)箭頭18所示的油流被運(yùn)送到微流體芯片10中，使得這些微滴中的一些被捕集在表面張力捕集阱12中。

然而，作為變型，這里提出在油中形成含有生物細(xì)胞的水凝膠微滴，而不精確控制在油中含有生物細(xì)胞的水凝膠的流動(dòng)。這是因?yàn)橹挥心切┚哂泻线m尺寸的微滴隨后被捕集在捕集區(qū)中，使得捕集區(qū)被實(shí)際上具有很大的尺寸均勻性、形狀均勻性和生物細(xì)胞濃度均勻性的微滴占據(jù)。

根據(jù)圖3所示的另一變型，捕集區(qū)，特別是微流體芯片10，包含含有生物細(xì)胞16的水凝膠溶液20。然后將油注入捕集區(qū)(注射由箭頭18示意性地表示)，其驅(qū)動(dòng)含有生物細(xì)胞16的水凝膠溶液20朝向捕集區(qū)的出口。然后通過(guò)將水凝膠捕集在微流體芯片的這些捕集阱中直到獲得與圖2所示的構(gòu)造基本相同的構(gòu)造，微滴直接在表面張力捕集阱12中形成。因此，通過(guò)在表面張力捕集阱上含有生物細(xì)胞的水凝膠溶液的自發(fā)分離(或破裂)來(lái)形成微滴。在這種情況下，也不需要對(duì)流量的精確控制，甚至可以用手推動(dòng)注射器，而不必使用復(fù)雜的儀器。在這種情況下，優(yōu)選的是深的表面張力捕集阱，以便在表面張力捕集阱處能夠使微滴破裂(也就是說(shuō)微滴的形成)。這樣的捕集阱將隨后描述。

這里應(yīng)當(dāng)注意，捕集阱可以具有非常不同的形狀，特別是根據(jù)所需的應(yīng)用，也就是說(shuō)特別是根據(jù)被捕集的微滴的所需形狀，捕集阱可以具有非常不同的形狀。形成捕集阱的空腔也可以沒(méi)有優(yōu)先地位于捕集區(qū)、特別是微流體芯片的上壁、下壁或一個(gè)側(cè)壁上。

圖7至圖12示出可以設(shè)想用于微流體芯片10的表面張力捕集阱12的形狀以及可以通過(guò)這些表面張力捕集阱12獲得的微滴14的形狀。

特別地，捕集阱12的形狀使得可以根據(jù)形成有捕集阱12的微流體通道的幾何參數(shù)和捕集的微滴的體積來(lái)控制捕集的微滴的形狀。圖7示意性地示出了確定微滴的輪廓所要考慮的參數(shù)，即限制在含有捕集阱12的通道中的微滴的半徑r、該通道的高度h(其小于該通道中的微滴的半徑r)、以及捕集阱12的直徑d和深度p。

當(dāng)捕集阱12是圓柱形的并且具有大于通道高度h兩倍的直徑d時(shí)，如圖8至圖10所示，則微滴14盡可能多地裝入捕集阱12中。根據(jù)捕集阱12和微滴14的相對(duì)體積，微滴14可以具有或不具有半球狀的圓頂，并且可以具有或不具有由通道的壁限制的平坦部分。因此，在圖8中，微滴14的體積大于捕集阱12的體積。在這種情況下，微滴14幾乎完全填充捕集阱12，并且具有抵著通道的壁和捕集阱的壁扁平化的形狀。在圖9中，微滴14的體積略小于捕集阱12的體積，因此微滴14具有兩個(gè)半球狀的圓頂，并且僅輕微接觸通道的壁。最后，如圖10所示，如果微滴14的體積明顯小于捕集阱12的體積，則微滴14(或甚至幾個(gè)微滴14)完全容納在捕集阱12內(nèi)。

另一方面，在圖11的情況下，捕集阱的直徑d小于通道高度h的一半。因此，微滴14基本上仍被限制在通道中，并且在捕集阱12中僅具有小的半球狀的圓頂。

最后，在圖12的情況下，捕集阱12是圓錐形的并且直徑d為通道高度h的兩倍。微滴14因此緊密地裝入捕集阱12的壁的形狀中，以便在捕集阱12中形成半球狀的圓頂。

此外，如圖13所示，如果捕集在捕集阱12中的微滴14具有平坦的底部，則細(xì)胞16在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均勻地沉降和沉淀其自身于微滴14的底部。于是可以觀察到單個(gè)的細(xì)胞并且不聚集。另一方面，如圖14和圖15所示，如果捕集在捕集阱12中的微滴14具有非平坦的底部、特別是凸起的底部，則細(xì)胞16在其沉降期間與微滴12的界面接觸，并且必須沿著這個(gè)界面滑動(dòng)。細(xì)胞16因此集中在微滴14的底部，并且可以任選地在一些錨定依賴性細(xì)胞的情況下聚集并形成球狀體。

這里提出的微流體方法包括在捕集這些微滴之后對(duì)微滴膠凝化的步驟。

該步驟可以以各種方式進(jìn)行，特別是根據(jù)所用的水凝膠膠凝劑。因此，根據(jù)第一實(shí)施例，水凝膠含有瓊脂糖，優(yōu)選是瓊脂糖。然后通過(guò)冷卻微流體芯片將微滴膠凝化。當(dāng)水凝膠含有藻酸鹽或優(yōu)選地為藻酸鹽時(shí)，可以在其中浸入微滴的油中提供鈣離子ca²⁺，或者甚至將鈣質(zhì)顆粒與藻酸鹽預(yù)混合并使其中浸入微滴的油在二氧化碳中飽和。藻酸鹽因此被酸化并釋放鈣離子。當(dāng)然，由于可以使用其它膠凝劑，因此可以使用其它膠凝化方法。

此外，根據(jù)所尋求的應(yīng)用，該膠凝化步驟可以在該處理方法期間的不同時(shí)刻進(jìn)行。特別地，可以在捕集后立即進(jìn)行膠凝化，以將細(xì)胞適當(dāng)固定在微滴中并防止它們沉降。然后可以彼此獨(dú)立地觀察細(xì)胞?？商孢x地，在細(xì)胞沉降以形成球狀體之后進(jìn)行膠凝化。這使得可以觀察到已經(jīng)形成球狀體的細(xì)胞的行為。根據(jù)另一替代方案，微滴僅在用于處理液體介質(zhì)中的細(xì)胞的操作之后膠凝化，例如選擇性提取某些細(xì)胞-非膠凝化微滴中的細(xì)胞。這對(duì)于例如細(xì)菌或紅細(xì)胞和白細(xì)胞的細(xì)胞(其是錨定非依賴的)可是有用的。

膠凝化后，例如可以用含有特別是包含生物化學(xué)成分(例如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、抗體、藥物或藥劑分子)的生物化學(xué)溶液的水溶液來(lái)代替其中浸漬有微滴的油。這些生物化學(xué)成分通過(guò)凝膠擴(kuò)散并到達(dá)細(xì)胞。因此，可以研究獨(dú)立的或以球狀體的形式的細(xì)胞對(duì)這些刺激的反應(yīng)。因此，在將細(xì)胞包封在微滴期間，水凝膠使得可以將細(xì)胞保持在精確的位置，同時(shí)允許細(xì)胞通過(guò)水相輸入并且預(yù)先劃分生物樣品。

為了成功地進(jìn)行該操作，優(yōu)選地迫使表面活性劑從微滴的界面出來(lái)。這是因?yàn)楸砻婊钚詣┰谖⒌谓缑嫣幮纬傻臍?huì)非常有效地阻止被注入以代替油的水相填充微流體芯片，從而保持微滴在其各自的捕集阱中膠凝化。由于聚結(jié)被表面活性劑的存在所抵抗，故水相界面到達(dá)捕集阱產(chǎn)生施加到膠凝化微滴的力，如果構(gòu)成膠凝化微滴的水凝膠是足夠可壓縮的，則膠凝化微滴會(huì)被迫使離開(kāi)捕集阱。這就是優(yōu)選通過(guò)降低界面處的表面活性劑的濃度來(lái)促進(jìn)聚結(jié)的原因。為此，在注入水相之前，使微流體芯片注滿油，該油與之前使用的油不同，不含有表面活性劑。微流體芯片的油中的表面活性劑的濃度降低，這使得可以將界面處的表面活性劑吸附的平衡轉(zhuǎn)向解吸附。對(duì)于高濃度的表面活性劑，例如幾個(gè)重量百分?jǐn)?shù)的數(shù)量級(jí)，優(yōu)選使微流體芯片注滿相當(dāng)于微流體芯片體積的50倍的量的油。該比例取決于表面活性劑的性質(zhì)及其對(duì)兩相的親和力。

捕集阱的形狀也可以進(jìn)行優(yōu)化，以確保膠凝化微滴保持在捕集阱中的適當(dāng)位置。因此，在足夠深的圓柱形捕集阱的情況下，如果通道的高度大于捕集阱的半徑，則進(jìn)入捕集阱的微滴將是最少的，導(dǎo)致低的捕集效率。隨后，外部流動(dòng)的速度有一個(gè)限制，超過(guò)該速度，迫使微滴離開(kāi)捕集阱。相反，當(dāng)通道的高度小于捕集阱的半徑時(shí)，只要微滴足夠大，微滴就能明顯地滲透到捕集阱的空腔中，從而產(chǎn)生高的捕集效率。無(wú)論外部流的速率如何，微滴保持在適當(dāng)?shù)奈恢?。在第一種情況下，微滴的形狀非常接近其通道中的形狀，而在第二種情況下，其在局部呈現(xiàn)捕集阱的形狀。

當(dāng)選擇的水凝膠的膠凝劑為可逆的時(shí)候，可以將微滴去膠凝化，然后從微流體芯片釋放出其內(nèi)容物，如圖4至圖6所示。在這些圖4至圖6的情況下，微滴14例如是膠凝化的瓊脂糖微滴。這些瓊脂糖微滴14通過(guò)局部加熱(通過(guò)閃電栓21所示的加熱)，特別是通過(guò)紅外激光或電極，逐個(gè)去膠凝化。熱使瓊脂糖液化。當(dāng)微滴14周圍的相是水性時(shí)，去膠凝化瓊脂糖的內(nèi)容物16與水相混合。然后可以使用水相的流22攜帶該內(nèi)容物，任選地以便回收該內(nèi)容物。因此，也可以通過(guò)微流體芯片10消除被認(rèn)為不感興趣的細(xì)胞。再次，優(yōu)選地選擇捕集阱的形狀和尺寸以使得能夠提取細(xì)胞。例如，在細(xì)胞必須保持存活的情況下，捕集阱的尺寸足夠大以致加熱水凝膠不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡機(jī)制。

可替選地，當(dāng)微滴周圍的相是油性時(shí)，可以施加油流以將液體微滴從捕集阱移出。在這種情況下，捕集阱的形狀和強(qiáng)度優(yōu)選為僅允許提取所選擇的微滴而不是其它微滴的尺寸。該尺寸特別取決于水相和油之間的表面張力的值，也取決于凝膠微滴的剛性及其在捕集阱內(nèi)的形狀。

另一種替代方案是保持微滴為液體，用于處理懸浮液中的細(xì)胞，例如細(xì)菌。然后僅進(jìn)行膠凝化以選擇性提取微滴。在這種情況下，可以在提取前膠凝化所有微滴并且應(yīng)用上述方案，或者另一方面僅膠凝化那些期望保留在捕集阱中的微滴。

經(jīng)由輕微的修改，所提供的方法能夠檢測(cè)非常多樣化的生物應(yīng)用。在每種情況下，當(dāng)然也可以通過(guò)調(diào)節(jié)微流體芯片中的通道的高度以及捕集阱的幾何形狀來(lái)修改該裝置。

因此，例如快速膠凝化低濃度的細(xì)胞使得可以使在每個(gè)微滴中的幾個(gè)單細(xì)胞個(gè)體化，同時(shí)試圖限制它們的直接相互作用。這些細(xì)胞例如可以是細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

可替選地，快速膠凝化高濃度的細(xì)胞使得仍然可以獲得仍被個(gè)體化但彼此接近的大量細(xì)胞。例如可以通過(guò)旁分泌分泌物檢查細(xì)胞(可能地在共培養(yǎng)中)之間的相互作用。

然而，在膠凝化之前，細(xì)胞可以在液相中長(zhǎng)時(shí)間保持包封。然后，低濃度的細(xì)胞使得可以例如在懸浮液中研究錨定依賴性細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞。能夠使細(xì)胞沉降的高濃度的細(xì)胞和捕集的微滴的形狀使得可以將能夠?qū)⑵渥陨碇亟M為球狀體的細(xì)胞聚集在一起。

該方法還可以以受控的方式直接在芯片中形成球狀體。所產(chǎn)生的微滴的體積可以由用于在微流體芯片上游形成微滴的裝置來(lái)控制。優(yōu)選地調(diào)節(jié)該體積，使得一旦被捕集，則微滴的直徑等于捕集阱的直徑并且微滴具有球形形狀。為此，捕集阱的深度優(yōu)選至少等于其直徑。捕集的微滴的直徑與捕集阱的直徑一致的事實(shí)使得可以確保高的捕集效率。球形形狀促進(jìn)球狀體的形成。對(duì)于該特定應(yīng)用，微滴優(yōu)選含有懸浮在包含培養(yǎng)基和水凝膠或由培養(yǎng)基和水凝膠構(gòu)成的水相中的細(xì)胞。一旦捕集阱填充了這樣的微滴，則外部的油的流動(dòng)停止，這停止在微滴中的再循環(huán)并促進(jìn)細(xì)胞的沉降。然后，捕集阱中的微滴的球形形狀使得細(xì)胞在微滴的最低點(diǎn)處集中，直到它們接觸。然后，在有利于細(xì)胞的存活和適當(dāng)?shù)拇x功能的條件下，特別是在溫度方面，在幾個(gè)小時(shí)到幾天的持續(xù)時(shí)間內(nèi)，將芯片靜置，使得能夠?qū)⒓性诒徊都奈⒌蔚撞康募?xì)胞重組為球狀體。

球狀體形成所需的持續(xù)時(shí)間會(huì)特別取決于所使用的細(xì)胞類型和取決于水凝膠的組成。對(duì)于在培養(yǎng)基中稀釋的1重量％的瓊脂糖溶液中的h4iiec3大鼠肝細(xì)胞，觀察到該持續(xù)時(shí)間小于24小時(shí)。當(dāng)然，在球狀體形成期間，水凝膠保持液體。

這種方法使得可以快速形成大量的具有非常均勻尺寸的球狀體。事實(shí)上，球狀體的尺寸由每個(gè)微滴中包封的細(xì)胞數(shù)量確定，并因此由注入到微流體芯片中的細(xì)胞溶液的濃度來(lái)確定。只要細(xì)胞在注入時(shí)充分個(gè)體化，則每個(gè)微滴的細(xì)胞數(shù)量的分布、并因此形成的球狀體的尺寸的分布就非常均勻。在本發(fā)明人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，在孵育24小時(shí)之后，平均98％的捕集阱填充有一個(gè)含有良好重組的球狀體的液體瓊脂糖的微滴。

在微流體芯片中獲得的球狀體可以保持培養(yǎng)若干天。例如，包封在瓊脂糖中的h4iiec3細(xì)胞的球狀體可以在芯片中培養(yǎng)一周，而不顯著改變其活力并且同時(shí)保持高功能性(在該實(shí)例中，強(qiáng)烈和連續(xù)的白蛋白分泌)。

這里提出的方法和通過(guò)進(jìn)行該方法獲得的微流控芯片構(gòu)成了用于篩選藥劑的優(yōu)良工具。例如，可以形成癌細(xì)胞的球狀體并觀察根據(jù)暴露于被測(cè)分子其活力隨時(shí)間是否降低。通過(guò)向芯片添加能夠在室內(nèi)設(shè)置濃度梯度的裝置，或者通過(guò)設(shè)置平行芯片，可以在同一系統(tǒng)中測(cè)試整個(gè)濃度范圍。形成這些球狀體的方法的高效率也使得可以從非常有限的樣品開(kāi)始產(chǎn)生大量的這些球狀體。因此，僅用100000個(gè)細(xì)胞可以形成直徑約70μm的500個(gè)球狀體。

構(gòu)成球狀體的細(xì)胞也可以是不同的類型，以便接近共培養(yǎng)的主題。這些細(xì)胞類型可以在注入芯片中之前均勻地混合在溶液中，或者在幾個(gè)連續(xù)的水凝膠層中按照某種結(jié)構(gòu)組織排列或者僅通過(guò)在輸入在外部水相中之后粘附水凝膠而排列。例如，可以將成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞聯(lián)合以形成皮膚模型并測(cè)試化妝品的毒性，將神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合以模擬腦部，或者將如在血管壁中的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞聯(lián)合。

由于這里提出的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞微環(huán)境的非常高度的控制，故它還是研究干細(xì)胞分化的優(yōu)良工具。事實(shí)上，包封的細(xì)胞可以經(jīng)受全范圍的分化因子的濃度，并且潛在地同時(shí)經(jīng)受全范圍的基質(zhì)的剛性，同時(shí)調(diào)節(jié)例如水凝膠濃度。類似地，該方法可用于觀察胚胎隨時(shí)間的發(fā)育，與來(lái)自外部培養(yǎng)基的物理化學(xué)因子的相互作用。

在來(lái)自患者的原代細(xì)胞的情況下，該方法使得可以基于細(xì)胞對(duì)某些標(biāo)記的響應(yīng)來(lái)進(jìn)行醫(yī)學(xué)診斷。在這種情況下，細(xì)胞以非常低的損失程度被捕獲。然后可以使細(xì)胞進(jìn)行已知的用于診斷某些疾病的測(cè)試，例如癌癥活檢的表征。例如，可以例如通過(guò)原位聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)或通過(guò)fish方法來(lái)測(cè)試包封細(xì)胞的基因組中突變的存在。也可以通過(guò)標(biāo)記方法，例如通過(guò)提供用于免疫標(biāo)記的抗體或用于原位免疫酶法、elisa(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))的抗體，檢測(cè)特異性蛋白的表達(dá)。

上述方法提供了借助微滴在芯片中被捕集后的膠凝化，在微流體芯片中進(jìn)行細(xì)胞分析和培養(yǎng)的所有步驟的可能性。這使得可以使用比在多孔板或培養(yǎng)皿中進(jìn)行的測(cè)試少得多的量的試劑。這也使得可以在不同的刺激之后監(jiān)測(cè)隨時(shí)間的細(xì)胞響應(yīng)。

上述方法可以容易地在包括以下的裝置中進(jìn)行：

-形成含有細(xì)胞的水凝膠微滴的構(gòu)件，

-捕集區(qū)，特別是微流體芯片，用于在預(yù)定位置處捕集水凝膠微滴，以及

-用于膠凝化至少一部分的被捕集的微滴的構(gòu)件。

該膠凝化構(gòu)件包括例如用于將化學(xué)試劑注入捕集區(qū)中的元件和/或用于溫度調(diào)節(jié)(例如用于冷卻微流體芯片)的元件。

該裝置還可以包括用于使至少一些膠凝化的水凝膠微滴去膠凝化的構(gòu)件，例如激光器。

上述方法也使得可以生產(chǎn)具有膠凝化微滴的產(chǎn)品，其包括用于捕集微滴的區(qū)域，特別是微流體芯片，以及各自包括一個(gè)或多個(gè)捕集在捕集區(qū)中的細(xì)胞的膠凝化微滴，膠凝化微滴優(yōu)選被冷凍保存。細(xì)胞可以以簇或球狀體的形式聚集。膠凝化微滴可以浸入流體中，優(yōu)選浸入水溶液中或浸入油中，流體和微滴優(yōu)選被冷凍保存。這種冷凍保存使得特別能夠在穩(wěn)定條件下長(zhǎng)時(shí)間保持細(xì)胞，以便運(yùn)輸或存儲(chǔ)它們用于隨后的分析。

包封在微滴中的生物細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、優(yōu)選除人類細(xì)胞外的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選大鼠細(xì)胞或來(lái)自其它哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，或從其天然環(huán)境分離的人類細(xì)胞。

當(dāng)然，本發(fā)明不限于僅上述示例，在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講可存在許多變型。

除了細(xì)胞之外，使用的樣品還可以特別地是通過(guò)將它們與分子偶聯(lián)而官能化的分子或塑料珠。

此外，捕集的微滴可以與由水溶液流提供的其它微滴融合。

構(gòu)成微滴的水溶液也可含有生物化學(xué)溶液，生物化學(xué)溶液優(yōu)選包含脂質(zhì)(脂肪酸等)、碳水化合物(以單體形式或多糖形式等)、氨基酸和蛋白質(zhì)(生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、抗體、抗原等)以及鹽緩沖液和/或ph緩沖液中的至少一者。

最后，根據(jù)一個(gè)變型，微滴周圍的油(或油相)可以含有氟油(fc40型)或者可光交聯(lián)的水不混溶溶液(norlandopticaladhesive型)，其一旦聚合就可以使油膠凝化，從而物理性和選擇性地分離微滴。因此，可以更可靠地相對(duì)于彼此使微滴區(qū)室化。這使得可以防止兩個(gè)微滴融合，防止引起它們含有的樣品的混合。這也使得可以持久地儲(chǔ)存樣品，由于通過(guò)膠凝化的油使微滴區(qū)室化，在微滴周圍形成固體隔室，故微滴蒸發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)尤其極大地降低。

一旦一部分油已被膠凝化，就可以驅(qū)動(dòng)周圍的油未膠凝化的微滴從捕集區(qū)排出。為此，可以在捕集區(qū)中使用油或另一種流體的流動(dòng)，該流動(dòng)足夠強(qiáng)以攜帶微滴。因此，可以僅保留周圍的油在捕集區(qū)中膠凝化的那些微滴。

在此應(yīng)當(dāng)注意，即使在油被膠凝化的情況下，微滴也可以被膠凝化。此外，該方法當(dāng)然可以包括使膠凝化的油去膠凝化的后續(xù)步驟，在這種情況下一部分油被膠凝化。