本發(fā)明涉及特異性結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體變體iii(egfrviii)的抗體，編碼所述抗體的核酸，包含所述核酸的載體，包含所述載體的宿主細(xì)胞，制備所述抗體的方法，以及用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的所述抗體。

背景技術(shù)：

egfr(表皮生長(zhǎng)因子受體；erbb-1；人her1)是在細(xì)胞表面表達(dá)的erbb家族的受體酪氨酸激酶(rtk)，由范德堡大學(xué)的stanleycohen所發(fā)現(xiàn)。該受體的過度表達(dá)或過度活性突變表現(xiàn)為癌變(zhangh.等，2007)。egfr家族的受體(egfr(erbb-1)、her2/c-neu(erbb-2)、her3(erbb-3)以及her4(erbb-4))在諸如egf、tgf-α等的配體(在her2的情況下無已知配體)中反應(yīng)，形成同源二聚體或異源二聚體，并將激活信號(hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞。

由于二聚體的形成，如附圖中所示的經(jīng)自磷酸化通過mapk、akt或jnk的信號(hào)(downwardj.等，1984)被傳導(dǎo)以激活細(xì)胞周期或細(xì)胞增殖(odak.等，2005)。egfr的各結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)與圖1中所示相同。

用于抑制腫瘤相關(guān)egfr激活的各治療劑已經(jīng)問世，目前顯示強(qiáng)抗癌效應(yīng)。正在開發(fā)新型egfr拮抗劑，以彌補(bǔ)諸如治療劑相應(yīng)的副作用、耐受性等的缺陷。目前開發(fā)中的egfr拮抗劑的詳細(xì)情況與圖2中所示相同。

egfr過度表達(dá)及突變以多種不同形式出現(xiàn)于肺癌、肛門癌以及多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(gbm)。egfrviii突變常見于腦腫瘤，并反映手術(shù)治療、放射治療及化學(xué)治療后的預(yù)后不良(kuanct等，2003)。重組形式的egfr突變體具有特異性外顯子的缺失或復(fù)制。重組形式的egfr和egfr突變體與圖3中所示相同。

egfrviii是seqidno:1的egfr變體，其是最常出現(xiàn)的，缺乏外顯子2-7氨基酸，在50％或更多的終末病腦腫瘤患者中表達(dá)。egfrviii缺乏egfrwt的氨基酸序列中的267個(gè)氨基酸，結(jié)合外顯子1和8，產(chǎn)生作為新氨基酸的甘氨酸，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域磷酸化，顯示持續(xù)活性，由此促進(jìn)致癌作用(downwardj等，1984)。當(dāng)然，egfr的其他形式也可被靶向，但目前egfrviii被認(rèn)為是作為抗癌靶的最合適的egfr變體，許多研究和開發(fā)正在進(jìn)行中。

具體地，在腦腫瘤中，細(xì)胞信號(hào)主要通過egfrviii的pi3k和akt由主要信號(hào)傳導(dǎo)途徑傳導(dǎo)。通過作為次要途徑的stat-3、ap-1或mapk激活，其促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抵抗程序性細(xì)胞死亡，血管發(fā)生，增加癌細(xì)胞穿透，形成癌干細(xì)胞，等等(ganhk等，2013)。最近的研究已經(jīng)報(bào)道了egfrviii在致癌作用中通過mtorc2激活nf-κb而起到重要作用(stanleycohen等，2012；tanaka等，2011)。egfrviii激活相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑與圖4中所示相同。

此外，由于egfrviii誘導(dǎo)c-met磷酸化后的激活(huangph.等，2007)，當(dāng)與c-met抑制劑連同egfr或egfrviii抑制劑一起應(yīng)用和施用于患者時(shí)，可在降低高水平egfrviii患者化學(xué)治療抗藥性的同時(shí)改進(jìn)功效。

在腦腫瘤中，egfrviii通常與egfr野生型(wt)同時(shí)表達(dá)(ekstrand等，1991)，由于egfrviii自身在egfr基因擴(kuò)增的腫瘤中表達(dá)(biernat等，2004，frederick等，2000)，認(rèn)為單個(gè)的癌癥細(xì)胞會(huì)同時(shí)進(jìn)行相互作用的egfrwt擴(kuò)增和egfrviii表達(dá)。

egfrviii在腦腫瘤中以相對(duì)高頻率表達(dá)，但是在其他癌中需要進(jìn)一步的研究。最新的一項(xiàng)研究使用了被轉(zhuǎn)化表達(dá)egfrviii的腦腫瘤細(xì)胞系，該究表明，使用egfrviii和egfrwt的網(wǎng)絡(luò)的確會(huì)具有被共同激活的可能性(shiaq.等，pnas,2012)。egfrviii和egfrwt之間這樣的相互作用需要再使用egfrviii加以證實(shí)，egfrviii通過異種移植模型、gbm球體細(xì)胞系或其他細(xì)胞系天然表達(dá)。

已有報(bào)道egfr磷酸化egfrviii，導(dǎo)致stat3/5激活途徑，顯著影響腦腫瘤進(jìn)展(fanqw等，2013)。egfrviii二聚體形成顯著影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活。由于egfrwt表達(dá)增加，egfrviii磷酸化和激活提高。由此，認(rèn)為形成egfrwt二聚化的二聚化臂和激酶激活促進(jìn)egfrviii激活。從在同位移植模型中當(dāng)egfrwt或hb-egf的表達(dá)被抑制則egfrviii誘導(dǎo)的癌變被抑制的結(jié)果(lil.等，2014)可以說明，圍繞egfrwt的激活途徑在腫瘤發(fā)生中通過egfrviii激活起到重要作用。

目前，正開發(fā)的靶向egfrviii的治療(腦)腫瘤的治療劑可分為五類。第一類是一種通過使用傳統(tǒng)egfr治療劑阻斷egfrwt和egfrviii的內(nèi)部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。第二類是一種通過使用諸如abt-806(mab806,abbott)的同時(shí)靶向egfr和egfrviii的抗體抑制外部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和受體之間相互作用的方法。第三類是開發(fā)抗體藥物綴合物(adc)形式的抗egfrviii抗體，如amgen目前正在開發(fā)的amg-595。第四類是嵌合抗原受體-t細(xì)胞(car-t)形式可用作細(xì)胞免疫治療劑。第五類是一種將egfrviii特異性14個(gè)氨基酸序列與匙孔血藍(lán)蛋白(keyholelimpethemocyanin,klh)連接并將其作為egfrviii抗癌疫苗施用的方法。目前沒有僅靶向egfrviii而不靶向egfr的商業(yè)化抗癌藥，如圖6所示，有一種egfrviii疫苗cdx-110，目前由臨床開發(fā)領(lǐng)先的celldextherapeutics開發(fā)。

在這些技術(shù)背景下，本發(fā)明的發(fā)明人制備了一種新型特異性結(jié)合egfrviii的抗體。具體地，他們證實(shí)了一種僅結(jié)合egfrviii而不結(jié)合egfrwt的新型抗體，其可通過生成特異性結(jié)合egfrviii而不與egfrwt交叉反應(yīng)的抗體來制備，由此實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供新型的特異性結(jié)合egfrviii的抗體，編碼所述抗體的核酸，包含所述核酸的載體，包含所述載體的宿主細(xì)胞，其制備方法，以及用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的所述抗體。

本發(fā)明涉及結(jié)合包含seqidno:1氨基酸序列的表皮生長(zhǎng)因子受體變體iii(egfrviii)的抗體，所述抗體不與野生型表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)交叉反應(yīng)，其中，所述抗體特異性結(jié)合seqidno:1氨基酸序列的第1位至第13位氨基酸區(qū)域。

本發(fā)明涉及一種編碼所述抗體的核酸。

本發(fā)明涉及一種包含所述核酸的載體。

本發(fā)明涉及一種包含所述載體的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明涉及一種制備所述抗體的方法，所述方法包括通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞表達(dá)所述抗體。

本發(fā)明涉及一種用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的所述抗體。

本發(fā)明涉及一種通過將藥理學(xué)有效量的所述抗體施用于有相應(yīng)需要的個(gè)體治療癌癥或腫瘤的方法。

附圖說明

圖1顯示egfr的各結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)。

圖2顯示靶向egfr受體的已知拮抗劑的開發(fā)進(jìn)展。

圖3是顯示與egfr重組形式的egfr突變體的結(jié)構(gòu)的示意圖。

圖4是顯示egfrviii激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)流的示意圖。

圖5顯示獲自www.clinicaltrials.gov.的臨床開發(fā)中的egfrviii靶向治療劑候選系列。

圖6a顯示chok1-egfrviii單細(xì)胞系的受體表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。

圖6b顯示u87mg-egfrviii單細(xì)胞系的受體表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。

圖7顯示包含用于篩選egfrviii抗體的egfrviii特異性序列的肽的小珠淘選噬菌體elisa結(jié)果。

圖8顯示證實(shí)了通過小珠淘選篩選(beadpanning)的單噬菌體-抗體的抗原特異性結(jié)合能力的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。

圖9a顯示證實(shí)在非還原性緩沖液中通過sds-page處理獲得的igg的結(jié)果。

圖9b顯示證實(shí)在還原性緩沖液中通過sds-page處理獲得的igg的結(jié)果。

圖10顯示使用elisa人igg克隆的抗egfrviii肽結(jié)合。

圖11顯示使用流式細(xì)胞術(shù)的人igg克隆的egfrviii細(xì)胞系的結(jié)合特異性。

圖12顯示證實(shí)在抗egfrviii流式細(xì)胞術(shù)中人igg濃度降低影響的結(jié)合能力的結(jié)果。

圖13顯示通過elisa證實(shí)人igg輕鏈變化相應(yīng)的結(jié)合能力的結(jié)果。

圖14顯示通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)人igg輕鏈變化相應(yīng)的結(jié)合能力的結(jié)果。

圖15a顯示通過使用u87mg13的流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)抗egfrviii人igg的內(nèi)化結(jié)果。

圖15b顯示通過使用chok122-2的流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)抗egfrviii人igg的內(nèi)化結(jié)果。

具體實(shí)施方式

一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合包含seqidno:1氨基酸序列的表皮生長(zhǎng)因子受體變體iii(egfrviii)的抗體，所述抗體不與野生型表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)交叉反應(yīng)，其中，所述抗體特異性結(jié)合seqidno:1的氨基酸序列的第1位至第13位氨基酸區(qū)域。各組成具體描述如下。

抗原egfrviii

如上所述，egfrviii是egfr的缺失突變體，具有seqidno:1序列，其中，egfr細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的267個(gè)氨基酸缺失，同時(shí)接頭處具有甘氨酸單個(gè)氨基酸取代。

本發(fā)明的發(fā)明人通過使用包含egfrviii肽特異性序列13mer的肽作為抗原制備抗體，以制備特異性結(jié)合egfrviii而不與egfr野生型交叉反應(yīng)的抗體。具體地，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可特異性結(jié)合seqidno:2leekkgnyvvtdhcsggkn(n是生物素)序列，該序列中包含egfrviii肽特異性序列13mer、4mer的連接體和生物素。同時(shí)，具有ttaccdrii序列的肽，例如seqidno:3neinpgnghtnynekfks(n是生物素)用作阻斷非特異性結(jié)合的負(fù)抗原。由此，制備特異性結(jié)合egfrviii而不與egfr野生型交叉反應(yīng)的抗體。

抗體

本申請(qǐng)所用的術(shù)語“抗體”是指與特異性抗原免疫反應(yīng)的免疫球蛋白分子，表示用作特異性識(shí)別抗原的受體作用的蛋白分子，該術(shù)語可包括多克隆抗體、單克隆抗體、全抗體和抗體片段。此外，該術(shù)語還可包括嵌合抗體(例如，人源化鼠抗體)、二價(jià)或雙特異性分子(例如，雙特異性抗體)、雙抗體、三抗體和四抗體。

全抗體是具有兩條全長(zhǎng)輕鏈和兩條全長(zhǎng)重鏈的結(jié)構(gòu)，各輕鏈通過二硫鍵與重鏈連接。全抗體包括iga、igd、ige、igm和igg，igg是亞類，包括igg1、igg2、igg3和igg4。抗體片段是指具有結(jié)合抗原功能的片段，包括fab、fab'、f(ab')2和fv等。

在具有輕鏈和重鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和第一重鏈恒定區(qū)(ch1域)的結(jié)構(gòu)中，fab具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。fab'與fab的不同在于其具有鉸鏈區(qū)，該鉸鏈區(qū)在重鏈ch1結(jié)構(gòu)域的c末端區(qū)至少包含一個(gè)半胱氨酸殘基。當(dāng)fab'鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基形成二硫鍵時(shí)生成f(ab')2抗體。

可變片段(fv)是指僅具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的最小抗體片段。雙鏈fv(dsfv)通過二硫鍵連接到重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，單鏈fv(scfv)通常經(jīng)共價(jià)鍵通過肽連接體連接到重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。此類抗體片段可以通過使用蛋白水解酶獲得(例如，可以通過使用木瓜蛋白酶限制和裂解全抗體獲得fab，可以通過使用胃蛋白酶裂解全抗體獲得f(ab')2片段)，并且可以通過基因重組技術(shù)制備(例如，設(shè)定編碼抗體重鏈或其可變區(qū)的dna和編碼輕鏈或其可變區(qū)的dna作為模板，使用引物通過pcr擴(kuò)增它們，組合和擴(kuò)增編碼肽連接體的dna和引物對(duì)，所述引物對(duì)被設(shè)置成連接重鏈及其可變區(qū)和輕鏈或其可變區(qū)各自末端)。

免疫球蛋白具有重鏈和輕鏈。各重鏈和輕鏈均包含恒定區(qū)和可變區(qū)(該區(qū)域也稱為“結(jié)構(gòu)域”)。輕鏈和重鏈可變區(qū)包含被稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”(下文稱為“cdr”)的三個(gè)可變區(qū)和四個(gè)框架區(qū)。該cdr主要負(fù)責(zé)結(jié)合到抗原的表位上。從n-末端開始按鏈的cdr通常被順序稱為cdr1、cdr2和cdr3，通過特異性cdr位于其中的鏈來鑒定。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本相同的抗體組獲得的具有單一分子組成的抗體分子，可對(duì)特異性表位表現(xiàn)出單一結(jié)合特異性和親和力。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語“人抗體”是指源于人免疫球蛋白的分子，其中構(gòu)成抗體的所有氨基酸序列包括互補(bǔ)決定區(qū)和框架區(qū)均由人免疫球蛋白氨基酸序列組成。人抗體通常用于治療人疾病，其優(yōu)點(diǎn)在于：i)通過與人免疫系統(tǒng)更穩(wěn)定地相互作用而更有效地破壞靶細(xì)胞，例如，通過補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)或抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)；ii)人免疫系統(tǒng)不會(huì)將該抗體識(shí)別為外來抗體；以及iii)即使以較小量較低頻率施用較小量藥物，人循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期也與天然存在的抗體的半衰期相似。

鑒于如上所述，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體是特異性結(jié)合egfrviii的單克隆抗體，其不僅對(duì)于egfrviii表現(xiàn)強(qiáng)親和力和特異性，而且表現(xiàn)低免疫原性，這是因?yàn)槠湓醋杂谌?，由此適于治療諸如癌癥或腫瘤的疾病。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語“特異性結(jié)合egfrviii的抗體”是指結(jié)合egfrviii而抑制egfrviii生物活性的抗體，該術(shù)語可與“抗egfrviii抗體”交換使用。此時(shí)，egfrviii的kd可為例如10^-8或更少，優(yōu)選10^-9或更少，更優(yōu)選10^-10或更少。

本申請(qǐng)使用的術(shù)語“不與egfr交叉反應(yīng)”可指結(jié)合egfr野生型的抗體和結(jié)合egfrviii的抗體不顯示對(duì)于各抗原的交叉反應(yīng)性。此時(shí)，不與egfr交叉反應(yīng)的抗體具有針對(duì)對(duì)egfr野生型的抗體的kd的，例如，10^-5或更多、優(yōu)選10^-4或更多、更優(yōu)選10^-3或更多。實(shí)際上，不與egfr交叉反應(yīng)的抗體可指這樣一種抗體，即這種抗體不能以標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定的非限制形式檢測(cè)結(jié)合egfr野生型的抗體。

在一種非限制性實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可為，例如，實(shí)施例1中具體描述的，不與egfr交叉反應(yīng)的單克隆人抗體pa430、pd27、pd52以及pd10，結(jié)構(gòu)上特定化并分離以特異性結(jié)合seqidno:1的egfrviii氨基酸序列的第1位至第13位氨基酸區(qū)域。各抗體的重鏈cdr和輕鏈cdr在下列表1和表2中列出。

[表1]

[表2]

根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可通過例如混合vh和vl序列來生成，所述vh和vl序列與表1和表2中所述的vhcdr1、vhcdr2及vhcdr3序列和vlcdr1、vlcdr2及vlcdr3序列在結(jié)構(gòu)上相似，被設(shè)置為vh/vl配對(duì)的cdr1、cdr2以及cdr3，可包括例如包含下列重鏈cdr的重鏈可變區(qū)：

包含選自seqidno:4-7的至少一種氨基酸序列的重鏈cdr1；

包含選自seqidno:8-11的至少一種氨基酸序列的重鏈cdr2；以及

包含選自seqidno:12-15的至少一種氨基酸序列的重鏈cdr3。

此外，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含下列輕鏈cdr：

包含選自seqidno:16-19的至少一種氨基酸序列的輕鏈cdr1；

包含選自seqidno:20-23的至少一種氨基酸序列的輕鏈cdr2；以及

包含選自seqidno:24-27的至少一種氨基酸序列的輕鏈cdr3。

在一種實(shí)施方式中,根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可特別包含下列表3中所述的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，或與它們具有同源性的序列：

[表3]

根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可包含例如重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含與選自seqidno:28-31的至少一種氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。該抗體可包括，即，seqidno:28-31的序列作為重鏈可變區(qū)，包含與選自seqidno:28-31的至少一種氨基酸序列具有至少80％同源性、優(yōu)選至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同源性以及更優(yōu)選100％同源性的序列的重鏈可變區(qū)。

此外，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含與選自seqidno:32-35的至少一種氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。該抗體可包括，即，seqidno:32-35的序列作為輕鏈可變區(qū)，包含與選自seqidno:32-35的至少一種氨基酸序列具有至少80％同源性、優(yōu)選至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同源性以及更優(yōu)選100％同源性的序列的輕鏈可變區(qū)。

具體地，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可包含選自下列序列的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，表3中所述的vh序列和vl序列可通過混合vh和vl序列來生成，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上相似，可非限制性設(shè)置為vh/vl配對(duì)：

包含seqidno:28序列的重鏈可變區(qū)和選自seqidno:32-35的序列的輕鏈可變區(qū)；

包含seqidno:29序列的重鏈可變區(qū)和選自seqidno:32-35的序列的輕鏈可變區(qū)；

包含seqidno:30序列的重鏈可變區(qū)和選自seqidno:32-35的序列的輕鏈可變區(qū)；

包含seqidno:31序列的重鏈可變區(qū)和選自seqidno:32-35的序列的輕鏈可變區(qū)。

具體地，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可包含下列重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)：

包含seqidno:28序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno:32序列的輕鏈可變區(qū)；

包含seqidno:29序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno:33序列的輕鏈可變區(qū)；

包含seqidno:30序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno:34序列的輕鏈可變區(qū)；

包含seqidno:31序列的重鏈可變區(qū)和包含seqidno:35序列的輕鏈可變區(qū)。

另一方面，本發(fā)明涉及編碼抗體的核酸。本申請(qǐng)所用的術(shù)語“核酸”可以在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞裂解物或者以部分純的形式或基本純的形式提供。當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括堿/sds處理、cscl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳以及其他本領(lǐng)域公知的技術(shù)從其他細(xì)胞組分或其他污染物(例如，其他細(xì)胞的核酸或蛋白質(zhì))純化時(shí)，核酸成為“分離的”或“基本純的”。本發(fā)明的核酸可為例如dna或rna，可包含或不包含內(nèi)含子序列。

在一非限制性實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明所述的編碼vh序列和vl序列的核酸在表4中描述，可包含與選自seqidno:36-39的編碼重鏈可變區(qū)的序列具有至少95％同源性的至少一種重鏈可變區(qū)編碼序列，和/或可包含與選自seqidno:40-43的至少一種輕鏈可變區(qū)編碼序列具有至少95％同源性的至少一種輕鏈可變區(qū)編碼序列。該抗體與選自seqidno:36-39和/或seqidno:40-43的至少一種核酸序列具有至少95％同源性、優(yōu)選至少98％同源性、更優(yōu)選100％同源性。

[表4]

本發(fā)明可包括一種綴合物，其中，毒素、藥物等與抗體連接。毒素或藥物可包括任何靶化合物。這樣的毒素的實(shí)例可為duocamycin,刺孢霉素，美登新(mytansine)或阿里他汀(auristatin)，所述化合物可為已知的抗癌或抗腫瘤化合物，例如，紫杉醇(taxol)，依托泊苷(etoposide)，tenofoside，長(zhǎng)春新堿，阿霉素等，烷化劑(例如，順鉑，蒽環(huán)類抗生素(例如阿霉素等)。綴合物可使用本領(lǐng)域可獲得的技術(shù)使用交聯(lián)劑來制備。

此外，除了抗體外，本發(fā)明還可包括雙特異性結(jié)合分子，該雙特異性結(jié)合分子包含兩個(gè)或更多不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中，肽、蛋白質(zhì)或抗體與不同于抗體的其他抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。雙特異性結(jié)合分子可通過使用本領(lǐng)域已知的方法連接結(jié)合特異性部分來制備。此外，當(dāng)連接抗體時(shí)，可在重鏈的c末端區(qū)通過巰基來連接。根據(jù)具體情況，所述抗體可在同一載體被編碼，并且在同一待組合的宿主細(xì)胞中被表達(dá)。

抗體的制備方法

另一方面，本發(fā)明涉及一種包含核酸的載體。為了表達(dá)抗體或其抗體片段，可通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)(例如，使用表達(dá)靶抗體的雜交瘤的pcr擴(kuò)增或cdna克隆)來獲得編碼輕鏈和重鏈的部分或全長(zhǎng)的dna，并且可將其插入到表達(dá)載體中，以此將dna與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列操作性連接。

本申請(qǐng)所用的術(shù)語“操作性連接”可指將抗體基因與載體連接以致載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列起到調(diào)控抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。對(duì)于表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列的選擇要使得其與用于表達(dá)的宿主細(xì)胞匹配。將抗體的輕鏈基因和抗體的重鏈基因插入各自的載體，或?qū)煞N基因均插入同一表達(dá)載體。通過標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，在抗體基因片段和載體上連接互補(bǔ)限制性酶位點(diǎn)，或者如果不存在非限制性酶位點(diǎn)鈍末端連接)將抗體插入表達(dá)載體。根據(jù)具體情況，重組表達(dá)載體可編碼有利于從宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號(hào)肽。可將抗體鏈基因克隆至載體中，以致將信號(hào)肽與抗體鏈基因的氨基末端結(jié)合以適合框架。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(例如，源自非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的信號(hào)肽)。此外，重組表達(dá)載體具有調(diào)控宿主細(xì)胞中抗體鏈基因表達(dá)的“調(diào)控序列”?！罢{(diào)控序列”可包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及其他調(diào)控抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的表達(dá)調(diào)控元件(例如，多腺苷酸化信號(hào))。本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，根據(jù)諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素，可通過選擇不同調(diào)控序列來改變表達(dá)載體的設(shè)計(jì)。

本發(fā)明還可包括宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含核酸或載體。所述核酸或載體是轉(zhuǎn)染過的?？梢允褂猛ǔＳ糜趯⑼庠磀na導(dǎo)入待“轉(zhuǎn)染”的原核或真核宿主細(xì)胞的多種技術(shù)，例如，電泳、磷酸鈣沉淀方法、deae-葡聚糖轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可在真核細(xì)胞中表達(dá)，考慮到應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的可能性，優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。用于抗體表達(dá)的合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞(包括，例如，與dhfr可選擇標(biāo)記物一起使用的dhfr-cho細(xì)胞)，nso骨髓瘤細(xì)胞，cos細(xì)胞或sp2細(xì)胞等。

另一方面，本發(fā)明涉及一種制備抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞以表達(dá)所述抗體。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞時(shí)，可通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞持續(xù)一段足以允許抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間，或更優(yōu)選地，持續(xù)一段足以允許抗體分泌至培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中的時(shí)間。此外，抗體的制備可包括使用包含seqidno:1的氨基酸序列的egfrviii淘選。

根據(jù)具體情況，可從宿主細(xì)胞中分離表達(dá)抗體，并將其純化至同質(zhì)?？贵w的分離或純化可通過用于常規(guī)蛋白質(zhì)的分離和純化方法來進(jìn)行，例如層析。層析可包括，例如，親和層析(包括蛋白質(zhì)a柱、蛋白質(zhì)g柱)，離子交換層析，或疏水層析。除層析以外，還可通過聯(lián)合過濾、超濾、鹽析、透析等進(jìn)一步分離和純化抗體。

藥物組合物

另一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療癌癥或腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的所述抗體。

本申請(qǐng)所用的術(shù)語“癌癥或腫瘤”并非特別限制，只要是可通過本發(fā)明的抗體治療的癌癥或腫瘤類型。例如，可以是由egfrviii過度表達(dá)導(dǎo)致的乳腺癌、肺癌或肛門癌，和腦腫瘤，例如原發(fā)性腦腫瘤(即，在腦中發(fā)生的)和繼發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腦腫瘤。

根據(jù)具體情況，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可與其他抗癌藥物聯(lián)合施用(即，在接受癌癥治療之前、過程中或之后)。其可聯(lián)合本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何一種或多種化學(xué)治療藥物施用，例如，烷化劑，例如卡氮芥、苯丁酸氮芥、順鉑、碳鉑、oxyplatin、proccarbazine以及環(huán)磷酰胺；抗代謝物，例如，氟尿嘧啶、氟尿苷(phloxuridine)、氟達(dá)拉濱、吉西他濱(gemcitabine)、甲氨喋呤以及羥基脲；天然產(chǎn)物，例如植物生物堿，或抗生素，例如博來霉素、阿霉素、柔紅霉素、去甲氧基柔紅霉素、依托泊苷、絲裂霉素、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿，以及諸如的紫杉醇(paclitaxel)或相關(guān)化合物；用于治療腦腫瘤的治療劑，例如包含替莫唑胺或卡氮芥的薄片(wafer)；以及其他藥物，例如依立替康，格列衛(wèi)(gleevec)等。此外，可包括其他生物劑，例如，單克隆抗體，例如用于her2抗原的herceptin^tm，用于vegf的avastin^tm；針對(duì)egf受體的抗體，例如以及其他egf受體拮抗劑。

藥物組合物可配制成包含藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指不刺激活生物體且不抑制所施用化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。用于待配制成液體溶液的組合物的藥學(xué)上可接受的載體適于滅菌和活體，可通過混合鹽水溶液、無菌水、林格氏液(ringer’ssolution)、緩沖的鹽水溶液、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇或這些組分中的一種或多種來使用。如有必要，可添加其他常用添加劑，例如抗氧化劑、緩沖劑和制菌劑。此外，可另外添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑以及潤(rùn)滑劑而配制成注射制劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑，例如水性溶液，懸浮液、乳劑等。

藥物組合物可以是各種口服或胃腸外制劑形式。在制劑的情況下，可使用常規(guī)使用的稀釋劑或賦形劑制備，例如填料、填充劑、粘合劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑、表面活性劑等?？诜┯玫墓腆w制劑包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊等，可通過將一種或多種諸如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等的賦形劑與一種或多種化合物混合來制備。此外，除了簡(jiǎn)單的賦形劑，也可使用諸如硬脂酸鎂、滑石等的潤(rùn)滑劑。口服施用的液體制劑實(shí)例包括懸浮液、溶液、乳劑以及糖漿等。除了通常用作簡(jiǎn)單稀釋劑的水和液體石蠟以外，還可包括各種賦形劑，例如，潤(rùn)濕劑，甜味劑，香料，防腐劑等。

腸胃外給藥的制劑可包括滅菌水溶液劑、非水溶液劑、懸浮劑、乳劑、凍干劑以及栓劑。非水溶劑和懸浮液溶劑的實(shí)例包括丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油的植物油、諸如油酸乙酯的可注射酯。witepsol、聚乙二醇、吐溫、可可脂、月桂脂、甘油明膠等可用作栓劑基質(zhì)。

藥物組合物可具有選自如下的任一種制劑：片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、懸浮液、溶液劑、乳劑、糖漿、滅菌水溶液劑、非水溶液劑、懸浮劑、乳劑、凍干制劑和栓劑。此外，可以一次或多次施用。此時(shí)，以液體制劑、粉劑、氣霧劑、膠囊、陰道片劑、膠囊或栓劑的形式施用組合物。施用途徑可包括但不限于腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)口、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)等。然而，當(dāng)口服施用時(shí)，由于肽在胃中消化，必須配制成保護(hù)其防止在胃中降解或?qū)钚猿煞职?。此外，可通過任何能夠轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的裝置施用活性物質(zhì)。

可以以藥學(xué)有效量施用組合物，“治療有效量”可指足以以適用于醫(yī)學(xué)治療的合理利益/風(fēng)險(xiǎn)比治療疾病的量。有效劑量水平通過如下因素來確定，包括個(gè)體的類型和嚴(yán)重程度、年齡、性別、癌癥類型、藥物活性、對(duì)藥物的敏感性、給藥時(shí)間、給藥途徑、釋放速率、治療持續(xù)時(shí)間、同時(shí)使用的藥物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的其他因素。通?？梢砸?.1至5mg/kg的高劑量給藥組合物，例如1、2、3或4mg/kg，10mg/kg，或15或20mg/kg。作為固定的單位量，例如，可以以50、100、200、500或1000mg提供。為了導(dǎo)致癌癥或腫瘤退化，更優(yōu)選去除腫瘤，可以1至8次(例如1、2、3、4、5、6、7或8次)，或10、20或更多次給藥?；诳贵w的半衰期，可每周兩次，每周一次、每?jī)芍芤淮?、每個(gè)月一次，或以一周、兩周、四周、八周、三至六個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間的其他間隔來給藥。

在下文中，將通過實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，這些實(shí)施例僅例示本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1：egfrviii細(xì)胞系的建立

通過使用dna合成(invitrogen，seqidno:1)獲得含有hindiii和xbai限制性酶位點(diǎn)的egfrviii基因，并通過使用hindiii和xbai限制性酶裂解該基因。將所裂解的模板dna克隆至使用hindiii和xbai限制性酶裂解的表達(dá)載體pcdna3.1中，以組合pcdna3.1-egfrviii。將pcdna3.1-egfrviii轉(zhuǎn)化至dh5α大腸桿菌中以篩選氨芐霉素抗性菌株。確認(rèn)是否通過使用hindiii和xbai限制性酶裂解而插入egfrviii基因。

就chok1、u87mg以及a431而言，通過使用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染被制備以產(chǎn)生egfrviii細(xì)胞系的pcdna3.1-egfrviii載體，在10％fbs,dmem中培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)。將所培養(yǎng)的細(xì)胞在添加g418的10％fbs(1000μg/ml、400μg/ml、400μg/ml1:10稀釋度)的dmem或rpmi中培養(yǎng)之后，在6孔板中篩選和增殖待克隆的細(xì)胞。當(dāng)溶解各增殖12天的細(xì)胞之后，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，并進(jìn)行電泳，使用抗egfr抗體和抗人igghrp處理，與ecl底物反應(yīng)(圖6a和6b)。

實(shí)施例2：生物淘選

將用作抗原的egfrviii肽合成為含有用作連接體的特異性序列13mer和4mer以及生物素(seqidno:2)。還將生物素-ttaccdrii肽(seqidno:3)合成為負(fù)抗原以阻斷非特異性結(jié)合。使用m-280鏈霉親和素(invitrogen,usa)珠以每5μl連接7.8ng肽制備各肽。

在25℃使人抗體噬菌體文庫(kù)與事先連接至小珠的ttaccdrii肽反應(yīng)30分鐘以誘導(dǎo)非特異性噬菌體抗體結(jié)合。其后，使用磁棒收集結(jié)合至小珠的ttaccdrii肽，然后分開僅收取上清液。將上清液再添加至結(jié)合小珠的egfrviii肽，在25℃反應(yīng)2小時(shí)以發(fā)生抗體噬菌體的結(jié)合。使用磁棒收集結(jié)合至小珠的egfrviii肽，移除噬菌體上清液。使用pbst(含有0.1％tween20的pbs)重復(fù)洗滌吸引至磁棒上的小珠egfrviii肽5次，最后，使用pbs洗滌一次。使100ul100mm的三乙胺溶液反應(yīng)10分鐘，以使得結(jié)合至抗原的噬菌體洗脫，通過50ul1mtrisph7.5中和洗脫的噬菌體。

將中和的噬菌體洗脫液添加至10ml對(duì)數(shù)中期xl1-blue大腸桿菌細(xì)胞系，在37℃反應(yīng)30分鐘以誘導(dǎo)感染。將所感染的xl1-blue大腸桿菌細(xì)胞系鋪于含有1％葡萄糖的2×yt/c板上，在30℃培養(yǎng)16小時(shí)。以相同方式進(jìn)行第一輪淘選和第二輪和第三輪淘選。

實(shí)施例3：特異性結(jié)合egfrviii的噬菌體抗體的篩選

從所完成的淘選中隨機(jī)選擇大腸桿菌克隆，在96孔板37℃和300rpm下在對(duì)數(shù)中期通過添加500μl2×yt/c培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后添加m13輔助噬菌體，之后在37℃誘導(dǎo)噬菌體感染30分鐘。在30℃和30rpm條件下培養(yǎng)所感染的大腸桿菌克隆15小時(shí)，以制備待洗脫的噬菌體抗體。在6000rpm下離心所培養(yǎng)的大腸桿菌克隆細(xì)胞10分鐘以去除細(xì)胞，僅獲得上清液。

以1μg/ml將egfrviii肽、ttaccdrii肽以及bsa涂覆在maxisorb96孔elisa板(nunc，denmark)上，在室溫下使用3％脫脂乳/pbs封閉1小時(shí)，然后使用所獲得的上清液接種，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。使用0.05％pbst洗滌elisa板3次，然后經(jīng)1小時(shí)將抗m13-hrp(辣根過氧化物酶)抗體(ge)稀釋至1:3000.05％pbst。在處理10分鐘并tmb底物(bd,usa)顯色后，通過2nh2so4處理終止反應(yīng)。在450nm-650nm使用sunriseelisa讀板機(jī)(tecan，switzerland)測(cè)量顯色elisa(圖7)。

實(shí)施例4：蛋白質(zhì)印跡

使用chok1-egfrviii細(xì)胞裂解物通過蛋白質(zhì)印跡觀察噬菌體-抗體的egfrviii結(jié)合能力。

使用pbs洗滌實(shí)施例1中制備的chok122-2(作為chok1-egfrviii細(xì)胞系)和作為其母細(xì)胞表達(dá)chok1和egfr的a431，通過使用洗脫緩沖液(1％sds，1mmna3vo3，10mmtris(ph7.4)，1mmpmsf，10μm亮抑酶肽(leupeptin)，1.5μm胃蛋白酶(pepstein)，以及10μg/ml抑肽酶)溶解。通過6％sds-page分離15μg各細(xì)胞裂解物之后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至pvdf膜。在使用3％脫脂乳tbst封閉1小時(shí)之后，處理5×10¹⁰pfupa430噬菌體和pd54噬菌體1小時(shí)，之后經(jīng)1小時(shí)將抗m13-hrp(辣根過氧化物酶)抗體(ge)稀釋至1:24000tbst，在通過使用ecl(gehealthcare，usa)底物顯色之后，使用odysseyfc成像系統(tǒng)(licor，usa)確認(rèn)印跡。

結(jié)果示于圖8，根據(jù)圖8，可以理解pa430噬菌體和pd54噬菌體僅在表達(dá)egfrviii的細(xì)胞系中結(jié)合。

實(shí)施例5：igg表達(dá)和純化

通過使用包含噬菌體-抗體重鏈可變區(qū)以獲取片段的sfii限制性酶雙切，并且通過在包含重鏈區(qū)以獲取與片段連接的pigghd-6a6hvy中使用sfii限制性酶雙切，實(shí)現(xiàn)向igg形式的轉(zhuǎn)化。

通過使用包含噬菌體-抗體輕鏈可變區(qū)的bstxi限制性酶雙切獲取片段。以與包含輕鏈區(qū)的載體piggld-6a6lgt相同的方式將片段與片段連接(對(duì)于上述方法，請(qǐng)參考韓國(guó)專利申請(qǐng)公開文本no.2008-0109417)。

通過每100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿8×10⁶個(gè)細(xì)胞，接種hek293t細(xì)胞，并且在37℃co25％培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)以致細(xì)胞的附著和密度達(dá)到80～90％培養(yǎng)細(xì)胞來測(cè)定igg的表達(dá)。以80％至90％來培養(yǎng)細(xì)胞。

將所制備的igg的10μg重鏈表達(dá)載體和10μg輕鏈表達(dá)載體，即總共20μg載體與pei以1:3(dna:pei)μg比例混合，反應(yīng)15分鐘以形成復(fù)合物。將dnapei復(fù)合物添加至培養(yǎng)的細(xì)胞中，在反應(yīng)10小時(shí)之后，使用dmem洗滌一次。然后，通過添加10ml其中添加了10％青霉素鏈霉素(gibco，usa)至freestyle293(gibco，usa)的培養(yǎng)基，放置48小時(shí)，以獲取其中表達(dá)igg的上清液。

將所獲得的上清液注射至使用20mmtris-hcl,50mmnacl及5mmedtaph7.0平衡的蛋白a柱(gehealthcare,usa)，使用50mmtris-hcl(ph7.0),5mmedta,500mmnacl,0.2％聚山梨醇酯20洗滌，然后使用50mmnacl,0.1m甘氨酸-hcl(ph3.5)溶液洗脫。之后，進(jìn)行使用1mtris中和的親和層析。在mwco10,000spectra/por透析膜(spectrum,usa)中回收洗脫的蛋白質(zhì)，通過pbs透析置換溶液。

結(jié)果示于圖9a和9b。根據(jù)圖9a和9b，使用非還原性或還原性lds樣品緩沖液通過sds-page處理各抗體，當(dāng)將其上樣至nupage4-12％bis-trisgel(invitrogen,usa)上時(shí)，獲得包含50kd重鏈和25kda輕鏈對(duì)應(yīng)于150kda的igg。

實(shí)施例6：特異性結(jié)合egfrviii的igg的篩選

進(jìn)行elisa以鑒定轉(zhuǎn)化為igg的克隆的抗原特異性結(jié)合能力。在37℃將egfrviii肽、ttaccdrii肽以及bsa鋪于1μg/ml96孔板2小時(shí)。此后，在使用3％脫脂乳/0.05％pbst封閉未覆蓋的部分之后，將1μg/mligg添加至板上，于37℃反應(yīng)1小時(shí)。以1:3000稀釋抗人igghrp(pierce,usa)，反應(yīng)1小時(shí)。接下來，處理tmb底物(bd，usa)10分鐘用于顯色，通過使用2nh2so4處理來終止反應(yīng)。對(duì)于顯色elisa，在450nm-650nm使用sunriseelisa讀板機(jī)(tecan，switzerland)檢測(cè)吸光度。

結(jié)果示于圖10，根據(jù)圖10，pa430、pd27、pd52以及pd10僅對(duì)于egfrviii肽顯示特異性結(jié)合能力，而無非特異性結(jié)合。

基于這些結(jié)果，進(jìn)行熒光染色流式細(xì)胞術(shù)，以證實(shí)上述四種抗體是否保持egfrviii表達(dá)細(xì)胞系的結(jié)合能力。以egfrviii表達(dá)細(xì)胞系，chok122-2及其母細(xì)胞，chok1以及表達(dá)egfr野生型的a431為試驗(yàn)對(duì)象。以1×10⁶個(gè)細(xì)胞數(shù)獲取各細(xì)胞，以在添加有2％fbs的pbs中1μg/ml的各抗體稀釋，并添加至細(xì)胞，在4℃反應(yīng)1小時(shí)。1:200稀釋抗人iggpe(bethyl，usa)，在4℃反應(yīng)45分鐘，用于熒光染色。使用facscaliber(bd,usa)儀器以每樣品1×10⁴個(gè)細(xì)胞檢測(cè)各樣品。

結(jié)果示于圖11，根據(jù)圖11，pa431、pd27以及pd10能夠結(jié)合egfrviii表達(dá)細(xì)胞系chok122-2，但不結(jié)合egfrviii非表達(dá)細(xì)胞系chok1和a431。此外，顯示在表達(dá)egfr野生型的a431中未觀察到結(jié)合。

為了根據(jù)抗體濃度的降低來證實(shí)三種對(duì)于egfrviii表達(dá)細(xì)胞系顯示結(jié)合能力的抗體的結(jié)合特性，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。從1000ng/ml連續(xù)數(shù)量級(jí)雙倍稀釋抗體濃度，制備至達(dá)31ng/ml。以如上所述相同數(shù)量級(jí)進(jìn)行熒光染色流式細(xì)胞術(shù)。

結(jié)果示于圖12，根據(jù)圖12，觀察到，pa430顯示高結(jié)合能力，即便是在與pd27和pd10相同濃度下處理igg時(shí)也是如此。

實(shí)施例7：輕鏈親和力增強(qiáng)的變化

改變輕鏈以增強(qiáng)pa430的抗原特異性親和力。當(dāng)考察pa430、pd52以及pd27的輕鏈可變區(qū)的cdr時(shí)，已經(jīng)證實(shí)它們?cè)趐a430的輕鏈可變區(qū)序列中是相似的，具有高抗原特異性親和力(見表1-3)。利用該事實(shí)，除了原始的pa430輕鏈，將pd52、pd27以及pd10的輕鏈載體與pa430的重鏈載體混合，進(jìn)行轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生igg，這與實(shí)施例5中相同。

當(dāng)以實(shí)施例6的elisa相同方式進(jìn)行所產(chǎn)生的和鑒定的430h10l、430h52l以及430h27l的實(shí)驗(yàn)時(shí)，證實(shí)其保持了抗原特異性結(jié)合能力(圖13)。

對(duì)于pa430和430h52l、430h27l和pd10igg以相同方式進(jìn)行實(shí)施例6的熒光染色流式細(xì)胞術(shù)。當(dāng)對(duì)于基于u87mg細(xì)胞和a43116-3細(xì)胞系(基于a431細(xì)胞作為egfrviii表達(dá)細(xì)胞系產(chǎn)生的)作為egfrviii表達(dá)細(xì)胞系產(chǎn)生的u87mg13細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，證實(shí)430h52l和430h27l保持結(jié)合能力，即便在egfrviii特異性細(xì)胞系中也是如此。此外，觀察到430h52l的結(jié)合信號(hào)顯著，即便在與具有環(huán)輕鏈的pa430相同濃度處理時(shí)也是如此(圖14)。

實(shí)施例8：使用熒光染色流式細(xì)胞術(shù)分析抗體內(nèi)化

通過使用具有egfrviii特異性結(jié)合能力的430h52l抗體，進(jìn)行熒光染色流式細(xì)胞術(shù)，以證實(shí)是否通過抗體-egfrviii結(jié)合進(jìn)行了內(nèi)化。

針對(duì)u87mg13細(xì)胞和chok122-2細(xì)胞，使用胰蛋白酶edta處理2×10⁶個(gè)細(xì)胞，然后在4℃冷卻30分鐘，以抑制細(xì)胞活性。在4℃于dmem培養(yǎng)基中使用1μg/ml430h52l處理細(xì)胞30分鐘以誘導(dǎo)抗體抗原結(jié)合。使用僅dmem處理的二級(jí)抗體處理樣品。接下來，在1300rpm離心3分鐘后，使用pbs洗滌細(xì)胞以去除殘留抗體，添加dmem培養(yǎng)基，在4℃與樣品反應(yīng)，在co25％下37℃溫育樣品15分鐘，37℃溫育樣品30分鐘，以及37℃溫育樣品60分鐘。在離心后，在4℃使用pbs洗滌細(xì)胞，然后0.1m甘氨酸和0.5mnaclph2.2重復(fù)處理三次每次10分鐘，以人工去除結(jié)合細(xì)胞表面egfrviii的抗體。離心之后，使用pbs洗滌細(xì)胞，在4℃使用4％多聚甲醛(usb，usa)固定10分鐘。通過0.1％triton-100(sigmaaldrich,usa)pbs溶液使各樣品滲透，或使用2％fbspbs溶液處理，以致不發(fā)生滲透。離心之后，使用pbs洗滌細(xì)胞，2％fbspbs處理和封閉，以1:400處理抗人iggpe(bethyl,usa)，用于染色。使用facscaliber(bd,usa)儀器以每一樣品1×10⁴個(gè)細(xì)胞來檢測(cè)各樣品。

結(jié)果分別示于圖15a和15b。根據(jù)15a和15b，當(dāng)使用430h52l抗體處理egfrviii表達(dá)細(xì)胞系u87mg13或chok122-2細(xì)胞和通過使用細(xì)胞透化通過各溫度和時(shí)間的反應(yīng)進(jìn)行熒光染色時(shí)，觀察到與4℃相比在37℃信號(hào)隨著時(shí)間增加而增加。當(dāng)在不進(jìn)行細(xì)胞透化的對(duì)照組中進(jìn)行非透化熒光染色時(shí)，沒有信號(hào)隨著溫度和時(shí)間增加而增加。這通過37℃條件下430h52ligg結(jié)合egfrviii以致內(nèi)化隨著時(shí)間增加而增加的熒光信號(hào)來證實(shí)。

根據(jù)本發(fā)明所述的特異性結(jié)合egfrviii的抗體是僅結(jié)合egfrviii而不結(jié)合野生型egfr(egfrwt)的新型抗體，在表達(dá)egfrviii的細(xì)胞中顯示顯著的結(jié)合能力。已經(jīng)證實(shí)發(fā)生內(nèi)化，由此其可用作靶向egfrviii的有效拮抗劑。由此，根據(jù)本發(fā)明所述的特異性結(jié)合egfrviii的抗體可有效用于治療egfrviii表達(dá)誘導(dǎo)的疾病。

基于上述內(nèi)容，本發(fā)明范圍內(nèi)的多種變化和修飾對(duì)于本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。

序列表

<110>藥物抗體公司

<120>新型egfrviii抗體和包含所述抗體的組合物

<130>pdk03479a

<140>pct/kr2014/011381

<141>2014-11-25

<160>43

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>919

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>egfrviii的序列

<400>1

leugluglulyslysglyasntyrvalvalthrasphisglysercys

151015

valargalacysglyalaaspsertyrglumetglugluaspglyval

202530

arglyscyslyslyscysgluglyprocysarglysvalcysasngly

354045

ileglyileglygluphelysaspserleuserileasnalathrasn

505560

ilelyshisphelysasncysthrserileserglyaspleuhisile

65707580

leuprovalalapheargglyaspserphethrhisthrproproleu

859095

aspproglngluleuaspileleulysthrvallysgluilethrgly

100105110

pheleuleuileglnalatrpprogluasnargthraspleuhisala

115120125

phegluasnleugluileileargglyargthrlysglnhisglygln

130135140

pheserleualavalvalserleuasnilethrserleuglyleuarg

145150155160

serleulysgluileseraspglyaspvalileileserglyasnlys

165170175

asnleucystyralaasnthrileasntrplyslysleupheglythr

180185190

serglyglnlysthrlysileileserasnargglygluasnsercys

195200205

lysalathrglyglnvalcyshisalaleucysserprogluglycys

210215220

trpglyprogluproargaspcysvalsercysargasnvalserarg

225230235240

glyargglucysvalasplyscysasnleuleugluglygluproarg

245250255

gluphevalgluasnserglucysileglncyshisproglucysleu

260265270

proglnalametasnilethrcysthrglyargglyproaspasncys

275280285

ileglncysalahistyrileaspglyprohiscysvallysthrcys

290295300

proalaglyvalmetglygluasnasnthrleuvaltrplystyrala

305310315320

aspalaglyhisvalcyshisleucyshisproasncysthrtyrgly

325330335

cysthrglyproglyleugluglycysprothrasnglyprolysile

340345350

proserilealathrglymetvalglyalaleuleuleuleuleuval

355360365

valalaleuglyileglyleuphemetargargarghisilevalarg

370375380

lysargthrleuargargleuleuglngluarggluleuvalglupro

385390395400

leuthrproserglyglualaproasnglnalaleuleuargileleu

405410415

lysgluthrgluphelyslysilelysvalleuglyserglyalaphe

420425430

glythrvaltyrlysglyleutrpileprogluglyglulysvallys

435440445

ileprovalalailelysgluleuargglualathrserprolysala

450455460

asnlysgluileleuaspglualatyrvalmetalaservalaspasn

465470475480

prohisvalcysargleuleuglyilecysleuthrserthrvalgln

485490495

leuilethrglnleumetpropheglycysleuleuasptyrvalarg

500505510

gluhislysaspasnileglyserglntyrleuleuasntrpcysval

515520525

glnilealalysglymetasntyrleugluaspargargleuvalhis

530535540

argaspleualaalaargasnvalleuvallysthrproglnhisval

545550555560

lysilethrasppheglyleualalysleuleuglyalagluglulys

565570575

glutyrhisalagluglyglylysvalproilelystrpmetalaleu

580585590

gluserileleuhisargiletyrthrhisglnseraspvaltrpser

595600605

tyrglyvalthrvaltrpgluleumetthrpheglyserlysprotyr

610615620

aspglyileproalasergluileserserileleuglulysglyglu

625630635640

argleuproglnproproilecysthrileaspvaltyrmetilemet

645650655

vallyscystrpmetileaspalaaspserargprolyspheargglu

660665670

leuileileglupheserlysmetalaargaspproglnargtyrleu

675680685

valileglnglyaspgluargmethisleuproserprothraspser

690695700

asnphetyrargalaleumetaspglugluaspmetaspaspvalval

705710715720

aspalaaspglutyrleuileproglnglnglyphepheserserpro

725730735

serthrserargthrproleuleuserserleuseralathrserasn

740745750

asnserthrvalalacysileaspargasnglyleuglnsercyspro

755760765

ilelysgluaspserpheleuglnargtyrserseraspprothrgly

770775780

alaleuthrgluaspserileaspaspthrpheleuprovalproglu

785790795800

tyrileasnglnservalprolysargproalaglyservalglnasn

805810815

provaltyrhisasnglnproleuasnproalaproserargasppro

820825830

histyrglnaspprohisserthralavalglyasnproglutyrleu

835840845

asnthrvalglnprothrcysvalasnserthrpheaspserproala

850855860

histrpalaglnlysglyserhisglnileserleuaspasnproasp

865870875880

tyrglnglnaspphepheprolysglualalysproasnglyilephe

885890895

lysglyserthralagluasnalaglutyrleuargvalalaprogln

900905910

serserglupheileglyala

915

<210>2

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗原的序列

<400>2

leugluglulyslysglyasntyrvalvalthrasphiscyssergly

151015

glylysasn

<210>3

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>負(fù)抗原的序列

<400>3

asngluileasnproglyasnglyhisthrasntyrasnglulysphe

151015

lysser

<210>4

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr1

<400>4

tyrhisalamethis

15

<210>5

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr1

<400>5

asptyralamethis

15

<210>6

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr1

<400>6

gluhisalamethis

15

<210>7

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr1

<400>7

gluhisalamethis

15

<210>8

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr2

<400>8

alametserhisaspglythrgluthrsertyralaaspservallys

151015

gly

<210>9

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr2

<400>9

glyilesertrpasnserglyalaileglytyralaaspservallys

151015

gly

<210>10

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr2

<400>10

glyileasntrpasnserglylysthrglytyralaaspservallys

151015

gly

<210>11

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr2

<400>11

glyileasntrpasnserglylysthrglytyralaaspservallys

151015

gly

<210>12

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr3

<400>12

gluglyleuargserasnglyglyalaphegluthr

1510

<210>13

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr3

<400>13

alaserargglyleuglyaspalapheaspile

1510

<210>14

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr3

<400>14

proglygluaspthrglyglyglypheaspile

1510

<210>15

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>h-cdr3

<400>15

proglygluaspthrglyglyglypheaspile

1510

<210>16

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr1

<400>16

serglyaspvalleuprolyshistyralatyr

1510

<210>17

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr1

<400>17

serglyaspvalleuprolyshistyralatyr

1510

<210>18

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr1

<400>18

serglyaspvalleualaasphistyrsertyr

1510

<210>19

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr1

<400>19

serseraspvalglyglytyrasntyrvalser

1510

<210>20

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr2

<400>20

lysaspsergluargproser

15

<210>21

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr2

<400>21

lysaspthrgluargproser

15

<210>22

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr2

<400>22

lysaspsergluargproser

15

<210>23

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr2

<400>23

aspvalthrlysargproser

15

<210>24

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr3

<400>24

glnservalaspserseraspthrservalval

1510

<210>25

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr3

<400>25

glnservalaspasnseraspthrservalval

1510

<210>26

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr3

<400>26

glnservalaspserseraspthrservalval

1510

<210>27

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>l-cdr3

<400>27

sersertyrserserserthrphetyrval

1510

<210>28

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hv

<400>28

glnmetglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglylys

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesertyrhis

202530

alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpleu

354045

alaalametserhisaspglythrgluthrsertyralaaspserval

505560

lysglyargilethrileserargaspasnserlysseralaleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thralagluglyleuargserasnglyglyalaphegluthrtrpgly

100105110

argglythrmetilethrvalserser

115120

<210>29

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hv

<400>29

glnmetglnleuvalglnserglyglyglyvalvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysvalglyserglypheserpheaspasptyr

202530

alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serglyilesertrpasnserglyalaileglytyralaaspserval

505560

lysglyargphethrvalserargaspasnserlysasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alathralaserargglyleuglyaspalapheaspiletrpglygln

100105110

glythrmetvalthrvalserser

115120

<210>30

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hv

<400>30

glnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspgluhis

202530

alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglntrpval

354045

serglyileasntrpasnserglylysthrglytyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thrargproglygluaspthrglyglyglypheaspiletrpglygln

100105110

glythrmetilethrvalserser

115120

<210>31

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hv

<400>31

glnvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspgluhis

202530

alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglntrpval

354045

serglyileasntrpasnserglylysthrglytyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnserleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

thrargproglygluaspthrglyglyglypheaspiletrpglygln

100105110

glythrmetilethrvalserser

115120

<210>32

<211>109

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>lv

<400>32

sertyrgluleuthrglnproproservalservalalaproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspvalleuprolyshistyrala

202530

tyrtrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalleuvaliletyr

354045

lysaspsergluargproserglyileprogluargphethrglyser

505560

serserglythrlysvalthrleuthrileserglyvalargalaglu

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnservalaspserseraspthrser

859095

valvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105

<210>33

<211>109

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>lv

<400>33

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspvalleuprolyshistyrala

202530

tyrtrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalleuvaliletyr

354045

lysaspthrgluargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

serserglythrthrvalthrleuthrileserglyvalglnalaglu

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnservalaspasnseraspthrser

859095

valvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105

<210>34

<211>109

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>lv

<400>34

sertyrgluleuthrglnproleuservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspvalleualaasphistyrser

202530

tyrtrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalleuvalmettyr

354045

lysaspsergluargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

serserglythrthrvalthrleuthrileserglyvalglnalaglu

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnservalaspserseraspthrser

859095

valvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleugly

100105

<210>35

<211>111

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>lv

<400>35

asnphemetleuthrglnproalaservalserglyserproglygln

151015

serilethrilesercysthrglyserserseraspvalglyglytyr

202530

asntyrvalsertrptyrglnglnhisproglylysalaproglnleu

354045

ileiletyraspvalthrlysargproserglyvalserasnargphe

505560

serglyserlysserglyasnseralaserleuthrileserglyleu

65707580

glnalagluaspglualaasptyrtyrcyssersertyrserserser

859095

thrphetyrvalpheglythrglythrlysvalthrvalleugly

100105110

<210>36

<211>363

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hv

<400>36

cagatgcagctggtggagtccgggggaggcgtggtccagcctgggaagtccctgagactt60

tcctgtgcagcgtctggattcaccttcagttaccatgccatgcactgggtccgccaggct120

ccaggcaaggggctggagtggctggcagctatgtcacatgatggaaccgaaaccagctac180

gcagactccgtgaagggccgaatcaccatctccagagacaattccaagagtgcgttgtat240

ctacaaatgaacagtctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtaccgcagagggg300

cttcggagcaatggaggggcttttgagacttggggccgcgggacaatgatcaccgtctcc360

tca363

<210>37

<211>360

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hv

<400>37

cagatgcagctggtgcagtctggagggggcgtggtacagcctggggggtccctgagactc60

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