整料的制作方法
本發(fā)明涉及用于處理流體樣品的整料(monolith)、以及制造和使用這樣的整料的方法。
背景技術(shù)：
大多數(shù)一次性護(hù)理點(diǎn)診斷設(shè)備利用色譜和/或側(cè)流方法，以硝化纖維素膜、玻璃纖維綴合墊和纖維素吸收墊構(gòu)成基本材料，如milliporerapidlateralflowteststrips：considerationsforproductdevelopment.lit.no.tb500en00，rev.b，05/08，diagnostics-08-00161，pages37-38，2008中和lateralflowimmunoassay.wongandtse，humanapress，2009：isbn978-1-58829-908-6；isbn978-1-59745-240-3；doi10.1007/978-1-59745-240-3中所述。在許多情況下，此類設(shè)備由全部三種材料構(gòu)成，如milliporehi-flowplusmembranesandsurewickpadmembranes，lit.no.pb1267en00，rev.05/08，diagnostics-08-00087，2008中所述。
這些是用于確定生物樣品中特定抗原如激素或藥物存在的單步一次性設(shè)備。
側(cè)流測試通常由一系列至少四個(gè)排列成線性系列的芯段構(gòu)成。這些段中的每一個(gè)通常由特定的材料制成，所述材料具有定制為在總體分析中最佳地發(fā)揮特定作用的性質(zhì)。
將應(yīng)用于典型測試條帶的樣品首先拉伸成通常由非織造吸水纖維制成的樣品墊。樣品墊起到濾除固體、并且通過例如向樣品基質(zhì)中釋放緩沖液來改變樣品流體以與下游檢測組分相容的作用。
樣品墊后面的段通常含有一些檢測試劑。在最常見的檢測配置中，抗體涂布的有色珠粒被掃入經(jīng)過的樣品流體中。
樣品然后被芯吸(wick)到硝化纖維素檢測段中，在這里，至少一種其他抗體已被固定于捕獲線中。通常包括對照線。當(dāng)結(jié)合了分析物的綴合珠粒通過捕獲線時(shí)，它們將被固定化的抗體所保留。如果足夠數(shù)量的珠粒在給定的線處被捕獲，則會(huì)發(fā)生可見的顏色。
在流體通過捕獲線之后，其將被芯吸到最終的吸收墊中，吸收墊具有足以確保足夠的量的樣品被芯吸通過捕獲線的流體容量。
最近，兩種市售材料已被作為大多數(shù)側(cè)流測試設(shè)備中各種構(gòu)成材料的單一基質(zhì)替代物出售。這些材料的顯著特征在于，可使用任一者的單個(gè)單元作為整個(gè)測試條帶而無需調(diào)適處理并且在區(qū)之間無機(jī)械接頭。
fusion5(whatman)為由涂布了親水聚合物的粘結(jié)玻璃纖維制成的材料。在結(jié)構(gòu)上，這些膜與最常用于樣品墊、綴合墊和槽的材料相似。fusion5與使用的典型材料的區(qū)別在于惰性的生物相容聚合物涂層，其消除了制造過程中對任何再潤濕或阻斷步驟的需要。另外，如果用涂布了捕獲試劑的大珠粒浸漬，則該材料也可承擔(dān)經(jīng)典的硝化纖維素檢測段的作用。在孔隙大小尺度上的珠粒不會(huì)遷移通過基質(zhì)。
4castchip(johnsenandjohnsen)由以條帶的形式布置于剛性塑料支承物上的微米尺度柱的規(guī)則陣列形成。所述柱通過注塑形成并且通過葡聚糖進(jìn)行親水化。這些柱陣列通過毛細(xì)力芯吸并可因此實(shí)現(xiàn)纖維和鑄制硝化纖維素膜二者的功能。芯片在其與蛋白質(zhì)上的氨基基團(tuán)呈反應(yīng)性的條件下遞送，因此捕獲抗體可通過簡單地將抗體溶液點(diǎn)在基質(zhì)上而共價(jià)地固定于柱結(jié)構(gòu)上。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明基于以下的發(fā)明人見解：存在對改進(jìn)的替代流體處理材料的需要，所述改進(jìn)的替代流體處理材料滿足易于使用、支持的化學(xué)品多樣化、制造的經(jīng)濟(jì)性、高的靈敏度并且易于功能化的標(biāo)準(zhǔn)。
雖然是功能性并且可得到的，但硝化纖維素具有若干主要缺點(diǎn)。第一，市售硝化纖維素膜具有均一的組成和/或平均的孔隙尺寸，這將限制工藝的多樣性和/或每一具體工藝可取得的化學(xué)性質(zhì)。第二，高的光密度和高的光后向散射將限制進(jìn)入到硝化纖維素膜中的可見深度(通常-10微米)，從而限制診斷設(shè)備的檢測靈敏度。
已知其他更復(fù)雜的測試條帶。然而，復(fù)雜的布置和多個(gè)部件意味著這些測試條帶的制造可能昂貴。
在整個(gè)發(fā)達(dá)和發(fā)展中世界，迫切需要高度靈敏且特異性的可靠且可負(fù)擔(dān)的使用點(diǎn)和/或護(hù)理點(diǎn)診斷和分析技術(shù)。然而，這樣的診斷不是廣泛可用的，主要是因?yàn)樗鼈儾皇浅杀居行У暮?或難以使用。此外，對于一些用途，非常需要提供一次性需求點(diǎn)診斷。對于任何一次性的測試設(shè)備，成本成為關(guān)鍵問題。
在資源有限的環(huán)境中，基于簡單浸棒/測試棒的測試的成本必須接近每個(gè)單元1美元。顯然，該成本限制將排除復(fù)雜的制造方法和設(shè)置。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，可將某些單體和單體的組合聚合以提供高效地自芯吸(self-wick)流體的聚合型整料，從而為護(hù)理點(diǎn)/現(xiàn)場診斷和分析提供方便的工具。這些自芯吸聚合型整料易于貯存和運(yùn)輸，其制造比較符合成本效益，允許分析物分子的良好檢測并易于通過其他化學(xué)部分的浸漬和/或共價(jià)接枝到整個(gè)整料或區(qū)中而功能化。
在使用中，從測試過程的開始到結(jié)束，作為分離的流體或在載體流體中的分析物樣品可流過自芯吸整料而不需要泵或其他動(dòng)力設(shè)備。
本發(fā)明基于以下發(fā)明人見解：由包含具有至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體的可聚合組合物形成的整料將為流體處理和流體診斷提供有用的工具。本發(fā)明因此涉及使用包含具有至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體的單體制造整料的方法、包含具有至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體的整料和使用這樣的整料的方法。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，由具有至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的單體和親水的單體形成的整料尤其適合于這些目的中的許多。
在第一個(gè)方面，本發(fā)明可提供一種制造用于處理流體樣品的自芯吸整料的方法，所述方法包括：
-提供親水單體和連接體單體，所述連接體單體具有由包含至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體間隔開的兩個(gè)可聚合基團(tuán)；
任選地其中提供一種或多種另外的單體；
-通過在致孔溶劑中合并所述親水單體和連接體單體來獲得可聚合組合物；和
-聚合所述可聚合組合物以形成整料。
每一個(gè)r可為氫或可為任何有機(jī)基團(tuán)。換句話說，連接體可包含烷基或被取代的烷基鏈-(c(r)2)n-，其中至少一個(gè)、優(yōu)選地至少兩個(gè)-c(r)2-基團(tuán)被氧所代替。合適地，n為3至20，例如，5至15，例如，5至13。r基團(tuán)可自身包含另外的可聚合基團(tuán)。換句話講，優(yōu)選地連接體為聚醚，例如聚乙二醇或類似物。合適地，連接體包含聚乙二醇鏈，例如含1、2、3、4、5或更多個(gè)-oc(r)2c(r)2-基團(tuán)，例如1、2或3個(gè)-oc(r)2c(r)2-基團(tuán)。
聚合步驟形成聚合物基質(zhì)，即單體聚合得到為基本連續(xù)的聚合物網(wǎng)絡(luò)的整料。所述整料可因此寬泛地稱為宏觀尺度單分子。
在聚合步驟之后，可將整料與殘余的未聚合材料分離開來。殘余的未聚合材料可為未聚合的單體、未結(jié)合到聚合物基質(zhì)的短低聚物鏈、引發(fā)劑副產(chǎn)物和/或殘余的溶劑。
合適地，殘余的未聚合材料可在洗滌步驟中移除(即，洗去)。此殘余的未聚合材料可為固體和/或液體。例如，在洗滌步驟中，可用醇和/或水洗滌整料。洗滌步驟可包括通過施加壓差迫使液體通過整料。
在一些優(yōu)選的方法中，整料首先用醇(例如，甲醇、乙醇或異丙醇)洗滌，然后用水洗滌。例如，整料可用醇洗滌三次，然后用水洗滌三次。
合適地，整料然后被干燥直至恒重(即，不再有溶劑殘留)。對于干燥步驟，可使用真空烘箱。
連接體單體的可聚合基團(tuán)中的每一個(gè)可包含乙烯基部分。例如，連接體分子的每一個(gè)可聚合基團(tuán)可獨(dú)立地選自丙烯酰基或甲基丙烯?；?。
在一些實(shí)施方案中，連接體選自-o-ch2-ch2-o-；-(-o-ch2-ch2-)n-o-，其中n選自2、3、4或5；-o-ch2-ch(oh)-ch2-o-；和-o-ch2-ch(oh)-ch2-ch(oh)-ch2-ch(oh)-ch2-o-。
應(yīng)理解，連接體單體可包含另外的可聚合基團(tuán)，例如，連接體可為-och2-c(ch2o---)(ch2ch3)-ch2o-，其中，----表示與另外的可聚合基團(tuán)的鍵。
合適的此類連接體單體包括乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、四(乙二醇)二丙烯酸酯和二(乙二醇)二甲基丙烯酸酯。
合適地，親水單體為丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯，例如，親水單體可為甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)、丙烯酸2-羥基酯、丙烯酸2-羥乙酯、甲基丙烯酸2-羥丙酯或丙烯酸2-羥丙酯。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，其為甲基丙烯酸2-羥乙酯。
當(dāng)然，應(yīng)理解，可使用不止一種連接體單體。因此，在一些實(shí)施方案中，將兩種或更多種不同的連接體單體與親水單體在致孔溶劑中合并。在一些實(shí)施方案中，僅使用一種連接體單體。在一些實(shí)施方案中，使用兩種連接體單體。在一些實(shí)施方案中，使用三種連接體單體。連接體單體的組合可產(chǎn)生改善的整料物理性質(zhì)。
連接體單體的一些優(yōu)選組合包括：乙二醇二甲基丙烯酸酯和四乙二醇二甲基丙烯酸酯；乙二醇二甲基丙烯酸酯和四乙二醇二丙烯酸酯。例如，連接體單體的組合可為乙二醇二甲基丙烯酸酯和四乙二醇二丙烯酸酯，例如比率為4∶3至1∶3，例如比率為1∶1至1∶3，例如比率為2∶3至7∶10。例如，連接體單體的組合可為乙二醇二甲基丙烯酸酯和四乙二醇二甲基丙烯酸酯，例如比率為5∶1至1∶1，例如比率為約3∶1。
例如，四乙二醇二甲基丙烯酸酯對親水單體如hema的比率可為5∶2至1∶3，例如2∶1至1∶1。在一些實(shí)施方案中，四乙二醇二甲基丙烯酸酯對親水單體如hema的比率可為1∶1至7∶10。例如，四乙二醇二丙烯酸酯對親水單體如hema的比率可為5∶2至1∶3，例如2∶1至1∶1。在一些實(shí)施方案中，四乙二醇二丙烯酸酯對親水單體如hema的比率可為1∶1至7∶10。
可聚合組合物可還包含一種或多種另外的單體。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，將一種或多種另外的單體與親水單體在致孔溶劑中合并。包含所述另外的單體可改變整料的物理特性和/或可賦予整料以功能性。
例如，至少一種另外的單體可為官能化的單體。所述官能化的單體可具有選自以下的部分：適于與可接枝化合物的反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)以將化合物共價(jià)地接枝到整料的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)；ph敏感基團(tuán)；適于分析物的直接固定化的基團(tuán)；染料、熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)或猝滅劑；固定化的蛋白；和固定化的天然或人工核酸分子，例如，dna或rna分子。這些基團(tuán)將在本說明書中于后文詳細(xì)描述，但作為實(shí)例而非限制，另外的單體可包含以下側(cè)鏈或基團(tuán)中的至少之一：氨基、羧基、聚乙二醇、烷基、馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺、?；u、巰基或疊氮化物。
所述或每一另外的單體(如果存在)可包含以下側(cè)鏈或基團(tuán)中的至少之一：氨基、羧基、聚乙二醇、烷基、馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺、?；u、巰基或疊氮化物。例如，在一些實(shí)施方案中，另外的單體可選自甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯、甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯、甲基丙烯酸n-羥基琥珀酰亞胺酯、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸、甲基丙烯酸縮水甘油酯、琥珀酸單-2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸烯丙酯。
例如，在一些實(shí)施方案中，另外的單體可選自甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸n-羥基琥珀酰亞胺酯、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸、甲基丙烯酸縮水甘油酯和甲基丙烯酸月桂酯。
應(yīng)理解，所述另外的單體可根據(jù)預(yù)期的功能(例如，具有適于如本文所述的共價(jià)接枝反應(yīng)的側(cè)鏈)來選擇。
在一些優(yōu)選的方法中，所述另外的單體為氨基甲基丙烯酸酯或氨基丙烯酸酯，例如，甲基丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯或丙烯酸(二烷基氨基)烷基酯，例如，甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯或丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯。合適地，所述另外的單體(其為甲基丙烯酸氨基烷基酯或丙烯酸氨基烷基酯)是ph敏感的。
在一些實(shí)施方案中，另外的單體可為甲基丙烯酸2-氨基乙酯。
在一些優(yōu)選的方法中，所述另外的單體包含游離的羧酸基團(tuán)。例如，所述另外的單體可為丙烯酸或甲基丙烯酸。
合適地，另外的單體的總含量為可聚合組合物的總單體含量的1-3％，例如，其可為1-2.5％，優(yōu)選地1-2％，更優(yōu)選地1.25-1.75％。
合適地，總連接體單體對總親水單體的比率可為1∶1至10∶1，優(yōu)選地1∶1至7∶1，更優(yōu)選地1∶1至5∶1，更優(yōu)選地2∶1至4∶1。合適地，總連接體單體對總的其他單體含量(親水單體加另外的單體)為1∶1至10∶1，優(yōu)選地1∶1至7∶1，更優(yōu)選地1∶1至4∶1。
致孔溶劑可選擇為與所需的整料性質(zhì)相符。
在一些優(yōu)選的方法中，致孔溶劑能夠溶解固體單體，和/或致孔溶劑可與液體單體混溶。
合適地，致孔溶劑可選擇為使得連接體聚合物團(tuán)簇在聚合的早期從致孔溶劑沉淀。例如，致孔溶劑可選擇為使得已聚合連接體單體的團(tuán)簇將在開始聚合的30-60秒內(nèi)從溶劑-單體體系中沉淀。
可使用單一溶劑體系或混合溶劑體系。
例如，致孔溶劑可為純醇。
例如，致孔溶劑可選自含烷烴和醇的二元混合物；含芳族溶劑和醇的二元混合物；含醇和二醇的二元混合物；含醇和水的二元混合物；含醇、二醇和水的三元混合物；和含至少10％(體積/體積)的表面活性劑的混合物。
例如，溶劑體系可包含c8-12單醇，例如，c8-10單醇，優(yōu)選地辛醇。當(dāng)然，c8-12單醇可自身為不止一種c8-12單醇的混合物(例如，辛醇和十二烷醇的混合物)。c8-12單醇可與一種或多種另外的溶劑混合。合適地，所述另外的溶劑為c1-4單醇或c2-6二醇。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，包含c1-4單醇將導(dǎo)致所得整料孔隙尺寸的增大，而包含c2-6二醇將增大機(jī)械強(qiáng)度。合適的c1-4單醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇和丁醇；優(yōu)選甲醇和正丙醇。在一些實(shí)施方案中，引入甲醇。在一些實(shí)施方案中，引入正丙醇。合適的c2-6二醇包括但不限于丙二醇、戊二醇和己二醇；優(yōu)選戊二醇。
合適地，c8-12單醇對c1-4單醇的比率為10∶1至1∶1；例如，其可為9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1。優(yōu)選地，c8-12單醇對c1-4單醇的比率為3∶2至3∶1。
合適地，c8-12單醇對c2-6二醇的比率為10∶1至2∶1；例如，其可為9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、2∶3、2∶1。優(yōu)選地，c8-12單醇對c2-6二醇的比率為3∶2至3∶1。
所述c8-10單醇溶劑體系可還包含至多10％的總?cè)軇┖?，?yōu)選地至多5％的水，前提條件是溶劑體系基本上是單相的。
溶劑體系可為水性溶劑體系，例如，水、c1-4單醇和/或乙酸的混合物。某些優(yōu)選的水性溶劑體系可包含水和甲醇、乙醇、正丙醇或異丙醇。水對另外的組分的優(yōu)選比率為3∶1。
任何上述溶劑體系可還包含表面活性劑，例如，泊洛沙姆。表面活性劑的存在可有助于所述混合溶劑體系的初始混溶性。合適地，表面活性劑含量至多為總?cè)軇┖康?0％，優(yōu)選至多5％。
或者，在一些方法中，致孔溶劑可為100％的泊洛沙姆。
某些優(yōu)選的溶劑體系包括：辛醇和丁二醇的混合物；辛醇和戊二醇的混合物；辛醇和正丙醇的混合物；辛醇和水的混合物；乙醇和水的混合物；及一種或多種泊洛沙姆和水的混合物。
例如，溶劑體系可為：正-辛醇；19∶1的辛醇∶水；4∶1至2∶3的辛醇：c4-6-正二醇；4∶1至1∶1的正辛醇∶正丙醇。
本發(fā)明還提供了自包含如本文所述具有至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體的連接體單體制造整料的方法、包含如本文所述具有至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體的整料和使用這樣的整料的方法。應(yīng)理解，本文描述的一些整料可自不一定需要親水單體的可聚合組合物制造。本發(fā)明因此還提供了制造這樣的整料的方法，所述方法包括提供連接體單體，所述連接體單體具有由包含至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體間隔開的兩個(gè)可聚合基團(tuán)，任選地其中還提供一種或多種另外的單體；通過在致孔溶劑中合并連接體單體與任選的另外的單體來獲得可聚合組合物；和聚合所述可聚合組合物以形成整料。
本發(fā)明還提供了制造整料的方法，其中所述方法包括在聚合步驟之后進(jìn)一步衍生化。例如，所述方法可如本文所述在聚合步驟之后包括水解步驟。除此之外或作為另外一種選擇，所述進(jìn)一步衍生化可包括可接枝化合物的共價(jià)接枝和/或整料內(nèi)化合物的浸漬。
本發(fā)明提供了如本文所述具有一個(gè)或多個(gè)區(qū)的整料。所述區(qū)可因聚合步驟或因聚合步驟之后的處理和/或衍生化而在聚合物基質(zhì)的組成上不同。
在一些實(shí)施方案中，所述方法是一種制造方法，其中提供不止一種在致孔溶劑中含一種或多種單體和一種或多種連接體單體的組合物，其中所述組合物中的兩者在以下中的至少一個(gè)方面不同：
-親水單體和/或連接體單體種類；
-總的非連接體單體對連接體單體的比率；
-致孔溶劑；
-溶液中親水單體、連接體單體和另外的單體(如果存在)的濃度；
-一種或多種另外的單體的存在和種類；和
-引發(fā)劑的存在和種類；
所述方法包括于聚合之前在模具內(nèi)不同的位置處提供這些組合物的步驟，以便整料包含多個(gè)區(qū)，其中不同的區(qū)具有不同的芯吸性質(zhì)和/或化學(xué)性質(zhì)。
優(yōu)選地，所述另外的單體為如本文所述的官能化單體。
合適地，所述區(qū)沿著整料的預(yù)期芯吸方向順序排列。然而，應(yīng)理解，所述區(qū)也可沿著芯吸方向平行地提供。例如，可并排提供兩個(gè)區(qū)，以允許沿著整料與樣品并排地運(yùn)行對照樣。
也可通過在聚合步驟之后整料的進(jìn)一步衍生化來提供區(qū)，例如通過可接枝化合物的共價(jià)接枝和/或整料內(nèi)化合物的浸漬。衍生化也可以是如本文所述聚合物基質(zhì)內(nèi)例如酯基團(tuán)的水解的結(jié)果。
整料的區(qū)可為如本文所述的區(qū)。應(yīng)理解，可根據(jù)所需的用途選擇不同的此類區(qū)。某些優(yōu)選組合的其他細(xì)節(jié)將在本說明書中于后文進(jìn)一步詳細(xì)描述。
在一些實(shí)施方案中，所述進(jìn)一步衍生化包括可接枝化合物向整料的共價(jià)接枝?？山又衔锟蔀槊浮？山又衔锟蔀榭贵w。可接枝化合物可為兩親物?？山又衔锟蔀閐na探針。
應(yīng)理解，可在單個(gè)區(qū)內(nèi)和同一整料的不同區(qū)處使用不止一種可接枝化合物。除此之外或作為另外一種選擇，其中所述進(jìn)一步衍生化可包括整料內(nèi)一種或多種組分的浸漬。
所述區(qū)中的至少之一可為擴(kuò)增區(qū)，其配置為促進(jìn)流體樣品中靶核酸序列的擴(kuò)增。所述區(qū)中的至少之一可為擴(kuò)增區(qū)，其配置為促進(jìn)流體樣品中的全基因組擴(kuò)增。所述區(qū)中的至少之一可為清潔區(qū)，其配置為促進(jìn)流體樣品中細(xì)胞的裂解。所述區(qū)中的至少之一可為清潔區(qū)，其配置為促進(jìn)流體樣品中病毒的裂解。所述區(qū)中的至少之一可為逆轉(zhuǎn)錄區(qū)，其配置為促進(jìn)rna向cdna的轉(zhuǎn)錄。所述區(qū)中的至少之一可為指示區(qū)，其配置為促進(jìn)分析物分子的檢測，任選地其中所述區(qū)包含染料熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)和猝滅劑中的至少之一，任選地其中所述分析物分子為dna。所述區(qū)中的至少之一可配置為阻滯或保留樣品的一種或多種組分以便分析物與樣品中的其他組分分離開來。所述區(qū)中的至少之一可配置為促進(jìn)樣品的一種或多種組分的化學(xué)轉(zhuǎn)化。應(yīng)理解，可提供這些區(qū)中的一者或不止一者。
合適地，整料以測試棒的形式提供。在這些實(shí)施方案中，整料可具有單個(gè)預(yù)期芯吸方向。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，整料具有如下外部尺寸：長度介于1和10cm之間；寬度介于2和25mm之間；深度介于1和10mm之間。
或者，整料可成形為使得其提供一個(gè)或多個(gè)分支，所述分支分割和合并流過整料的流體。
整料可沿著預(yù)期的芯吸方向具有固定的寬度和/或深度，或者其可包含一個(gè)或多個(gè)頸區(qū)域(這些為橫截面積減小的區(qū)域)。例如，在整料的至少一個(gè)部分中，小于5mm、優(yōu)選小于4mm、更優(yōu)選小于3mm、最優(yōu)選小于2mm的深度可能是理想的以允許透照從而便于檢測。相應(yīng)地，聚合步驟可在成形為提供具有一個(gè)或多個(gè)頸區(qū)域的整料的模具中進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，總的連接體單體對總的非連接體單體的比率為1∶3至20∶1，更優(yōu)選1∶1至5∶1，更優(yōu)選2∶1至4∶1。優(yōu)選的比率為3∶1。
在一些實(shí)施方案中，整料包含一個(gè)或多個(gè)孔隙率為50-85％的區(qū)域。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明可提供一種根據(jù)第一個(gè)方面的任何方法制造的自芯吸整料。
在第三個(gè)方面，本發(fā)明可提供一種用于處理流體樣品的自芯吸整料，所述整料包含由可聚合組合物形成的聚合物網(wǎng)絡(luò)，所述可聚合組合物包含至少一種親水單體和至少一種連接體單體，所述連接體單體具有由包含至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體間隔開的兩個(gè)可聚合基團(tuán)。
整料可包含多個(gè)區(qū)，所述區(qū)沿著整料的預(yù)期芯吸方向順序排列和/或沿著整料的預(yù)期芯吸方向平行地排列，其中不同的區(qū)具有不同的芯吸性質(zhì)和/或化學(xué)性質(zhì)。
在第四個(gè)方面，本發(fā)明可提供一種包含連續(xù)聚合物網(wǎng)絡(luò)的整料，所述整料包含多個(gè)區(qū)，所述區(qū)沿著整料的預(yù)期芯吸方向順序排列和/或沿著整料的預(yù)期芯吸方向平行地排列，其中不同的區(qū)具有不同的芯吸性質(zhì)和/或化學(xué)性質(zhì)。
整料的區(qū)可為如本文所述的區(qū)。應(yīng)理解，可根據(jù)所需的用途選擇不同的此類區(qū)。某些優(yōu)選組合的其他細(xì)節(jié)將在本說明書中于后文進(jìn)一步詳細(xì)描述。
在一些實(shí)施方案中，整料以測試棒的形式提供。在這些實(shí)施方案中，整料可具有單個(gè)預(yù)期芯吸方向。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，整料具有如下外部尺寸：長度介于1和10cm之間；寬度介于2和25mm之間；深度介于1和10mm之間。
或者，整料可成形為使得其提供一個(gè)或多個(gè)分支，所述分支分割和合并流過整料的流體。
整料可沿著預(yù)期的芯吸方向具有固定的寬度和/或深度，或者其可包含一個(gè)或多個(gè)頸區(qū)域(這些為橫截面積減小的區(qū)域)。例如，在整料的至少一個(gè)部分中，小于5mm、優(yōu)選小于4mm、更優(yōu)選小于3mm、最優(yōu)選小于2mm的深度可能是理想的以允許透照從而便于檢測。
在一些實(shí)施方案中，整料的體積密度介于0.15和0.50g/cc之間，例如0.20和0.40g/cc之間。整料可包含一個(gè)或多個(gè)孔隙率為50-85％、例如60-85％的區(qū)域。
當(dāng)然，應(yīng)理解，在如本文所述的多區(qū)化整料中以及在如本文所述的多區(qū)化整料制造方法中，不同的區(qū)可具有不同的體積密度和/或孔隙率。例如，多區(qū)整料可包含具有第一體積密度值的第一區(qū)和具有不同于第一體積密度的第二體積密度的第二區(qū)(在預(yù)期芯吸方向上、在第一區(qū)之前或之后)。
例如，多區(qū)整料可包含孔隙率介于50-85％之間的第一區(qū)和孔隙率介于50-85％之間的第二區(qū)(在預(yù)期芯吸方向上、在第一區(qū)之前或之后)，其中第一區(qū)的孔隙率不同于第二區(qū)的孔隙率。
在使用過程中控制整料或整料的一部分(例如，一個(gè)區(qū))的溫度可能是有用的。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，整料可具有熱耦合至整料的溫度傳感器和/或熱耦合到整料的加熱元件。還可提供耦合至溫度傳感器和/或加熱元件的控制器，該控制器配置為調(diào)節(jié)整料的至少一部分的溫度。
對于一些應(yīng)用，出于操作目的，可能優(yōu)選整料是柔性和/或易彎曲的(換句話說，不脆)。例如，具有12×1.5mm橫截面的、30mm長跨距的整料可具有小于2psi、例如小于1psi的楊氏模量。在一些實(shí)施方案中，整料可具有小于0.5psi、例如小于0.3psi的楊氏模量。在一些實(shí)施方案中，整料可具有小于0.1psi、例如小于0.05psi的楊氏模量。
如本文所述的整料可與適于照射整料的一部分例如指示區(qū)的裝置一起使用以便于分析物的檢測。相應(yīng)地，在第五個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種裝置，其包含如本文所述的整料和配置為用光照射整料的一部分的光源。
合適地，所述裝置還包含光學(xué)傳感器，其配置為接收從整料反射或透射通過整料的光?？商峁┛刂破鳎隹刂破黢詈系焦庠春凸鈱W(xué)傳感器，并配置為控制光源和從光學(xué)傳感器接收光學(xué)數(shù)據(jù)。
相應(yīng)地，在第六個(gè)方面，本發(fā)明可提供一種裝置，其包含如本文所述的整料，其還包含：
配置為用光照射整料的一部分的光源；
配置為接收從整料反射或透射通過整料的光的光學(xué)傳感器；和
耦合到光源和光學(xué)傳感器的控制器，其中所述控制器配置為控制光源和從光學(xué)傳感器接收光學(xué)數(shù)據(jù)。
所述控制器也可配置為確定分析物是否存在。
所述裝置可還包含耦合到配置為從光學(xué)傳感器接收數(shù)據(jù)的控制器的接口、以及經(jīng)由無線或有線連接耦合到所述接口的通信設(shè)備，所述通信設(shè)備配置為經(jīng)由控制器的接口從光學(xué)傳感器接收數(shù)據(jù)。通過這些數(shù)據(jù)的處理，可進(jìn)行測定，從而確定是否已在流體樣品中檢測到靶分析物。靶分析物可例如為靶dna序列。
通信設(shè)備可被耦合至電信網(wǎng)絡(luò)或耦合至與互聯(lián)網(wǎng)耦合的網(wǎng)路服務(wù)。這在處理數(shù)據(jù)、存儲(chǔ)結(jié)果和/或?qū)⒔Y(jié)果中繼到有關(guān)方時(shí)可能是有利的。
例如，通信設(shè)備可處理數(shù)據(jù)并作出決定，或者其可將數(shù)據(jù)中繼到另外的設(shè)備或基于云的信息系統(tǒng)以進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)處理的結(jié)果(例如，是否存在分析物的測定)可被中繼回用于使用點(diǎn)測定的裝置。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種裝置，其包含如本文所述的整料，并還包含：
光學(xué)傳感器，其配置為接收從在整料中或在整料上的化合物發(fā)射的光，所述光發(fā)射指示分析物的存在；和
耦合到光學(xué)傳感器的控制器，其中所述控制器配置為處理接收到的數(shù)據(jù)，并且確定在指示區(qū)中于流體樣品中是否已檢測到、或是尚未檢測到分析物；和
耦合到控制器的視覺指示器或顯示器，所述視覺指示器或顯示器接收來自控制器的信號(hào)以提供分析物已經(jīng)被檢測到或尚未被檢測到的視覺提示或消息。
所述裝置可還包含配置為照射整料的至少一部分例如指示區(qū)的光源。
所述裝置可還包含耦合到控制器的視覺指示器或顯示器，其中所述控制器配置為確定流體樣品中分析物存在或不存在，并且在視覺指示器或顯示器處生成指示分析物存在或不存在的視覺提示或消息。
所述裝置可還包含耦合到控制器并配置為接收來自控制器的數(shù)據(jù)的接口；和經(jīng)由有線或無線連接耦合到所述接口的通信設(shè)備，所述通信設(shè)備包括視覺顯示器，所述通信設(shè)備經(jīng)由所述接口接收來自控制器的數(shù)據(jù)，所述通信設(shè)備處理所述數(shù)據(jù)以確定在指示區(qū)中于流體樣品中是否已檢測到、或是尚未檢測到分析物，并且所述通信設(shè)備提供分析物已經(jīng)被檢測到或尚未被檢測到的視覺提示或消息。所述通信設(shè)備可被耦合至電信網(wǎng)絡(luò)或耦合至與互聯(lián)網(wǎng)耦合的網(wǎng)路服務(wù)。
如本文所述，可能期望在使用過程中控制整料的溫度。所述裝置可因此包含一個(gè)或多個(gè)熱耦合到所述多個(gè)區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)的溫度傳感器；一個(gè)或多個(gè)熱耦合到所述多個(gè)區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)的加熱元件；和耦合到所述一個(gè)或多個(gè)溫度傳感器和所述一個(gè)或多個(gè)加熱元件的控制器，其中所述控制器配置為調(diào)節(jié)所述多個(gè)區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)的溫度。
本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的任何其他方面的整料在診斷方法和環(huán)境監(jiān)測方法中的用途。
相應(yīng)地，在第七個(gè)方面，本發(fā)明可提供如本文所述的整料在診斷方法中的用途，所述方法包括：
-提供包含一種或多種分析物分子的流體樣品；
-任選地預(yù)處理所述流體樣品；
-任選地在載體流體中稀釋所述流體樣品；
-向整料的樣品施加部施加所述流體樣品；
-任選地向整料施加另外的載體流體；
-在整料的指示部處檢測分析物分子，所述指示部與所述樣品施加部間隔開。
在第八個(gè)方面，本發(fā)明可提供如本文所述的整料在環(huán)境監(jiān)測方法中的用途，所述方法包括：
-提供疑似包含一種或多種分析物分子的環(huán)境樣品；
-任選地預(yù)處理所述環(huán)境樣品(例如，通過濃縮樣品)；
-任選地在載體流體中稀釋所述環(huán)境樣品；
-任選地用載體流體提取所述環(huán)境樣品并棄去不溶物；
-向整料的樣品施加部施加所述環(huán)境樣品；
-任選地向整料施加另外的載體流體；
-在整料的指示部處檢測分析物分子，所述指示部與所述樣品施加部間隔開。
在第九個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種裝置，其包含第一和第二整料以及用于容納彼此流體連通的所述第一和第二整料的外殼；其中通過將所述第一和第二整料的表面抵接(abut)形成接合部，以便施加到第一整料的樣品芯吸到第二整料中。
所述第一和第二整料中的任一者或二者可為如本文所述的整料。任選地，整料中之一可為不同類型的芯吸材料，例如，如本領(lǐng)域中已知的硝化纖維素塊。合適地，第一和第二整料二者均為本發(fā)明的整料。
相應(yīng)地，在另一個(gè)方面，本發(fā)明可提供一種裝置，其包含：
如本文所述的第一整料和如本文所述的第二整料；和
用于容納彼此流體連通的所述第一和第二整料的外殼；其中通過將所述第一和第二整料的表面抵接形成接合部，以便施加到第一整料的樣品芯吸到第二整料中。
應(yīng)理解，上述方面的裝置可任選地還包含關(guān)于本文中的其他裝置所描述的特征。例如，所述裝置可包含配置為用光照射整料中的至少之一的一部分的光源；配置為接收從所述整料反射或透射通過所述整料的光的光學(xué)傳感器；和耦合到光源和光學(xué)傳感器的控制器，其中所述控制器配置為控制光源和從光學(xué)傳感器接收光學(xué)數(shù)據(jù)。應(yīng)理解，也可提供如本文所述的視覺指示器。例如，所述裝置可還包含如本文所述的溫度傳感器和加熱元件，其可由控制器控制。
應(yīng)理解，除非明確地不允許這樣的組合，否則關(guān)于本文所述的任何整料描述的偏好和任選特征可同等地適用于任何其他整料。類似地，關(guān)于制造整料的方法描述的偏好和任選特征同等地適用于整料自身，反之亦然。
附圖說明
通過本說明書，本發(fā)明的方面將結(jié)合下列附圖進(jìn)一步描述，但不限于此，在附圖中：
圖1示出了具有變化的橫截面的整料的一個(gè)實(shí)施方案的圖。
圖2示出了比較用乙醇溫育時(shí)接枝染料和未共價(jià)接枝染料從聚合物基質(zhì)的保留性的線圖。
圖3示出了來自樹枝狀大分子-熒光素偶聯(lián)和洗滌后整料片的x-y掃描的峰值熒光強(qiáng)度的條形圖，比較了連接體類型和臂對探針的比率。
圖4示出了hplc色譜圖的比較，證實(shí)了偶聯(lián)到本發(fā)明的整料的蛋白酶k的功效。底物為α乳白蛋白。
圖5示出了
圖6示出了示例性的4區(qū)整料。
圖7示出了整料中和液體對照中l(wèi)ampdna擴(kuò)增的線圖比較。
圖8示出了切口核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的原理的圖示。
圖9示出了液體中、以及具有和不具有耦合到整料片的探針的壓碎整料材料漿料中流感nesa反應(yīng)的條形圖比較。
圖10示出了立置于樣品架中的整料。
圖11為證實(shí)整料中的nesa反應(yīng)的照片。
圖12示出了用于處理流體樣品的兩區(qū)整料的側(cè)視圖。
圖13示出了用于處理流體樣品的四區(qū)整料的頂視圖。
圖14示出了一種四區(qū)加固整料的頂視圖。
圖15示出了圖14的整料的側(cè)視圖。
圖16示出了具有兩個(gè)平行清潔區(qū)的整料的頂視圖。
圖17示出了具有兩個(gè)平行反應(yīng)區(qū)的整料的頂視圖。
圖18示出了具有兩個(gè)平行指示區(qū)的整料的頂視圖。
圖19示出了用于分子診斷的裝置的框圖。
圖20示出了用于制造整料的裝置的側(cè)視圖。
圖21示出了使用圖20的裝置制造整料的方法。
圖22示出了用于制造整料的替代裝置的圖。
圖23示出了使用圖22的裝置制造整料的方法。
具體實(shí)施方式
定義
流體樣品
如本文所述的流體樣品可能包含感興趣的分析物，可疑似包含感興趣的分析物，或可能被推定不含感興趣的分析物(應(yīng)理解，在分析方法中，可使用例如分子診斷、檢測等來確認(rèn)預(yù)期的陰性結(jié)果)。
流體樣品可為生物樣品。生物樣品可為自受試者獲得的體液，例如，血液、唾液、尿液、初乳、母乳、痰液、腦脊髓液、羊水、血漿、精液、陰道分泌物或血清。樣品可視情況合適地稀釋。生物流體也可為自受試者獲得的生物樣品例如組織樣品、拭子樣品或糞便的提取物；或者其可為自昆蟲、蛛形綱動(dòng)物、寄生蟲、甲殼類動(dòng)物、線蟲類等提取的樣品。
生物流體也可以是人工培養(yǎng)的，例如，其可以是重組酶、病毒、發(fā)酵培養(yǎng)基、疫苗等。
生物樣品可以是植物相關(guān)的。例如，其可以是植物滲出液或植物的提取物。
流體樣品可從擦拭表面或以其他方式從表面提取材料獲得，所述表面例如為醫(yī)療設(shè)備、個(gè)人防護(hù)設(shè)備、家具、柜臺(tái)或地板。
流體樣品可為環(huán)境樣品，例如，其可為水樣品或感興趣的固體的提取物，例如，土壤提取物、灰燼提取物等。水樣品應(yīng)理解為包括水凈化處理中各種階段的水樣品，例如，水樣品可為原污水或經(jīng)處理的污水。
流體樣品可為對于分子診斷或分析而言感興趣的樣品。流體樣品的處理可包括檢測/分析步驟以確定感興趣的分析物存在或不存在。相應(yīng)地，如本文所述的整料可能適合于促進(jìn)流體樣品中感興趣的分析物的檢測。
自芯吸
如本文所用，該術(shù)語指整料孔隙對液體的毛細(xì)作用效果。這是整料的性質(zhì)，其使得液體樣品自發(fā)地從整料的第一部分流向與第一部分間隔開的另一部分而不需要施加外部壓差(如例如常規(guī)柱色譜中所使用的)。在本文所述的診斷方法過程中，正是該自芯吸能力可單獨(dú)地向流體分析物樣品提供運(yùn)動(dòng)性。
自芯吸與整料在空間中的取向無關(guān)。其可豎直地發(fā)生，例如垂直于整料，或橫向地發(fā)生，即沿著整料，具體取決于流體的施加方法。
自芯吸，如本文所述，指在以下芯吸試驗(yàn)中具有至少1.8cm的芯吸測量值的材料。
當(dāng)然，應(yīng)理解，如本文所述自芯吸整料的一些部分可具有較低的芯吸率，例如，在以下芯吸試驗(yàn)中1cm的測量值。這些部分可用作流量限制器，例如以將流體保持在自吸芯整料的前面部分中，如本文中別處所述。
如本文所述，如本文所述的整料合適地自芯吸。
有利地，這意味著將發(fā)生流體的流動(dòng)通過整料而不需要外加壓力。相應(yīng)地，如本文所述的自芯吸整料可用在其中流體在整個(gè)整料上無外加壓力梯度地流動(dòng)的方法中。在這里公開的自芯吸整料中，溶劑與整料材料之間有利的界面能通過將流體拉入材料中而導(dǎo)致芯吸作用，直至所有的整料都已被潤濕。這種相互作用的自由能將在低于環(huán)境壓力的溶劑前緣處產(chǎn)生流體靜壓。換句話講，芯吸通過整料的流體的背壓低于任何高度處的環(huán)境壓力，并因此低于平均海平面壓力。當(dāng)整料被充滿流體時(shí)，芯吸將停止。
芯吸試驗(yàn)
該試驗(yàn)測量水將沿尺寸為1.27cm寬、6.35cm長、0.30cm厚的固化整料向上行進(jìn)的距離。整料如本文所述制備。
測試前，將整料貯存在大氣條件(溫度：18-22℃，rh：10-40％)下，但本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，對于未加載環(huán)境敏感試劑(例如，通過固定化/共價(jià)接枝)的整料，不需要環(huán)境控制。
1.將整料的3mm浸沒在去離子水中，使整料呈直立取向；
2.水因芯吸作用而沿整料的長度上移；
3.在具有最高測量值的整料拐角處測量2.0分鐘的時(shí)間內(nèi)水行進(jìn)的距離。
測量可簡單地通過觀察溶劑前緣以視覺方式進(jìn)行。
可加入染料以幫助測量。合適地，所述染料為將與水一起行進(jìn)而不會(huì)被整料顯著阻滯的染料。合適的實(shí)例包括fd&c黃色1號(hào)和熒光素。對于如本文所述的一些整料，也可使用紅色40和藍(lán)色1，但應(yīng)理解，任何染料均可能與某些如本文所述的整料的基質(zhì)中的特定官能團(tuán)(例如，游離氨基基團(tuán))相互作用，從而導(dǎo)致阻滯。
應(yīng)理解，非常大的染料如藍(lán)色葡聚糖可能因整料的孔隙尺寸而受阻滯。類似地，荷電染料可能以不同的速率沿整料移動(dòng)。
合適地，如本文所用的自芯吸描述了在此試驗(yàn)中將取得至少1.8cm、優(yōu)選地至少2.0cm、更優(yōu)選至少2.3cm、更優(yōu)選至少2.5cm、更優(yōu)選至少2.7cm、更優(yōu)選至少3.0cm、更優(yōu)選至少3.2cm、更優(yōu)選至少3.5cm的結(jié)果的整料。
應(yīng)理解，對于本文所述的診斷方法，可能優(yōu)選芯吸不要太快發(fā)生，例如，以視情況允許合適的清潔、擴(kuò)增和/或檢測。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，如本文所述自芯吸整料將取得小于4.5cm、例如小于4.2cm、例如小于4.0cm、例如小于3.7cm的結(jié)果。
在一些實(shí)施方案中，如本文所述的自芯吸描述了將取得在2.5和4.5cm之間、例如3.0和4.0cm之間的結(jié)果的整料。
例如，該結(jié)果可在2.7和4.2cm之間，例如3.0和4.2cm之間，例如3.2和4.2cm之間，例如3.2和4.0cm之間，例如3.4和4.0cm之間。
例如，該結(jié)果可在2.5和4.0cm之間，例如2.5和3.7cm之間，例如2.7和3.7cm之間，例如3.0和3.7cm之間，例如3.2和3.7cm之間。
芯吸率也可以s/4cm為單位量度。下面提供了對應(yīng)于根據(jù)如本文所述芯吸試驗(yàn)的測量值和以s/4cm為單位的芯吸值的比較表(表1)：
表1
整料
如本文所用，術(shù)語整料指主要由聚合物基質(zhì)組成的塊體。該聚合物基質(zhì)也可被稱為連續(xù)聚合物網(wǎng)絡(luò)或網(wǎng)狀聚合物。換句話講，整料的聚合物基質(zhì)是鄰接的(contiguous)。
合適地，本文所述整料是伸長的，具有沿著最長長度(本文中稱長度)的軸的預(yù)期流動(dòng)方向(芯吸方向)。寬度和深度可相同，或者它們可不同。合適地，寬度和深度不同。長度和寬度限定至少一個(gè)診斷表面。該診斷表面合適地是平坦的。在一些實(shí)施方案中，整料包含至少兩個(gè)相對的平行平面?zhèn)取?/p>
在一些實(shí)施方案中，整料可包含一個(gè)或多個(gè)寬度減小的區(qū)域；即，整料可具有一個(gè)或多個(gè)頸區(qū)域。該頸區(qū)域可分離不止一個(gè)診斷表面。頸區(qū)域可通過在適宜形狀的模具中制造整料來形成。合適的整料形狀將在本文中描述。
相應(yīng)地，診斷表面可為矩形形狀，或者可成型為具有一個(gè)或多個(gè)寬度減小的區(qū)域，例如，啞鈴形狀。
診斷表面為自其進(jìn)行檢測的表面。然而，檢測不一定是對在診斷表面處或診斷表面附近的分析物的檢測。如本文所述整料可以是至少部分地半透明的。這可允許整料主體內(nèi)分析物的檢測，例如，在距離診斷表面選自至多5.0mm、至多3.0mm、至多2.5mm、至多2.0mm、至多1.5mm、至多1.0mm、至多0.5mm的深度處。可通過經(jīng)指示區(qū)向光電二極管陣列、ccd(電荷耦合器件)等上照射光來輔助該檢測。
相應(yīng)地，診斷表面可為整料的表面或任何形狀的整料的一部分，其適于在有或沒有背向照明(即，來自與診斷表面相背的表面的照明)的幫助下由傳感器讀取或視覺判讀。
含分析物的樣品可在沿著診斷表面的一個(gè)位置(在樣品施加部)處施加，檢測于一定時(shí)間間隔后在與樣品施加部間隔開的一個(gè)位置(在指示部)處進(jìn)行?；蛘?，可將樣品施加于整料的與診斷表面相對的面(在樣品施加部)上，檢測于一定時(shí)間間隔后在與診斷表面上的樣品施加部間隔開的一個(gè)位置(在指示部)處進(jìn)行。或者，可將整料的一端(為具有最小表面積的面的端)浸沒在含分析物的樣品中(整料的浸沒表面為樣品施加部)；在此情況下，指示部與浸沒端間隔開。
樣品施加部與指示部之間的距離可大于1cm，例如大于1.3cm、大于1.5cm、大于1.7cm、大于2cm、大于2.2cm、大于2.5cm、大于3.0cm、大于3.5cm、大于4.0cm、大于4.5cm、大于5.0cm、大于6.0cm、大于7.0cm、大于8.0cm。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在這些距離內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)樣品處理和分析物擴(kuò)增，例如，dna擴(kuò)增、蛋白質(zhì)消化、細(xì)胞或病毒裂解、或熱處理。這些結(jié)果將在本文中描述。
指示部可以是與在流動(dòng)方向上緊接于其前的整料部分相比具有受限的流動(dòng)的指示區(qū)。例如，指示區(qū)可與清潔或擴(kuò)增區(qū)鄰近。提供與在流動(dòng)方向上緊接于其前的區(qū)相比具有受限的流動(dòng)的指示區(qū)具有兩個(gè)有利的潛在應(yīng)用：
1)其可促進(jìn)從前一部分流入指示部中的分析物的濃縮。
2)其可阻滯分析物從前一部分的流出。因此，清潔或擴(kuò)增區(qū)可被快速填充以樣品，所述樣品將較慢地離開該區(qū)(以進(jìn)入具有受限的流動(dòng)的指示區(qū))，從而延長在前一部分中的“反應(yīng)時(shí)間”。
合適地，整料的長度可為30mm至85mm總流體路徑長度，例如30mm至50mm總流體路徑長度。
合適地，整料的寬度可為約2mm至約25mm或甚至更寬。
合適地，整料的深度可為1mm至5mm，這為聚合步驟過程中uv固化以引發(fā)聚合的合適厚度。更大深度的整料可使用熱固化程序制造。
如本文所述，羧基整料指具有游離羧基(-cooh基團(tuán))的整料。這些基團(tuán)可通過選擇適宜的單體在聚合過程中引入到整料中，或者它們可以是水解引入到聚合物基質(zhì)中的酯基團(tuán)的整料聚合后處理的產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，羧基整料為合適的聚合后水解步驟的產(chǎn)物，例如，使用堿如氫氧化物堿如氫氧化鈉。
預(yù)期芯吸方向
如本文所用，術(shù)語預(yù)期芯吸方向指流體在樣品內(nèi)的主要流動(dòng)方向。合適地，該方向?yàn)閺臉悠肥┘硬康綐悠窓z測部和越過樣品檢測部，樣品檢測部在本文中也稱指示部。芯吸方向可通過觀看或以其他方式觀察使用中流體通過整料的運(yùn)動(dòng)來確定。
分析物
如本文所用，術(shù)語分析物指在診斷和/或分析方法中檢測的感興趣的物種。為簡單起見，在整個(gè)本說明書中，適當(dāng)時(shí)，提及的分析物可包括一種或多種預(yù)分析物。預(yù)分析物指其自身將經(jīng)歷改變以釋放或轉(zhuǎn)化為被檢測的分析物的樣品組分。例如，細(xì)胞可經(jīng)歷裂解以釋放分析物蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，包括dna和rna。例如，感興趣的物種可用熒光團(tuán)修飾。
親水單體
術(shù)語親水單體指具有極性側(cè)鏈的單體，其能夠在水性環(huán)境中離子化或氫鍵結(jié)合。一般來講，具有高的親水單體含量的聚合物是可潤濕的或?qū)⑽账ＳH水側(cè)鏈的實(shí)例包括但不限于羥基、氨基、醋酸酯、胍酸酯、酰胺、硫酸酯、硝酸酯或腈。
合適但不一定的是，親水單體包含游離的羥基基團(tuán)。例如，親水單體可為丙烯酸羥基酯、甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)、丙烯酸2-羥乙酯、甲基丙烯酸2-羥丙酯或丙烯酸2-羥丙酯；或丙烯酸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，其為甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)。
當(dāng)然應(yīng)理解，連接體單體可自身包含游離的羥基基團(tuán)；即，連接體單體可為親水單體。例如，其可為甲基丙烯酸3-(丙烯酰氧基)-2-羥丙酯或甘油1，3-二甘油醇酸二丙烯酸酯。這些包含游離羥基基團(tuán)的連接體單體可在如本文所述的整料和方法中充當(dāng)連接體單體和/或充當(dāng)親水單體。
連接體單體
如本文所述，連接體單體指具有由包含至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體間隔開的至少兩個(gè)可聚合基團(tuán)的可聚合化合物。
所述兩個(gè)可聚合基團(tuán)合適地包含乙烯基部分，并可例如為丙烯?；蚣谆；鶊F(tuán)。當(dāng)連接體通過-o-接合到所述兩個(gè)基團(tuán)時(shí)，連接體單體可因此為丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯，例如，二丙烯酸酯或二(甲基丙烯酸酯)。
每一個(gè)r可為氫或可為任何有機(jī)基團(tuán)。換句話說，連接體可為烷基或被取代的烷基鏈-(c(r)2)n-，其中至少一個(gè)、優(yōu)選地至少兩個(gè)-c(r)2-基團(tuán)被氧所代替。r基團(tuán)可自身包含另外的可聚合基團(tuán)，并可相同或不同。在一些實(shí)施方案中，每一個(gè)r基團(tuán)均為h。
合適地，連接體為乙二醇，例如，乙二醇、二乙二醇或聚乙二醇?；蛘?，連接體可為甘油，例如，甘油1-3-二甘油醇酸酯或甲基丙烯酸3-丙烯酰氧基-2-羥基丙酯。
合適的連接體單體可包括但不限于：
表2
應(yīng)理解，除非上下文另有規(guī)定，否則提及的連接體單體包括兩種或更多種不同的此類單體的混合物。即，連接體單體的提及可指單一的如本文所述的連接體單體或指兩種或更多種此類連接體單體的組合。
致孔溶劑
如本文所用，提及的致孔溶劑包括致孔溶劑體系，即兩種或更多種溶劑的混合物。這些混合物可以是均質(zhì)的(即，溶劑可混溶)或者它們可以是非均質(zhì)的(即，溶劑中的至少兩者可能不可混溶，混合物可以不止一個(gè)相存在)。當(dāng)然，致孔溶劑可為單一溶劑。致孔溶劑體系可提供為含一種或多種單體，例如，其可提供為單一溶劑外加一種或多種單體，所述單一溶劑和一種或多種單體在組合中穩(wěn)定(即，不與彼此反應(yīng))。
致孔溶劑將在聚合工藝過程中促進(jìn)孔隙的形成。簡言之，可聚合組合物提供為使得至少一些、優(yōu)選全部單體在溶液中。隨著聚合的進(jìn)行，形成的聚合物鏈開始從溶液中沉淀，因?yàn)殡m然成孔劑-單體混合物是單體的良好溶劑，但是是聚合物的不良溶劑。這些沉淀的聚合物核然后變?yōu)槭Ｓ嗟膯误w聚集的場所，其將迅速并入到生長的聚合物網(wǎng)絡(luò)中。隨著核的生長，它們碰撞并團(tuán)聚，形成具有間隙(intersticial)孔隙的交聯(lián)小球基質(zhì)。此組裝機(jī)制產(chǎn)生高度互連、開放通道的系統(tǒng)，其中連續(xù)網(wǎng)絡(luò)聚合物球體形成通道壁。
合適地，使用溶劑的混合物。合適的溶劑包括醇(例如，辛醇)、醇的混合物(例如，十二烷醇或辛醇與丁二醇)及醇和水的混合物(例如，甲醇或乙醇與水或者十二烷醇或辛醇與水)。合適的致孔溶劑體系包括：正辛醇；正辛醇與1，4-丁二醇的混合物；正辛醇與1，5-戊二醇的混合物；正辛醇與正丙醇的混合物；正辛醇與水的混合物；甲醇與水的混合物；和一種或多種泊洛沙姆與水的混合物。
合適地，可使用表面活性劑作為溶劑或可在溶劑體系中包含表面活性劑。例如，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，包含表面活性劑將給可聚合組合物增加一些乳液特性。這又將導(dǎo)致更大規(guī)模的孔隙體系。
合適的表面活性劑的實(shí)例包括但不限于聚山梨酸酯、泊洛沙姆和triton-xtm表面活性劑，包括聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20、泊洛沙姆331、泊洛沙姆181、泊洛沙姆168、tritonx15和tritonx-100。
如本文中其他地方所述，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在本文中描述的一些方法中，可使用表面活性劑作為溶劑。本文所述的泊洛沙姆可尤其適合作為溶劑使用。
引發(fā)劑
合適地，采用自由基聚合來聚合可聚合組合物。相應(yīng)地，可在可聚合組合物中引入自由基引發(fā)劑。合適的引發(fā)劑可在熱或光化學(xué)誘導(dǎo)時(shí)引發(fā)聚合鏈反應(yīng)。合適的引發(fā)劑是本領(lǐng)域已知的并包括2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(dmpa或dmpap)、2，2′-偶氮雙異丁腈(aibn)、過氧化苯甲酰(bpo)、過氧化月桂酰(lpo)、過硫酸銨和l-抗壞血酸。優(yōu)選地，可聚合組合物中的引發(fā)劑為2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮。
引發(fā)劑合適以相對小的量存在。例如，可聚合組合物中引發(fā)劑的量可低于總單體(連接體單體和非連接體單體，包括另外的單體)的3％，優(yōu)選地低于2.5％，更優(yōu)選低于2％，更優(yōu)選低于或等于1.5％。合適地，引發(fā)劑濃度足以使得可聚合組合物在照射的5分鐘內(nèi)變混濁并在本文所述的輻照條件下于30分鐘內(nèi)基本上完全聚合。
樣品施加部
此為含分析物的樣品被施加到的整料表面部分。其可為整料的在整料的至少一個(gè)其他部分/區(qū)的上游的任何部分。其可為模制或機(jī)加工到整料中的孔或梳形結(jié)構(gòu)。其可為局限于整料的診斷表面(即，在其上進(jìn)行檢測的面)的區(qū)域、或可為整料的一端的浸沒面、和(如果整料“對端(endon)”放置于溶液中來以其豎直配置使用的話)四個(gè)鄰近表面的浸沒部分。在一些實(shí)施方案中，樣品施加部為清潔區(qū)或清潔區(qū)的一部分，所述區(qū)如本文所描述。
可能優(yōu)選使用載體流體(例如，緩沖液)來幫助樣品通過整料。這樣的載體流體可在與樣品相同的點(diǎn)處加到整料，或者可在上游加入。相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，樣品施加區(qū)可在載體流體引入部/區(qū)的下游。
指示部
其為在其處進(jìn)行分析物檢測的整料部分。所述樣品指示部可為指示區(qū)或指示區(qū)的一部分，所述區(qū)如本文所描述。指示部/區(qū)可具有比硝化纖維素低的折射率，例如1.4，并且其可足夠薄以在透照時(shí)允許超過1％、優(yōu)選地超過5％、優(yōu)選地超過10％的入射光通過。
整料制造程序
一般程序
提供以下非限制性一般程序。
在合適的容器中合并單體和一種或多種溶劑以及引發(fā)劑。劇烈混合以合并所述成分，直至外觀均勻(澄清或在不可混溶組分的情況下呈乳白色)。該溶液為“可聚合組合物”。向所需的模具中分配一定量的可聚合組合物，然后逐出任何氣泡，例如通過輕輕攪動(dòng)或聲處理。
通過用uv光(約1mw/cm2)輻照20分鐘進(jìn)行固化。任選地，用至少3份醇洗滌固化的整料中的殘余溶劑，然后用壓差使至少3份水或其他水性溶液強(qiáng)制通過整料。于40-100℃(例如，40-60℃)下真空干燥整料直至重量不再隨時(shí)間改變。在環(huán)境條件下貯存。
用于多區(qū)整料的程序
多區(qū)整料(其中存在具有不同化學(xué)或物理性質(zhì)的區(qū)域的單個(gè)整料)可包含因在初始整料形成(聚合步驟)過程中引入的差異而不同、或因聚合步驟完成后例如通過共價(jià)接枝另外的化學(xué)部分或通過用試劑處理整料的一部分以實(shí)現(xiàn)該部分中整料化學(xué)性質(zhì)的改變的后處理而不同的區(qū)。
這樣的區(qū)可在聚合步驟過程中使用以下方法中之一引入：
方法1：如上面及本文中其他地方的一般程序中所述制備一定類型的整料。在洗滌之前停止，或用溶劑填充經(jīng)干燥的整料，并將經(jīng)填充的整料放置在模具中適當(dāng)位置。按照上面的一般程序制備混合整料，其中將更多的聚合組合物倒入模具中使得它們與已經(jīng)固化的整料塊直接接觸。這些組合物可相同或不同(因?yàn)榧幢闶褂孟嗤慕M成，聚合條件也可影響聚合產(chǎn)物)。如一般程序中所述進(jìn)行固化和后續(xù)步驟。換句話講，整料可分“段”產(chǎn)生，并在每一聚合步驟中通過固體聚合物結(jié)構(gòu)的機(jī)械交錯(cuò)搭疊和通過新段的新生聚合物與下面一段中未反應(yīng)的可聚合基團(tuán)之間的聚合進(jìn)行段之間的互連。這樣，可制造出線形整料和支化整料。也可包括“垂直”層。
方法2：提供不止一種可聚合組合物，這些可聚合組合物在以下中的至少一個(gè)方面不同：親水單體和/或連接體單體種類；總的非連接體單體對連接體單體的比率；致孔溶劑(溶劑種類、混合溶劑體系的溶劑比率)；溶液中親水單體、連接體單體和另外的單體(如果存在)的濃度；一種或多種另外的單體的存在和種類；引發(fā)劑的存在和種類。向模具中不同位置處分配這些可聚合組合物，以便單體溶液流動(dòng)為彼此抵接。當(dāng)發(fā)生聚合時(shí)，這些不同的位置具有不同的性質(zhì)。
可能有利的是在模具內(nèi)提供隔離器以限定不同的位置和防止模具填充過程中、以及可能地初始聚合過程中不同的可聚合組合物的混合。如果提供了這樣的隔離器，則這些隔離器可在聚合之前即刻或聚合的中途移除。例如，隔離器可在固化開始后5-30秒、固化開始后30-300秒、固化開始后5-10分鐘、固化開始后10-15分鐘或固化開始后15-20分鐘移除。這允許在區(qū)內(nèi)發(fā)生初始聚合而不會(huì)有不同的可聚合組合物的混合。一旦隔離器被移除，固化將繼續(xù)，新生區(qū)互連到單個(gè)聚合物網(wǎng)絡(luò)而形成多區(qū)化整料。
方法3：向模具中分配可聚合組合物，然后選擇性地輻照模具內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位置以便聚合僅在所述一個(gè)或多個(gè)位置處引發(fā)。剩余的組合物可在稍后輻照。
整料模具和形狀
整料聚合在模具中進(jìn)行。聚合后，整料可任選地被干燥，任選地從模具取出并任選地如上所述洗滌。干燥、取出和洗滌步驟可在聚合后以任何順序進(jìn)行。
例如，整料可被干燥、取出、洗滌并然后干燥。
例如，整料可被取出、洗滌并然后干燥。
例如，整料可被洗滌、取出并然后干燥。
例如，整料可被取出、干燥、洗滌并然后干燥。
例如，整料可被洗滌、干燥并然后取出。
其他排列組合對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
合適地，模具具有提供所需形狀和尺寸的整料的內(nèi)部維度。例如，模具可限定如這里所述的矩形區(qū)域。合適地，整料可具有圓形的端，即，模具可限定具有由直邊接合的兩個(gè)半圓形端的區(qū)域。
對于一些應(yīng)用，可能優(yōu)選提供一個(gè)或多個(gè)頸區(qū)域(這些為在預(yù)期的流動(dòng)方向上橫截面減小的區(qū)域)。相應(yīng)地，可成型合適的模具以限定可變寬度的區(qū)域。
模具可由任何合適的材料例如金屬、塑料或彈性體制成。模具可內(nèi)襯薄膜塑料如sarantm、ldpe或內(nèi)襯硅氧烷膜。
出于經(jīng)濟(jì)或易于制造的原因，在一些情況下，聚合可在大模具(即，限定比所需的整料診斷表面大得多的表面積的模具)中進(jìn)行，然后將片材切割成一個(gè)一個(gè)單獨(dú)的整料以供使用。片材可在任何時(shí)候切割，但為了方便起見，優(yōu)選在干燥之前切割。
在本文所述的一些實(shí)施方案中，整料呈長圓形形狀。即，整料可沿整個(gè)芯吸長度具有單一橫截面。合適地，長圓形整料的長度介于1cm和10cm之間，優(yōu)選介于6和8cm之間，更優(yōu)選介于4和8cm之間。合適地，長圓形整料的寬度介于2mm和25mm之間，優(yōu)選地介于6mm和20mm之間，更優(yōu)選介于8和16mm之間，更優(yōu)選介于10mm和14mm之間；例如，寬度可為約12mm。合適地，長圓形整料的深度介于1mm和10mm之間，優(yōu)選介于1mm和7mm之間，更優(yōu)選介于1mm和5mm之間，更優(yōu)選為約2-3mm。
或者，整料橫截面可沿芯吸方向改變。在這些實(shí)施方案中，整料的不同區(qū)可具有不同的橫截面。小的橫截面面積可便于檢測，例如，為了檢測過程中分析物的可視化，可能優(yōu)選較小的深度，尤其是在采用透照時(shí)。較小的橫截面面積也可減慢流體從前一區(qū)流動(dòng)的速率。這可起到保持流體于所述前一區(qū)中的作用，其可用于延長反應(yīng)(例如，清潔區(qū)中的細(xì)胞裂解、反應(yīng)區(qū)中rna向dna的轉(zhuǎn)化、反應(yīng)區(qū)中分析物的擴(kuò)增)的停留時(shí)間。
例如，整料可為“啞鈴形狀”；即，整料可包含頸區(qū)域，所述頸區(qū)域具有減小的橫截面，其位于具有較大橫截面的兩個(gè)部分之間，圖1中示出了它的一個(gè)非限制性實(shí)例。參照該附圖，合適地，將樣品施加到整料頂(診斷)表面上的左下方處。流體樣品通過沿著芯吸方向芯吸而沿著整料行進(jìn)。芯吸方向?yàn)檠刂蠌膱D像的左下方到右上方對角線。在固定橫截面的第一長度中，樣品可進(jìn)入如所述的清潔區(qū)和/或反應(yīng)區(qū)，例如，如所述的逆轉(zhuǎn)錄或擴(kuò)增區(qū)。樣品然后在橫截面減小(頸區(qū)域)的長度處流入另一區(qū)位置中。該頸區(qū)域的減小的橫截面可減慢流體沿芯吸方向的流動(dòng)速率，從而增大流體在緊接于其前的區(qū)中的停留持續(xù)時(shí)間。合適地，頸區(qū)域?yàn)槿缢龅闹甘緟^(qū)。在頸區(qū)域之后，整料的橫截面增大。合適地，整料在頸區(qū)域之后包含槽區(qū)。
收縮
在聚合洗滌過程中和/或干燥過程中可能發(fā)生一些收縮。合適地，固化過程中總收縮率小于頂面總表面積的約10％，更優(yōu)選小于約5％。
然而，在一些情況下，可能需要部分地包封先前形成的整料結(jié)構(gòu)的整料區(qū)一定的收縮。該適度的收縮起到以機(jī)械方式將預(yù)先形成的整料結(jié)構(gòu)捕集到新形成的整料內(nèi)的作用。這樣的捕集將在兩個(gè)區(qū)之間產(chǎn)生密切的大面積流體連接，其將促進(jìn)從一個(gè)區(qū)向另一個(gè)中的芯吸。這樣的捕集還可起到以機(jī)械方式穩(wěn)定兩個(gè)區(qū)之間的接頭的作用。這種適度收縮可為至多約10％，更優(yōu)選至多約5％，更優(yōu)選至多約3％。表3和4提供了若干示例性整料的數(shù)據(jù)。
tbama-甲基丙烯酸四丁基氨基乙酯
maa-甲基丙烯酸
nhs-甲基丙烯酸n-羥基琥珀酰亞胺酯
lyma-甲基丙烯酸月桂酯
glyma-甲基丙烯酸縮水甘油酯
so4aa-2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸
化學(xué)部分的共價(jià)接枝
如本文所述，通過基質(zhì)內(nèi)的反應(yīng)性基團(tuán)與附加到化學(xué)部分的合適的反應(yīng)性基團(tuán)之間的共價(jià)反應(yīng)向整料的聚合物基質(zhì)接枝化學(xué)部分可能是有利的。
例如，許多反應(yīng)性基團(tuán)將直接與羧酸基團(tuán)反應(yīng)，并可用來向聚合物基質(zhì)上接枝化學(xué)部分。羧酸基團(tuán)可通過選擇適宜的單體引入到聚合物網(wǎng)絡(luò)中，或者可通過用堿如氫氧化鈉或氫氧化鉀處理使得酯基團(tuán)(例如，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯基團(tuán))水解而產(chǎn)生。
如本文所述，羧基整料指具有游離羧基(-cooh)基團(tuán)的整料。
實(shí)例水解程序
將7.5mg中性聚合物基質(zhì)制劑(2∶1egdma∶hema)的圓盤在95℃下于1m或6mnaoh中浸泡1小時(shí)。然后通過浸泡在10ml水浴中至少一小時(shí)來洗滌圓盤。此在水中的浸泡再重復(fù)四次。然后通過浸泡在10ml異丙醇中至少一小時(shí)來洗滌圓盤。此在異丙醇中的浸泡再重復(fù)兩次。最后，將圓盤于40℃下真空干燥過夜。
合適地，引入或水解產(chǎn)生的羧酸基團(tuán)經(jīng)預(yù)活化以輔助共價(jià)接枝，例如，使用已知的偶聯(lián)試劑。合適的偶聯(lián)試劑包括但不限于1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edac或edc)、二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)、二異丙基碳二亞胺(dic)、1-羥基-苯并三唑(hobt)和1-羥基-7-氮雜-苯并三唑(hoat)。
氨基整料生成
許多反應(yīng)性基團(tuán)將直接與氨基基團(tuán)反應(yīng)，并可用來向聚合物基質(zhì)上接枝化學(xué)部分。相應(yīng)地，除此之外或作為另外一種選擇，游離氨基基團(tuán)可通過選擇適宜的單體引入到聚合物網(wǎng)絡(luò)中，或者可以受保護(hù)的形式引入，保護(hù)基團(tuán)隨后被移除以脫去游離氨基基團(tuán)的保護(hù)。合適的氮保護(hù)基團(tuán)是本領(lǐng)域已知的，例如叔丁氧基羰基(t-boc)。
接枝
可共價(jià)接枝任何合適的化學(xué)部分。合適的實(shí)例可包括染料、蛋白質(zhì)、酶或dna/rna衍生物、蛋白質(zhì)底物、抑制劑和抗體，如本文所述。合適的化學(xué)部分可包括ph敏感基團(tuán)，包括衍生自強(qiáng)酸或堿的那些；脂質(zhì)樣分子和樹枝狀大分子，如本文所述。
相應(yīng)地，在一些方面中，本發(fā)明涉及包含共價(jià)接枝化合物的整料，所述共價(jià)接枝被接枝到聚合物基質(zhì)的至少一部分上，其中所述共價(jià)接枝化合物可選自染料、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)底物、抑制劑、抗體、ph敏感化合物、脂質(zhì)樣分子或樹枝狀大分子。在一些實(shí)施方案中，整料包含選自酶或dna/rna衍生物的共價(jià)接枝化合物。在一些實(shí)施方案中，整料包含共價(jià)接枝寡核苷酸探針，例如，熒光猝滅dna探針。在一些實(shí)施方案中，整料包含共價(jià)接枝的酶，例如，溶菌酶、防御素、成孔毒素、切口酶、限制酶、核酸酶、轉(zhuǎn)錄酶、抗體或蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，整料包含浸漬的酶，例如，溶菌酶、防御素、成孔毒素、切口酶、限制酶、核酸酶、轉(zhuǎn)錄酶、抗體或蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，整料包含浸漬的寡核苷酸探針，例如，熒光猝滅dna探針。在一些實(shí)施方案中，整料包含共價(jià)接枝的酶，例如，溶菌酶、切口酶、轉(zhuǎn)錄酶或蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，整料包含浸漬的酶，例如，溶菌酶、切口酶、轉(zhuǎn)錄酶或蛋白酶。
fitc染料向氨基整料珠粒的共價(jià)接枝
為證實(shí)合適的染料向具有游離氨基基團(tuán)的整料的共價(jià)接枝，將熒光素異硫氰酸酯(fitc)共價(jià)接枝到聚合物基質(zhì)材料的珠粒上。
使用丸粒杵和研缽在100μl50mm硼酸鈉(ph8.5)中研磨氨基整料材料(1∶3∶1tegdma∶egdma∶hema加5.0％的甲基丙烯酸2-氨基乙酯(ama))。使用硼酸鈉緩沖液將磨碎的材料稀釋至1ml并于100xg下離心1分鐘。將無大塊整料、含破碎珠粒的上清液等分(850μl)加入到新的微管中，加入fitc至在900μl的體積中20ng/ml的最終濃度，并在黑暗中溫育一小時(shí)。通過混合、離心和再懸浮于pbs中來洗滌珠粒兩次并最后再懸浮于pbs中。使最后的懸浮液通過becktondickinson40μm細(xì)胞過濾器進(jìn)入5ml圓底管中。
出于比較的目的，使用由羧基整料材料(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的甲基丙烯酸(maa))形成的珠粒重復(fù)相同的過程。
在becktondickinsonfacscalibur流式細(xì)胞儀中進(jìn)行測量。使用中性制劑優(yōu)化通道設(shè)置以建立在儀器動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的前向和側(cè)向散射值。調(diào)節(jié)熒光增益以允許檢測強(qiáng)熒光強(qiáng)度的足夠動(dòng)態(tài)范圍。如表5中所示，dx3-羧基陰性對照珠粒的fitc處理導(dǎo)致了主要低的熒光群體(門m1)，而氨基珠粒(1∶3∶1tegdma∶egdma∶hema加5％的ama)的fitc處理導(dǎo)致幾乎全部珠粒存在于高熒光門(門m2)上。
表5使用用戶定義的熒光門控方法將整料珠粒分離成熒光群體。在此實(shí)例中，dx3-羧基陰性對照珠粒的fitc處理導(dǎo)致了主要低的熒光群體(門m1)，而(1∶3∶1tegdma∶egdma∶hema加5％的ama)氨基珠粒的fitc處理導(dǎo)致幾乎全部珠粒存在于高熒光門(門m2)上。
熒光素尸胺向羧基整料固體的共價(jià)接枝
將新鮮的edac固體以16mg/ml溶解于水中。將135μledac溶液與135μl200mmmes(ph7.0)混合并分配到12孔板的孔中。將羧基聚合物基質(zhì)(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的maa和2∶1egdma∶hema)的餡餅形狀圓盤片浸沒在edac/mes溶液中。向每個(gè)孔中加入30μl0.33mg/ml的熒光素-尸胺(在dmso中)分子探針染料。使餡餅形狀圓盤片于室溫下振蕩溫育0.5小時(shí)。移除edac/mes/熒光素染料溶液并將薄片轉(zhuǎn)移到96孔板的孔中。
用乙醇洗去未結(jié)合的染料，同時(shí)監(jiān)測熒光。隨著時(shí)間的推移，收集整料片的一系列熒光x-y掃描?？讙呙枳x數(shù)在bmgfluostaroptima板讀數(shù)器上進(jìn)行。使用的過濾器為480(激發(fā))和530(發(fā)射)。繪制每個(gè)孔的最亮像素強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。如圖2中所示，共價(jià)接枝的染料保留下來(-■-)，而未共價(jià)接枝的染料隨著乙醇溫育從聚合物基質(zhì)洗脫出來(-●-)。從熒光素-尸胺向由中性整料材料(2∶1egdma∶hema)的1m氫氧化鈉處理形成的羧基-整料材料的edac-介導(dǎo)偶聯(lián)的試驗(yàn)獲得了類似的結(jié)果。
氨基改性寡核苷酸探針向聚合物基質(zhì)的共價(jià)接枝
每一次使用前制備新鮮的edac偶聯(lián)溶液。羧基整料制劑(例如，1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的maa)芯吸大約2.5μl流體每mg整料基質(zhì)。測試的通用模式是采用6mg塞子，其將芯吸15μl溶液。使用以下配方制備足夠的偶聯(lián)混合物以允許整料的完全飽和：
將160mg/ml的edac溶解在無水dmso中(10x儲(chǔ)備溶液)?；旌?/2體積的200mmmes緩沖液(ph7.0)、1/10體積新鮮的160mg/mledac(溶解在干燥的dmso中)、1/10體積的熒光猝滅dna探針(100μm儲(chǔ)備溶液)。用去離子蒸餾水使溶液取得最終體積。加入足夠的偶聯(lián)混合物以使羧基整料固體或珠粒飽和。反應(yīng)物于室溫下溫育2小時(shí)至過夜(對于熒光寡核苷酸，在黑暗中溫育)。每70μledac溶液加入5μl30mg/ml的甘氨酸(ph7.0)溶液。反應(yīng)物于室溫下溫育至少15分鐘并然后在200μl水中沖洗3次。對于破碎的整料珠粒，使用輕離心來沉淀珠粒。棄去上清液。樣品于65℃下真空干燥1小時(shí)。
也用1/10體積的熒光素-尸胺(使用10mg/ml)進(jìn)行上述反應(yīng)，作為共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)效率的對照。
使用連接體分子改變接枝密度
接枝可以是如上所述直接的，或者可經(jīng)由連接體分子。可使用支化的連接體分子(也稱多臂)來增大整料表面上接枝的化學(xué)部分的密度。
兩種這樣的連接體分子為：
nhs-peg-nhs(d型：gas-戊二酰胺琥珀酰亞胺酯)(2-臂)和
4-臂peg-nhs(c型nhs：ss-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯)
如下文所述實(shí)驗(yàn)中也已使用8臂型式。
在本文中，本發(fā)明人通過示意而非限制的方式經(jīng)由聚合物基質(zhì)中的氨基基團(tuán)，展示了樹枝狀大分子-臂對熒光素尸胺-染料比率的6種組合的偶聯(lián)水平和穩(wěn)定性。
連接體和熒光素尸胺最初于室溫下溫育5分鐘。然后將該混合物與edac混合，轉(zhuǎn)移到氨基聚合物基質(zhì)的干片(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.5％的ama；1/8餡餅形狀圓盤片)并再溫育30分鐘，然后移除該反應(yīng)混合物并加入300μl水。
比率為臂對染料探針，因此較低的比率具有較多的染料探針，并且每個(gè)8-臂反應(yīng)具有4倍于相應(yīng)的2-臂反應(yīng)的探針。
圖3示出了來自樹枝狀大分子-熒光素偶聯(lián)和洗滌之后整料片的x-y掃描的峰值熒光強(qiáng)度。對于給定的連接體，較低的臂：探針比率(較高的探針：臂比率)有最大的信號(hào)。8-臂2∶1混合物相對于2-臂2∶1混合物獲得了更高的洗滌后殘余熒光，表明了最大程度的探針偶聯(lián)。兩臂10∶1和2∶1染料：連接體比率的峰值熒光強(qiáng)度的等效性表明了整料表面上可用結(jié)合位點(diǎn)的飽和。8-臂2∶1條件的較高值顯示染料結(jié)合超出固有整料容量；過量的染料偶聯(lián)到8-臂連接體上的附加結(jié)合位點(diǎn)。
酶的共價(jià)接枝
本發(fā)明人還已證實(shí)，功能酶可被共價(jià)接枝到如本文所述的整料的聚合物基質(zhì)。實(shí)例描述了使用蛋白酶k和溶菌酶，但應(yīng)認(rèn)識(shí)，所述程序可適用于其他合適的分子，包括但不限于適體、核酶、其他酶、抗體、凝集素和其他蛋白質(zhì)。
酶是具有許多氨基基團(tuán)的復(fù)雜分子，這些氨基基團(tuán)可參與本文描述的共價(jià)接枝反應(yīng)。因此可預(yù)期共價(jià)接枝將降低或完全抑制酶活性。然而，本發(fā)明人已證實(shí)，對于所述的酶，即便在共價(jià)接枝之后也保持了足夠的酶活性。
酶向羧基整料材料(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的maa)的固定化可使用碳二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)。例如，酶溶液可在edac在50％干燥的dmso和50％200mmmes(ph7.0)中的新鮮溶液的存在下與羧基基質(zhì)一起溫育。在酶蛋白質(zhì)中的可用氨基基團(tuán)與聚合物基質(zhì)中的羧基基團(tuán)之間發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)。
蛋白酶k是對許多肽鍵、特別是與脂族和芳族氨基酸的羧基基團(tuán)鄰近的肽鍵具有廣譜特異性的蛋白酶。它是從復(fù)雜細(xì)胞混合物或組織中純化核酸時(shí)使用的非常常見的酶。
溶菌酶是一種糖苷酶，其將特異性地分解革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌的細(xì)胞壁中的碳水化合物鍵。它是從革蘭氏陰性細(xì)菌和在較小程度上從革蘭氏陽性細(xì)菌中純化核酸時(shí)使用的非常常見的酶。
使用共價(jià)接枝蛋白酶k的整料介導(dǎo)蛋白水解
本發(fā)明人已證實(shí)，通過共價(jià)接枝到本文所述整料的聚合物網(wǎng)絡(luò)上而固定化的蛋白酶k能夠消化乳白蛋白，從而表現(xiàn)為盡管共價(jià)接枝但酶的活性仍保留。確實(shí)，觀察到的活性高，如下文所述。
將160mg/ml的edac儲(chǔ)備溶液溶解在干燥的dmso中。向在pbs中的15μl200mmmes(ph7.0)和20μl10mg/ml蛋白酶k中加入35μl該儲(chǔ)備溶液。將該溶液加到20mg圓盤羧基整料聚合物基質(zhì)(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的maa)。圓盤于室溫下溫育1小時(shí)。然后將反應(yīng)用5μl30mg/ml甘氨酸(ph7.0)于室溫下淬滅15分鐘。然后將圓盤在1xpbs中洗滌3次并在1xpbs中于4℃下保持4天。
將α-乳白蛋白底物以10mg/ml溶解于1xpbs中。將蛋白酶k偶聯(lián)圓盤切割成相等的8個(gè)餡餅形狀的片。對于每一測定，將一個(gè)餡餅片點(diǎn)側(cè)朝下地放置于0.5ml微量離心管中。對于每一個(gè)管，加入27μl10mg/ml乳白蛋白溶液或1xpbs、3μl5mmcaso4。封閉該管并于65℃下溫育2小時(shí)。加入另外的50μl去離子蒸餾水，封閉該管，并于65℃下再溫育30分鐘。
通過hplc分析未經(jīng)處理和經(jīng)蛋白酶k芯片處理的α-乳白蛋白(圖4)。該圖重疊示出了相繼的hplc運(yùn)行：蛋白酶k芯片，加α-乳白蛋白(消化了的片段)，無蛋白酶k的芯片，加α-乳白蛋白(完好無損的α-乳白蛋白)。
經(jīng)蛋白酶k處理的α-乳白蛋白在受試的短溫育期后從其原始形式完全降解，表明即使該酶被固定化于聚合物基質(zhì)上，其活性也得到保持。
使用共價(jià)接枝溶菌酶的整料介導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞壁降解
本發(fā)明人還已證實(shí)，共價(jià)接枝的溶菌酶將保持糖苷水解酶活性。這表明溶菌酶可被固定化于如本文所述的整料上并用來促進(jìn)如所述的細(xì)菌dna的純化和檢測。
在向一小段羧基整料聚合物基質(zhì)共價(jià)接枝溶菌酶后，與溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列一道，將樣品放置到熒光標(biāo)記細(xì)胞壁材料的溶液(
制備160mg/mledac儲(chǔ)備溶液在干燥的dmso中的新鮮溶液。自20μl10mg/ml的溶菌酶/1xpbs溶液、28μl200mmmes溶液(ph7.0)和15μl水制備溶菌酶混合物。
將7μl160mg/mledac點(diǎn)樣于由整料材料(1∶2∶1tegdma∶egdma∶hema加2.0％的maa)形成的單個(gè)20mg圓盤上。然后加入制得的溶菌酶混合物(63μl)并將樣品于室溫下溫育1小時(shí)。然后加入甘氨酸溶液(10μl；30mg/ml溶液，在100mmph7.0的mes溶液中)并將樣品于室溫下溫育15分鐘。然后在水中沖洗圓盤并貯存于4℃下直至使用。
為測試固定化的酶的活性，將溶菌酶偶聯(lián)圓盤和未經(jīng)處理的對照圓盤各切割成相等的1/8大小的餡餅形狀片段。然后向微孔板的兩個(gè)孔中加入各自的兩片并加入溶菌酶底物。還試驗(yàn)溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)試劑的稀釋系列。每隔一定時(shí)間讀取熒光以確定碳水化合物分解的程度和隨之而來的溶菌酶活性。
功能和官能化
如本文所述的整料可被官能化并可用于各種功能。
例如，如本文所述的整料可：
●在表面上或整個(gè)結(jié)構(gòu)上官能化；
●通過在整料的制造過程中添加至少一種官能化單體來官能化，所述官能化單體例如選自具有以下側(cè)鏈中之一的單體：氨基、羧基、peg、烷基、馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺、?；u、巰基或疊氮化物；
●通過化學(xué)水解來官能化；
●通過化合物向整料的聚合物基質(zhì)的共價(jià)接枝來官能化；和/或
●通過一種或多種化合物在整料的聚合物基質(zhì)內(nèi)的浸漬來官能化。
例如，如本文所述的整料可能可用于以下中的任何或全部，而不限于任何順序或組合：
●通過物理設(shè)計(jì)來引導(dǎo)流體的流動(dòng)(可使用方向來混合試劑與流體)；
●控制流體流動(dòng)的凈速率(通量)；
●顆粒物、全細(xì)胞、細(xì)胞空殼、細(xì)胞器、細(xì)胞碎片、病毒衣殼、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核糖體或分子聚集體的機(jī)械捕集；
●例如經(jīng)由細(xì)胞、孢子、病毒、細(xì)菌、酵母或真菌、分子聚集體等的破壞從混合物中釋放分子；
●離子或分子的親和結(jié)合，例如，通過靜電、范德華力或氫鍵相互作用或它們的任何組合；
●經(jīng)由酸、堿、鹽、糖、滲透劑或賦形劑的釋放和/或吸附改變流體的ph和同滲容摩；
●貯存、保存或控制試劑向混合物中的釋放；
○釋放任何類別的分子，包括但不限于酶或其他蛋白質(zhì)、溶菌酶、防御素、核酸酶、脂蛋白、去垢劑、表面活性劑、變性劑、蛋白酶、激酶、連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或核糖核酸酶抑制劑或它們的任何組合；
●保持和定域化適合定域化于特定區(qū)而非其他區(qū)中的活性分子如酶、去垢劑或探針；和
●透射光或反射光以用作化學(xué)指示器。
相應(yīng)地，如本文所述的制造方法可還包括官能化整料的步驟使得其配置為實(shí)現(xiàn)任何上述功能。
分區(qū)化整料
對于一些應(yīng)用，為了便于樣品處理和分析物檢測，可優(yōu)選提供具有有著不同性質(zhì)的區(qū)的整料，這些區(qū)沿著預(yù)期的流體流動(dòng)方向(芯吸方向)依次取向和/或沿著芯吸方向平行地定位。當(dāng)然，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于多區(qū)整料。
區(qū)可在物理性質(zhì)和/或化學(xué)性質(zhì)方面不同。差異可以是整料的聚合物基質(zhì)的整體特征(例如，在聚合步驟過程中引入或通過改變區(qū)內(nèi)的聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)引入、通過后處理和/或向基質(zhì)共價(jià)接枝另外的化學(xué)部分引入)或者可以是用試劑等在該部分處浸漬整料的結(jié)果。
在使用中，流體樣品被施加到整料的樣品施加區(qū)，并在與樣品施加區(qū)間隔開的位置處檢測。分析物的檢測點(diǎn)在整料的指示部中。
應(yīng)理解，雖然多區(qū)整料含具有不同性質(zhì)的區(qū)，但多區(qū)整料的全部區(qū)不一定與每個(gè)其他的區(qū)不同，盡管它們可以不同。
應(yīng)理解，使用的區(qū)的組合和這些區(qū)的性質(zhì)可隨預(yù)期的流體處理方法而異。以下特定組合提供以示意而非意在限制本發(fā)明。其他組合和修改將是顯而易見的并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
清潔區(qū)
該區(qū)可配置為將感興趣的分析物與樣品的至少一種其他組分分離開來和/或在檢測之前(和可能地在擴(kuò)增之前)處理分析物。還可向樣品中添加試劑如緩沖液、去垢劑、蛋白酶抑制劑或穩(wěn)定劑。該處理可有助于分析物的釋放，例如通過細(xì)胞或病毒裂解和/或樣品ph的酸化。
為簡單起見，在整個(gè)本說明書中，適當(dāng)時(shí)，提及的分析物可包括一種或多種預(yù)分析物。預(yù)分析物指其自身將經(jīng)歷改變以釋放或轉(zhuǎn)化為被檢測的分析物的樣品組分。例如，細(xì)胞可經(jīng)歷裂解以釋放分析物蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，包括dna和rna。
分析物的分離可通過過濾進(jìn)行；例如，通過在區(qū)中提供足夠尺寸的孔隙/通道以允許分析物與流體一起移動(dòng)，但所述孔隙/通道應(yīng)足夠小以防止其他組分的移動(dòng)。這可稱為機(jī)械捕集。例如，病毒(尺寸大約0.1μm)可通過清潔區(qū)中的過濾作用與紅細(xì)胞(尺寸大約2μm)分離開來。病毒可然后與芯吸流體一起行進(jìn)至指示區(qū)，任選地經(jīng)由又一清潔區(qū)和/或一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增區(qū)。例如，病毒可行進(jìn)通過配置為便于病毒衣殼裂解的清潔區(qū)和/或配置為便于逆轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增區(qū)和/或配置為擴(kuò)增dna的擴(kuò)增區(qū)。
清潔區(qū)可通過過濾作用移除不希望有的污染物?？赏ㄟ^這樣的過濾作用移除的其他樣品“污染物”包括顆粒物、纖維素、纖維、硅酸鹽、全細(xì)胞、細(xì)胞空殼、細(xì)胞器、細(xì)胞碎片、病毒衣殼、脂筏和核糖體。
清潔也可通過親和結(jié)合進(jìn)行，例如通過靜電、范德華力或氫鍵相互作用或它們的任何組合?？赏ㄟ^選擇合適的單體或通過在聚合后處理聚合物網(wǎng)絡(luò)來實(shí)現(xiàn)靶向親和結(jié)合，例如通過用氫氧化物處理以水解酯部分或通過如本文所述共價(jià)接枝化學(xué)部分。
可使用氨基基團(tuán)如甲基丙烯酸氨基乙酯來捕獲具有負(fù)電荷的物種如脂質(zhì)-膜片段、dna和蛋白質(zhì)。氨基基團(tuán)是化學(xué)反應(yīng)性的；初始制造之后可使用它們來在整料的內(nèi)表面上永久性地固定其他化學(xué)品。該結(jié)合可以是直接的，或者其可經(jīng)由添加的連接體(例如，碳二亞胺)進(jìn)行。氨基基團(tuán)也可用作錨定劑以捕獲化學(xué)物質(zhì)(例如，以固定分子如抗體和/或凝集素)和固定化蛋白酶于清潔區(qū)中。
可使用帶負(fù)電的基團(tuán)如羧基或硫酸根來捕獲帶正電荷的物種如蛋白質(zhì)。羧基基團(tuán)是化學(xué)反應(yīng)性的；初始制造之后可使用它們來在整料的內(nèi)表面上永久性地固定其他化學(xué)品。該結(jié)合可以是直接的，或者其可經(jīng)由添加的連接體進(jìn)行。羧基基團(tuán)也可用在清潔區(qū)中以固定蛋白酶或去垢劑樣分子用于裂解細(xì)胞。
可使用例如通過在聚合過程中使用具有長鏈的單體(例如，甲基丙烯酸月桂酯、或甲基丙烯酸氨基月桂酯、或甲基丙烯酸磺基月桂酯)引入的長鏈烷基基團(tuán)來捕獲油和脂肪鏈分子，例如，去垢劑、甘油三酯、卵磷脂、脂質(zhì)-膜片段和脂蛋白。
如本文所用，捕獲既指完全固定化又指流動(dòng)過程中的阻滯。
清潔區(qū)還可促進(jìn)分析物例如自細(xì)胞等(預(yù)分析物)的釋放。例如，清潔區(qū)可促進(jìn)以下中的一者或多者：
-經(jīng)由體細(xì)胞、病毒、細(xì)菌或真菌的破壞從預(yù)分析物釋放多核苷酸；
-通過細(xì)胞裂解釋放胞質(zhì)溶膠；
-通過酸化釋放與白蛋白結(jié)合的藥物；
-用表面活性劑從磨碎的固體提取分析物。
這些可例如通過例如通過向聚合物基質(zhì)中共價(jià)接枝或浸漬試劑而固定化的試劑(包括酶)來實(shí)現(xiàn)。
這些試劑可包括蛋白質(zhì)，例如酶，例如溶菌酶、蛋白酶；防御素、脂蛋白、核糖核酸酶抑制劑；去垢劑、表面活性劑、變性劑、緩沖劑或它們的任何組合。
清潔區(qū)還可在流體進(jìn)入下一流體處理區(qū)之前改變流體的性質(zhì)。這可通過酸、堿、鹽、糖、滲透劑或賦形劑的吸收或釋放來實(shí)現(xiàn)。例如，滲透劑可為甘油。
相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可提供如本文所述的整料或制造如本文所述的整料的方法，其中所述整料包含清潔區(qū)，所述清潔區(qū)配置為實(shí)現(xiàn)以下功能中的至少之一：
-機(jī)械捕集樣品中的某組分以阻滯或防止該組分在芯吸過程中移動(dòng)通過整料；
-親和捕集樣品中的某組分以阻滯或防止該組分在芯吸過程中移動(dòng)通過整料；
-經(jīng)由體細(xì)胞、病毒、細(xì)菌或真菌的破壞來促進(jìn)一種或多種多核苷酸釋放；通過細(xì)胞裂解促進(jìn)胞質(zhì)溶膠釋放；
-通過破壞樣品基質(zhì)中的掩蔽效應(yīng)來促進(jìn)分析物的釋放。
在一些實(shí)施方案中，提供兩個(gè)或更多個(gè)平行的清潔區(qū)。
反應(yīng)區(qū)
反應(yīng)區(qū)為其中執(zhí)行對分析物的所需化學(xué)修飾的區(qū)。實(shí)例包括但不限于捕獲、水解、加成、共軛和擴(kuò)增，其最后一者將在下文更詳細(xì)地描述。這些反應(yīng)可由如本文所述的共價(jià)接枝化合物和/或浸漬化合物得到促進(jìn)。
反應(yīng)步驟可能花費(fèi)比樣品芯吸通過該區(qū)的長度通常所花的時(shí)間更長的時(shí)間。反應(yīng)區(qū)可因此配置為阻滯該區(qū)中的分析物使得它們留在反應(yīng)區(qū)內(nèi)足以進(jìn)行反應(yīng)步驟的時(shí)間。這樣的阻滯可為機(jī)械阻滯或親和阻滯。
作為另外一種選擇或除此之外，整料可構(gòu)造為限制流出反應(yīng)區(qū)的流動(dòng)，例如，可在反應(yīng)區(qū)的末端處和/或在下一區(qū)的開始處提供頸區(qū)域。作為另外一種選擇或除此之外，可在反應(yīng)區(qū)下游提供具有低芯吸率的整料段。下文提供了關(guān)于整料配置的更多信息。
擴(kuò)增
于檢測之前擴(kuò)增分析物可能是有利的。如本文所述，擴(kuò)增包括增加總分析物含量、修飾分析物以便于檢測，例如通過與染料等絡(luò)合或接枝到染料等、通過觸發(fā)產(chǎn)生發(fā)色團(tuán)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)、或通過其他反應(yīng)或處理。擴(kuò)增可在反應(yīng)區(qū)中進(jìn)行(即，反應(yīng)區(qū)可為擴(kuò)增區(qū))。
如上文所述，擴(kuò)增步驟可能花費(fèi)比樣品芯吸通過該區(qū)的長度通常所花的時(shí)間更長的時(shí)間。擴(kuò)增區(qū)可因此如上文所述配置為阻滯該區(qū)中的分析物。
整料可與溶液中的酶、核苷三磷酸和核酸相容，以便其基本上不會(huì)干擾涉及它們的反應(yīng)。其還可適于貯存、保持和/或控制以下物質(zhì)的釋放：有機(jī)或無機(jī)化學(xué)品、蛋白質(zhì)、酶、天然或非天然核苷酸序列、dna類似物、引物、靶核苷酸序列、探針核苷酸序列、熒光標(biāo)記核苷酸序列、保存試劑、穩(wěn)定試劑或它們的任何組合。
相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可提供如本文所述的整料或制造如本文所述的整料的方法，其中所述整料包含擴(kuò)增區(qū)，所述擴(kuò)增區(qū)配置為實(shí)現(xiàn)以下功能中的至少之一：
-提供與溶液中的酶、核苷三磷酸和核酸的相容性；
-在沿著流體路徑的一個(gè)或多個(gè)位置處向樣品中引入試劑；混合試劑與樣品；
-貯存、保持和/或控制以下物質(zhì)的釋放：有機(jī)或無機(jī)化學(xué)品、蛋白質(zhì)、酶、天然或非天然核苷酸序列、dna類似物、引物、靶核苷酸序列、探針核苷酸序列、熒光標(biāo)記核苷酸序列、保存試劑、穩(wěn)定試劑或它們的任何組合；
-修飾分析物以便于檢測，例如通過與探針絡(luò)合或接枝到探針，例如發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、膠體金、磁性珠粒、量子點(diǎn)或膠乳珠粒。
相應(yīng)地，在一些方面，本發(fā)明涉及具有配置為促進(jìn)流體樣品中靶核酸序列的擴(kuò)增的部分的整料，所述整料包含以下組分中的至少之一：
-脫氧核苷三磷酸(dntp)
-內(nèi)引物，例如fip和bip內(nèi)引物
-外引物，例如f和b外引物
-聚合酶，例如bstwarmstart2.0聚合酶(newenglandbiolabs)
-緩沖劑、穩(wěn)定劑和/或鹽
-環(huán)狀引物
如本文所述，這些組分中的每一者可獨(dú)立地如本文所述共價(jià)接枝到整料的聚合物基質(zhì)或浸漬在整料內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，提供兩個(gè)或更多個(gè)平行的擴(kuò)增區(qū)，例如，在清潔區(qū)和指示區(qū)之間。
指示區(qū)
分析物的檢測在整料的指示部中進(jìn)行。合適地，這是整料的診斷表面上或臨近整料的診斷表面的位置。該位置可在指示區(qū)中。
指示區(qū)可配置為便于分析物的檢測。這可以是通過基質(zhì)改性以引入某些化學(xué)部分、通過懸浮試劑或探針于網(wǎng)絡(luò)內(nèi)或者印刷(任選地接枝)試劑或探針于診斷表面上所致整料基質(zhì)的機(jī)械/物理性質(zhì)的結(jié)果。合適地，整料是至少部分地半透明的，以便可通過整料的背向照明輔助檢測。
指示區(qū)可包括檢測區(qū)域，例如斑點(diǎn)和/或條紋，其指示樣品中分析物的存在，例如通過改變顏色、發(fā)出磷光等。
這些檢測區(qū)域可包含探針。合適地，探針可包含發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)或猝滅劑。例如，探針可包含蒼耳烷衍生物，例如熒光素、若丹明、俄勒岡綠(oregongreen)、曙紅和德州紅(texasred)或它們的衍生物，例如熒光素-尸胺。
合適地，在制造之后于整料中形成檢測區(qū)域。例如，可在制造之后向整料的表面上印刷檢測區(qū)域。例如，探針可作為適于噴墨印刷的溶液來提供。這樣，可取得合適尺寸和形狀的檢測區(qū)域。
相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可提供如本文所述的整料或制造如本文所述的整料的方法，其中所述整料包含指示區(qū)，所述指示區(qū)具有一個(gè)或多個(gè)檢測區(qū)域，所述檢測區(qū)域包含如本文所述用于檢測分析物的探針。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可提供用于制造如本文所述的整料的方法，所述方法還包括向整料的診斷表面施加包含一種或多種探針的溶液以形成一個(gè)或多個(gè)檢測區(qū)域的步驟。所述或每一個(gè)檢測區(qū)域可例如獨(dú)立地為斑點(diǎn)或條紋(定向?yàn)闄M向或居中)。施加溶液的步驟可為噴墨印刷步驟或移液步驟或滾動(dòng)步驟，或者可涉及向診斷表面下方的本體材料中注入溶液。
在一些實(shí)施方案中，分析物可為樣品中的靶核酸序列。
在一些實(shí)施方案中，可提供兩個(gè)或更多個(gè)平行的指示區(qū)，例如，在反應(yīng)區(qū)和槽區(qū)之間。
槽區(qū)
合適地，如本文所述整料在使用過程中因自芯吸而進(jìn)行流體和分析物輸送。如本文所述，沿著流動(dòng)方向可能優(yōu)選不同的芯吸率，例如以幫助清潔、擴(kuò)增和/或檢測。如本文所述向著芯吸方向上整料的末端提供槽區(qū)可能是有利的，以在本文所述方法的過程中促進(jìn)樣品沿著整料的運(yùn)動(dòng)性。
槽區(qū)配置為具有高的芯吸率和/或流體吸收性；換句話講，其可起到沿著整料抽吸樣品的作用。因此，合適地，槽區(qū)可在本文所述的芯吸試驗(yàn)中具有大于3.0cm的芯吸率，優(yōu)選大于3.2cm，更優(yōu)選大于3.5cm，更優(yōu)選大于3.7cm。
除此之外或作為另外一種選擇，槽區(qū)可具有比芯吸方向上在其之前的一個(gè)或多個(gè)整料區(qū)更大的總?cè)萘?。這可以是槽區(qū)與所述在前的區(qū)相比具有更大的寬度和/或深度的結(jié)果。
合適地，槽區(qū)為吸收器，并可為以下中的至少之一：中和器、去活化器、分解器或它們的任何組合。
相應(yīng)地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可提供如本文所述的整料或制造如本文所述的整料的方法，其中所述整料包含槽區(qū)。合適地，所述槽位于芯吸方向上整料的末端處；即，槽區(qū)用作已從整料的流體施加部沿著整料芯吸的流體的槽。
多區(qū)配置
如本文所述，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有兩個(gè)或更多個(gè)不同的區(qū)的整料。這些區(qū)可沿著整料的預(yù)期芯吸方向從流體施加部向整料的末端順序布置。
優(yōu)選地，整料具有位于整料末端處的槽區(qū)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，整料總是具有位于最遠(yuǎn)離樣品施加區(qū)的區(qū)域中的槽區(qū)。例如，在線形設(shè)計(jì)中，槽區(qū)和樣品加載區(qū)在整料的相對端處，而在其中樣品加載于中心處的徑向設(shè)計(jì)中，一個(gè)或多個(gè)槽將在整料的最周緣區(qū)域處。
可包括任何形式或功能的不止一個(gè)區(qū)。這些區(qū)可相同或不同。例如，可提供兩個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)。這些區(qū)可以是相繼的且不同(例如，反應(yīng)區(qū)a和反應(yīng)區(qū)b)或者可以由例如清潔區(qū)間隔開。在后一情況下，反應(yīng)區(qū)可具有相同或不同的性質(zhì)。
如本文所述的整料可用于廣泛的工藝和方法。相應(yīng)地，可使用本文所述和/或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的組合物、模具、浸漬、接枝和其他方法提供多種多區(qū)整料。
以下布置僅提供以示意可提供的多種多區(qū)整料。當(dāng)然，以下非意在限制本發(fā)明的多區(qū)整料：
指示區(qū)-槽區(qū)
反應(yīng)區(qū)-槽區(qū)
反應(yīng)區(qū)-指示區(qū)-槽區(qū)
反應(yīng)區(qū)a-反應(yīng)區(qū)b-指示區(qū)-槽區(qū)
反應(yīng)區(qū)-清潔區(qū)-反應(yīng)區(qū)-指示區(qū)-槽區(qū)
清潔區(qū)-指示區(qū)-槽區(qū)
清潔區(qū)-反應(yīng)區(qū)-指示區(qū)-槽區(qū)
清潔區(qū)-反應(yīng)區(qū)a-反應(yīng)區(qū)b-指示區(qū)-槽區(qū)
清潔區(qū)-反應(yīng)區(qū)-清潔區(qū)-反應(yīng)區(qū)-指示區(qū)-槽區(qū)
清潔區(qū)-清潔區(qū)-反應(yīng)區(qū)a-反應(yīng)區(qū)b-指示區(qū)-槽區(qū)
附圖中示出了多個(gè)非限制性的示例性多區(qū)整料。
例如，圖6示出了示例性的4區(qū)整料。可選擇性地使用清潔區(qū)來從樣品捕集顆粒物材料，如污染物或不期望的細(xì)胞類型。反應(yīng)區(qū)可承擔(dān)多種功能：試劑釋放、裂解、消化、逆轉(zhuǎn)錄、核酸擴(kuò)增等(即，其可為清潔區(qū)、擴(kuò)增區(qū)或如本文所述兩者的組合)。指示區(qū)可含將識(shí)別感興趣的分析物(包括對照分析物)的存在的試劑。槽區(qū)(吸收區(qū))保持從樣品施加點(diǎn)通過每一后續(xù)區(qū)直至分析完成的流體流。這些區(qū)是連續(xù)的并各自可根據(jù)應(yīng)用的需要具有多種相容的化學(xué)物質(zhì)。如所示，指示區(qū)位于橫截面積減小的頸區(qū)域中。
如本文所述，可以向整料基質(zhì)施加含傳染劑如流感病毒顆粒的流體樣品并使用整料使流體在不同功能的區(qū)之間移動(dòng)的自芯吸性質(zhì)以連續(xù)的方式裂解、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和檢測特定的擴(kuò)增產(chǎn)物。
整料之間的流體接合部
在一些情況下，可能有利的是在單個(gè)設(shè)備或外殼中組合不止一個(gè)整料。這些單獨(dú)的整料中的每一者可含有一個(gè)或多個(gè)如本文所述的區(qū)。合適地，這些單獨(dú)的整料可放置為彼此接觸或流體連通使得流體將從一個(gè)整料的特定接液部分移動(dòng)或芯吸到另一整料中。合適地，整料可由外部框架保持彼此接觸。或者，可將整料引入到機(jī)械組件中，所述機(jī)械組件將在施加樣品后的某個(gè)時(shí)間使它們彼此接觸。應(yīng)理解，如果在整料之間的接合部中存在足夠的物理接觸水平，則這些整料之間的流體傳輸將是最有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，單獨(dú)的整料的界面或抵接表面具有基本上相同的形狀或者整料中的一者或兩者是足夠柔性的以適形于接合部的形狀。還應(yīng)理解，可將不同芯吸材料的一部分放置在兩個(gè)單獨(dú)的整料之間以在其間建立流體接合部。
本發(fā)明的整料中相關(guān)化學(xué)過程的演示
以下描述的特定化學(xué)過程以示意而非限制的方式提供。
dna擴(kuò)增
如本文所述的整料可包含一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增區(qū)。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增區(qū)配置為擴(kuò)增dna。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增區(qū)配置為將rna轉(zhuǎn)化為dna并且擴(kuò)增dna二者。在一些實(shí)施方案中，提供兩個(gè)擴(kuò)增區(qū)：第一個(gè)配置為將rna轉(zhuǎn)化為dna，第二個(gè)配置為擴(kuò)增新生的dna。
合適地，dna擴(kuò)增經(jīng)由等溫方法例如鏈置換擴(kuò)增(sda)進(jìn)行。例如，dna擴(kuò)增可經(jīng)由滾環(huán)擴(kuò)增(rca)、重組酶/聚合酶擴(kuò)增(rpa)、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(expar)、螺旋酶依賴性擴(kuò)增(hda)或環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增(lamp)進(jìn)行。
優(yōu)選地，dna擴(kuò)增可經(jīng)由環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增(lamp)進(jìn)行。相應(yīng)地，在一些方面，本發(fā)明提供了用于處理流體樣品的自芯吸整料，所述整料包含配置為實(shí)現(xiàn)流體樣品中dna的環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增的擴(kuò)增區(qū)。本發(fā)明還提供了制造這樣的整料的方法。
lamp是由notomi及其同事于2000年開發(fā)的等溫?cái)U(kuò)增方法(notomi，t.等人，2000，nucleicacidsresearch，28，e63)。此方法使用每靶一組4-6個(gè)引物，并可將靶分子擴(kuò)增為含有原始靶序列的多個(gè)復(fù)制品的發(fā)夾樣和花椰菜形結(jié)構(gòu)的混合物。lamp通常在65℃左右使用bst聚合酶樣酶運(yùn)行。當(dāng)在恒溫、具有染料的實(shí)時(shí)pcr機(jī)器中運(yùn)行時(shí)，其將產(chǎn)生pcr樣擴(kuò)增曲線，這些曲線從基線開始上升的時(shí)間(time-to-rise)與起始模板的初始量的對數(shù)成反比。當(dāng)模板分子越豐富時(shí)，熒光將越快升至閾值以上。
配置為實(shí)現(xiàn)環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增的擴(kuò)增區(qū)可包含以下組分中的至少之一：
-脫氧核苷三磷酸(dntp)
-內(nèi)引物，例如fip和bip內(nèi)引物
-外引物，例如f和b外引物
-聚合酶，例如bstwarmstart2.0聚合酶(newenglandbiolabs)
-緩沖劑、穩(wěn)定劑和/或鹽
-環(huán)引物
如果存在，任何這些組分可被浸漬到聚合物基質(zhì)中。這可通過在所需的區(qū)位置用所述一種或多種組分的一種或多種溶液灌注聚合物基質(zhì)并然后讓溶劑蒸發(fā)(這可自然地發(fā)生或可在升高的溫度和/或減壓下進(jìn)行或通過凍干進(jìn)行)來實(shí)現(xiàn)。浸漬的組分可然后隨著芯吸流體通過該區(qū)而溶解到芯吸流體中，從而與樣品混合以進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)級(jí)聯(lián)。
作為另外一種選擇或除此之外，可使用如本文所述的方法使聚合酶共價(jià)接枝到聚合物基質(zhì)。
應(yīng)理解，可在芯吸流體中(例如，在樣品緩沖劑中)包含促進(jìn)反應(yīng)所需的一種或多種組分，以便當(dāng)芯吸流體在反應(yīng)區(qū)中時(shí)可發(fā)生反應(yīng)。
配置為實(shí)現(xiàn)lamp的擴(kuò)增區(qū)可還包含逆轉(zhuǎn)錄酶。所述逆轉(zhuǎn)錄酶可如所述浸漬到基質(zhì)中。作為另外一種選擇或除此之外，其可使用如本文所述的方法共價(jià)接枝到聚合物基質(zhì)。應(yīng)理解，在本文所述的方法中，逆轉(zhuǎn)錄酶可提供在芯吸流體中，例如樣品緩沖劑中。
應(yīng)理解，可將額外的一組lamp組分與相應(yīng)的模板dna序列、rna序列或病毒顆粒一起浸漬以用作反應(yīng)對照樣品。例如，對照反應(yīng)可與分析物擴(kuò)增一起并行地進(jìn)行。
作為另外一種選擇或除此之外，配置為實(shí)現(xiàn)lamp的擴(kuò)增區(qū)可在配置為將rna轉(zhuǎn)化為cdna的擴(kuò)增區(qū)(逆轉(zhuǎn)錄區(qū))之后，所述配置為將rna轉(zhuǎn)化為cdna的區(qū)包含逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶可被浸漬到聚合物基質(zhì)中。作為另外一種選擇或除此之外，其可使用如本文所述的方法共價(jià)接枝到聚合物基質(zhì)。
相應(yīng)地，在一些方面，本發(fā)明提供了一種制造用于處理流體樣品的自芯吸整料的方法，所述方法包括形成配置為實(shí)現(xiàn)dna的lamp的擴(kuò)增區(qū)。
形成配置為實(shí)現(xiàn)dna的lamp的擴(kuò)增區(qū)的步驟可包括浸漬以下中的一者或多者：脫氧核苷三磷酸(dntp)；內(nèi)引物，例如，fip和bip內(nèi)引物；外引物，例如，f和b外引物；環(huán)引物；聚合酶，例如，bstwarmstart2.0聚合酶；鹽、穩(wěn)定劑和/或緩沖劑；和對照模板dna和/或rna和/或病毒顆粒(當(dāng)然，試驗(yàn)?zāi)０逵尚疚黧w供給)。例如，所述浸漬可以是dntp、內(nèi)引物和外引物及任選地還有環(huán)引物的浸漬。
形成擴(kuò)增區(qū)可還包括用聚合酶浸漬聚合物基質(zhì)和/或向聚合物基質(zhì)共價(jià)接枝聚合酶。
形成擴(kuò)增區(qū)可還包括用逆轉(zhuǎn)錄酶浸漬聚合物基質(zhì)和/或向聚合物基質(zhì)共價(jià)接枝逆轉(zhuǎn)錄酶。或者，所述方法可還包括通過逆轉(zhuǎn)錄酶的浸漬和/或向聚合物基質(zhì)共價(jià)接枝逆轉(zhuǎn)錄酶來形成配置為將rna轉(zhuǎn)化為cdna的擴(kuò)增區(qū)(逆轉(zhuǎn)錄區(qū))的步驟。
例如，制造用于處理流體樣品的自芯吸整料的方法可為包括以下的方法：
-提供親水單體和連接體單體，所述連接體單體具有由包含至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體間隔開的兩個(gè)可聚合基團(tuán)；
-任選地其中還提供一種或多種另外的單體；
-通過在致孔溶劑中合并所述親水單體和連接體單體來獲得可聚合組合物；
-聚合所述可聚合組合物以形成整料；
-獲得作為不含有未聚合的起始材料的聚合物基質(zhì)的整料；
-形成配置為實(shí)現(xiàn)dna的lamp的擴(kuò)增區(qū)，其通過以下實(shí)現(xiàn)：
-向聚合物基質(zhì)中浸漬以下中的一者或多者：脫氧核苷三磷酸(dntp)；內(nèi)引物，例如，fip和bip內(nèi)引物；外引物，例如，f和b外引物；環(huán)引物；聚合酶，例如，bstwarmstart2.0聚合酶；鹽、穩(wěn)定劑和/或緩沖劑；和模板dna和/或rna和/或病毒顆粒；
-用聚合酶浸漬聚合物基質(zhì)和/或向聚合物基質(zhì)共價(jià)接枝聚合酶。
所述方法可還包括用逆轉(zhuǎn)錄酶浸漬聚合物基質(zhì)和/或向聚合物基質(zhì)共價(jià)接枝逆轉(zhuǎn)錄酶的步驟?；蛘?，所述方法可還包括通過逆轉(zhuǎn)錄酶的浸漬和/或向聚合物基質(zhì)共價(jià)接枝逆轉(zhuǎn)錄酶來形成配置為將rna轉(zhuǎn)化為cdna的擴(kuò)增區(qū)(逆轉(zhuǎn)錄區(qū))的步驟。
所述浸漬可通過向整料施加試劑，然后通過自然蒸發(fā)溶劑、于升高的溫度和/或減壓下蒸發(fā)溶劑、凍干或任何其他合適的方法來進(jìn)行。
還提供了根據(jù)所述方法制造的用于處理流體樣品的自芯吸整料，所述整料包含配置為實(shí)現(xiàn)流體樣品中dna的環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增的擴(kuò)增區(qū)。
lamp等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)
25μl等溫lamp反應(yīng)含有1.4mmdntp、1.6μmfip和bip內(nèi)引物、0.2μmf和b外引物、0.4μm環(huán)引物、≥16單位的bstwarmstart2.0聚合酶(newenglandbiolabs)、dna模板或病毒顆粒和補(bǔ)充了6mmmgso4的1xnewengland
使用流感病毒來證實(shí)自芯吸整料中的lamp擴(kuò)增。
流感病毒是一種負(fù)鏈分節(jié)段rna病毒。獲得了針對2012-2013季季節(jié)性流感的美國medimmune疫苗。2012-2013medimmune疫苗是一種含有活性減毒流感a/california/7/2009(h1n1)、a/victoria/361/2011(h3n2)和b/wisconsin/1/2010病毒株的三價(jià)疫苗。使用parida等人在專利(ep2499264a1、us20120231445、wo2011058580a1)中公布的流感aca2009lamp引物。使用這些針對a/california/7/2009株的血凝素基因設(shè)計(jì)的lamp引物，本發(fā)明人能夠在溶液中和整料中對稀釋的液體疫苗進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)。使用1e7作為公開顆粒/ml(1e6.5至1e7.5)的平均值來計(jì)算lamp反應(yīng)中使用的病毒顆粒/rna復(fù)制數(shù)。
應(yīng)理解，對于從病毒擴(kuò)增核酸序列，病毒裂解必須在病毒核酸的擴(kuò)增之前進(jìn)行。這可通過使用高溫在擴(kuò)增區(qū)中實(shí)現(xiàn)，或者例如在如本文所述整料的在前清潔區(qū)中通過其他方法實(shí)現(xiàn)。
對于rna的擴(kuò)增，合適地進(jìn)行病毒rna向病毒互補(bǔ)dna(cdna)的逆轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄)。這可在配置為將rna轉(zhuǎn)化為dna的擴(kuò)增區(qū)中，所述擴(kuò)增區(qū)在配置為實(shí)現(xiàn)dna擴(kuò)增的擴(kuò)增區(qū)之前，或者逆轉(zhuǎn)錄和dna擴(kuò)增可在同一區(qū)中進(jìn)行。
液體反應(yīng)混合物被芯吸到干燥的整料中，于65℃下溫育，在95℃下滅活，并將整料樣品浸泡在緩沖液中以洗脫反應(yīng)產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物通過實(shí)時(shí)pcr定量(圖7)。將液體(對照)反應(yīng)物稀釋至與實(shí)時(shí)pcr前從整料洗脫的液體相同的程度。在50分鐘的等溫lamp擴(kuò)增反應(yīng)后，來自洗脫和液體對照lamp反應(yīng)的實(shí)時(shí)pcr擴(kuò)增曲線同時(shí)從基線上升，表明在液體中和整料中具有相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增水平。
dna檢測
如本文所述的整料可配置為便于dna的檢測，例如通過dna的核酸雜交和信號(hào)傳導(dǎo)。
相應(yīng)地，在一些方面，本發(fā)明提供了一種制造用于處理流體樣品的自芯吸整料的方法，所述方法包括形成配置為便于dna的檢測的指示區(qū)。例如，所述方法可為制造用于處理流體樣品的自芯吸整料的方法，所述方法包括形成配置為實(shí)現(xiàn)dna的核酸雜交和信號(hào)傳導(dǎo)的指示區(qū)。
例如但非作為限制，所述核酸雜交和信號(hào)傳導(dǎo)可以是切口核酸內(nèi)切酶(nesa)雜交和信號(hào)傳導(dǎo)過程。配置為實(shí)現(xiàn)nesa雜交和信號(hào)傳導(dǎo)的指示區(qū)包含dna探針。合適地，dna探針包含熒光團(tuán)和由核酸鏈例如dna的短單鏈連接的猝滅劑。合適的探針是本領(lǐng)域已知的。合適地，配置為實(shí)現(xiàn)nesa雜交和信號(hào)傳導(dǎo)的指示區(qū)還包含切口酶，例如，切口核酸內(nèi)切酶。相應(yīng)地，在一些方面，本發(fā)明涉及包含切口酶的整料；所述切口酶可共價(jià)接枝到整料的聚合物網(wǎng)絡(luò)和/或浸漬到整料的聚合物網(wǎng)絡(luò)中。
合適地，所述探針適于檢測靶序列。nesa雜交和信號(hào)傳導(dǎo)過程在美國專利申請us2012/00655088中有詳細(xì)描述。簡而言之，探針的熒光團(tuán)通過其接近猝滅劑而猝滅。當(dāng)探針遇到靶序列時(shí)，dna探針的核酸序列將與靶序列雜交而形成包含dna探針的雙鏈dna段。作為雙鏈dna，可通過切口酶切割dna探針的核酸序列，從而從熒光團(tuán)釋放猝滅劑使得可檢測熒光。通過設(shè)計(jì)，切口核酸內(nèi)切酶可分裂dna探針的核酸鏈而不是靶dna(如圖8中所示)。合適地，使用光來使得熒光團(tuán)可視化。光的波長可選擇為合適。光可例如為uv光。
圖8示出了切口核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的原理。當(dāng)單鏈dna探針與其dna配對雜交時(shí)，切口核酸內(nèi)切酶將切割探針鏈，從而分離熒光團(tuán)與猝滅劑。因?yàn)槲挥谇锌趥?cè)面的探針兩側(cè)均較短，故它們將傾向于與靶分離，導(dǎo)致熒光。靶dna然后自由結(jié)合到新的未切割探針并繼續(xù)此循環(huán)，產(chǎn)生熒光。如果dna探針是共價(jià)接枝到整料的，則熒光將在固定化的部位。
可使用如本文所述的方法將dna探針浸漬到聚合物基質(zhì)中和/或可將所述探針經(jīng)由寡核苷酸連接體共價(jià)接枝到聚合物基質(zhì)。形成配置為實(shí)現(xiàn)dna的nesa雜交和信號(hào)傳導(dǎo)的指示區(qū)的步驟可包括如本文所述向聚合物基質(zhì)中浸漬一種或多種dna探針和/或向聚合物基質(zhì)上共價(jià)接枝一種或多種探針。優(yōu)選地，dna探針是共價(jià)接枝的。這將防止熒光團(tuán)在整料內(nèi)的遷移，所述遷移會(huì)削弱信號(hào)。此外，對于不止一種分析物的檢測，合適地，可將適宜的dna探針共價(jià)接枝于一個(gè)或多個(gè)指示區(qū)內(nèi)的不同點(diǎn)處以便每一分析物可獨(dú)立地可視化。例如，整料可包含兩種沿著整料的芯吸方向于不同點(diǎn)處共價(jià)接枝到聚合物基質(zhì)的dna探針。
可使用如本文所述的方法將切口酶浸漬到聚合物基質(zhì)中和/或可將切口酶共價(jià)接枝到聚合物基質(zhì)。形成配置為實(shí)現(xiàn)dna的nesa雜交和信號(hào)傳導(dǎo)的指示區(qū)的步驟可包括如本文所述向聚合物基質(zhì)中浸漬一種或多種切口酶和/或向聚合物基質(zhì)上共價(jià)接枝一種或多種切口酶。
例如，制造用于處理流體樣品的自芯吸整料的方法可以是包括以下的方法：
-提供親水單體和連接體單體，所述連接體單體具有由包含至少一個(gè)-c(r)2o-基團(tuán)的連接體間隔開的兩個(gè)可聚合基團(tuán)；
-任選地其中還提供一種或多種另外的單體；
-通過在致孔溶劑中合并所述親水單體和連接體單體來獲得可聚合組合物；
-聚合所述可聚合組合物以形成整料；
-獲得作為不含有未聚合的起始材料的聚合物基質(zhì)的整料；
-形成配置為實(shí)現(xiàn)dna的nesa和信號(hào)傳導(dǎo)的指示區(qū)，其通過以下進(jìn)行：
-用dna探針浸漬聚合物基質(zhì)和/或向整料共價(jià)接枝dna探針；
-用切口酶浸漬聚合物基質(zhì)和/或向聚合物基質(zhì)共價(jià)接枝切口酶。
優(yōu)選地，形成配置為實(shí)現(xiàn)dna的nesa和信號(hào)傳導(dǎo)的指示區(qū)的步驟包括向聚合物基質(zhì)共價(jià)接枝dna探針。
合適地，切口酶為切口核酸內(nèi)切酶。
任選地，可存在不止一種dna探針。
還提供了根據(jù)所述方法制造的用于處理流體樣品的自芯吸整料，所述整料包含配置為實(shí)現(xiàn)流體樣品中dna的nesa雜交和信號(hào)傳導(dǎo)的指示區(qū)。
偶聯(lián)dna探針的nesa反應(yīng)
為測試偶聯(lián)的探針進(jìn)行nesa反應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)的能力，將帶有共價(jià)接枝的探針的整料材料片置于nesa反應(yīng)溶液中并與僅在溶液中(對照)的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果示于圖9中。對照反應(yīng)和整料加(plugs)共價(jià)接枝nesa探針的反應(yīng)二者均發(fā)出熒光，表明該系統(tǒng)在溶液中、以及探針接枝到整料時(shí)都起作用。
為在芯吸反應(yīng)中顯示nesa，使用碳二亞胺化學(xué)將胺化nesa探針的斑點(diǎn)固定于羧基整料的指示區(qū)中。在芯吸開始前不久，向偶聯(lián)探針上游不遠(yuǎn)的整料中浸漬切口核酸內(nèi)切酶的2μl小斑點(diǎn)。將含緩沖液和dna模板的nesa反應(yīng)混合物加到50ml圓錐管中。通過立置整料使得樣品施加部在反應(yīng)混合物中來將反應(yīng)混合物施加到整料(圖10)。整料于48℃下在此位置中溫育1小時(shí)。將整料切成兩半(圖11，照片)并使之在uv可視化盒中于一側(cè)可視。檢測區(qū)域因固定化的nesa反應(yīng)產(chǎn)物而發(fā)出熒光。
熒光信號(hào)來自整料內(nèi)的以下事件鏈：
a)探針與靶序列的雜交，
b)由切口核酸內(nèi)切酶識(shí)別靶雙鏈體序列以及與靶雙鏈體序列絡(luò)合，
c)通過切口核酸內(nèi)切酶對靶雙鏈體中的一條鏈進(jìn)行酶裂分，
d)絡(luò)合物組分(包括熒光猝滅劑)的解離，和
e)來自現(xiàn)在未猝滅的熒光端(固定化端)的探針的熒光發(fā)射。
圖12至23的詳細(xì)討論
圖12示出了用于處理流體樣品102的兩區(qū)整料110的一個(gè)實(shí)施方案的側(cè)視圖。流體樣品102可為生物樣品或環(huán)境樣品，具有或不具有載體流體。整料110包括第一區(qū)112和槽區(qū)114。第一區(qū)112中的化學(xué)品和試劑處理流體樣品102并且所得混合物113流到或芯吸到槽區(qū)114中。
在一些實(shí)施方案中，整料110可具有不止兩個(gè)用于處理流體樣品的區(qū)。例如，圖12中所示與整料110相似的三區(qū)整料可包括清潔區(qū)、配置作為擴(kuò)增區(qū)的反應(yīng)區(qū)和槽區(qū)。
圖13為可用來處理流體樣品的整料210的一個(gè)實(shí)施方案的俯視圖，其包括清潔區(qū)212、反應(yīng)區(qū)214、帶指示斑點(diǎn)220的指示區(qū)216和槽區(qū)218。整料220可配置作為用于分子診斷設(shè)備的測試棒，以測試分析物如流體樣品102中的靶核酸序列，并且這樣的整料將具有配置作為擴(kuò)增區(qū)的反應(yīng)區(qū)214。流體混合物102被加載到整料210中、清潔區(qū)212處。清潔區(qū)212中的化學(xué)品和試劑處理混合物102并且所得混合物213流到或芯吸到反應(yīng)區(qū)214中。反應(yīng)區(qū)214中的化學(xué)品和試劑可實(shí)現(xiàn)各種功能，如擴(kuò)增混合物213中預(yù)定的靶核酸序列，并且所得混合物215流到或芯吸到指示區(qū)216中。指示區(qū)216中的化學(xué)品和試劑處理混合物215并且所得混合物217流到或芯吸到槽區(qū)218中。
當(dāng)流體混合物215在指示區(qū)216中處理時(shí)，指示區(qū)216中的試劑可與混合物215反應(yīng)并產(chǎn)生在施加光時(shí)可通過反射或透照由光學(xué)傳感器讀取的結(jié)果。如果靶核酸序列在混合物215中，則指示區(qū)216中透射通過指示斑點(diǎn)220的光的波長和/或強(qiáng)度將存在變化。隨著試驗(yàn)進(jìn)行到結(jié)束，混合物217從指示區(qū)216流向或芯吸向槽區(qū)218，在這里，混合物217被吸收和收集。箭頭222示出了整料210中芯吸的方向，并且是如本文所討論的整料處理?xiàng)l帶的典型特征。
四區(qū)整料的一個(gè)替代實(shí)施方案包括配置為具有擴(kuò)增區(qū)212、清潔區(qū)214、指示區(qū)216和槽區(qū)218的整料210。在此實(shí)施方案中，清潔區(qū)214提供樣品的酸或酶處理。
在其他實(shí)施方案中，整料可具有不止四個(gè)區(qū)，如用于實(shí)現(xiàn)rna基生物樣品的分子診斷測試的五區(qū)整料，其具有以下區(qū)：清潔區(qū)、rna向互補(bǔ)dna的逆轉(zhuǎn)錄區(qū)、產(chǎn)生的dna的擴(kuò)增區(qū)、指示區(qū)和槽區(qū)。
圖14為加固整料300的一個(gè)實(shí)施方案的頂視圖。圖14示出了設(shè)置于基材330上的整料310。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，可無基材330地使用整料310。具有或不具有基材330的整料310可以用來以多種可能的配置處理流體樣品，如配置為測試棒以實(shí)現(xiàn)分子診斷測試?；?30加固和強(qiáng)化整料310并可防止整料310在組裝、裝運(yùn)和操作過程中的破裂?；?30可呈多種配置，如：載體、支承物、框架或托盤。整料310包括清潔區(qū)312、反應(yīng)區(qū)314、指示區(qū)316和槽區(qū)318。圖14示出了流體混合物313從清潔區(qū)312向反應(yīng)區(qū)314的流動(dòng)?；旌衔?15離開反應(yīng)區(qū)314并且行進(jìn)到指示區(qū)316?；旌衔?17離開指示區(qū)316并且行進(jìn)到槽區(qū)318。指示區(qū)316包括指示斑點(diǎn)320和在基材330中的開口或窗口332以允許光源和/或光學(xué)傳感器能夠從整料310上方和下方二者以光的形式到達(dá)指示斑點(diǎn)320。
任選地，可向整料或向圖14和15中示出的基材330添加光學(xué)可讀代碼(圖中未示出)以提供序列號(hào)、產(chǎn)品代碼、測試代碼或它們的任何組合，其可由配置為讀取指示區(qū)316中的指示測試結(jié)果的光學(xué)傳感器讀取。
圖15示出了圖14的加固整料300的側(cè)視圖。整料310設(shè)置于基材330上，并且流動(dòng)從左到右從清潔區(qū)312向反應(yīng)區(qū)314向指示區(qū)316向槽區(qū)318行進(jìn)。
如圖14和圖15中所示，指示區(qū)316包括頸區(qū)域，即，該區(qū)中的橫向橫截面積改變。指示區(qū)316的這種變窄是為了在混合物315進(jìn)入指示區(qū)316時(shí)減慢其流動(dòng)，從而與無此限制的配置相比增加在反應(yīng)區(qū)314中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的時(shí)間量并提供混合物315進(jìn)入指示區(qū)320中的流動(dòng)的延長。如果靶核酸序列在混合物315中，則指示區(qū)316中的化學(xué)反應(yīng)將引起從指示區(qū)316發(fā)射的光的波長和/或強(qiáng)度的改變并由光學(xué)傳感器檢測到，如圖19中所示。作為檢測在區(qū)316中的測試結(jié)果的過程的一部分，指示區(qū)316從頂部到底部的薄度將減少透射通過指示區(qū)316的任何光的衰減。
整料中的區(qū)可配置為具有兩個(gè)或更多個(gè)平行的子區(qū)以便該區(qū)內(nèi)的平行處理，如圖15-18中所示例。圖16示出了具有兩個(gè)平行的清潔區(qū)的整料510的一個(gè)實(shí)施方案。整料510包括平行地運(yùn)行的清潔區(qū)512a和512b。兩個(gè)清潔區(qū)均接收一部分混合物102?；旌衔?02在兩個(gè)平行的清潔區(qū)512a和512b中處理，兩個(gè)清潔區(qū)可具有不同的過程化學(xué)，并且隨著混合物流行進(jìn)到反應(yīng)區(qū)514，輸出流513a和513b合并到一起?；旌衔?15從反應(yīng)區(qū)514流向指示區(qū)516，指示區(qū)516包括指示斑點(diǎn)520?；旌衔?17從指示區(qū)516流向清潔區(qū)518。
圖17示出了整料610的一個(gè)實(shí)施方案，其具有兩個(gè)平行的反應(yīng)區(qū)614a和614b，允許在同一整料610中進(jìn)行兩個(gè)不同的反應(yīng)過程。整料610包括接收混合物102的清潔區(qū)612。清潔區(qū)612的輸出流被分成兩個(gè)混合物613a和613b，其流入相應(yīng)的平行反應(yīng)區(qū)614a和614b中。相應(yīng)的平行反應(yīng)區(qū)614a和614b的輸出流615a和615b流入指示區(qū)616中。指示區(qū)616包括指示斑點(diǎn)620。反應(yīng)區(qū)616的輸出流617流向槽區(qū)618。
圖18示出了整料710的一個(gè)實(shí)施方案，其具有平行的指示斑點(diǎn)716a和716b。整料710包括清潔區(qū)712、反應(yīng)區(qū)714、指示斑點(diǎn)716a和716b及槽區(qū)718?；旌衔?13從清潔區(qū)712流向反應(yīng)區(qū)714?；旌衔?15a和715b流入相應(yīng)的指示斑點(diǎn)716a和716b中。指示斑點(diǎn)716a和716b包括相應(yīng)的指示斑點(diǎn)720a和720b?；旌衔?17a和717b從相應(yīng)的指示斑點(diǎn)716a和716b流入槽區(qū)718中。在混合物715a和715b的處理過程中，根據(jù)特定的測試應(yīng)用的需要，兩種或更多種靶核酸序列的指示可使用一個(gè)或兩個(gè)光學(xué)傳感器在單獨(dú)的指示斑點(diǎn)716a和716b中實(shí)現(xiàn)。
圖19示出了用于處理或測試流體樣品如用于分子診斷測試的裝置800的框圖。裝置800包括測試塢850和測試棒840。測試棒840包含如前文所述的整料，包括分別結(jié)合圖13-18示出和描述的示例性整料210、310、510、610和710。測試塢850包括包含加熱器和溫度傳感器的加熱器系統(tǒng)880、控制器855、光源860、光學(xué)傳感器865、接口870和內(nèi)部電源如電池(未示出)。
在一些實(shí)施方案中，加熱器系統(tǒng)880可包括在測試棒840中并耦合到測試塢850中的控制器855。在一些實(shí)施方案中，光源860和光學(xué)傳感器865可包括在測試棒840中并耦合到測試塢850中的控制器855。
裝置800可通過檢測流體樣品102中一種或多種由rna或dna組成的靶核酸序列用來確定流體樣品102是否含有分析物，如特定的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生生物等。每一測試棒可配置為檢測至少一種靶核酸序列，如特定的病原體，例如乙型肝炎、丙型肝炎、h1n1流感病毒等。測試棒840可配置為用后即拋的一次性使用的測試棒，其連接到測試塢850，測試塢850提供進(jìn)行診斷測試所需的電力和電子系統(tǒng)。在診斷測試后測試塢850可與測試棒840斷開連接，并與新的測試棒840一起使用以進(jìn)行另一測試。測試塢850和測試棒840可使用多種技術(shù)配置為耦合在一起，這些技術(shù)未在圖19中示出。
清潔區(qū)812處理流體樣品102并產(chǎn)生混合物813，混合物813流到或芯吸到反應(yīng)區(qū)814。反應(yīng)區(qū)814處理自清潔區(qū)812接收的混合物813并產(chǎn)生混合物815，混合物815流到或芯吸到指示區(qū)816。指示區(qū)816處理從反應(yīng)區(qū)814接收的混合物815并產(chǎn)生混合物817，混合物817流到或芯吸到槽區(qū)818。槽區(qū)818吸收混合物817，結(jié)束輸入到測試棒840中的流體102的處理。混合物102被處理成混合物813，然后混合物813被進(jìn)一步處理成混合物815，混合物815被處理成混合物817，其結(jié)束在測試棒840中的處理。在流體樣品102已被放置并流入清潔區(qū)812中后，流體樣品102將由已貯存在測試棒840的清潔區(qū)812內(nèi)的各種化學(xué)品和試劑處理。在其他實(shí)施方案中，可有不止四個(gè)順序耦合的流體處理區(qū)。
測試塢850通過有線或無線連接到通信設(shè)備875以便讀出測試結(jié)果。包括加熱器和溫度傳感器的加熱器系統(tǒng)880被熱耦合到反應(yīng)區(qū)814并且加熱器系統(tǒng)880調(diào)節(jié)反應(yīng)區(qū)814的溫度以支持反應(yīng)區(qū)814中dna的擴(kuò)增，無論所需的溫度控制是等溫還是其他?？墒褂霉鈱W(xué)傳感器865與光源860的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)流入指示區(qū)816中的混合物815的檢測，因?yàn)楣庠?60將透過指示區(qū)816中的指示斑點(diǎn)820照到光學(xué)傳感器865。指示區(qū)816處理混合物815，如果已發(fā)現(xiàn)在樣品流體102中存在靶核酸序列，則所得混合物將在由光學(xué)傳感器865接收的光的波長和/或強(qiáng)度方面產(chǎn)生變化。由光學(xué)傳感器865接收的光學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)由鏈路854被發(fā)送至控制器855，在這里，其可經(jīng)由鏈路852被發(fā)送至接口870。接口870可經(jīng)由有線或無線鏈路872將數(shù)據(jù)發(fā)送至計(jì)算機(jī)或通信設(shè)備875。計(jì)算機(jī)或通信設(shè)備875可處理接收到的數(shù)據(jù)，并且確定是否已在流體混合物102中檢測到靶核酸序列以及向裝置800的操作者提供關(guān)于測試結(jié)果的語音和/或視覺消息。在一些實(shí)施方案中，控制器可確定是否已在流體樣品102中檢測到靶核酸序列，并且經(jīng)由接口870向通信設(shè)備875發(fā)送通信或消息以將測試結(jié)果通知裝置800的操作者。
測試棒840可包含各種機(jī)械指示器、電子標(biāo)簽(如rfid標(biāo)簽)或光學(xué)可讀唯一標(biāo)識(shí)符中的任何一種，其可在測試開始時(shí)由測試塢850讀取以識(shí)別連接到測試塢850的測試棒840的類型及在測試過程中控制器855和通信設(shè)備875應(yīng)遵循的測試協(xié)議的類型，如測試過程中待進(jìn)行的任何加熱過程的時(shí)間安排。
在一個(gè)替代的實(shí)施方案中(未示出)，光源可在測試棒840的指示斑點(diǎn)820下方與光學(xué)傳感器865相鄰。在這樣的替代的實(shí)施方案中，光源將從下方照射指示斑點(diǎn)820而光學(xué)傳感器865將檢測由指示斑點(diǎn)820反射或發(fā)射的光并檢測光在波長和/或強(qiáng)度方面的變化。
控制器855可為微處理器、asic、狀態(tài)機(jī)或其他類型的處理器，其配置為從光學(xué)傳感器865接收光學(xué)數(shù)據(jù)。通信設(shè)備875可被耦合至電信網(wǎng)絡(luò)或耦合至與互聯(lián)網(wǎng)耦合的網(wǎng)路服務(wù)以提供對數(shù)據(jù)庫的可及性，測試結(jié)果可被存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫中以便進(jìn)一步分析。通信設(shè)備875可以是蜂窩電話、智能電話、平板電腦、個(gè)人計(jì)算機(jī)或具有合適的計(jì)算或通信能力的其他設(shè)備。
圖20示出了用于制造多區(qū)整料910的裝置900的圖。圖20示出了將在模具905中形成的整料910的側(cè)視圖。制造后，整料910可包含各種流體處理區(qū)，如：清潔區(qū)912、反應(yīng)區(qū)914、指示區(qū)916和槽區(qū)918。這些區(qū)由過渡913、915和917分開。多通道分配器920的噴嘴922、924、926和928位于模具905上方，在模具905中，將在至少一種親水單體、至少一種連接體單體、至少一種致孔溶劑和至少一種引發(fā)劑的聚合之后形成整料910。應(yīng)理解，裝置900為具有四個(gè)區(qū)的示例性配置，可使用類似的裝置通過例如使用多于或少于四個(gè)噴嘴來形成具有多于或少于四個(gè)區(qū)的整料。使用裝置900可制備各種類型和型式的整料。
分配器920的每一個(gè)噴嘴可根據(jù)聚合過程中的需要，填充以溶劑、單體和其他化學(xué)品的定制混合物以形成整料910的個(gè)體的區(qū)。噴嘴922可含有形成區(qū)912所需的化學(xué)混合物932。噴嘴924可含有形成區(qū)914所需的化學(xué)混合物934。噴嘴926可含有用來形成區(qū)916的化學(xué)混合物936。噴嘴928可含有用來形成區(qū)918的化學(xué)混合物938。在制造裝置900的一個(gè)替代的實(shí)施方案中，整料的任何區(qū)內(nèi)多個(gè)串聯(lián)和/或平行的區(qū)域可通過向位于待具有這樣的區(qū)域的區(qū)上方的分配器920增加更多的噴嘴來制造。下面結(jié)合圖21描述使用圖20的制造裝置的方法。
圖21列出了使用與圖20中所示相似的制造裝置制造整料如相應(yīng)的圖13、14和19中示出的整料210、310和整料測試棒840或各種其他整料的步驟的方法1000，其中所述整料包含三維自芯吸聚合物。步驟1001提供配置為制造整料910的模具905。步驟1002在模具中限定多個(gè)區(qū)912、914、916和918，如通過在圖20中模具905的相關(guān)聯(lián)的相應(yīng)區(qū)上方設(shè)置噴嘴922、924、926和928。步驟1003提供多個(gè)容器、噴嘴922、924、926和928，其中所述多個(gè)容器中的每一個(gè)與所述多個(gè)區(qū)中的一個(gè)相關(guān)聯(lián)。
步驟1004向所述多個(gè)容器中的一個(gè)中分配多種親水單體中的一種或多種單體。步驟1005向所述多個(gè)容器中的一個(gè)中分配多種致孔溶劑中的一種或多種致孔溶劑。任選的步驟1006向所述多個(gè)容器中的一個(gè)中分配多種連接體單體中的一種或多種單體。任選的步驟1007向所述多個(gè)容器中的一個(gè)中分配多種引發(fā)劑中的一種或多種引發(fā)劑。任選的步驟1008可重復(fù)步驟1004、1005、1006和1007直至所述多個(gè)容器中的每一個(gè)已接收至少一種單體、至少一種致孔溶劑、至少一種連接體單體和至少一種引發(fā)劑。
任選的步驟1009混合所述多個(gè)容器中的每一個(gè)的內(nèi)容物。步驟1010向模具中相應(yīng)的多個(gè)區(qū)中的每一個(gè)中計(jì)量加入所述多個(gè)容器中的每一個(gè)的內(nèi)容物。步驟1011引發(fā)模具的內(nèi)容物的聚合。步驟1012完成模具的內(nèi)容物的聚合并由此形成整料。步驟1013從整料洗滌任何剩余的溶劑。
圖22示出了用于制造整料1110的裝置1100的圖。圖22示出了將在模具1105中形成的整料1110的側(cè)視圖。制造后，整料1110可包含各種流體處理區(qū)，如：清潔區(qū)1112、反應(yīng)區(qū)1114、指示區(qū)1116和槽區(qū)1118。這些區(qū)由可移除的隔離器1113、1115和1117分開。多通道分配器1120的噴嘴1122、1124、1126和1128位于模具1105上方，在模具1105中，將在至少一種親水單體、至少一種連接體單體、至少一種致孔溶劑和至少一種引發(fā)劑的聚合之后形成整料1110。應(yīng)理解，裝置1100為具有四個(gè)區(qū)的示例性配置，可使用類似的裝置通過例如使用多于或少于四個(gè)噴嘴來形成具有多于或少于四個(gè)區(qū)的整料。
分配器1120的每一個(gè)噴嘴可根據(jù)聚合過程中的需要，填充以溶劑、單體和其他化學(xué)品的定制混合物以形成整料1110的個(gè)體的區(qū)。噴嘴1122可含有形成區(qū)1112所需的化學(xué)混合物1132。噴嘴1124可含有形成區(qū)1114所需的化學(xué)混合物1134。噴嘴1126可含有用來形成區(qū)1116的化學(xué)混合物1136。噴嘴1128可含有用來形成區(qū)1118的化學(xué)混合物1138。下面結(jié)合圖23描述使用圖22的制造裝置的方法。
圖23列出了使用圖22的隔離器和裝置制造整料1110的方法1200，其中所述整料包含自芯吸聚合物。步驟1201提供配置為制造整料1110的模具1105及多個(gè)隔離器1113、1115和1117。步驟1202將所述多個(gè)隔離器定位在模具中以限定多個(gè)區(qū)。步驟1203提供多個(gè)容器，其中所述多個(gè)容器中的每一個(gè)與所述多個(gè)區(qū)中的一個(gè)相關(guān)聯(lián)。
步驟1204向所述多個(gè)容器中的一個(gè)中分配多種親水單體中的一種或多種單體。步驟1205向所述多個(gè)容器中的一個(gè)中分配多種致孔溶劑中的一種或多種致孔溶劑。步驟1206向所述多個(gè)容器中的一個(gè)中分配多種連接體單體中的一種或多種單體。步驟1207向所述多個(gè)容器中的一個(gè)中分配多種引發(fā)劑中的一種或多種引發(fā)劑。步驟1208重復(fù)步驟1204、1205、1206和1207直至所述多個(gè)容器中的每一個(gè)已接收至少一種單體、至少一種致孔溶劑、至少一種連接體單體和至少一種引發(fā)劑。
步驟1209混合所述多個(gè)容器中的每一個(gè)的內(nèi)容物。步驟1210向模具中相應(yīng)的多個(gè)區(qū)中的每一個(gè)中計(jì)量加入所述多個(gè)容器中的每一個(gè)的內(nèi)容物。步驟1211引發(fā)模具的內(nèi)容物的聚合。在步驟1212中，模具中聚合的狀態(tài)通過例如使用光學(xué)方法來監(jiān)測。步驟1213在內(nèi)容物凝固之前從模具移除所述多個(gè)隔離器。移除所述多個(gè)隔離器的時(shí)間安排可根據(jù)在移除隔離器之前待取得的所需聚合狀態(tài)而異。步驟1214完成模具的內(nèi)容物的聚合并由此形成一個(gè)鄰接的整料。步驟1215從整料洗滌剩余的溶劑。
在已如上所述形成整料后，可向整料的區(qū)中加載各種需要提供每個(gè)區(qū)的一些不同功能的試劑。每個(gè)區(qū)所需的試劑可以作為液體施加，所述液體將芯吸到該區(qū)或區(qū)內(nèi)的某個(gè)區(qū)域中并貯存在先前創(chuàng)建的區(qū)內(nèi)。作為另外一種選擇或除此之外，整料可例如通過水解和/或共價(jià)接枝而被進(jìn)一步衍生化。整料可任選地與貯存的一種或多種試劑一起干燥。
本發(fā)明的整料的一些優(yōu)點(diǎn)
與先前已知的整料相比，本發(fā)明的整料顯示出許多優(yōu)點(diǎn)。除了對于技術(shù)人員顯而易見的其他優(yōu)點(diǎn)外，在如本文所述的一些實(shí)施方案中，它們可以：
偶允許樣品的處理而無需外部泵送。
●制造和使用更高效且更成本有效。
●具有優(yōu)異的機(jī)械性能，使得它們更易于操作。
●允許納入廣泛的功能。例如，本發(fā)明的整料可提供完整的“棒上實(shí)驗(yàn)室”診斷或分析測定。換句話講，本發(fā)明的整料可以是多功能的。
●適合于大批量的樣品處理(通過消除對芯吸設(shè)備中薄膜形式的需要)。
●通過允許使用透照以便于檢測。
●如本文所述，配置為進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，例如，細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性或分析物擴(kuò)增。
應(yīng)理解，本文所述的實(shí)例和變型僅用于示意的目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將在其基礎(chǔ)上想到各種變型或改變，這些變型或改變包括在本申請的精神和附隨的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請出于所有目的以其全文引用方式并入本文。
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