發(fā)明領(lǐng)域

本公開一般涉及trail受體結(jié)合劑的治療用途。特別地，本公開涉及包括ctb006，即一種抗trail-r2(dr5)抗體的方法和組合物，及其單獨或與各種化學(xué)治療劑組合時在體外和體內(nèi)的腫瘤抑制的治療效果。

發(fā)明背景

trail在上世紀90年代被鑒定，并且已知在腫瘤細胞的免疫監(jiān)視中起重要作用。活化的t淋巴細胞和nk細胞表達高水平的trail，其使這些有免疫活性的細胞具備殺死腫瘤細胞的能力。動物研究表明，trail的敲除導(dǎo)致隨著年齡增長而增高的腫瘤發(fā)病率。因此，trail缺陷或表達不足可能是腫瘤發(fā)生的一個因素。

在trail被發(fā)現(xiàn)后不久，人們注意到了它作為抗癌劑用于癌癥治療的潛力。這是基于trail選擇性地殺死腫瘤細胞而不殺死正常細胞的能力。trail的抗腫瘤效力可以通過許多當前的癌癥療法(例如，化學(xué)療法和放射療法)來顯著地增強。此外，trail可以致敏腫瘤細胞并提高腫瘤細胞對化學(xué)療法和放射療法的敏感性。因此，trail與化學(xué)療法和放射療法的組合有希望成為一種非常有效的抗腫瘤治療方法。

trail是tnf蛋白質(zhì)家族的成員。這個家族的一些蛋白質(zhì)的特征是它們誘導(dǎo)細胞凋亡的能力，例如tnf-α和fas配體。然而，由于它們的毒副作用，tnf-α和fas的臨床應(yīng)用價值有限。相比之下，因為trail展現(xiàn)出對腫瘤細胞的選擇性殺傷，它的臨床價值是明顯的。迄今為止，已經(jīng)鑒定了trail的五種受體，其中的兩種dr4(trail-r1)和dr5(trail-r2)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞凋亡信號，而其他三種dcr1(trail-r3)、dcr2(trail-r4)和護骨蛋白(osteoprotegerin，opg)不轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞凋亡信號。trail的所有五種受體在它們的細胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中有顯著的同源性。dr4和dr5的細胞內(nèi)片段含有保守的功能結(jié)構(gòu)域，即所謂的“死亡結(jié)構(gòu)域”，其負責轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞凋亡信號。

發(fā)明概述

本技術(shù)涉及在有需要的受試者中治療癌癥的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)向受試者施用包含單克隆抗體的組合物，所述單克隆抗體具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性；和(b)同時地、依序地或分別地向受試者施用化學(xué)治療劑。

在一些實施方式中，所述抗體包含重鏈cdr氨基酸序列syfih、wiypgnvntkysekfkg和geagyfd，以及輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava、wastrht和qqhyrtpw。在一些實施方式中，所述抗體是人嵌合抗體。在一些實施方式中，所述人嵌合抗體包含如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列。在一些實施方式中，所述癌癥包括肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病中的一種或多種。

在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑包括5-氟尿嘧啶和紫杉醇中的一種或多種。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是5-氟尿嘧啶。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是紫杉醇。

在另一個方面，本文公開的是選擇性誘導(dǎo)表達trail-r2多肽的細胞凋亡的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)鑒定表達trail-r2多肽的細胞；和(b)使所述細胞與單克隆抗體相接觸，所述單克隆抗體具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性。

在一些實施方式中，所述抗體包含重鏈cdr氨基酸序列syfih、wiypgnvntkysekfkg和geagyfd，以及輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava、wastrht和qqhyrtpw。在一些實施方式中，所述抗體是人嵌合抗體。在一些實施方式中，所述人嵌合抗體包含如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列。在一些實施方式中，所述表達trail-r2多肽的細胞是癌細胞。在一些實施方式中，所述癌細胞包括肝癌細胞、結(jié)腸癌細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞和白血病細胞中的一種或多種。

在一些實施方式中，所述方法包括使所述細胞與化學(xué)治療劑接觸。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑包括5-氟尿嘧啶和紫杉醇中的一種或多種。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是5-氟尿嘧啶。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是紫杉醇。

在另一個方面，本文提供的是在有需要的受試者中治療癌癥的方法。在一些實施方式中，所述方法包括向受試者施用包含單克隆抗體的組合物，所述單克隆抗體具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性，其中所述受試者被鑒定為患有表達trail-r2的腫瘤。

在一些實施方式中，所述抗體包含重鏈cdr氨基酸序列syfih、wiypgnvntkysekfkg和geagyfd，以及輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava、wastrht和qqhyrtpw。在一些實施方式中，所述抗體是人嵌合抗體。在一些實施方式中，所述人嵌合抗體包含如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列。在一些實施方式中，所述癌癥包括肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病中的一種或多種。

在一些實施方式中，所述方法還包括同時地、依序地或分別地向受試者施用化學(xué)治療劑。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是5-氟尿嘧啶。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是紫杉醇。

在另一個方面，本公開提供了鑒定適合癌癥治療進行改善的受試者的體外方法，其中所述癌癥治療包括(a)向受試者施用包含單克隆抗體的組合物，所述單克隆抗體具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性；和(b)同時地、依序地或分別地向受試者施用化學(xué)治療劑。在一些實施方式中，鑒定受試者的方法包括使來自受試者的腫瘤樣品與單克隆抗體相接觸，所述單克隆抗體具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性。在一些實施方式中，該抗體包含重鏈cdr氨基酸序列syfih、wiypgnvntkysekfkg和geagyfd，以及輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava、wastrht和qqhyrtpw。在一些實施方式中，所述抗體是人嵌合抗體。在一些實施方式中，所述人嵌合抗體包含如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列。在一些實施方式中，所述癌癥包括肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病中的一種或多種。

在另一個方面，本公開提供了用于確定受試者是否適合癌癥治療進行改善的診斷試劑盒，其中所述癌癥治療包括(a)向受試者施用包含單克隆抗體的組合物，所述單克隆抗體具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性；和(b)同時地、依序地或分別地對受試者施用化學(xué)治療劑。在一些實施方式中，所述試劑盒包括具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體。

在一些實施方式中，所述抗體包含重鏈cdr氨基酸序列syfih、wiypgnvntkysekfkg和geagyfd，以及輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava、wastrht和qqhyrtpw。在一些實施方式中，所述抗體是人嵌合抗體。在一些實施方式中，所述人嵌合抗體包含如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列。在一些實施方式中，所述癌癥包括肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病中的一種或多種。

在另一個方面，本公開提供了抗體在制備用于在被鑒定為患有表達trail-r2的腫瘤的受試者中治療癌癥的藥物中的用途。在一些實施方式中，所述抗體包括具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體。

在一些實施方式中，所述抗體包含重鏈cdr氨基酸序列syfih、wiypgnvntkysekfkg和geagyfd，以及輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava、wastrht和qqhyrtpw。在一些實施方式中，所述抗體是人嵌合抗體。在一些實施方式中，所述人嵌合抗體包含如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列。在一些實施方式中，所述癌癥包括肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病中的一種或多種。在一些實施方式中，所述藥物還包含一種或多種化學(xué)治療劑。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是5-氟尿嘧啶。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是紫杉醇。

在另一個方面，本公開提供了抗體在制備用于選擇性誘導(dǎo)表達trail-r2多肽的細胞凋亡的藥物中的用途。在一些實施方式中，所述抗體包括具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體。

在一些實施方式中，所述抗體包含重鏈cdr氨基酸序列syfih、wiypgnvntkysekfkg和geagyfd，以及輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava、wastrht和qqhyrtpw。在一些實施方式中，所述抗體是人嵌合抗體。在一些實施方式中，所述人嵌合抗體包含如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列。在一些實施方式中，所述表達trail-r2多肽的細胞是癌細胞。在一些實施方式中，所述癌細胞包括肝癌細胞、結(jié)腸癌細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞和白血病細胞中的一種或多種。在一些實施方式中，所述藥物還包含一種或多種化學(xué)治療劑。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是5-氟尿嘧啶。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是紫杉醇。

簡要附圖說明

附圖描述了本文公開的技術(shù)的非限制性示例性實施方式，用以幫助讀者理解本公開。在附圖和附圖描述中，人嵌合抗體huctb006被稱為“ctb006”。

圖1a和1b是顯示通過化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測(chemiluminescentenzymeimmunoassay，cleia)測定的鼠ctb006，mctb006(圖1a)和人ctb006(圖1b)的結(jié)合特異性的圖。測試了5種trail受體：dr5、dr4、dcr1、dcr2和opg中每一種的結(jié)合親和力。

圖2是表示通過表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance，spr)測定的ctb006的親和性的圖。

圖3a和3b是顯示ctb006或奧沙利鉑(oxaliplatin)對人正常組織細胞系wi-38(圖3a)和hfl-1(圖3b)的細胞毒性的圖。

圖4a和b是顯示ctb006或奧沙利鉑對人正常組織細胞系huv-ec-c(圖4a)和肝分化細胞(圖4b)的細胞毒性的圖

圖5a和5b是顯示ctb006或奧沙利鉑對人肝癌細胞系sk-hep-1(圖5a)和hepg2(圖5b)的細胞毒性的圖。

圖6a和6b是顯示ctb006或伊立替康(irinotecan)對人結(jié)腸直腸癌細胞系colo205(圖6a)和hct116(圖6b)的細胞毒性的圖。

圖7a和7b是顯示ctb006或伊立替康對人結(jié)腸直腸癌細胞系sw480(圖7a)和widr(圖7b)的細胞毒性的圖。

圖8a、8b和8c是顯示ctb006或奧沙利鉑對人胰腺癌細胞系bxpc3(圖8a)、mia-paca-2(圖8b)和panc2.03(圖8c)的細胞毒性的圖。

圖9a和9b是顯示ctb006或紫杉醇對人肺癌細胞系h2122(圖9a)和sk-mes-1(圖9b)的細胞毒性的圖。

圖10a和10b是顯示ctb006或伊立替康對人乳腺癌細胞系mda-mb-231(圖10a)和dy36t2(圖10b)的細胞毒性的圖。

圖11a和11b是顯示ctb006或伊立替康對人乳腺癌細胞系2-lmp(圖11a)和sum102(圖11b)的細胞毒性的圖。

圖12是顯示ctb006或順鉑對人卵巢癌細胞系ovcar3的細胞毒性的圖。

圖13a和13b是顯示ctb006或甲氨蝶呤(methotrexate)對人急性t淋巴細胞白血病細胞系molt-4(圖13a)和jurkat(圖13b)的細胞毒性的圖。

圖14是顯示ctb006或5-fu對bgc823胃癌細胞的細胞毒性作用以及ctb006和5-fu組合對bgc823胃癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。

圖15是顯示ctb006或5-fu對panc2.03胰腺癌細胞的細胞毒性作用以及ctb006和5-fu組合對panc2.03胰腺癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。

圖16是顯示ctb006或紫杉醇對a549肺癌細胞的細胞毒性作用以及ctb006和紫杉醇組合對a549肺癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。

圖17是顯示ctb006或紫杉醇對h460肺癌細胞的細胞毒性作用以及ctb006和紫杉醇組合對h460肺癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。

圖18是顯示ctb006或5-fu對huh-7肝癌細胞的細胞毒性作用以及ctb006和5-fu組合對huh-7肝癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。

圖19是顯示ctb006或吉西他濱(gemcitabine)對7402肝癌細胞的細胞毒性作以及ctb006與吉西他濱組合對7402肝癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。

圖20a和20b是顯示ctb006、索拉非尼(sorafenib)、拉帕替尼(lapatinib)或厄洛替尼(erlotinib)中每一個單獨對sw480結(jié)腸直腸癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼組合對sw480結(jié)腸直腸癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。細胞用62.5、125、250、500或1000ng/ml的ctb006處理。索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼分別以10μm(圖20a)或5μm(圖20b)使用。

圖21a-21d。圖21a和21b是顯示ctb006、索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼中每一個單獨對widr結(jié)腸直腸癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼組合對widr結(jié)腸直腸癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。21c和21d是顯示ctb006、愛必妥(erbitux)或赫賽汀(herceptin)中每一個單獨對widr結(jié)腸直腸癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與愛必妥或赫賽汀組合對widr結(jié)腸直腸癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。細胞用62.5、125、250、500或1000ng/ml的ctb006以及10μm(圖21a)或5μm(圖21b)的索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼，1μg/ml(圖21c)或0.1μg/ml(圖21d)的愛必妥或赫賽汀處理。

圖22a-22c。圖22a和圖22b是顯示ctb006、索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼中每一個單獨對bgc823胃癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼組合對bgc823胃癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。圖22c是顯示ctb006、愛必妥或赫賽汀中每一個單獨對bgc823胃癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與愛必妥或赫賽汀組合對bgc823胃癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。細胞用62.5、125、250、500或1000ng/ml的ctb006以及10μm(圖22a)或5μm(圖22b)的索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼，10μg/ml或1μg/ml的愛必妥或赫賽汀(圖22c)處理。

圖23a-23c。圖23a和圖23b是顯示ctb006、索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼中每一個單獨對nugc3胃癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼組合對nugc3胃癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。圖23c是顯示ctb006、愛必妥或赫賽汀中每一個單獨對nugc3胃癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與愛必妥或赫賽汀組合對nugc3胃癌細胞的細胞毒性作用的圖。細胞用62.5、125、250、500或1000ng/ml的ctb006以及10μm(圖23a)或5μm(圖23b)的索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼，10μg/ml或1μg/ml的愛必妥或赫賽汀(圖23c)處理。

圖24a和圖24b是顯示ctb006、索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼中每一個單獨對h460肺癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼組合對h460肺癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。細胞用62.5、125、250、500或1000ng/ml的ctb006以及10μm(圖24a)或5μm(圖24b)的索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼處理。

圖25a和圖25b是顯示ctb006、索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼中每一個單獨對sk-br3乳腺癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼組合對sk-br3乳腺癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。細胞用62.5、125、250、500或1000ng/ml的ctb006以及7μm(圖25a)或3.5μm(圖25b)的索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼處理。

圖26a和圖26b是顯示ctb006、索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼中每一個單獨對sum102乳腺癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼組合對sum102乳腺癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。細胞用62.5、125、250、500或1000ng/ml的ctb006以及7μm(圖26a)或3.5μm(圖26b)的索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼處理。

圖27a和圖27b是顯示ctb006、索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼中每一個單獨對dy36t2乳腺癌細胞的細胞毒性作用，以及ctb006與索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼組合對dy36t2乳腺癌細胞的協(xié)同細胞毒性作用的圖。細胞用62.5、125、250、500或1000ng/ml的ctb006以及7μm(圖27a)或3.5μm(圖27b)的索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼處理。

圖28a和28b是顯示ctb006或吉西他濱治療對使用mia-paca-2(胰腺癌細胞)皮下模型的小鼠腫瘤進展的影響的圖。圖28a顯示了ctb006或吉西他濱治療對腫瘤體積的影響，圖28b顯示了ctb006或吉西他濱治療對腫瘤重量的影響。圖28a底部的“+”標志表示在當天處理了的小鼠。

圖29是顯示在mia-paca-2(胰腺癌細胞)皮下模型中ctb006或吉西他濱治療對小鼠體重的影響的圖。

圖30a-30c是顯示ctb006或伊立替康治療對使用colo205皮下模型的小鼠腫瘤進展的影響的圖。圖30a顯示了ctb006或伊立替康治療對腫瘤體積的影響。圖30b顯示了ctb006或伊立替康治療對腫瘤重量的影響，30c顯示ctb006或伊立替康治療對腫瘤攜帶率的影響。

圖31是顯示ctb006或伊立替康治療對使用colo205皮下模型的小鼠體重的影響的圖。

圖32a和32b是顯示ctb006或伊立替康治療對使用widr皮下模型的小鼠腫瘤進展的影響的圖。圖32a顯示了ctb006或伊立替康治療對腫瘤體積的影響，32b顯示了ctb006或伊立替康治療對widr皮下模型腫瘤重量的影響。

圖33是顯示ctb006或伊立替康治療對使用widr皮下模型的小鼠體重的影響的圖。

圖34a-34c是顯示ctb006或紫杉醇治療對使用h2122皮下模型的小鼠腫瘤進展的影響的圖。圖34a顯示了ctb006或紫杉醇治療對腫瘤體積的影響，圖34b顯示了ctb006或紫杉醇治療對腫瘤重量的影響，圖34c顯示了ctb006或分類治療對腫瘤攜帶率的影響。

圖35是顯示ctb006或紫杉醇治療對使用h2122皮下模型的小鼠體重的影響的圖。

圖36a-36c。圖36a是顯示ctb006單獨、5-fu單獨以及ctb006與5-fu組合協(xié)同對皮下的小鼠模型中患體原發(fā)性腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs146，2#)的腫瘤生長的影響的圖。圖36a顯示ctb006和5-fu組合對腫瘤體積的協(xié)同作用。圖36b顯示單獨用ctb006處理的腫瘤組織切片，和患體原發(fā)腫瘤組織cs146，he，200×的病理切片。圖36c顯示了用ctb006和5-fu處理的一部分腫瘤組織，和cs146，0#，he，200×的病理切片。

圖37a-37c。圖37a和37b是顯示ctb006單獨、伊立替康單獨以及ctb006與伊立替康組合協(xié)同對皮下的小鼠模型中患體原發(fā)性腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs182，5#)的腫瘤生長的影響的圖。圖37a顯示了ctb006和伊立替康的組合對腫瘤體積的協(xié)同作用。圖37b顯示了ctb006和伊立替康組合對腫瘤重量的協(xié)同作用，圖37c顯示cs182，0#，he，200×的病理切片。

圖38a-38e。圖38a和38b是顯示ctb006單獨、伊立替康單獨以及ctb006與伊立替康組合協(xié)同對皮下的小鼠模型中患者原發(fā)性腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs263，1#)的腫瘤生長的影響的圖。圖38a顯示了ctb006和伊立替康組合對腫瘤體積的協(xié)同作用。圖38b顯示了ctb006和伊立替康組合對腫瘤重量的協(xié)同作用。38c顯示cs263，0#，he，200×的病理切片；圖38d顯示cs263，1#，he，200×的病理切片；圖38e顯示cs263，he，200×的病理檢查結(jié)果，其中a)對照，b)組合組，c)未顯示腫瘤細胞的組合組。

圖39a-d。圖39a和39b是顯示ctb006單獨、紫杉醇加卡鉑(carboplatin)以及ctb006與紫杉醇加卡鉑組合協(xié)同對皮下的小鼠模型中患者原發(fā)性腫瘤組織(肺癌，cs113，3#)的腫瘤生長的影響的圖。圖39a顯示了ctb006與紫杉醇加卡鉑組合對腫瘤體積的協(xié)同作用。圖39b顯示ctb006與紫杉醇加卡鉑組合對腫瘤攜帶率的協(xié)同作用。圖39c顯示cs113，0#，he，200×的病理切片；圖39d顯示cs113，1#，he，200×的病理切片。

圖40a-d。圖40a和40b是顯示ctb006單獨、順鉑單獨和ctb006與順鉑組合協(xié)同對皮下的小鼠模型中患者原發(fā)性腫瘤組織(肺癌，cs225，1#)的腫瘤生長的影響的圖。圖40a顯示了ctb006與順鉑對腫瘤體積的協(xié)同作用。圖40b顯示ctb006與順鉑對腫瘤攜帶率的協(xié)同作用。圖40c顯示cs225，0#，he，200×的病理切片；圖40d顯示cs225，1#，he，200×的病理切片。

圖41是表示人腫瘤細胞裂解液中的dr5濃度與ctb006的體外細胞毒敏感性之間的關(guān)系的圖，顯示了人腫瘤細胞裂解液中dr5濃度與ctb006的體外細胞毒性敏感性之間的相關(guān)性。具有較高dr5濃度的細胞在體外顯示更有效的殺傷作用?！皯?yīng)答者(responder)”的閾值為0.208ng/ml，“部分應(yīng)答者(partialresponder)”為0.109ng/ml。檢測限為0.0256ng/ml。

圖42a-i。圖42a、b、d、e、g和h是組織切片。該圖顯示了cleiakit(cleia試劑盒)和ihc檢測到的dr5表達的相容性(用一些結(jié)腸癌組織和相對鄰近組織作為實例)。在該圖中，左側(cè)病理圖(即圖42a、42d和42g)是腫瘤的病理切片，右側(cè)病理圖(即圖42b、42e和42h)是相對鄰近組織。cleia試劑盒的結(jié)果表明了dr5的表達。從所有圖中，clela試劑盒檢測到的腫瘤較高的dr5表達對應(yīng)于腫瘤的病理區(qū)域，其顯示為

具體實施方式

i.概述

應(yīng)當理解，本文公開的技術(shù)的某些方面、模式、實施方式、變型和特征在下面以各種詳細程度進行描述，以便提供實質(zhì)的理解技術(shù)。

本技術(shù)提供了可用于誘導(dǎo)表達trail-r2多肽的細胞凋亡的和用于治療癌癥的trail受體結(jié)合劑(例如抗體)。

由于trail的細胞凋亡誘導(dǎo)功能是由其受體介導(dǎo)的，所以trail受體系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛的研究。早期研究表明，許多正常細胞可能在轉(zhuǎn)錄水平上表達trail的死亡受體(trail-r1和trail-r2)。隨著抗死亡受體抗體可供使用，據(jù)信正常細胞和組織表達非常低水平的細胞表面trail-r1和trail-r2。相比之下，正常細胞和組織可能表達高水平的trail-r3和trail-r4。正常細胞中不同trail受體的差異表達可能是正常細胞逃避trail殺傷的保護機制。與正常細胞不同，大多數(shù)轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞表達高水平的trail-r1和trail-r2，而trail-r3和trail-r4的表達水平非常低。因此，大多數(shù)腫瘤細胞易受trail介導(dǎo)的殺傷。正常和腫瘤細胞之間差異表達的trail受體解釋了trail的選擇性。

許多臨床前研究已經(jīng)證實trail是治療癌癥的安全有效的治療劑。已經(jīng)顯示，三聚可溶性trail的全身給藥在實驗動物中沒有引起毒性，但還是能夠誘導(dǎo)植入的腫瘤消退。更令人鼓舞的是，當trail與化學(xué)療法或放射治療結(jié)合使用時，其抗腫瘤功效顯著提高。許多體外和體內(nèi)實驗已經(jīng)證明這種協(xié)同作用。此外，trail可以增加腫瘤細胞對化學(xué)治療和放射治療的敏感性。由于腫瘤細胞對化學(xué)治療和放射治療的抵抗一直是治療癌癥的主要障礙，因此trail防止或逆轉(zhuǎn)化療或放療的抵抗可能是未來癌癥治療的重大進展。

然而作為治療劑，trail具有幾個缺點。首先，trail具有至少五種受體，包括死亡受體和誘餌受體，因此缺乏對受體的選擇性。特別是當癌細胞表達分化的死亡受體和誘餌受體時，難以預(yù)測trail誘導(dǎo)細胞凋亡的能力。第二，重組trail具有非常短的體內(nèi)半衰期，這限制了trail在體內(nèi)的有效劑量和抗癌功效?；颊咄ǔ２环奖憬邮苤貜?fù)和大劑量的trail。第三，某些形式的重組trail具有潛在的肝細胞毒性令人顧慮。

trail作為治療劑的這些限制導(dǎo)致了trail替代品的開發(fā)。單克隆抗體可以選擇性地靶向trail的死亡受體，這可能是更有效和安全的癌癥治療策略。

在從第一個單克隆抗體產(chǎn)生開始的25年中，單克隆抗體已經(jīng)在癌癥治療中表現(xiàn)出巨大影響。大多數(shù)這些臨床有效的單克隆抗體靶向癌細胞表面高度表達的抗原或受體，并阻斷腫瘤生長所需的生長信號。這些抗體通過激活補體和抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependentcytotoxicity，adcc)來殺死腫瘤細胞。此外，當與放射性同位素、毒素和藥物結(jié)合時，單克隆抗體可以用作追蹤分子，以將這些治療劑帶到癌組織并增強抗癌功效。

用以取代trail的trail-r1或trail-r2特異性單克隆抗體已經(jīng)成功產(chǎn)生。已經(jīng)有幾種這樣的抗體進入臨床試驗。初步結(jié)果表明，與trail相比，這些抗體不僅具有很強的抗癌功效，而且是安全的。

日本制藥公司sankyo首先開發(fā)了抗trail-r2抗體tra-8。ichikawa等人使用trail-r2-fc融合蛋白作為免疫原來免疫balb/c小鼠。tra-8不誘導(dǎo)正常細胞凋亡，但是許多腫瘤細胞對tra-8誘導(dǎo)的凋亡高度敏感。雖然trail-r2的mrna在正常組織中廣泛分布，但trail-r2蛋白在包括肝、肺、乳腺、腎、脾、卵巢、耳和胰腺的正常組織中無法檢測到。然而，這些組織中的癌細胞表達高水平的trail-r2蛋白。另外，正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞和外周血細胞表達trail-r2水平很低，對tra-8誘導(dǎo)的細胞凋亡不敏感，而膠質(zhì)瘤細胞和白血病細胞表達高水平，對tra-8誘導(dǎo)的細胞凋亡非常敏感。tra-8在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡中也表現(xiàn)出比trail高幾倍的細胞凋亡誘導(dǎo)能力。重要的是，tra-8沒有誘導(dǎo)正常肝細胞凋亡。當結(jié)合化療或放射治療時，tra-8的抗癌功效顯著增強。tra-8目前正在進行i期臨床試驗。

人類基因科學(xué)公司進行了抗trail-r1抗體的i期試驗。初步數(shù)據(jù)表明患者耐受化合物良好，在幾例患者中觀察到陽性反應(yīng)表明抗trail-r1是安全有效的治療劑。

本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑(例如，具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體；具有重鏈cdr氨基酸序列syfih、wiypgnvntkysekfkg和geagyfd及輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava、wastrht和qqhyrtpw；具有如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列；huctb006抗體)可單獨或與其它活性劑(例如化學(xué)治療藥物)組合用于調(diào)節(jié)trail受體介導(dǎo)的功能。特別地，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑在與殺死癌細胞的化學(xué)治療劑(例如5-氟尿嘧啶和/或紫杉醇)組合時顯示出顯著和意想不到的協(xié)同作用水平。此外，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑可用于檢測測試樣品(例如患者樣品)中的trail受體多肽(即目標多肽)。trail受體結(jié)合劑可用于在有需要的受試者中診斷、預(yù)防和/或治療trail受體相關(guān)的醫(yī)療狀況。本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑(例如抗體)提供了獨特的生物功能和抗癌活性。盡管可溶性trail已經(jīng)顯示出在體內(nèi)有效誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，但由于其半衰期短，殺傷活性似乎非常低，并且通常需要大量(和重復(fù))的劑量。根據(jù)本技術(shù)的結(jié)合劑與trail和其它單特異性抗trail-r2抗體相比具有更強的藥效。

本技術(shù)的各個方面另外涉及診斷方法和試劑盒，它們使用本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑鑒定易患醫(yī)學(xué)病癥的個體，或者針對藥物反應(yīng)性、副作用或最佳藥物劑量對個體進行分類。在其他方面，該技術(shù)提供了使用trail受體結(jié)合劑預(yù)防或治療trail受體介導(dǎo)的病癥，各種癌癥以及篩選和/或驗證配體(例如結(jié)合trail受體多肽的小分子)的方法。相應(yīng)的，說明這些方面的各種具體實施方式如下。

在以下附隨的說明中將闡述本技術(shù)的一個或多個實施方式的細節(jié)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到與本文所述類似或等同的方法和材料可用于本技術(shù)的實踐或測試。該技術(shù)的其它特征、目的和優(yōu)點將由說明書和權(quán)利要求書而變得顯而易見。一般地，酶促反應(yīng)和純化步驟是根據(jù)制造商的說明書來進行的。本文中的技術(shù)和程序通常根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法和各種一般參考文獻(大體參考sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，2ded.(coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，newyork，1989)進行，其在本申請文件全文中均有提供。

ii.定義和縮寫

除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義一般與本技術(shù)所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同。除非文章內(nèi)容明確地另有所指，在本說明書和附隨的權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一種/個(a，an)”和“該(the)”包括了復(fù)數(shù)的所指。例如，提及“細胞(acell)”時，包括兩個或更多細胞的組合等等。一般地，在此使用的命名法和本文所描述的細胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機化學(xué)、分析化學(xué)和核酸化學(xué)及雜交中的實驗方法是本領(lǐng)域公知和常用的。核酸和肽合成使用標準的技術(shù)?；瘜W(xué)合成和化學(xué)分析使用標準的技術(shù)或其修改方案。本文引用的所有參考文獻通過整體并且出于所有目的引用并入本文，其程度如同每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埗季唧w及分別的出于所有目的被引用。

選用的生物化學(xué)和血液學(xué)術(shù)語的縮寫分別總結(jié)在下面的表a和表b中

以下提供了在本說明書中使用的某些術(shù)語的定義。其他術(shù)語的定義可以在illustrateddictionaryofimmunology，2ndedition(cruse，j.m.和lewis，r.e.，eds.，bocaraton，fl；crcpress，1995)中找到。

術(shù)語對“dr4”和“trail-r1”、“dr5”和“trail-r2”、“dcr1”和“trail-r3”以及“dcr2”和“trail-r4”可以互換使用。除非另外表明，在本文中使用這些術(shù)語時是指人類蛋白質(zhì)和基因。鼠類版本的分子之前可加有“m”。

如本文所用，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑(例如抗體)或其變體或片段的術(shù)語“生物活性”是指試劑(1)特異性結(jié)合trail-r2(dr5)；(2)在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)癌細胞死亡；和(3)表現(xiàn)出與化療藥物如紫杉醇和5-氟尿嘧啶在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)癌細胞死亡的協(xié)同作用的能力。

如本文所用，術(shù)語“協(xié)同作用”或“協(xié)同劑”是指在兩種或更多種試劑、實體、因子或物質(zhì)之間產(chǎn)生的作用大于其各自作用的總和的效果。在一些實施方式中，生物活性劑如本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑(例如，具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體；具有重鏈cdr氨基酸序列syfih、wiypgnvntkysekfkg和geagyfd及輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava、wastrht和qqhyrtpw；具有如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列；huctb006抗體)與化學(xué)治療劑之間的協(xié)同作用是通過藥物相互作用系數(shù)(coefficientofdruginteraction，即cdi)確定的(參考caoss等人，potentiationofantimetaboliteantitumoractivityinvivobydipyridamoleandamphotericinb.cancerchemotherpharmacol1989；24:181-186)。在一些實施方式中，cdi計算如下：cdi＝ab/a×b。根據(jù)每組的化學(xué)發(fā)光，ab是合用組與對照組的比例；a或b是單一藥劑組與對照組的比例。當cdi值小于1時，藥物組合是協(xié)同的。在確定兩種或更多種組分之間的協(xié)同相互作用時，在一些實施方式中，可以通過給需要治療的患者在不同的w/w比例范圍和/或不同劑量下施用該組分，來測量效果的最佳范圍和每種組分對于該效果的絕對劑量范圍。在一種物種中觀察到的協(xié)同作用可以預(yù)測其他物種中的效果，這些研究的結(jié)果可用于預(yù)測有效劑量。

如本文所用，術(shù)語“顯著的協(xié)同作用”或“顯著協(xié)同的”是指在兩種或更多種試劑、實體、因子或物質(zhì)之間產(chǎn)生的作用在統(tǒng)計學(xué)上顯著大于其各自作用的總和效果。作為實例而不是限制，當cdi值小于0.7時，藥物組合是顯著協(xié)同的。

如本文所用，術(shù)語“加和的”是指在兩種或更多種試劑、實體、因子或物質(zhì)之間產(chǎn)生的作用等于其各自作用的總和的效果。作為實例而不是限制，當cdi值等于1時，藥物組合是加和的。

如本文所用，術(shù)語“拮抗”或“拮抗的”是指在兩種或更多種試劑、實體、因子或物質(zhì)之間產(chǎn)生的作用小于其各自作用的總和的效果。作為實例而不是限制，當cdi值大于1時，藥物組合是拮抗的。

如本文所用，術(shù)語“trail受體”是指tnf受體家族的成員。人trail受體是trail(ap02配體)的細胞表面受體。迄今為止，已經(jīng)鑒定了trail的五個受體，其中兩個dr4(trail-r1；cd261或死亡受體4)和dr5(trail-r2；cd262或死亡受體5)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號，而其他三個dcr1(trail-r3；cd263或誘餌受體1)、dcr2(trail-r4；cd264或誘餌受體2)和骨保護素(opg)不轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞凋亡信號。三聚trail與trailr1或trailr2的結(jié)合通過這些受體的低聚誘導(dǎo)細胞凋亡。trailr1和trailr2由胞外富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域組成。trailr3和trailr4也具有細胞外富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，但trailr3缺少細胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域，trailr4具有截短的結(jié)構(gòu)域。trail的所有五個受體在其細胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中具有顯著的同源性。dr4和dr5的細胞內(nèi)段含有保守的功能結(jié)構(gòu)域，即所謂的“死亡結(jié)構(gòu)域”，其負責轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號。

如本文所用，試劑或藥物對受試者的施用包括自我施用和由他人施用。還應(yīng)當理解，所描述的醫(yī)療狀況的各種治療模式或預(yù)防措施旨在表示“實質(zhì)性的”，其包括總體但也包括少于總體的治療或預(yù)防，并且其中實現(xiàn)了一些生物學(xué)或醫(yī)學(xué)上相關(guān)的結(jié)果。

如本文所用，術(shù)語“氨基酸”包括天然存在的氨基酸和合成氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即與氫、羧基、氨基和r基團結(jié)合的α-碳，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這樣的類似物具有修飾的r基團(例如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但是以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的化合物。氨基酸在此可以通過它們公知的三字母符號或通過iupac-iub生物化學(xué)術(shù)語委員會推薦的單字母符號來指代。同樣地，核苷酸可以通過它們公認的單字母代碼來指代。

如本文所用，術(shù)語“抗體”是指包含特異性結(jié)合并識別抗原例如trail受體多肽的免疫球蛋白基因或其片段的框架區(qū)的多肽。術(shù)語“抗體”的使用意圖包括完整抗體、包括單鏈的完整抗體，以及其抗原結(jié)合片段。術(shù)語“抗體”包括雙特異性抗體和多特異性抗體，只要它們展現(xiàn)了期望的生物學(xué)活性或功能。

如本文所用，術(shù)語“抗體相關(guān)的多肽”是指抗原結(jié)合性抗體片段，包括單鏈抗體，其可以包含單獨的可變區(qū)或與所有或部分的以下多肽元件組合的可變區(qū)：抗體分子的絞鏈區(qū)、ch1、ch2和ch3結(jié)構(gòu)域。本公開還包括可變區(qū)與絞鏈區(qū)、ch1、ch2和ch3結(jié)構(gòu)域的任何組合?？捎米鞅炯夹g(shù)的結(jié)合劑的抗體相關(guān)分子包括但不限于fab、fab'和f(ab')2、fd、單鏈fvs(scfv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的fvs(sdfv)和包含vl或vh結(jié)構(gòu)域的片段。實例包括：(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)f(ab')2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接的兩個fab片段的二價片段；(iii)由vh和ch1結(jié)構(gòu)域組成的fd片段；(iv)由抗體單臂的vl和vh結(jié)構(gòu)域組成的fv片段；(v)由vh結(jié)構(gòu)域組成的dab片段(ward等人，nature341：544-546,1989)；和(vi)分離的互補決定區(qū)(cdr)。因而，“抗體片段”可以包含全長抗體的一部分，通常是抗原結(jié)合區(qū)或其可變區(qū)?？贵w片段的實例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。單鏈抗體分子可以包含具有多個單獨分子的聚合物，例如，二聚體、三聚體或其它聚合物。

如本文所用，術(shù)語“生物樣品”是指源自于活細胞或被活細胞接觸過的樣品材料。術(shù)語“生物樣品”意圖包括從受試者分離的組織、細胞和生物液體，以及存在于受試者體內(nèi)的組織、細胞和液體。本技術(shù)的生物樣品包括，例如但不限于，全血、血漿、精液、唾液、淚液、尿液、糞便材料、汗液、口腔的(buccal)、皮膚、腦脊液和毛發(fā)。生物樣品也可以從內(nèi)臟的活檢或從癌癥獲得。生物樣品可以從用于診斷或研究的受試者獲得，或者可以從未患病的個體獲得，作為對照或用于基礎(chǔ)研究。

如本文所用，術(shù)語“cdr-移植的抗體”是指其中至少一個“受體”抗體的cdr被來自具有所需抗原特異性的“供體”抗體的cdr“接枝”替代的抗體。

如本文所用，術(shù)語“嵌合抗體”是指使用重組dna技術(shù)將來自一個物種(例如，小鼠fc恒定區(qū))的單克隆抗體的fc恒定區(qū)用另一個物種fc恒定區(qū)(例如，人fc恒定區(qū))替換的抗體。一般地參見，robinson等人，pct/us86/02269；akira等人，歐洲專利申請184,187；taniguchi,歐洲專利申請171,496；morrison等人，歐洲專利申請173,494；neuberger等人，wo86/01533；cabilly等人美國專利no.4,816,567；cabilly等人，歐洲專利申請125,023；better等人，science240:1041-1043，1988；liu等人，procnatlacadsciusa84:3439-3443，1987；liu等人，jimmunol139:3521-3526，1987；sun等人，procnatlacadsciusa84:214-218，1987；nishimura等人，cancerres47:999-1005，1987；wood等人，nature314:446-449，1885；和shaw等人，jnatlcancerinst80:1553-1559，1988。

如本文所用，術(shù)語“比較窗口”(comparisonwindow)是指具有選自20至600個，通常為約50至約200個，更通常為約100至約150個氨基酸或核苷酸的任一個連續(xù)位置數(shù)的片段，其中序列可以與具有相同連續(xù)位置數(shù)的參考序列在兩個序列以最優(yōu)方式對齊以后進行比較。

如本文所用，術(shù)語“共有fr”是指共有免疫球蛋白序列中的框架(fr)抗體區(qū)域?？贵w的fr區(qū)域不接觸抗原。

如本文所用，術(shù)語“共有序列”是指由在相關(guān)序列的家族中最經(jīng)常出現(xiàn)的氨基酸(或核苷酸)所形成的序列(參見，例如，winnaker，fromgenestoclones(verlagsgesellschaft，weinheim，germany1987)。也就是說，在蛋白質(zhì)的家族中，共有序列中的每個位置均被家族中在該位置上最常出現(xiàn)的氨基酸所占據(jù)。如果兩個氨基酸出現(xiàn)頻度相等，則其中任一個均可以被包括在共有序列中。

如本文所用，術(shù)語“接觸”用于細胞時是指這樣一種過程，通過該過程本技術(shù)中的trail受體結(jié)合劑、抗體、抗體組合物、細胞毒性劑或部分、基因、蛋白質(zhì)和/或反義序列，被遞送到目標細胞或被放置在與靶細胞直接接近的位置。該遞送可以在體外或體內(nèi)，并且可以涉及使用重組載體系統(tǒng)。

如本文所用，術(shù)語“細胞毒性部分”(“cytotoxicmoiety”)是指當接近細胞或被細胞吸收時抑制細胞生長或促進細胞死亡的部分。在這方面，合適的細胞毒素部分包括放射性試劑或同位素(放射性核素)、化學(xué)毒物如分化誘導(dǎo)劑、抑制劑和小的化學(xué)毒性藥物、毒素蛋白質(zhì)及其衍生物以及核苷酸序列(或其反義序列)。因此，作為非限制性實例，細胞毒性部分可以是化學(xué)治療劑、光活化毒素或放射性試劑。

如本文所用，術(shù)語“雙價抗體”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，該片段在相同的多肽鏈(vhvl)中含有相互連接的輕鏈可變域(vl)和重鏈可變域(vh)。通過使用過短而不容許在同一鏈上兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，結(jié)構(gòu)域被迫與另一鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙價抗體在例如ep404,097；wo93/11161和30hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa，90:6444-6448(1993)中有更詳細的描述。

如本文所用，術(shù)語“效應(yīng)物細胞”是指免疫應(yīng)答的效應(yīng)物階段——與免疫反應(yīng)的認知和活化階段相對——中涉及的免疫細胞。示例性的免疫細胞包括骨髓或淋巴來源的細胞，例如，淋巴細胞(例如，b細胞和t細胞，包括細胞溶解性t細胞(ctl))、殺傷細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸細胞、嗜中性細胞、多形核細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜堿性細胞。效應(yīng)物細胞表達特定的fc受體并進行特定的免疫功能。效應(yīng)物細胞可以誘導(dǎo)抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，adcc)，例如，能夠誘導(dǎo)adcc的嗜中性細胞。例如，表達fcαr的單核細胞、巨噬細胞、嗜中性細胞、嗜酸細胞和淋巴細胞參與目標細胞的特異性殺傷，并向免疫系統(tǒng)的其他成分呈遞抗原，或結(jié)合呈遞抗原的細胞。效應(yīng)細胞也可以吞噬目標抗原、目標細胞、轉(zhuǎn)移性癌細胞或微生物。

如本文所用，術(shù)語“表位”是指能夠特異性結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由化學(xué)活性的表面分子群集(grouping)例如氨基酸或糖類側(cè)鏈組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特性，以及特定的電荷特征。構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于在變性溶劑的存在下與前者的結(jié)合會喪失，而與后者的結(jié)合不會喪失。

為了篩選特異性結(jié)合表位的trail受體結(jié)合劑，可以進行常規(guī)的交叉阻斷(cross-blocking)測定，例如在antibodies，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，edharlow和davidlane(1988)中描述的。這種分析可以用于確定測試的trail受體結(jié)合劑是否結(jié)合與本技術(shù)的trail-r1和/或trail-r2抗體相同的位點或表位。另外一種方式，或者附加的，可以通過本領(lǐng)域已知的方法進行表位作圖(epitopemapping)。例如，抗體序列可以被例如通過丙氨酸掃描誘變，以鑒定接觸殘基。在另一種方法中，與trail-r1和trail-r2的不同區(qū)域相應(yīng)的肽可以用于與測試抗體，或者與測試抗體及具有已被表征的或已知的表位的抗體進行競爭測定。

如本文所用，術(shù)語組合物的“有效量”是足以實現(xiàn)所需治療和/或預(yù)防效果的量，例如，導(dǎo)致與正在治療的疾病(例如與靶多肽相關(guān)的疾病)相關(guān)的癥狀的預(yù)防或減少。施用給受試者的本技術(shù)的組合物的量將取決于疾病的類型和嚴重度，以及取決于個體的特征，例如一般健康狀態(tài)、年齡、性別、體重和對藥物的耐受性。還將取決于疾病的程度、嚴重度和類型。技術(shù)人員將能夠取決于這些和其他因素確定合適的劑量。本技術(shù)的組合物也可以相互組合、或與一種或多種其他的治療化合物組合施用。

如本文所用，“表達”包括但不限于下面的一項或多項：基因轉(zhuǎn)錄成前體mrna；前體mrna的剪接和其他處理來產(chǎn)生成熟mrna；mrna穩(wěn)定性；成熟mrna翻譯成為蛋白質(zhì)(包括密碼子利用(codonusage)和可供使用的trna(trnaavailability))；以及翻譯產(chǎn)物的糖基化和/或其他修飾，如果對于適合的表達和功能是必需的。

如本文所用，“融合多肽”包含與如下所述的多肽有效連接的trail受體多肽，所述多肽具有對應(yīng)于與trail受體多肽基本上不同源的多肽的氨基酸序列，例如不同于trail受體多肽，并且衍生自相同或不同的生物體的多肽。

如本文所用，術(shù)語“基因”是指包含調(diào)節(jié)rna產(chǎn)物的生物合成的所有信息的dna片段，包括啟動子、外顯子、內(nèi)含子和其他控制表達的非翻譯區(qū)。

如本文所用，術(shù)語“基因型”是指在個體中一對同源染色體上的基因座中的一個或多個多態(tài)性或突變位點處發(fā)現(xiàn)的無序的(unphased)5'至3'核苷酸對序列。如本文所用，基因型包括全基因型和/或亞基因型(sub-genotype)。

如本文所用，術(shù)語“人類序列抗體”包括具有來自人類種系(humangermline)免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在)的抗體。本技術(shù)的人類序列抗體可以包括不被人類種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外的隨機或定點誘變或通過體內(nèi)的體細胞突變而引入的突變)。這些抗體可以在非人類轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生，例如，如pct公開文本wo01/14424和wo00/37504中所描述的。然而，如本文所用，術(shù)語“人類序列抗體”并不意圖包括其中源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)的cdr序列已經(jīng)被移植到人框架序列(例如人源化抗體)上的抗體。

如本文所用，術(shù)語非人類(例如鼠)抗體的“人源化”形式，是含有最少的來自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。大體上，人源化的抗體是人免疫球蛋白，在其中受體的高變區(qū)殘基被來自非人物種(供體抗體)，例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的，并具有期望的特異性、親和性和能力(capacity)的高變區(qū)殘基所替代。在有些情況下，人免疫球蛋白的fv骨架區(qū)(fr)殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。此外，人源化抗體可以包含既不在受體抗體中存在也不在供體抗體中存在的殘基。進行這些修飾以進一步改善抗體性能，例如結(jié)合親和力。通常，人源化抗體將包含至少一個，通常為兩個可變結(jié)構(gòu)域的基本全部(substantiallyall)，其中全部或基本上全部的高變環(huán)與非人免疫球蛋白的那些高變環(huán)相對應(yīng)，并且所有或基本上所有fr區(qū)均為人類免疫球蛋白序列的那些fr區(qū)，盡管fr區(qū)可以包括提高結(jié)合親和力的一個或多個氨基酸取代。在fr區(qū)域中這些氨基酸替換的數(shù)目一般是在h鏈中不超過6個，在l鏈中不超過3個。人源化抗體任選地還包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)。進一步的細節(jié)參見jones等人，nature321:522-525(1986)；reichmann等人，nature332:323-329(1988)；和presta，curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。

本文考慮了在此所述的trail-r2結(jié)合劑的氨基酸序列修飾。例如，可能需要改善抗體的結(jié)合親和力和/或其他生物學(xué)性質(zhì)。通過向抗體核酸中導(dǎo)入合適的核苷酸變化或通過肽合成來制備trail-r2結(jié)合劑的氨基酸序列變體。這樣的修飾包括，例如，刪除、和/或插入和/或替換trail-r2結(jié)合劑的氨基酸序列內(nèi)的殘基。只要獲得的抗體具有希望的性質(zhì)，例如，生物活性，可進行刪除、插入和替換的任何組合來獲得感興趣的抗體。修飾還包括蛋白質(zhì)的糖基化模式的改變。一種有用的鑒定優(yōu)選的誘變位置方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如cunningham和wells在science，244:1081-1085(1989)中所描述的。然后針對所希望的活性篩選突變抗體。本技術(shù)包括具有cgmcc登錄號1691的雜交瘤ctb006所定義的氨基酸序列中添加、刪除和/或替換了一個或多個氨基酸的抗體變體，只要所述抗體變體具有希望的性質(zhì)，例如，生物活性。

如本文所用，術(shù)語“高變區(qū)”是指抗體中負責抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)一般包含來自“互補決定區(qū)(complementaritydeterminingregion)”或“cdr”的氨基酸殘基(例如，vl中的殘基23-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)左右，和vh中的殘基31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)左右)(kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1991))；和/或來自“高變環(huán)”的那些殘基(例如，vl中的殘基26-32(li)、50-52(l2)和91-96(l3)和vh中的26-32(h1)、52a-55(h2)和96-101(h3)(chothia和leskj.mol.biol.196:901-917(1987))。

如本文所用，當在兩個或多個核酸或多肽序列的上下文中使用時，術(shù)語“相同”或百分比“同一性”是指，如使用具有如下所述默認參數(shù)的blast或blast2.0序列比較算法，或通過人工比對或目視檢查(參見例如ncbi網(wǎng)站)，所測定的兩個或更多個序列或亞序列相同或指定百分比的氨基酸的殘基或核苷酸相同(即當以比較窗口或指定區(qū)域上的最大對應(yīng)度來進行比較和比對時，在指定的區(qū)域(例如，編碼本文所述抗體的核苷酸序列，或本文所述抗體的氨基酸序列)上有約60％同一性、優(yōu)選地65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。然后這些序列被稱為“基本上相同的”。該術(shù)語還指，或者說可以用于，測試序列的互補序列(complement)。該術(shù)語還包括具有刪除和/或添加的序列，以及那些具有替換的序列。如下所述，優(yōu)選的算法可以考慮缺口等等。在一些實施方式中，同一性存在于長度為至少約25個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上；附加或替代地，在一些實施方式中，同一性存在于長度為50-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域上。

“分離的”或“純化的”多肽或其生物學(xué)活性部分基本上不含來自該trail受體結(jié)合劑所來源的細胞或組織的細胞材料或其他污染多肽，或者，當它們?yōu)榛瘜W(xué)合成時，基本上不含化學(xué)藥品前體或其他化學(xué)藥品。例如，作為分離的trail受體結(jié)合劑的抗trail受體抗體將不含有干擾該試劑的診斷或治療用途的材料。這樣的干擾材料可以包括酶、激素和其他蛋白質(zhì)性的或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。

如本文所用，短語“誘導(dǎo)細胞死亡”或“能夠誘導(dǎo)細胞死亡”是指本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑使有活力的細胞變得沒有活力的能力。細胞死亡和細胞活力可以通過本領(lǐng)域的各種方法，例如錐蟲藍排除測定和其他細胞活力分析來測定。在本技術(shù)中，細胞死亡特別地是由“凋亡”或稱為“程序性細胞死亡”誘導(dǎo)的，其通過膜聯(lián)蛋白v的結(jié)合、dna片段、細胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞破碎和/或膜囊泡(稱為凋亡體)的形成來判定。有很多方法可用于評估與凋亡相關(guān)的細胞事件。例如，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，ps)轉(zhuǎn)位可以通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合來測量；dna片段化可以通過dna梯狀化(laddering)來評估；核/染色質(zhì)縮合以及dna片段化可以通過亞二倍體細胞的任何提高來評估。目標細胞是表達trail-r2的細胞，優(yōu)選地，所述細胞是腫瘤細胞，例如，乳腺、結(jié)腸、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎臟、甲狀腺、胰腺或膀胱細胞。

如本文所用，術(shù)語“完整抗體”是指具有由二硫鍵互連的至少兩個重(h)鏈多肽和兩個輕(l)鏈多肽的抗體。每個重鏈由一個重鏈可變區(qū)(在此縮寫為hcvr或vh)和一個重鏈恒定區(qū)構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域，ch1、ch2和ch3構(gòu)成。每個輕鏈由一個輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為lcvr或vl)和一個輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。輕鏈恒定區(qū)由一個結(jié)構(gòu)域cl構(gòu)成。vh和vl區(qū)域可以進一步分成高可變性的區(qū)域，稱為互補決定區(qū)(complementaritydeterminingregions，cdr)，這些互補決定區(qū)中間間隔著更為保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)域(frameworkregions，fr)。每個vh和vl由三個cdr和四個fr組成，它們從氨基末端到羧基末端按以下順序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。抗體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白對宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應(yīng)物細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分(c1q)。

如本文所用，術(shù)語“免疫應(yīng)答”是指淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞和上述細胞或肝臟產(chǎn)生的可溶大分子(包括抗體、細胞因子和補體)的協(xié)同動作，引起人體的癌性細胞、轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞、惡性黑色素瘤、侵入的病原體、病原體感染的細胞或組織的選擇性的損害、破壞或消滅；或者，在自體免疫或病理性炎癥的情況下，正常的人類細胞或組織的選擇性的損害、破壞或消滅。

如本文所用，術(shù)語“免疫交叉反應(yīng)性”和“免疫反應(yīng)性”可互換地使用，是指與抗體特異性地反應(yīng)的抗原，所述抗體是利用相同的(“免疫反應(yīng)性”)或不同的(“免疫交叉反應(yīng)性”)抗原產(chǎn)生的。一般地，抗原是trail受體多肽，其變體或子序列。

如本文所用，術(shù)語“免疫反應(yīng)條件”是指使針對抗原的特定表位而產(chǎn)生的抗體結(jié)合該表位，其結(jié)合的程度可檢測地大于(detectablygreaterthan)該抗體與基本上所有其他表位結(jié)合程度的條件，其結(jié)合的程度一般至少高于背景結(jié)合至少兩倍。免疫反應(yīng)條件取決于抗體結(jié)合反應(yīng)的模式，一般是在免疫分析方案中利用的那些模式。免疫分析模式和條件的描述可參見，harlow和lane，antibodies，alaboratorymanual(coldspringharborpublications，newyork，1988)。

如本文所用，術(shù)語“淋巴細胞”是指血液、淋巴和淋巴組織中存在的任何單核的、非巨噬細胞的白細胞，例如，b淋巴細胞和t淋巴細胞。

本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體，即除了可能以少量存在的可能自然發(fā)生的突變之外，構(gòu)成所述群體的抗體個體是相同的。單克隆抗體是高度特異的，針對單個的抗原性位點。此外，與常規(guī)的(多克隆的)抗體制品——它們通常包含對不同決定簇(表位)的不同抗體——形成對照的是，每種單克隆抗體針對的是抗原上的單個決定簇。修飾語“單克隆”表明了抗體是從實質(zhì)上同質(zhì)的抗體群體獲得的，并不能解釋為要求通過任何特別的方法生產(chǎn)抗體。例如，根據(jù)本技術(shù)使用的單克隆抗體可以通過首先由kohler等人，nature256:495(1975)描述的雜交瘤方法制備，或可以通過重組dna方法制備(參見，例如，美國專利no.4,816,567)。“單克隆抗體”也可以利用，例如，clackson等人，nature352:624-628(1991)和marks等人，j.mol.biol.222:581-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離。

如本文所用，術(shù)語“醫(yī)學(xué)狀況”包括但不限于，希望對其治療和/或預(yù)防的、表現(xiàn)為一種或多種生理和/或心理學(xué)的癥狀的任何狀況或疾病，包括早先和新近鑒定的疾病和其他病癥。

如本文所用，術(shù)語“調(diào)節(jié)物”包括抑制劑和活化劑。抑制劑是，例如，結(jié)合于、部分地或全部地阻斷刺激、降低、阻止、延遲活化、滅活、去致敏或下調(diào)trail受體多肽的活性的試劑，例如拮抗劑?；罨锸?，例如，結(jié)合于、刺激、提高、開放、活化、易化、增強活化、致敏或上調(diào)trail受體多肽的活性的試劑，例如激動劑。調(diào)節(jié)物包括，例如，改變trail受體多肽與下列物質(zhì)的相互作用的試劑：結(jié)合活化劑或抑制劑的蛋白質(zhì)、受體，包括蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、碳水化合物、多糖或上述物質(zhì)的組合，例如脂蛋白、糖蛋白等等。調(diào)節(jié)物包括天然存在的trail受體多肽的遺傳修飾的型式，例如，活性改變的遺傳修飾型式，以及天然存在的和合成的配體、拮抗劑、激動劑、小化學(xué)分子等等。

如本文所用，術(shù)語“中和抗體”是指能夠消除或顯著地降低trail受體多肽或trail受體樣多肽的至少一種(1種)生物學(xué)功能的抗體分子。

如本文所用，術(shù)語“核苷酸對”是指在兩條核苷酸鏈之間相互結(jié)合的兩個核苷酸。

如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”意圖包括與藥物施用相容的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌和抗真菌化合物、等滲和吸收延遲化合物等等。

如本文所用，術(shù)語“多克隆抗體”是指衍生于至少兩種(2種)不同的抗體生產(chǎn)細胞系的抗體的制品。該術(shù)語的使用包括至少兩種(2種)抗體的制品，其含有特異性結(jié)合抗原的不同表位或區(qū)域的抗體。如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”是指任何rna或dna，其可以是未修飾或修飾的rna或dna。多核苷酸包括但不限于單鏈和雙鏈dna，單鏈和雙鏈區(qū)域混合物的dna；單鏈和雙鏈rna，單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的rna；以及包含dna和rna的雜交分子，其可以是單鏈，或更一般地是雙鏈或是單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物。此外，多核苷酸指包含rna或dna或rna與dna兩者的三鏈區(qū)域。術(shù)語多核苷酸還包括含有一個或多個修飾的堿基的dna或rna，以及具有為了穩(wěn)定性或其他理由修飾了骨架的dna或rna。在特定的實施方式中，多核苷酸含有來自trail受體基因的多核苷酸序列。

如本文所用，術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在此可互換地用來指包含通過肽鍵或修飾的肽鍵(即肽電子等排體)連接在一起的兩個或更多個氨基酸的聚合物。多肽既指短的鏈，通常稱為肽、糖肽或寡聚體；也指較長的鏈，一般稱作蛋白質(zhì)。多肽可以含有20種基因編碼的氨基酸之外的氨基酸。多肽包括通過翻譯后加工等自然過程所修飾的，或通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)所修飾的氨基酸序列。這些修飾在基礎(chǔ)教科書以及在更詳細的專著中，以及在大量研究文獻中有詳盡的記載。在特定的實施方式中，多肽含有來自trail受體蛋白的多肽序列。

如本文所用，術(shù)語“重組”當用來指例如細胞、或核酸、蛋白質(zhì)或載體時，表明該細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已經(jīng)通過異源核酸或蛋白質(zhì)的導(dǎo)入或天然核酸或蛋白質(zhì)的改變而被修飾，或者所述材料來自這樣修飾的細胞。因而，例如，重組細胞表達在該細胞的天然(非重組)形式中不存在的基因，或表達本應(yīng)異常表達、少量表達或根本不表達的天然基因。

如本文所用，短語“救助受體結(jié)合表位(salvagereceptorbindingepitope)”是指igg分子(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)的fc區(qū)域的一種表位，其負責提高igg分子的體內(nèi)血清半衰期。為了提高抗體的血清半衰期，可以像例如美國專利5,739,277所描述的那樣向抗體(特別是抗體片段)中引入救助受體結(jié)合表位。

如本文所用，術(shù)語“單鏈抗體”或“單鏈fv(scfv)”是指fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域vl和vh的抗體融合分子。雖然fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域vl和vh由不同的基因編碼，但可以使用重組方法通過合成接頭來連接它們，所述接頭允許它們作為單一蛋白鏈產(chǎn)生，在該鏈中vl和vh區(qū)域配對形成單價的分子(稱為單鏈fv(scfv))。參見，例如，bird等人，science242:423-426，1988；和huston等人，proc.natl.acad.sci.usa，85:5879-5883，1988)。對術(shù)語“抗體”片段的提述包括了這樣一種單鏈抗體，其可以通過重組技術(shù)或完整抗體的酶學(xué)或化學(xué)切割來制備。

如本文所用，術(shù)語“小分子”是指具有低于約5kda，更優(yōu)選低于約2kda的分子量的一種成分(composition)。小分子可以是，例如，核酸、肽、多肽、糖肽、擬肽、碳水化合物、脂質(zhì)、脂多糖、這些物質(zhì)的組合，或其他有機或無機分子。

如本文所用，術(shù)語“特異性結(jié)合”是指trail受體結(jié)合劑和抗原之間結(jié)合親和力為至少10^-6m的接觸。優(yōu)選的結(jié)合劑以至少約10^-7m、優(yōu)選10^-8m到10^-9m、10^-10m、10^-11m或10^-12m的親和力結(jié)合。

如本文所用，短語“嚴格雜交條件”是指這樣的條件，在該條件下，探針將與其目標子序列(其一般處于復(fù)雜的核酸混合物中)雜交，而不與其他的序列雜交。嚴格條件是依賴于序列的，在不同的情況下會有所不同。較長的序列在較高的溫度下特異性雜交。對于核酸雜交的廣泛的指導(dǎo)可以在tijssen，techniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicprobes，“overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays”(1993)中找到。一般地，嚴格條件選擇為比在確定的離子強度ph下特定序列的熱熔點(tm)低約5-10℃。tm是(在確定的離子強度、ph和核酸濃度下)在平衡狀態(tài)時，與目標互補的探針有50％與目標序列雜交的溫度(由于目標序列過量存在，在tm時，平衡狀態(tài)下有50％的探針被占據(jù))。嚴格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來達到。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號可以是至少兩倍于背景的雜交，優(yōu)選為10倍于背景的雜交。示例性的嚴格雜交條件可以是如下：50％甲酰胺、5xssc和1％sds，在42℃溫育，或5xssc、1％sds，在65℃溫育，在0.2xssc和0.1％sds中在65℃洗滌。

如本文所用，術(shù)語“受試者”是指動物，優(yōu)選地是哺乳動物，例如人類，但也可以是其他哺乳動物，例如家養(yǎng)動物(例如，狗、貓等等)、農(nóng)畜(例如，牛、羊、豬、馬等等)以及實驗動物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等等)。

如本文所用，術(shù)語“替換”是指在本領(lǐng)域中通用的突變之一。示例性的替換變體在trail-r2結(jié)合劑(例如，抗體)分子中至少一個氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基所取代。替換突變的最感興趣的位點包括高變區(qū)，但也考慮fr改變。在以下表格中“優(yōu)選替換”的標題下列出了“保守性替換”。如果這種替換引起生物學(xué)活性的變化，則可以引入更為實質(zhì)性的改變(如表c中稱為“示例替換”的那些，或者如下文按氨基酸類型進一步描述的)，并篩選產(chǎn)物。

在一些實施方式中，替換變體包括對親本抗體的一個或多個高變區(qū)殘基的替換。一種方便地產(chǎn)生這種替換變體的方法包括利用噬菌體展示的親和成熟(affinitymaturation)。具體地，突變了幾個高變區(qū)位點(例如，6-7個位點)來在每個位點產(chǎn)生所有可能的氨基酸替換。由此產(chǎn)生的抗體變體作為與封裝在每個顆粒中的與m13的基因iii產(chǎn)物的融合物，以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上。然后篩選噬菌體展示的變體的生物活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點，可以進行丙氨酸掃描誘變以鑒定對結(jié)合trail-r2受體有顯著貢獻的高變區(qū)殘基。另外一種方式或附加地，分析抗原抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)來鑒定抗體和trail-r1和/或-r2受體之間的接觸點可能是有益的。這樣的接觸殘基和相鄰的殘基是根據(jù)本文詳述的技術(shù)進行取代的候選物。一旦產(chǎn)生了這類變體，則對一組變體如本文所述進行篩選，在一種或多種相關(guān)的測定中具有相似或更優(yōu)性質(zhì)的抗體可以被選擇用于進一步的開發(fā)。本技術(shù)包括具有對cgmcc登錄號1691的雜交瘤ctb006所定義的免疫球蛋白重鏈或輕鏈的高變結(jié)構(gòu)域的一個或多個氨基酸替換、特別是保守性替換的抗體變體，只要該抗體變體具有希望的性質(zhì)(例如，生物活性)。

如本文所用，術(shù)語“目標細胞”是指受試者(例如，人類或動物)中可以被本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑所靶向的任何細胞。

如本文所用，術(shù)語“治療劑”是指當以有效量存在時，對有需要的受試者產(chǎn)生期望的治療效果的化合物。

如本文所用，術(shù)語“進行治療(treating)”或“治療(treatment)”或“緩解”(alleviation)是指治療處理(therapeutictreatment)。如果受試者在根據(jù)本文所公開的方法接受治療量的本技術(shù)的trail-r2結(jié)合抗體之后，該受試者顯示特定疾病的一種或多種體征和癥狀的可觀察的和/或可測量的降低或不存在，則稱受試者被成功地“治療”了表達trail-r2的癌癥。例如，對于癌癥，癌細胞的數(shù)目的降低或癌細胞的不存在；腫瘤尺寸、腫瘤重量、腫瘤體積、腫瘤攜帶率的降低；腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制(即一定程度上的慢，優(yōu)選停止)；腫瘤生長在一定程度上的抑制；增加緩解時長和/或在某種程度上緩解與該特定癌癥相關(guān)的一個或多個癥狀；發(fā)病率和死亡率的降低；體重的增加，以及生活質(zhì)量問題的改善?！邦A(yù)防(prevention)”或“進行預(yù)防(preventing)”疾病或病癥是指預(yù)防(prophylactic)或預(yù)防(preventative)措施，其目的是預(yù)防或減緩(減輕)目標病理狀況或病癥。

如本文所用，術(shù)語“可變”是指在抗體之中可變區(qū)的某些片段在序列上廣泛地不同的事實。v結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合，并決定特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，可變性在可變區(qū)的整個氨基酸跨度上(acrosstheaminoacidspan)不是均勻分布的。相反，v區(qū)由相對不變的15-30個氨基酸的稱為框架區(qū)(fr)序列段組成，其被稱為“高變區(qū)”的長度為9-12個氨基酸的可變性極高的較短區(qū)域分隔開。天然重鏈和輕鏈的每個可變區(qū)都包含四個fr，這些fr主要采取β-片層結(jié)構(gòu)，通過三個高變區(qū)相互連接，這些高變區(qū)形成環(huán)，所述環(huán)連接所述β-片層結(jié)構(gòu)，在某些情況下形成所述β-片層結(jié)構(gòu)的部分。每個鏈中的高變區(qū)被fr緊密維系在一起，并且與來自另一個鏈的高變區(qū)一起對抗體的抗原結(jié)合位點的形成做出貢獻(參見kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1991))。恒定域不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但是顯示出各種效應(yīng)物功能，例如對抗體依賴細胞毒性(antibodydependentcellularcytotoxicity，adcc)的參與。

iii.組合物

trail受體結(jié)合劑。在一個方面，本技術(shù)提供了trail受體結(jié)合劑組合物(“結(jié)合劑”)。在一些實施方式中，本技術(shù)的結(jié)合劑是針對trail受體多肽、其同源物或衍生物的完整抗體。感興趣的結(jié)合劑可以是特異性結(jié)合trail-r2的結(jié)合劑，但不能“實質(zhì)地”(或“基本上”)結(jié)合其它trail受體如trail-r1、trail-r3或trail-r4。也就是說，感興趣的抗體可能不與其它trail受體如trail-r1、trail-r3或trail-r4顯著地交叉反應(yīng)。在這樣的實施方式中，如通過例如熒光活化的細胞分選(facs)分析、elisa、化學(xué)發(fā)光酶免疫測定(cleia)或放射免疫沉淀(ria)測定，本技術(shù)的結(jié)合劑與這些蛋白質(zhì)的結(jié)合程度將低于約10％，優(yōu)選地低于5％，低于1％。

對于本技術(shù)的結(jié)合劑，可以就其所識別或特異性結(jié)合的本技術(shù)的多肽的表位或部分，例如trail受體多肽的位于多肽表面的區(qū)域(例如親水性區(qū)域)，來對其進行描述或規(guī)定。在一個實施方式中，本技術(shù)提供trail-r2受體結(jié)合劑，例如針對trail-r2受體多肽(即目標多肽)的抗體或抗體相關(guān)多肽。所述結(jié)合劑在體內(nèi)和體外選擇性地誘導(dǎo)表達trail-r2的腫瘤細胞的凋亡。此外，當與一種或多種化學(xué)治療劑組合施用時，結(jié)合劑具有意想不到的和顯著的協(xié)同作用?；谄淇拱┗钚?，trail-r2結(jié)合劑可用作凋亡信號傳導(dǎo)研究的試劑，以及針對表達trail-r2受體的細胞的治療劑，其示例性地包括廣泛類型的癌細胞。

在一些實施方式中，本技術(shù)提供了表d中概述的trail受體結(jié)合劑。

在表d(上文)中總結(jié)的與trail受體結(jié)合劑相關(guān)的生物材料保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmcc)，中國微生物菌種保藏管理委員會，北京郵政信箱2714，10080，中華人民共和國。詳見下面的表e。

在另一個實施方式中，本技術(shù)提供了闡明trail-r2的表位的方法，其可用于通過結(jié)合trail-r2產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)抗體。被稱為trail受體2或trail-r2的tnf相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體2(uniprotkb/swiss-prot數(shù)據(jù)庫登錄號no.o14763)具有以下序列：針對trail-r2的結(jié)合劑可以具有不同的可變區(qū)或cdr區(qū)域，但具有本技術(shù)的結(jié)合劑的結(jié)合和功能特征。作為產(chǎn)生靶向抗體的手段，可以通過任何本領(lǐng)域公知的方法，包括，例如，kytedoolittle或hoppwoods方法，有或者沒有傅里葉變換(參見，例如hopp和woods，proc.nat.acad.sci.usa78:3824-3828(1981)；kyte和doolittle，j.mol.biol.157:105-142(1982))，來生成顯示親水性和疏水性區(qū)域的親水性分布圖。表位或多肽部分可以如本文所述，例如按照n-末端和c-末端位置、按照連續(xù)氨基酸殘基的大小，來具體指定。本技術(shù)包括特異性結(jié)合trail-r2受體的結(jié)合劑。

本技術(shù)的結(jié)合劑也可以基于它們的交叉反應(yīng)性來描述或具體指定。本技術(shù)包括不結(jié)合本技術(shù)的目標多肽的任何其他類似物、直系同源物(ortholog)或同源物的結(jié)合劑。不結(jié)合與本技術(shù)的多肽具有低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％以及低于50％的同一性(利用本領(lǐng)域已知的和在此描述的方法計算的)的多肽的結(jié)合劑也被包括在本技術(shù)內(nèi)。本技術(shù)進一步包括這樣的結(jié)合劑，其僅結(jié)合在嚴格雜交條件下(如在此描述的)與本技術(shù)的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽。本技術(shù)的結(jié)合劑也可以就它們的結(jié)合親和力來描述或具體指定。優(yōu)選的結(jié)合親和力包括具有低于5×10^-6m、10^-6m、5×10^-7m、10^-7m、5×10^-8m、10^-8m、5×10^-9m、10^-9m、5×10^-10m、10^-10m、5×10^-11m、10^-11m、5×10^-12m、10^-12m、5×10^-13m、10^-13m、5×10^-14m、10^-14m、5×10^-15m和10^-15m的離解常數(shù)或kd的那些結(jié)合親和力。在一些實施方式中，本技術(shù)提供結(jié)合人trail-r2的trail受體結(jié)合劑，其kd值不高于1×10^-8，優(yōu)選kd值不高于約1×10^-9。

本技術(shù)范圍內(nèi)的trail受體結(jié)合劑包括，例如但不限于，特異性結(jié)合目標多肽、其同源物、衍生物或片段的單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙價抗體，以及人類單克隆抗體和人類多克隆抗體。如本文所用，“trail受體樣多肽”是指不同于trail受體多肽但與本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑具有免疫反應(yīng)性的多肽。如本文所用，“trail受體樣多肽”是指不同于trail受體多肽但與本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑具有免疫反應(yīng)性的多肽。trail受體樣多肽可以來自與trail受體多肽相同的生物體或不同的生物體。trail受體樣多肽可以由與trail受體多肽相同的基因或不同的基因編碼?？捎米鞅炯夹g(shù)的結(jié)合劑的抗體包括，例如但不限于，igg(包括igg1、igg2、igg3和igg4)、iga(包括iga1和iga2)、igd、ige或igm，以及igy。

在另一個實施方式中，本技術(shù)的結(jié)合劑是針對trail受體多肽、其同源物或衍生物的抗體相關(guān)的多肽。一般地，結(jié)合劑的抗原結(jié)合區(qū)域，例如抗trail受體結(jié)合區(qū)域，是結(jié)合劑的結(jié)合特異性和親和力中最關(guān)鍵的。在一些實施方式中，trail受體結(jié)合劑是抗trail受體多肽抗體，例如抗trail受體多肽單克隆抗體、抗trail受體多肽嵌合抗體和抗trail受體多肽人源化抗體，它們已經(jīng)，例如，通過刪除、添加或替換抗體的一部分，而被修飾。例如，可以修飾抗trail受體多肽抗體以增加抗體的半衰期(例如血清半衰期)、穩(wěn)定性或親和力。

在一些實施方式中，通過產(chǎn)生雜交瘤來便利化對trail受體多肽(例如，trail-r2受體)的特定結(jié)構(gòu)域特異性的抗體的選擇，所述雜交瘤結(jié)合具有這種結(jié)構(gòu)域的trail受體多肽的片段。因而，在一些實施方式中，trail受體結(jié)合劑是對trail受體多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物內(nèi)期望的結(jié)構(gòu)域具有特異性的抗體。

本技術(shù)進一步包括針對本技術(shù)的結(jié)合劑的抗獨特型的抗體。本技術(shù)的結(jié)合劑可以是單特異性、雙特異性、三特異性或更多特異性的。多特異性結(jié)合劑可以特異于本技術(shù)的trail受體多肽的不同的表位，或可以既特異于本技術(shù)的trail受體多肽，又特異于異源組分(heterologouscompositions)，例如異源多肽或固相支持材料。參見，例如，wo93/17715；wo92/08802；wo91/00360；wo92/05793；tutt等人，j.immunol.147:60-69(1991)；美國專利no.5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648；6,106,835；kostelny等人，j.immunol.148:1547-1553(1992)。本技術(shù)的結(jié)合劑可以來自任何動物來源，包括鳥類和哺乳動物。在一些實施方式中，結(jié)合劑是人類、鼠、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的。

本技術(shù)的結(jié)合劑適合于在有需要的場合(例如，用于調(diào)節(jié)trail受體多肽功能)向受試者施用。因而，本技術(shù)的進一步的目的是提供trail受體結(jié)合劑組合物(compositions)，它們是trail受體調(diào)節(jié)物，例如trail受體多肽的功能拮抗劑或功能激動劑。本技術(shù)的目的還在于提供這樣的trail受體結(jié)合劑成分，它們是trail受體多肽的部分拮抗劑(partialantagonist)或部分激動劑(partialagonist)。同樣地，本技術(shù)包括結(jié)合trail受體多肽的抗trail受體中和抗體。在一些實施方式中，本技術(shù)的結(jié)合劑將純化至：(a)如lowry方法(lowry等人，j.biol.chem.193:265.1951)所測定的超過95％重量的抗體，最優(yōu)選大于99％重量；(2)達到通過使用旋轉(zhuǎn)杯測序儀足以獲得n-末端的或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)達到利用考馬斯藍或優(yōu)選的銀染色在還原或非還原條件下sds-page的均一。因為抗體的天然環(huán)境的至少一種成分將不會存在，所以分離的結(jié)合劑包括原位存在于重組細胞內(nèi)的多肽。然而通常地，trail受體結(jié)合劑，例如分離的抗trail受體抗體，將通過至少一個純化步驟來制備。

iv.組合治療

本技術(shù)的結(jié)合劑可以單獨使用或與其它組合物(compositions)或活性劑組合使用。本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑可以進一步在n-或c-末端重組地融合到異源多肽，或化學(xué)地綴合(包括共價和非共價地綴合)到多肽或其他組合物(compositions)或活性劑。例如，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑可以重組地融合或綴合到可在檢測分析中作為標記的分子和效應(yīng)分子，例如異源多肽、藥物或毒素。參見，例如，wo92/08495；wo91/14438；wo89/12624；美國專利no.5,314,995；和ep0396387。

在某些實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑是抗trail受體抗體或抗trail受體抗體相關(guān)多肽，它們偶聯(lián)或綴合到一種或多種治療性或細胞毒性模塊來產(chǎn)生trail受體結(jié)合劑綴合蛋白質(zhì)。本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑綴合蛋白質(zhì)可以用于修飾給定的生物應(yīng)答或產(chǎn)生生物應(yīng)答(例如，募集效應(yīng)物細胞)。治療性部分不應(yīng)被限于經(jīng)典的化學(xué)治療劑。例如，治療性部分可以是具有期望的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。這些蛋白質(zhì)可以包括，例如，酶活性毒素，或其活性片段，如相思豆毒蛋白、篦麻毒蛋白a、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子或干擾素-α；或生物應(yīng)答修飾物，例如，淋巴因子、白細胞介素-1(“il-1”)、白細胞介素-2(“il-2”)、白細胞介素-6(“il-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒細胞集落刺激因子(“g-csf”)、或其他生長因子。

在一些實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑(例如，具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體；具有重鏈cdr氨基酸序列syfih、wiypgnvntkysekfkg和geagyfd及輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava、wastrht和qqhyrtpw；具有如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列；huctb006抗體)與化學(xué)治療劑同時地、依序地或分別地施用于受試者。

本文提供了化學(xué)治療劑的示例性和非限制性列表。合適的化學(xué)治療藥物包括例如但不限于：長春花生物堿(vincaalkaloids)、破壞微管形成的藥劑(如秋水仙堿(colchicines)及其衍生物)、抗血管生成劑、治療性抗體、egfr靶向劑、酪氨酸激酶靶向劑(如酪氨酸激酶抑制劑)、過渡金屬絡(luò)合物、蛋白酶體抑制劑、抗代謝藥(如核苷類似物)、烷基化劑、鉑基試劑、蒽環(huán)類抗生素、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、大環(huán)內(nèi)酯類、治療性抗體、類視色素(如全反式維甲酸或其衍生物)；格爾德霉素或其衍生物(例如17-aag)和本領(lǐng)域公認的其它標準化學(xué)治療劑。

在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑包括阿霉素(adriamycin)、秋水仙堿(colchicine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、放線菌素(actinomycin)、博來霉素(bleomycin)、正定霉素(duanorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、絲裂霉素(mitomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine，bcnu)、甲基-ccnu、順鉑(cisplatin)、依托泊苷(etoposide)、干擾素(interferons)、喜樹堿(camptothecin)及其衍生物、苯芥膽甾醇(phenesterine)、紫杉烷(taxanes)及其衍生物(例如，紫杉醇(taxol)、紫杉醇(paclitaxel)及其衍生物，泰索帝(taxotere)及其衍生物等)、托泊替康(topetecan)、長春花堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、他莫昔芬(tamoxifen)、白消安(piposulfan)、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康(irinotecan)、hkp、沃塔紫杉醇(ortataxel)、吉西他濱(gemcitabine)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、長春瑞濱(vinorelbine)、卡培他濱(capecitabine)、非格司亭拉帕替尼(lapatinib)、索拉非尼(sorafenib)、厄洛替尼(erlotinib)、愛必妥(erbitux)、其衍生物、本領(lǐng)域已知的化學(xué)治療劑等。在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是包含含有硫代秋水仙堿(thiocolchicine)衍生物和載體蛋白(如白蛋白)的納米顆粒的組合物。

在一些實施方式中，所述化學(xué)治療劑是抗腫瘤劑，包括但不限于卡鉑、(navelbine)(長春瑞濱(vinorelbine))、蒽環(huán)霉素(anthracycline)拉帕替尼(gw57016)、吉西他濱卡培他濱順鉑、5-氟尿嘧啶(5-fu)、表柔比星、環(huán)磷酰胺、等。

本文中涉及的化學(xué)治療劑適用于化學(xué)治療劑或其衍生物，因此本技術(shù)包括這些實施例(試劑；試劑或衍生物)中的任一個?；瘜W(xué)治療劑或其他化學(xué)部分的“衍生物”或“類似物”包括但不限于在結(jié)構(gòu)上類似于化學(xué)治療劑或部分或與化學(xué)治療劑或部分在相同的一般化學(xué)類別里的化合物。在一些實施方式中，化學(xué)治療劑或部分的衍生物或類似物保留與化學(xué)治療劑或部分類似的化學(xué)和/或物理性質(zhì)(包括例如功能性)。

v.制備trail受體結(jié)合劑及其組合物的方法

一般概述。首先，選擇可以引出(raise)本技術(shù)的結(jié)合劑(例如抗trail受體抗體)的目標多肽。用于產(chǎn)生靶向目標多肽的結(jié)合劑的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這樣的技術(shù)的實例包括，例如但不限于，涉及展示庫、人體抗體轉(zhuǎn)基因或人單抗轉(zhuǎn)基因小鼠(xenoorhumabmice)、雜交瘤等等的技術(shù)。在本技術(shù)范圍內(nèi)的目標多肽包括能顯示抗原性的任何多肽或多肽衍生物。實例包括但不限于，蛋白質(zhì)(例如，受體、酶、激素、生長因子)、肽、糖蛋白、脂蛋白、trail受體多肽等等。示范性的目標多肽還包括引起人類疾病的細菌、真菌和病毒病原體，例如hiv、肝炎(甲型、乙型和丙型)、流感、皰疹、賈第鞭毛蟲、瘧疾、利什曼蟲(leishmania)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)。其他目標多肽是表達水平或組成與人類疾病或其他表型相關(guān)的人類蛋白質(zhì)。感興趣的其他目標多肽包括腫瘤細胞抗原和病毒顆?？乖?。

要理解的是，不僅天然存在的抗體適合作為結(jié)合劑根據(jù)本文的公開來使用，重組工程化的抗體和抗體片段，例如，針對trail受體多肽的抗體相關(guān)的多肽也是適合的。

可以適用于本文所述技術(shù)的結(jié)合劑，例如抗trail受體抗體，包括單克隆和多克隆抗體，以及抗體片段如fab、fab'、f(ab')2、fd、scfv、雙價抗體、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或抗體片段。已經(jīng)描述了可用于高產(chǎn)量產(chǎn)生含抗體fv的多肽(例如fab'和f(ab')2抗體片段)的方法。參見美國專利no.5,648,237。

一般地，結(jié)合劑從來源物種獲得。更特別地，獲得了對目標多肽抗原具有特異性的來源物種抗體的輕鏈、重鏈或兩者的可變部分的核酸或氨基酸序列。來源物種是任何對于產(chǎn)生本技術(shù)的結(jié)合劑或結(jié)合劑的庫有用的物種，例如大鼠、小鼠、兔、雞、猴、人類等等。

在一些實施方式中，trail受體結(jié)合劑是抗trail受體抗體。噬菌體或噬菌粒展示技術(shù)是得到本技術(shù)的結(jié)合劑的有用的技術(shù)。在本技術(shù)中有用的抗trail受體抗體是“人類抗體”(例如，分離自人類的抗體)或“人類序列抗體”。人類抗體可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法包括噬菌體展示方法來產(chǎn)生。也參見，美國專利no.4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；以及wo98/46645、wo98/50433、wo98/24893、wo98/16654、wo96/34096、wo96/33735和wo91/10741。已經(jīng)描述了通過篩選多聚噬菌體(polyphage)顆粒來鑒定編碼多聚體多肽復(fù)合物中的成員的核酸序列的方法。rudert等人，美國專利6,667,150。另外，可以產(chǎn)生重組免疫球蛋白。cabilly，美國專利4,816,567；cabilly等人，u.s.6,331,415和queen等人，proc.nat'lacad.sci.usa86:10029-10033，1989。產(chǎn)生和克隆單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑優(yōu)選具有高免疫反應(yīng)性，也就是正確折疊從而能特異性結(jié)合目標抗原的抗體分子的百分比。結(jié)合劑(例如本技術(shù)的抗體)的編碼序列的表達，可以如下所述在大腸桿菌中進行。這樣的表達通常產(chǎn)生至少80％、90％、95％或99％的免疫反應(yīng)性。

這些蛋白質(zhì)或基因的特定截短物能行使完整序列蛋白質(zhì)或基因的調(diào)節(jié)功能或酶功能。例如，可以通過能提供功能上等同的蛋白質(zhì)或基因的替換、添加、刪除或多聚體表達來改變編碼它們的核酸序列。由于核酸編碼序列的簡并性，編碼與天然存在的蛋白質(zhì)的序列基本上相同的氨基酸序列的其他序列可以在本技術(shù)的實踐中使用。這些序列包括但不限于：包括編碼上述多肽的核酸序列的全部或部分的核酸序列，這樣的核酸序列的改變是通過用編碼序列內(nèi)的功能等同氨基酸殘基的不同密碼子進行替換，由此產(chǎn)生沉默改變(silentchange)。要理解的是，按照通過標準方法("currentmethodsinsequencecomparisonandanalysis,"macromoleculesequencingandsynthesis，selectedmethodsandapplications，pp.127-149，1998，alanr.liss，inc.)所計算，根據(jù)本技術(shù)的免疫球蛋白的核苷酸序列可以容忍最多達25％的序列同源性變異，只要這種變體形成識別trail-r1和trail-r2的可操作的抗體。例如，多肽序列內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基可以被作為功能等同物的、具有類似極性的其他氨基酸替換，從而產(chǎn)生沉默的改變。序列內(nèi)氨基酸的替換物可以從被替換的氨基酸所屬的類別的其他成員中選擇。例如，非極性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性的中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電的(堿性的)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本技術(shù)的范圍還包括在翻譯期間或之后被差異地修飾，例如通過糖基化、蛋白酶切割、與抗體分子或其他細胞配體連接等方式進行修飾的蛋白質(zhì)或其片段或衍生物。另外，可以對抑制劑的編碼核酸序列進行體外或體內(nèi)突變來產(chǎn)生和/或破壞翻譯、起始和/或終止序列，或在編碼區(qū)域中產(chǎn)生變化，和/或形成新的限制性內(nèi)切酶位點，或破壞先前存在的限制性內(nèi)切酶位點，來促進進一步的體外修飾。可以使用本領(lǐng)域已知的用于誘變的任何技術(shù)，包括但不限于體外定點誘變，j.biol.chem.253:6551，tab接頭(pharmacia)的使用等等。

多克隆抗血清和免疫原的制備。產(chǎn)生本技術(shù)的抗體或抗體片段的方法一般包括用純化的trail受體多肽或用表達trail受體多肽的細胞免疫受試者(一般是非人類受試者，例如小鼠或兔)。trail受體多肽的任何免疫原性部分都可以被采用作為免疫原。合適的免疫原性制備物可以含有，例如，重組表達的trail受體多肽或化學(xué)合成的trail受體多肽?？梢允褂梅蛛x的trail受體多肽或其部分或片段作免疫原，利用多克隆和單克隆抗體制備的標準技術(shù)來產(chǎn)生結(jié)合trail受體多肽或其部分或片段的trail受體結(jié)合劑。可以使用全長trail受體多肽，或者作為另外一種選擇，本技術(shù)提供了trail受體多肽片段作為免疫原的用途。trail受體多肽包含如seqidno:17所示氨基酸序列的至少四個氨基酸殘基，并包括trail受體多肽的表位，從而針對所述肽產(chǎn)生的抗體與所述trail受體多肽形成特異性免疫復(fù)合物。優(yōu)選地，抗原肽包含至少5、8、10、15、20或30個氨基酸殘基。取決于用途并根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，更長的抗原肽有時比較短的抗原肽是更優(yōu)選的。一般地，免疫原將是長度至少約8個氨基酰殘基，優(yōu)選長度至少約10個?；鶜埢＝o定表位的多聚體有時比單體更有效。

如果需要，trail受體多肽(或其片段)的免疫原性可以通過融合于或綴合于半抗原，例如鑰孔血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin，klh)或卵清蛋白(ovalbumin，ova)來提高。許多這類半抗原是本領(lǐng)域已知的。人們也可以組合trail受體多肽和常規(guī)的佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑來提高受試者對所述多肽的免疫反應(yīng)。用于提高免疫反應(yīng)的各種佐劑包括，但不限于弗氏(完全和不完全的)、礦物質(zhì)凝膠(例如，氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)(例如，溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、二硝基苯酚等等)、人類佐劑例如卡介苗和短小棒狀桿菌(corynebacteriumparvum)，或相似的免疫刺激性化合物。這些技術(shù)是本領(lǐng)域標準的。

為了方便起見，在本技術(shù)中免疫應(yīng)答常常被描述為“初次”或“二次”免疫應(yīng)答。初次免疫應(yīng)答，其也被描述為“保護性”免疫應(yīng)答，是指作為對于特定抗原(例如trail受體多肽)的某種初次暴露(例如初次“免疫”)的結(jié)果，在個體中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。這種免疫可以，例如，作為對抗原(例如，來自某些展現(xiàn)或呈遞該抗原的病原體的初次感染)的某種天然的暴露的結(jié)果而發(fā)生，也可以來自個體中某些腫瘤(例如惡性黑色素瘤)的癌細胞所呈遞的抗原。另外一種方式，免疫的發(fā)生可以是用含有抗原的疫苗接種個體的結(jié)果。例如，疫苗可以是包含來自trail受體多肽或trail受體樣多肽的一種或多種抗原的trail受體疫苗。

初次免疫應(yīng)答可以隨著時間減弱或衰減，甚至可以消失或至少變得太衰弱而不能被檢測。因而，本技術(shù)還涉及“二次”免疫反應(yīng)，其在此還被描述為“記憶免疫反應(yīng)”。術(shù)語二次免疫反應(yīng)是指在已經(jīng)產(chǎn)生初次免疫應(yīng)答之后在個體中引發(fā)的免疫反應(yīng)。

因而，可以引發(fā)二次或免疫應(yīng)答，例如，來增強已經(jīng)變得減弱或衰減的現(xiàn)有免疫應(yīng)答，或來重建消失的或不能再被檢測的早先的免疫應(yīng)答。作為實例而不是為了限制，二次免疫應(yīng)答可以通過向個體重新導(dǎo)入(例如，通過重新施用疫苗)引發(fā)初次免疫應(yīng)答的抗原，例如trail受體多肽或trail受體樣多肽，來引發(fā)。然而，針對抗原的二次免疫應(yīng)答也可以通過施用不含有實際的抗原的其他試劑來引發(fā)。例如，本技術(shù)提供了通過向個體施用trail受體結(jié)合劑來強化二次免疫應(yīng)答的方法。在這樣的方法中，實際的抗原不必與trail受體結(jié)合劑一起施用，含有trail受體結(jié)合劑的組合物不必含有抗原。二次或記憶免疫應(yīng)答可以是體液(抗體)應(yīng)答或細胞應(yīng)答。二次或記憶體液應(yīng)答在抗原的初次呈遞時產(chǎn)生的記憶b細胞受到刺激時發(fā)生。延遲型超敏反應(yīng)(delayedtypehypersensitivity，dth)反應(yīng)是一種細胞的二次或記憶免疫應(yīng)答，其由cd4⁺細胞介導(dǎo)。對于抗原的第一次暴露致敏免疫系統(tǒng)，附加的暴露引起dth。

在合適的免疫之后，可以從受試者的血清制備trail受體結(jié)合劑，例如，抗trail受體多克隆抗體。如果需要，可以從哺乳動物(例如，從血液)分離針對trail受體多肽的抗體分子，并進一步通過公知的技術(shù)，例如多肽a層析來進一步純化，以獲得igg收份。

單克隆抗體。在本技術(shù)的一個實施方式中，所述結(jié)合劑是抗trail受體單克隆抗體。在本技術(shù)的一個實施方式中，所述抗trail受體單克隆抗體是人類抗trail受體單克隆抗體。對于針對特定的trail受體多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物的單克隆抗體的制備，可以利用任何通過連續(xù)細胞系培養(yǎng)來提供抗體分子的產(chǎn)生的技術(shù)。這些技術(shù)包括，但不限于雜交瘤技術(shù)(參見，例如kohler和milstein，1975，nature256:495-497)；三源雜交瘤(trioma)技術(shù)；人類b細胞雜交瘤技術(shù)(參見，例如kozbor等人，1983.immunol.today4:72)和ebv雜交瘤技術(shù)，來產(chǎn)生人類單克隆抗體(參見，例如cole等人，1985.monoclonalantibodiesandcancertherapy，alanr.liss，inc.，pp.77-96)。人類單克隆抗體可以在本技術(shù)的實踐中利用，可以通過使用人類雜交瘤(參見例如cote等人，1983.procnatlacadsciusa80:2026-2030)或通過用eb(epsteinbarr)病毒體外轉(zhuǎn)化人類b細胞(參見例如cole等人，1985.monoclonalantibodiesandcancertherapy，alanr.liss，inc.，pp.77-96)來產(chǎn)生。例如，可以分離編碼抗體的區(qū)域的核酸的群體。使用源自編碼抗體保守區(qū)域的序列的引物進行pcr，用于從群體擴增編碼抗體部分的序列，然后從擴增的序列重建編碼抗體或其片段(例如可變結(jié)構(gòu)域)的dna。這樣的擴增序列還可以與編碼其它蛋白質(zhì)的dna(例如噬菌體外殼，或細菌細胞表面蛋白)融合，用于在噬菌體或細菌上表達和展示融合多肽。然后可以將擴增的序列加以表達，并根據(jù)，例如，所表達的抗體或其片段對trail受體多肽上呈現(xiàn)的抗原或表位的親和力來加以進一步選擇或分離。另外一種方式，表達抗trail受體單克隆抗體的雜交瘤可以通過免疫受試者，然后使用常規(guī)方法從受試者的脾臟分離雜交瘤來制備。參見，例如milstein等人(galfre和milstein，methodsenzymol(1981)73：3-46)。利用標準方法篩選雜交瘤將產(chǎn)生具有不同的特異性(即針對不同的表位)和親和力的單克隆抗體。具有期望的性質(zhì)(例如trail受體結(jié)合)的選定的單克隆抗體可以如雜交瘤所表達的來使用，可以將它結(jié)合到聚乙二醇(peg)等分子來改變它的性質(zhì)，或可以分離編碼它的cdna，對其加以測序并以各種方式操作?？梢韵蚝铣傻臉湫腕w(dendromeric)樹添加反應(yīng)性的氨基酸側(cè)鏈，例如賴氨酸，來增強trail受體多肽的免疫原性性質(zhì)。并且，cpg二核苷酸技術(shù)可以用于增強trail受體多肽的免疫原性性質(zhì)。其他操作包括替換或刪除對于保存期間或在向受試者施用之后的抗體不穩(wěn)定性有貢獻的特定氨基?；鶜埢约坝H和成熟技術(shù)來改善trail受體多肽的抗體的親和力。

雜交瘤技術(shù)。在一個實施方式中，本技術(shù)的結(jié)合劑是通過雜交瘤產(chǎn)生的抗trail受體單克隆抗體，所述雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的，具有包含人類重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，融合到永生細胞的b細胞。雜交瘤技術(shù)包括本領(lǐng)域已知的那些技術(shù)，和在harlow等人，antibodies:alaboratorymanualcoldspringharborlaboratory，coldspringharbor，ny，349(1988)；hammerling等人，monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas，563-681(1981)中所教導(dǎo)的。其他產(chǎn)生雜交瘤和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

噬菌體展示技術(shù)。如上所述，本技術(shù)的結(jié)合劑可以通過應(yīng)用重組dna和噬菌體展示技術(shù)來產(chǎn)生。例如，本技術(shù)的結(jié)合劑，例如，抗trail受體抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法來制備。在噬菌體展示方法中，功能性抗體結(jié)構(gòu)域被展示在噬菌體顆粒的表面，噬菌體顆粒攜帶編碼它們的多核苷酸序列。通過直接用抗原(一般是結(jié)合或被捕獲到固體表面或顆粒上的抗原)進行選擇，可以從抗體庫或組合抗體庫(例如，人類或鼠的)選擇具有希望的結(jié)合性質(zhì)的噬菌體。這些方法中使用的噬菌體一般是絲狀噬菌體，包括fd和m13，且fab、fv或二硫化鍵穩(wěn)定化的fv抗體結(jié)構(gòu)域重組融合于噬菌體基因iii或基因viii蛋白質(zhì)。此外，方法可以加以調(diào)適以用于構(gòu)建fab表達庫(參見，例如huse等人，science,246:1275-1281,1989)來容許快速而有效地鑒定對trail受體多肽(例如，多肽或其衍生物、片段、類似物或同源物)具有期望的特異性的單克隆fab片段?？梢杂脕懋a(chǎn)生本技術(shù)的結(jié)合劑的噬菌體展示方法的其他實例包括在huston等人，proc.natl.acad.sciu.s.a.，85:5879-5883，1988；chaudhary等人，proc.natl.acad.sciu.s.a.，87:1066-1070，1990；brinkman等人，j.immunol.methods182:41-50，1995；ames等人，j.immunol.methods184:177-186，1995；kettleborough等人，eur.j.immunol.24:952-958，1994；persic等人，gene187:9-18，1997；burton等人，advancesinimmunology57:191-280，1994；pct/gb91/01134；wo90/02809；wo91/10737；wo92/01047；wo92/18619；wo93/11236；wo95/15982；wo95/20401；wo96/06213；wo92/01047(medicalresearchcouncil等人)；wo97/08320(morphosys)；wo92/01047(cat/mrc)；wo91/17271(affymax)；和美國專利no.5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727和5,733,743中公開的那些。通過用二硫鍵連接多肽而在噬菌體顆粒的表面上展示多肽的方法已經(jīng)在lohning，美國專利no.6,753,136中有所描述。如在上述參考文獻中描述的，在噬菌體選擇之后，可以從噬菌體分離抗體編碼區(qū)并用于產(chǎn)生完整的抗體，包括人類抗體，或任何其他期望的抗原結(jié)合片段，并在任何期望的宿主包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌中表達。例如，也可以利用重組產(chǎn)生fab、fab'和f(ab')2片段的技術(shù)，這些技術(shù)利用本領(lǐng)域已知的方法，例如在wo92/22324；mullinax等人，biotechniques12:864-869，1992；和sawai等人，ajri34:26-34，1995；和better等人，science240:1041-1043，1988中公開的那些。

一般地，為了鑒定出維持了良好的結(jié)合活性的變體，可以將克隆到展示載體中的雜交抗體或雜交抗體片段針對合適的抗原來進行選擇，因為抗體或抗體片段將存在于噬菌體或噬菌粒顆粒的表面上。參見，例如，barbasiii等人，phagedisplay,alaboratorymanual(coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，2001)。然而，這個過程可以使用其他載體模式，例如，將抗體片段文庫克隆到裂解性噬菌體載體(修飾的t7或lambdazap系統(tǒng))中用于選擇和/或篩選。

重組的trail受體結(jié)合劑的表達。如上所述，本技術(shù)的結(jié)合劑可以通過重組dna技術(shù)的應(yīng)用來產(chǎn)生。編碼本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑的重組多核苷酸構(gòu)建體一般包括與抗trail受體抗體鏈的編碼序列可操作地連接的表達控制序列，包括天然相關(guān)的或異源的啟動子區(qū)域。因而，本技術(shù)的另一個方面包括含有一個或多個編碼本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑的核酸序列的載體。對于本技術(shù)的一種或多種多肽的重組表達，通過本領(lǐng)域公知的重組dna技術(shù)，并如以下詳述的，將含有編碼trail受體結(jié)合劑的核苷酸序列的全部或一部分的核酸插入合適的克隆載體或表達載體(即含有用于轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入的多肽編碼序列的必需元件的載體)中。產(chǎn)生多樣性的載體群體的方法已經(jīng)由lerner等人，美國專利no.6,291,160；6,680,192描述了。

一般地，在重組dna技術(shù)中有用的表達載體通常是質(zhì)粒的形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換地使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本技術(shù)意圖包括行使等同功能的，從技術(shù)上說不屬質(zhì)粒的其他形式的表達載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。這種病毒載體可用于感染受試者和在受試者中表達化合物。優(yōu)選地，表達控制序列是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統(tǒng)。一旦載體被并入到合適的宿主中，宿主維持在適合于編碼trail受體結(jié)合劑的核苷酸序列的高水平表達，以及trail受體結(jié)合劑(例如交叉反應(yīng)性抗trail受體抗體)的收集和純化的條件下。參見，一般地，美國申請no.20020199213。這些表達載體一般能夠在宿主生物體中作為游離體或作為宿主染色體dna的組成部分進行復(fù)制。通常，表達載體含有選擇標記物，例如，氨芐青霉素抗性或潮霉素抗性，以允許檢測被期望的dna序列轉(zhuǎn)化了的那些細胞。載體還可以編碼對于指導(dǎo)細胞外抗體片段的分泌有用的信號肽，例如果膠酸裂合酶。參見美國專利no.5,576,195。

本技術(shù)的重組表達載體包含編碼具有trail受體結(jié)合性質(zhì)的化合物的核酸，該核酸處于適合于該核酸在宿主細胞中表達的形式，這意味著所述重組表達載體包括一種或多種基于表達用宿主細胞而被選擇的，與要表達的核酸序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列。在重組表達載體內(nèi)，“可操作連接的”意指感興趣的核苷酸序列以允許所述核苷酸序列表達的方式與調(diào)節(jié)序列連接(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或者，當載體導(dǎo)入宿主細胞中時，在宿主細胞中)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”意圖包括啟動子、增強子和其他表達控制元件(例如，多聚腺苷酸信號)。例如，在goeddel，geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185，academicpress，sandiego，calif.(1990)中描述了這些調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列包括那些在許多種類的宿主細胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達的調(diào)節(jié)序列，和那些僅在某些宿主細胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達的調(diào)節(jié)序列(例如，組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的是，表達載體的設(shè)計可能取決于一些因素，例如要轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇，希望的多肽表達水平等等。作為重組多肽(例如，trail受體結(jié)合劑)表達的啟動子有用的典型的調(diào)節(jié)序列包括，例如但不限于3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。誘導(dǎo)型的酵母啟動子包括，尤其是，來自乙醇脫氫酶、異細胞色素c和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。在一個實施方式中，編碼本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑的多核苷酸與arab啟動子可操作地連接，并可以在宿主細胞中表達。參見美國專利no.5,028,530。本技術(shù)的表達載體可以被導(dǎo)入宿主細胞，從而產(chǎn)生多肽或肽，包括由在此描述的核酸編碼的融合多肽(例如，trail受體結(jié)合劑等等)。

本技術(shù)的另一個方面涉及表達trail受體結(jié)合劑的宿主細胞，其含有編碼一種或多種trail受體結(jié)合劑的核酸。本技術(shù)的重組表達載體可以被設(shè)計用于trail受體結(jié)合劑在原核或真核細胞中的表達。例如，trail受體結(jié)合劑可以在細菌細胞例如大腸桿菌，昆蟲細胞(利用桿狀病毒表達載體)，真菌細胞例如酵母、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。在goeddel，geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185，academicpress，sandiego，calif.(1990)中進一步討論了適合的宿主細胞。另外一種選擇，重組表達載體可以體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如，使用t7啟動子調(diào)節(jié)序列和t7聚合酶。已經(jīng)描述了通過隨機地產(chǎn)生的多核苷酸序列的表達，對制備篩選具有預(yù)定性質(zhì)的多肽(例如trail受體結(jié)合劑)有用的方法。參見美國專利no.5,763,192、5,723,323、5,814,476、5,817,483、5,824,514、5,976,862、6,492,107、6,569,641。

原核生物中的多肽表達最常見地在帶有載體的大腸桿菌中進行，所述載體含有指導(dǎo)融合或非融合多肽表達的組成型或可誘導(dǎo)啟動子。融合載體向其中編碼的多肽添加許多氨基酸，通常添加到重組多肽的氨基末端。這些融合載體一般服務(wù)于三個目的：(i)提高重組多肽的表達，(ii)提高重組多肽的溶解度，以及(iii)通過作為親和純化中的配體來幫助重組多肽的純化。通常，在融合物表達載體中，將蛋白酶水解位點添加到融合模塊和重組多肽的連接處，以允許在融合多肽的純化之后從融合模塊分離重組多肽。這些酶和它們的同源識別序列包括因子xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pgex(pharmaciabiotechinc；smithandjohnson，1988.gene67:31-40)、pmal(newenglandbiolabs，beverly，mass.)和prit5(pharmacia，piscataway，n.j.)，其分別將谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(glutathiones-transferase，gst)、麥芽糖e結(jié)合多肽或多肽a融合到目標重組多肽。

適合的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達載體的實例包括ptrc(amrann等人，(1988)gene69:301-315)和pet11d(studier等人，geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185，academicpress，sandiego，calif.(1990)60-89)。通過多肽融合來靶向組裝具有不同活性的肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生多功能多肽的方法已經(jīng)由pack等人，美國專利no.6,294,353；6,692,935所描述。一種使大腸桿菌中的重組多肽(例如trail受體結(jié)合劑)的表達最大化的策略是在蛋白水解該重組多肽的能力受損的宿主細菌中表達該重組多肽。參見，例如，gottesman，geneexpressiontechnology：methodsinenzymology185，academicpress，sandiego，calif.(1990)119-128。另一個策略是改變要插入表達載體中的核酸的核酸序列，從而每個氨基酸的各自密碼子是在表達宿主(例如大腸桿菌)中優(yōu)先被利用的密碼子(參見，例如，wada等人，1992.nucl.acidsres.20:2111-2118)。本技術(shù)的這種核酸序列的改變可以通過標準的dna合成技術(shù)來進行。

在另一個實施方式中，trail受體結(jié)合劑表達載體是酵母表達載體。用在酵母釀酒酵母i(saccharomycescerivisae)中表達的載體的實例包括pyepsec1(baldari等人，1987.emboj.6:229-234)、pmfa(kurjan和herskowitz，cell30:933-943，1982)、pjry88(schultz等人，gene54:113-123，1987)、pyes2(invitrogencorporation，sandiego，calif.)和picz(invitrogencorp，sandiego，calif.)。另外一種選擇，trail受體結(jié)合劑可以使用桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細胞(例如，sf9細胞)中表達多肽(例如trail受體結(jié)合劑)的桿狀病毒載體包括pac系列(smith等人，mol.cell.biol.3:2156-2165，1983)和pvl系列(lucklowandsummers，1989.virology170:31-39)。

在又一個實施方式中，編碼本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑的核酸使用哺乳動物表達載體在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達載體的實例包括但不限于，pcdm8(seed,.nature329:840，1987)和pmt2pc(kaufman等人，emboj.6:187-195，1987)。當在哺乳動物細胞中使用時，通常由病毒調(diào)節(jié)元件來提供表達載體的控制功能。例如，常用的啟動子來源于多瘤病毒(polyoma)、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40。對于本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑的表達有用的原核和真核細胞的其他適合的表達系統(tǒng)。參見，例如，sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual2nded.，coldspringharborlaboratory，第16和17章，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1989。

在另一個實施方式中，重組哺乳動物表達載體能夠指導(dǎo)核酸優(yōu)先地在特定細胞類型中表達(例如，使用組織特異性調(diào)節(jié)元件來表達核酸)。組織特異性調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域已知的。適合的組織特異性啟動子的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝臟特異；pinkert等人，genesdev.1:268-277，1987)、淋巴特異啟動子(calame和eaton，adv.immunol.43:235-275，1988)、特別是t細胞受體的啟動子(winoto和baltimore，emboj.8:729-733，1989)和免疫球蛋白的啟動子(banerji等人，1983.cell33:729-740；queen和baltimore，cell33:741-748，1983.)、神經(jīng)元特異啟動子(例如，神經(jīng)絲啟動子；byrne和ruddle，proc.natl.acad.sci.usa86:5473-5477，1989)、胰腺特異啟動子(edlund等人，1985.science230:912-916)，和乳腺特異啟動子(例如，乳清啟動子；美國專利no.4,873,316和歐洲申請公開264,166)。還包括發(fā)育性調(diào)節(jié)的啟動子，例如鼠hox啟動子(kessel和gruss，science249:374-379，1990)和甲胎蛋白啟動子(campes和tilghman,.genesdev.3:537-546，1989)。

本技術(shù)進一步提供重組表達載體，其包含以反義方向克隆到表達載體中的本技術(shù)的編碼trail受體結(jié)合劑的dna分子。也就是說，dna分子以這樣的方式與調(diào)節(jié)序列可操作地連接，從而能夠表達(通過dna分子的轉(zhuǎn)錄)trail受體結(jié)合劑mrna的反義rna分子。至于與按反義方向克隆的核酸可操作連接的調(diào)節(jié)序列，可以在各種細胞類型中選擇指導(dǎo)反義rna分子的連續(xù)表達的調(diào)節(jié)序列，例如病毒啟動子和/或增強子，或可以選擇指導(dǎo)反義rna的組成型、組織特異性或細胞類型特異性表達的調(diào)節(jié)序列。反義表達載體可以是重組質(zhì)粒、噬菌粒或減毒病毒的形式，其中反義核酸在高效調(diào)節(jié)區(qū)域的控制下產(chǎn)生，其活性可通過導(dǎo)入了該載體的細胞類型來測定。對于利用反義基因調(diào)節(jié)基因表達的論述。參見，例如，weintraub等人，"antisensernaasamoleculartoolforgeneticanalysis,"reviews-trendsingenetics，vol.1(1)1986。

本技術(shù)的另一個方面涉及其中導(dǎo)入了本技術(shù)的重組表達載體的宿主細胞。術(shù)語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在此可互換地使用。要理解的是，該術(shù)語不僅僅指特定的受試細胞，而且指這種細胞的子代或可能的子代。由于在后代中可能因突變或環(huán)境影響而出現(xiàn)某些改變，這種子代實際上可能不與母細胞完全相同，但仍然包括在此處使用的該術(shù)語的范圍內(nèi)。

宿主細胞可以是任何原核或真核細胞。例如，trail受體結(jié)合劑可以在細菌細胞例如大腸桿菌、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞中表達。哺乳動物細胞是用于表達編碼免疫球蛋白或其片段的核苷酸區(qū)段的優(yōu)選的宿主。參見winnacker，fromgenestoclones，(vchpublishers，ny，1987)。本領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)了一些能夠分泌完整的異源蛋白質(zhì)的許多適合的宿主細胞系，包括中國倉鼠卵巢(chinesehamsterovary，cho)細胞系、各種cos細胞系、hela細胞、l細胞和骨髓瘤細胞系。優(yōu)選地，所述細胞是非人類的。這些細胞的表達載體可以包括表達控制序列，例如復(fù)制起點、啟動子、增強子和必需的加工信息位點，例如核糖體結(jié)合位點、rna剪接位點、多聚腺苷酸位點和轉(zhuǎn)錄終止子序列。queen等人，immunol.rev.89:49，1986。優(yōu)選的表達控制序列是來自內(nèi)源的基因、巨細胞病毒、sv40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒等等的啟動子。co等人，jimmunol.148:1149，1992。其他適合的宿主細胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體dna導(dǎo)入到原核或真核細胞中。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意指各種本領(lǐng)域已知的用于將外源核酸(例如dna)導(dǎo)入宿主細胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、deae-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔、基因槍(biolistics)或基于病毒的轉(zhuǎn)染可以用于其他細胞宿主。用于轉(zhuǎn)化哺乳動物的其他方法包括使用聚凝胺(polybrene)、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、電穿孔和顯微注射(一般參見，sambrook等人，molecularcloning)。可以在sambrook等人(molecularcloning:alaboratorymanual.2nded.，coldspringharborlaboratory，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1989)和其他實驗手冊中找到轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的適合的方法。根據(jù)細胞宿主的種類，含有感興趣的dna片段的載體可以通過公知的方法轉(zhuǎn)移到宿主細胞中。

對于哺乳動物細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知的是，取決于使用的表達載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅小部分細胞可能將外源dna整合到它們的基因組中。為了鑒定和選擇這些整合體，一般將編碼選擇標記(例如，抗生素抗性)的基因與感興趣的基因一起導(dǎo)入宿主細胞。各種選擇標記包括提供對藥物，例如g418、潮霉素和氨甲蝶呤的抗性的那些選擇標記。編碼選擇標記的核酸可以在編碼trail受體結(jié)合劑的相同載體上導(dǎo)入宿主細胞，或可以在單獨的載體上導(dǎo)入?？梢酝ㄟ^藥物選擇來鑒定導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞(例如，納入了選擇標記基因的細胞將生存，而其他細胞將死亡)。

包括本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑的宿主細胞，例如培養(yǎng)中的原核或真核宿主細胞，可以用于生產(chǎn)(即表達)重組trail受體結(jié)合劑。在一個實施方式中，所述方法包括在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞(其中已經(jīng)導(dǎo)入了編碼trail受體結(jié)合劑的重組表達載體)，從而產(chǎn)生trail受體結(jié)合劑。在另一個實施方式中，所述方法進一步包括從培養(yǎng)基或宿主細胞分離trail受體結(jié)合劑的步驟。一旦被表達，從培養(yǎng)基和宿主細胞中純化trail受體結(jié)合劑(例如抗trail受體抗體或抗trail受體抗體相關(guān)多肽)的收集物(collections)。trail受體結(jié)合劑可以根據(jù)本領(lǐng)域的標準方法來純化，包括hplc純化、柱層析、凝膠電泳等等。在一個實施方式中，trail受體結(jié)合劑通過boss等人，美國專利no.4,816,397的方法在宿主生物體中產(chǎn)生。通常，抗trail受體抗體鏈與信號序列一起表達，因而被釋放到培養(yǎng)基中。然而，如果宿主細胞天然地不分泌抗trail受體抗體鏈，可以通過用溫和洗滌劑處理來釋放抗trail受體抗體鏈。重組多肽的純化是本領(lǐng)域公知的，包括硫酸銨沉淀、親和層析純化技術(shù)、柱層析、離子交換純化技術(shù)、凝膠電泳等等(一般參見scopes，proteinpurification，springer-verlag，n.y.，1982)。

編碼trail受體結(jié)合劑的多核苷酸，例如抗trail受體抗體編碼序列，可以并入轉(zhuǎn)基因中，用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因動物的基因組，隨后在該轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中表達。參見，例如，美國專利no.5,741,957、5,304,489和5,849,992。適合的轉(zhuǎn)基因包括與來自乳腺的特異基因，例如酪蛋白或β-乳球蛋白的啟動子和增強子可操作連接的輕鏈和/或重鏈的編碼序列。為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，可以將轉(zhuǎn)基因顯微注射到受精的卵母細胞中，或可以并入胚胎干細胞的基因組中，而且這些細胞的核轉(zhuǎn)移到去核的卵母細胞中。

單鏈抗體。在一個實施方式中，本技術(shù)的結(jié)合劑是單鏈抗trail受體抗體。根據(jù)本技術(shù)，可以將一些技術(shù)加以調(diào)適用于生產(chǎn)對trail受體多肽特異性的單鏈抗體(參見，例如，美國專利no.4,946,778)?？梢杂糜诋a(chǎn)生本技術(shù)的單鏈fv和抗體的技術(shù)的實例包括在美國專利no.4,946,778和5,258,498；huston等人，methodsinenzymology，203:46-88，1991；shu，l.等人，proc.natl.acad.sci.usa，90:7995-7999，1993；和skerra等人，science240:1038-1040，1988中公開的那些。

嵌合抗體和人源化抗體。在一個實施方式中，本技術(shù)的結(jié)合劑是嵌合的抗trail受體抗體。在一個實施方式中，本技術(shù)的結(jié)合劑是人源化的抗trail受體抗體。在本技術(shù)的一個實施方式中，供體抗體和受體抗體是來自不同物種的單克隆抗體。例如，受體抗體是人類抗體(以使得它在人類中的抗原性最小化)，在這種情況下，如此產(chǎn)生的cdr移植的抗體被稱為“人源化”抗體。

可以使用標準重組dna技術(shù)產(chǎn)生的重組抗trail受體抗體，例如包含人類和非人類部分的嵌合和人源化單克隆抗體，其處在本技術(shù)的范圍之內(nèi)。對于某些應(yīng)用，包括本技術(shù)的結(jié)合劑在人體中的體內(nèi)使用以及這些試劑用于體外檢測分析的應(yīng)用，優(yōu)選的是使用嵌合的、人源化的或人類抗trail受體抗體。這些嵌合的和人源化的單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知的重組dna技術(shù)產(chǎn)生。這些有用的方法包括，例如但不限于，在國際申請pct/us86/02269；美國專利no.5,225,539；歐洲專利no.184187，歐洲專利no.171496；歐洲專利no.173494；pct國際公開wo86/01533；美國專利no.4,816,567；5,225,539；歐洲專利no.125023；better等人，1988.science240:1041-1043；liu等人，1987.proc.natl.acad.sci.usa84:3439-3443；liu等人，1987.j.immunol.139:3521-3526；sun等人，1987.proc.natl.acad.sci.usa84:214-218；nishimura等人，1987.cancerres.47:999-1005；wood等人，1985.nature314:446-449；shaw等人，1988.j.natl.cancerinst.80:1553-1559)；morrison(1985)science229:1202-1207；oi等人(1986)biotechniques4:214；jones等人，1986.nature321:552-525；verhoeyan等人，1988.science239:1534；morrison，science229:1202，1985；oi等人，biotechniques4:214，1986；gillies等人，j.immunol.methods，125:191-202，1989；美國專利no.5,807,715；和beidler等人，1988.j.immunol.141:4053-4060中描述的方法。例如，抗體可以使用各種技術(shù)，包括cdr移植(ep0239400；wo91/09967；美國專利no.5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,248,516；ep460167)、飾面(veneering)或表面重修(resurfacing)(ep0592106；ep0519596；padlane.a.，molecularimmunology，28:489-498，1991；studnicka等人，proteinengineering7:805-814，1994；roguska等人，pnas91:969-973，1994)和鏈改組(chainshuffling)(美國專利no.5,565,332)來人源化。在一個實施方式中，編碼鼠抗trail受體單克隆抗體的cdna用限制性內(nèi)切酶消化，所述限制性內(nèi)切酶被特別地選擇來去掉編碼fc恒定區(qū)的序列，用編碼人類fc恒定區(qū)的cdna的相當?shù)牟糠謥硖鎿Q(參見robinson等人，pct/us86/02269；akira等人，歐洲專利申請no.184,187；taniguchi，歐洲專利申請no.171,496；morrison等人，歐洲專利申請no.173,494；neuberger等人，wo86/01533；cabilly等人，美國專利no.4,816,567；cabilly等人，歐洲專利申請no.125,023；better等人(1988)science240:1041-1043；liu等人(1987)procnatlacadsciusa84:3439-3443；liu等人(1987)jimmunol139:3521-3526；sun等人(1987)procnatlacadsciusa84:214-218；nishimura等人(1987)cancerres47:999-1005；wood等人(1985)nature314:446-449；和shaw等人(1988)jnatlcancerinst80:1553-1559)；美國專利no.6,180,370；美國專利no.6,300,064；6,696,248；6,706,484；6,828,422。

在一個實施方式中，本技術(shù)容許構(gòu)建人源化的抗trail受體抗體，其不太可能誘導(dǎo)人類抗小鼠抗體(humananti-mouseantibody，以下稱為“hama”)應(yīng)答，而仍然具有有效的抗體效應(yīng)物功能。如本文所用，術(shù)語“人類”和“人源化的”，就抗體而言，涉及任何預(yù)計在人類受試者中引發(fā)治療上可耐受的弱免疫原性反應(yīng)的抗體。在一個實施方式中，本技術(shù)提供了人源化的trail-r1和/或trail-r2雙特異性抗體，ctb003或hctb003重鏈和輕鏈免疫球蛋白。

cdr抗體。在一個實施方式中，本技術(shù)的結(jié)合劑是抗trail受體cdr抗體。一般地，用于產(chǎn)生抗trail受體cdr抗體的供體和受體抗體是來自不同物種的單克隆抗體；一般受體抗體是人類抗體(以使它在人體中的免疫原性最小化)，在這種情況下，如此產(chǎn)生的cdr移植的抗體被稱為“人源化的”抗體。移植物可以是受體抗體的單個vh或vl內(nèi)的單個cdr(或甚至單個cdr的一部分)，或可以是vh和vl之一或兩者之內(nèi)的多個cdr(或其部分)。很多時候，受體抗體的所有可變域中的所有三個cdr都將被相應(yīng)的供體cdr替換，盡管人們只需要替換必需數(shù)目的cdr以允許產(chǎn)生的cdr移植抗體對metap3的充分結(jié)合。產(chǎn)生cdr移植的抗體和人源化抗體的方法在queen等人，美國專利no.5,585,089，美國專利no.5,693,761；美國專利no.5,693,762；和winteru.s.5,225,539；以及ep0682040中有所教導(dǎo)。制備vh和vl多肽的有用方法在winter等人，美國專利no.4,816,397；6,291,158；6,291,159；6,291,161；6,545,142；ep0368684；ep0451216；ep0120694中有所教導(dǎo)。

在從同一家族和/或同一家族成員選擇了適合的候選框架區(qū)域之后，通過將來源物種的cdr移植到雜合框架區(qū)域中來產(chǎn)生重鏈和/或輕鏈可變區(qū)。就上述兩個方面中的任一個而言，具有雜合的可變鏈區(qū)域的雜合抗體或雜合抗體片段的組裝可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來實現(xiàn)。例如，編碼在此描述的雜合可變域(即基于目標物種的框架和來源物種的cdr)的dna序列可以通過寡核苷酸合成和/或pcr來產(chǎn)生。也可以使用適合的限制性內(nèi)切酶從來源物種抗體分離編碼cdr區(qū)域的核酸，并通過用適合的連接酶連接來將其連接到目標物種框架中。另外一種選擇，可以通過定點誘變來改變來源物種抗體的可變鏈的框架區(qū)域。

由于雜合體是從對應(yīng)于各個框架區(qū)域的多個候選物之中進行選擇來構(gòu)建的，存在著許多可以依照本文描述的原則來進行構(gòu)建的序列組合。因而，可以組裝雜合體的文庫，該文庫的成員具有單個框架區(qū)域的不同組合。這種文庫可以是序列的電子數(shù)據(jù)庫集合或雜合體的實體集合。

這個過程一般不改變位于被移植的cdr側(cè)翼的受體抗體的fr。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員有時可以通過替換給定fr的某些殘基來使得fr更類似于相應(yīng)的供體抗體的fr，來改善產(chǎn)生的抗trail受體cdr移植抗體的抗原結(jié)合親和力。優(yōu)選的替換位置包括鄰近cdr的氨基酸殘基，或者能夠與cdr相互作用的殘基(參見，例如，us5,585,089，特別是第12-16欄)?；蛘弑绢I(lǐng)域技術(shù)人員可以從供體fr開始，對它進行修飾來使它更類似于受體fr或人類共有fr。產(chǎn)生這些修飾的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。特別地，如果產(chǎn)生的fr在該位置符合人類共有fr，或與這種共有fr有至少90％或更高的同一性，那么這樣做可能不會使得到的修飾的抗trail受體cdr抗體的抗原性與具有完全人類fr的相同抗體相比發(fā)生顯著提高。

融合蛋白。在一個實施方式中，本技術(shù)的結(jié)合劑是融合蛋白。trail受體結(jié)合劑當與第二種蛋白質(zhì)融合時，可以用作抗原標簽?？梢匀诤系蕉嚯牡慕Y(jié)構(gòu)域的實例不僅包括異源信號序列，還包括其他異源功能區(qū)域。融合不一定需要是直接的，可以通過接頭序列來融合。此外，本技術(shù)的融合蛋白也可以被工程化來改善trail受體結(jié)合劑的特征。例如，可以將由額外的氨基酸，特別是帶電氨基酸構(gòu)成的區(qū)域添加到trail受體結(jié)合劑的n-末端，來改善在從宿主細胞純化或后續(xù)的處理和保存期間的穩(wěn)定性和持久性。并且，可以將肽模塊添加到trail受體結(jié)合劑以便于純化。這些區(qū)域可以在trail受體結(jié)合劑的最終制備之前去除。添加肽模塊以便于多肽的處理是本領(lǐng)域慣用的和常規(guī)的技術(shù)。trail受體結(jié)合劑可以融合到標記物序列，例如，便于純化融合多肽的肽。在一些實施方式中，標記物氨基酸序列是六聚組氨酸肽，例如在pqe載體(qiagen，inc.，9259etonavenue，chatsworth，calif.，91311)等中提供的標簽，它們中許多是商業(yè)上可獲得的。如gentz等人，proc.natl.acad.sci.usa86:821-824，1989中描述的，六聚組氨酸使得純化融合蛋白易于進行。對于純化有用的另一個肽標簽，“ha”標簽，對應(yīng)于來自流感血凝素蛋白質(zhì)的表位。wilson等人，cell37:767，1984。

因此，這些上述融合物的任一種都可以利用本技術(shù)的多核苷酸或多肽來工程化。并且，融合蛋白可以顯示出增加的體內(nèi)半衰期。

具有二硫鍵連接的二聚結(jié)構(gòu)(由于igg)的融合蛋白，與單獨的單體型分泌蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段相比，在結(jié)合和中和其他分子方面可能是更有效的。fountoulakis等人，j.biochem.270:3958-3964，1995。

類似地，ep-a-o464533(對應(yīng)于加拿大的2045869)公開了一些融合蛋白，它們包含免疫球蛋白的恒定區(qū)的不同部分以及另一種人類蛋白質(zhì)或其部分。在很多情況下，融合蛋白中的fc部分對于治療和診斷是有益的，因而可以產(chǎn)生例如改善的藥物動力學(xué)性質(zhì)的結(jié)果。參見ep-a0232262。另外一種選擇，可能希望在表達、檢測和純化了融合蛋白之后刪除fc部分。例如，如果融合蛋白被用作免疫的抗原，fc部分可能阻礙治療和診斷。在藥物發(fā)現(xiàn)中，為了高通量篩選分析來鑒定hil-5的拮抗劑，例如，人類蛋白質(zhì)如hil-5已經(jīng)與fc部分融合。bennett等人，j.molecularrecognition8:52-58，1995；johanson等人，j.biol.chem.，270:9459-9471，1995。

通過t細胞表位修飾的治療蛋白質(zhì)的去免疫(de-immunization)。臨床使用中的許多治療蛋白質(zhì)已經(jīng)顯示了引發(fā)不希望的抗體應(yīng)答，這些應(yīng)答在某些情況下伴隨著不良事件。在本技術(shù)的一個實施方式中，通過鑒定重組抗trail受體抗體、trail受體多肽或trail受體結(jié)合劑的氨基酸序列中對于給定物種的t細胞的一個或多個潛在的表位，并修飾所述氨基酸序列來消除至少一個t細胞表位，使得所述抗體、多肽或結(jié)合劑對于給定的物種具有非免疫原性或較低的免疫原性。這樣就消除了或降低了多肽或蛋白質(zhì)暴露于給定物種的免疫系統(tǒng)時所述多肽或蛋白質(zhì)的免疫原性。這樣的去免疫化對單克隆抗體和其他免疫球蛋白樣分子可能特別有益，例如，可以對小鼠衍生的免疫球蛋白加以去免疫以用于人類治療用途。本技術(shù)領(lǐng)域去免疫多肽或蛋白質(zhì)的方法參見，例如，carr等人，美國專利申請20030153043；和degroot等人，aidsres.andhumanretroviruses13:539-541(1997)；schafer等人，vaccine16:1880-1884(1998)；degroot等人，dev.biol.112:71-80(2003)；degroot等人，vaccine19:4385-4395(2001)；reijonenandkwokmethods29:282-288；novak等人，j.immunology166:6665-6670(2001)。

在一個實施方式中，使用編碼作為融合蛋白的一部分的候選結(jié)合劑(其中這些融合蛋白在宿主細胞中表達時形成包涵體)的基因組dna或est來制備本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑。這種編碼作為融合蛋白的一部分的候選結(jié)合劑(其中這些融合蛋白在宿主細胞中表達時形成包涵體)的基因組dna或est的制備方法已經(jīng)有所描述。參見美國專利no.6,653,068；u.s.s.n.20040157291。例如，包涵體可用于產(chǎn)生特異性結(jié)合目標(多)肽的結(jié)合配偶體，例如trail受體結(jié)合劑。

trail受體結(jié)合劑綴合蛋白。如上所述，在某些實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑是抗trail受體抗體，其偶聯(lián)或綴合于一種或多種治療性或細胞毒性模塊來產(chǎn)生本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑綴合蛋白。任選地，trail受體結(jié)合劑可用作trail受體結(jié)合劑-細胞毒素綴合分子，例如用于腫瘤疾病治療的施用。

一般地，治療模塊(therapeuticmoieties)可以綴合于本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑，例如，通過任何合適的技術(shù)，同時適當?shù)乜紤]藥物動力學(xué)穩(wěn)定性和降低對受試者的總體毒性的需要。治療性、細胞毒性、或標記/顯象試劑(即“模塊(moiety)”)可以直接或間接(例如通過接頭基團)偶聯(lián)于適合的trail受體結(jié)合劑。當模塊和trail受體結(jié)合劑各自具有能夠相互反應(yīng)的功能基團時，模塊和trail受體結(jié)合劑之間的直接反應(yīng)是可能的。例如，親核基團，例如氨基或巰基基團，能夠與含有羰基的基團例如酐或酸性鹵化物(acidhalide)反應(yīng)，或與含有良好的離去基團(例如鹵素)的烷基(alkylgroup)反應(yīng)。作為選擇，可以使用適合的化學(xué)接頭基團。接頭基團可以起間隔區(qū)的作用，使所述模塊遠離所述trail受體結(jié)合劑，以避免對結(jié)合能力的干擾。接頭基團也可以用來提高所述模塊或trail受體結(jié)合劑上的取代基的化學(xué)反應(yīng)性，并從而提高偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)性的提高也可以使得本不可能使用的模塊或模塊上的功能基團變得容易使用。

適合的連接化學(xué)包括馬來酰亞胺基接頭和烷基鹵接頭(其與抗體模塊上的巰基反應(yīng))和琥珀酰亞胺基接頭(其與抗體模塊上的伯胺反應(yīng))。幾個伯胺和巰基基團存在于免疫球蛋白上，其他的基團可以設(shè)計到重組免疫球蛋白分子中。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，各種雙官能或多官能試劑，包括同官能和異官能的(例如，在piercechemicalco.，rockford，ill.的目錄中描述的那些)，可以用作接頭基團。結(jié)合可以例如通過氨基、羧基、巰基或氧化的糖殘基來進行(參見，例如美國專利no.4,671,958)。

作為備選的偶聯(lián)方法，例如，可以經(jīng)由糖基化位點處的氧化的糖基團將模塊偶聯(lián)到本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑上，如在美國專利no.5,057,313和5,156,840中描述的。結(jié)合trail受體結(jié)合劑到所述部分上的又一個可選擇的方法是通過使用非共價結(jié)合配對，例如，鏈霉抗生物素蛋白/生物素，或抗生物素蛋白/生物素。在這些實施方式中，將所述配對的一個成員共價結(jié)合到trail受體結(jié)合劑，結(jié)合配對的另一個成員共價結(jié)合到所述模塊上。

可斷裂(cleavable)的接頭。當本技術(shù)的免疫綴合物的細胞毒性或治療模塊在沒有trail受體結(jié)合劑部分時效力更強時，可能希望使用在細胞內(nèi)化期間或內(nèi)化后可斷裂的接頭基團，或在細胞外環(huán)境中可隨著時間逐漸地斷裂。已經(jīng)描述了許多不同的可斷裂的接頭基團。在細胞內(nèi)將細胞毒性模塊從這些接頭基團上釋放的實例包括，例如但不限于，通過二硫鍵的還原來斷裂(例如，美國專利no.4,489,710)、通過對光不穩(wěn)定鍵的照射(例如，美國專利no.4,625,014)、通過衍生化的氨基酸側(cè)鏈的水解(例如，美國專利no.4,638,045)、通過血清補體介導(dǎo)的水解(例如，美國專利no.4,671,958)，和酸催化的水解(例如，美國專利no.4,569,789)。

在一個實施方式中，trail受體結(jié)合劑與超過一種治療性、細胞毒性和/或顯像模塊結(jié)合。通過多衍生化(poly-derivatizing)本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑，可以同時地實現(xiàn)幾種細胞毒性策略，可以將trail受體結(jié)合劑制成對幾種可視化技術(shù)有用的造影劑，或可以對治療性抗體加以標記以用于通過可視化技術(shù)來追蹤。在一個實施方式中，將細胞毒性模塊的多個分子連接到一個trail受體結(jié)合劑上。在一個實施方式中，將trail受體結(jié)合劑與至少兩種模塊的混合物偶聯(lián)，所述模塊選自細胞毒性模塊、治療模塊、和標記/顯像模塊構(gòu)成的組。也就是說，多于一種類型的模塊可以連接到一個trail受體結(jié)合劑上。例如，治療模塊，如多核苷酸或反義序列，可以與細胞毒性或放射毒性模塊一起綴合于trail受體結(jié)合劑，以提高化學(xué)或放射毒性治療的有效性，以及降低獲得期望的治療效果所必需的劑量。不考慮特定的實施方式，可以以各種方式制備與多于一種模塊所成的免疫綴合物。例如，可以將多于一種模塊直接偶聯(lián)到trail受體結(jié)合劑上，或者可以使用提供多個附接位點的接頭(例如，樹枝狀聚合物(dendrimers))。另外一種選擇，可以使用具有容納多于一種細胞毒模塊的容量的載體。

如上文說明的，trail受體結(jié)合劑可以以各種方式攜帶所述模塊，包括直接或經(jīng)由接頭基團的共價鍵合，和非共價的締合。在一個實施方式中，trail受體結(jié)合偶聯(lián)的蛋白質(zhì)可以與封裝載體組合。這在化學(xué)毒性治療實施方式中是特別有用的，因為它們可以容許治療組合物隨著時間逐漸地釋放trail受體結(jié)合劑化學(xué)毒性模塊，同時將它濃縮在目標細胞的附近。

與放射性核素綴合的trail受體結(jié)合劑。在一個實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑與細胞毒性模塊偶聯(lián)，所述細胞毒性模塊是放射性核素。優(yōu)選的細胞毒性模塊的放射性核素是適合于藥理學(xué)施用的放射性核素。這些放射性核素包括¹²³i、¹²⁵i、¹³¹i、⁹⁰y、²¹¹at、⁶⁷cu、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、²¹²pb、和²¹²bi。碘和砹同位素是用于本技術(shù)的治療組合物中的更優(yōu)選的放射性核素，關(guān)于它們的用途已經(jīng)積累了大量的文獻。¹³¹i是特別優(yōu)選的，其他的β-輻射發(fā)射性核素也是，它們具有幾毫米的有效范圍。¹²³i、¹²⁵i、¹³¹i或²¹¹at可以與trail受體結(jié)合劑使用幾種已知的綴合試劑中的任何一種綴合用于組合物和方法中，所述已知的綴合試劑包括碘化試劑(lodogen)、3-[²¹¹at]砹代苯甲酸(astatobenzoate)n-琥珀酰亞胺酯、3-[¹³¹i]碘代苯甲酸n-琥珀酰亞胺酯(sib)和5-[¹³¹i]碘-3-吡啶羧酸n-琥珀酰亞胺酯(sipc)?？梢栽谏鲜龅獯噭┲欣萌魏蔚馔凰亍Ｆ渌派湫院怂乜梢酝ㄟ^核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的適合的螯合試劑綴合到trail受體結(jié)合劑上。

化學(xué)毒性模塊。在一個實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑與化學(xué)毒性模塊偶聯(lián)。化學(xué)毒性試劑包括但不限于，小分子藥物，例如氨甲蝶呤、和嘧啶和嘌呤類似物?；瘜W(xué)毒素分化誘導(dǎo)物包括佛波醇酯和丁酸?；瘜W(xué)毒性模塊可以直接綴合于trail受體結(jié)合劑。在一個實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑經(jīng)由化學(xué)接頭綴合于細胞毒性模塊。在另一個實施方式中，模塊被封裝在載體中，載體則偶聯(lián)于本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑。

蛋白質(zhì)毒素。在一個實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑與蛋白質(zhì)毒素模塊偶聯(lián)。優(yōu)選的用作細胞毒性模塊的毒素蛋白質(zhì)包括，例如但不限于，放線菌或鏈霉菌抗生素、多卡霉素(duocarmycin)、紫杉醇(taxol)、細胞松弛素b(cytochalasinb)、短桿菌肽d(gramicidind)、溴化乙錠(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、秋水仙堿(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、二羥基蒽環(huán)素(dihydroxyanthracindidne)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放線菌素d(actinomycind)、1-去氫睪酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)和其類似物或同源物。用作細胞毒性模塊的優(yōu)選的毒素蛋白質(zhì)進一步包括蓖麻毒素(ricin)、相思豆毒素(abrin)、白喉毒素(diphtheriatoxin)、霍亂毒素(choleratoxin)、白樹毒素(gelonin)、假單胞菌外毒素(pseudomonasexotoxin)、志賀氏菌毒素(shigellatoxin)、商陸抗病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein)和醫(yī)學(xué)生物化學(xué)領(lǐng)域已知的其他毒素蛋白質(zhì)。由于這些毒素試劑可能在受試者中引發(fā)不希望的免疫應(yīng)答，如果血管內(nèi)注射尤為如此，因此優(yōu)選是將它們封裝在載體中用于偶聯(lián)到trai受體結(jié)合劑，例如抗trail受體抗體和抗體相關(guān)多肽。

酶活性毒素。在一個實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑與酶活性毒素結(jié)合。酶活性毒素可以是細菌或植物來源的，或這種毒素的酶活性片段(“a鏈”)。在本技術(shù)中有用的的酶活性毒素和其片段包括白喉毒素a鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素a鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素a鏈、相思豆毒素a鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)a鏈、α-帚曲菌素(α-sarcin)、油桐(aleuritesfordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(phytolaccaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)和伊諾霉素(enomycin)。本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑與細胞毒性模塊的綴合物可以使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備。這些試劑的實例有：spdp；it；亞氨酸酯(例如二甲基己二酰亞胺鹽酸鹽)、活性酯類(例如諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對疊氮苯甲?；?己二胺)、雙疊氮衍生物(例如雙(對疊氮苯甲?；?乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙官能衍生物。毒素的溶解性部分(lysingportion)可以與抗體(例如trail受體結(jié)合劑)的fab片段連接。

治療性模塊。在一個實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑與治療模塊偶聯(lián)。治療模塊包括，例如但不限于，抗代謝物(例如，氨甲蝶呤(methotrexate)、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracildecarbazine))，烷化劑(例如，氮芥(mechlorethamine)、塞替派瘤可寧(thioepachlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，bsnu)和洛莫司汀(lomustine，ccnu)、環(huán)磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈唑霉素(streptozotocin)、絲裂霉素c(mitomycinc)和順式二氯二胺鉑(cis-dichlorodiamineplatinum)(ii)(ddp)順鉑)，蒽環(huán)類抗生素(anthracyclines)(例如，柔紅霉素(daunorubicin)(舊稱道諾霉素(daunomycin))和多柔比星(doxorubicin))，抗生素(例如，放線菌素(dactinomycin)(舊稱放線菌素(actinomycin))、博來霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和氨茴霉素(anthramycin)(amc))、多柔比星(doxorubicin)(亞德里亞霉素(adriamycin))、順鉑、硫酸博來霉素(bleomycinsulfate)、卡莫司汀(carmustine)、瘤可寧(chlorambucil)、環(huán)磷酰胺羥基脲(cyclophosphamidehydroxyurea)或蓖麻毒素a(ricina)，和抗有絲分裂試劑(例如，長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))。

將治療模塊綴合到本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑的技術(shù)是公知的，參見，例如，arnon等人，“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy”,monoclonalantibodiesandcancertherapy,reisfeld等人(eds.),pp.243-56(alanr.liss,inc.1985)；hellstrom等人,“antibodiesfordrugdelivery”,controlleddrugdelivery(2nded.),robinson等人(eds.),pp.623-53(marceldekker,inc.1987)；thorpe,“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview”,monoclonalantibodies‘84:biologicalandclinicalapplications,pinchera等人(eds.),pp.475-506(1985)；“analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy”,monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy,baldwin等人(eds.),pp.303-16(academicpress1985),和thorpe等人,“thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates”,immunol.rev.,62:119-58(1982)。

標記的trail受體結(jié)合劑。在一個實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑與標記模塊，即可檢測基團結(jié)合。綴合于trail受體結(jié)合劑的特定的標記物或可檢測基團不是本技術(shù)的關(guān)鍵方面，只要它不顯著地影響本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑對trail受體多肽或trail受體樣多肽的特異性結(jié)合。可檢測基團可以是具有可檢測的物理或化學(xué)性質(zhì)的任何材料。這些可檢測標記在免疫分析和顯像領(lǐng)域已經(jīng)得到了良好的開發(fā)，一般地，在這些方法中有用的幾乎任何標記物都可以用于本技術(shù)中。因而，標記物是可由分光的、光化學(xué)的、生物化學(xué)的、免疫化學(xué)的、電的、光學(xué)的或化學(xué)的手段檢測的任何組合物(composition)。在本技術(shù)中有用的標記物包括磁性珠子(例如，dynabeads^tm)、熒光染料(例如，異硫氰酸熒光素、texas紅、羅丹明等等)、放射性標記物(例如，³h、¹⁴c、³⁵s、¹²⁵i、¹²¹i、¹¹²in、⁹⁹mtc)，其他的顯像試劑，例如微泡(microbubbles)(用于超聲波顯像)、¹⁸f、¹¹c、¹⁵o(用于正電子發(fā)射層析成像)、^99mtc、¹¹¹in(用于單光子發(fā)射層析成像)、酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其他通常在elisa中使用的酶)，和量熱標記物，例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等等)珠子。描述了這些標記物的用途的專利包括美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，為了所有目的通過引用將它們每一個完全并入本文。也參見handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(6^thed.，molecularprobes，inc.，eugeneor.)。

標記物可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法直接或間接地偶聯(lián)到測定系統(tǒng)的希望組分上。如上所指出，可以使用各種各樣的標記物，標記物的選擇取決于需要的敏感性、與化合物綴合的便利性、穩(wěn)定性要求、可用的測試設(shè)備和處理規(guī)定。

非放射性標記通常通過間接的方式來連接。一般地，配體分子(例如生物素)共價地結(jié)合于分子。配體然后結(jié)合于抗配體(例如，鏈霉抗生物素蛋白)分子，抗配體本身可被檢測或者共價結(jié)合于信號系統(tǒng)，例如，可檢測的酶、熒光化合物，或化學(xué)發(fā)光化合物?？梢允褂枚喾N配體和抗配體。當配體具有天然的抗配體時，例如，生物素、甲狀腺素和可的松，它可以與標記的、天然存在的抗配體結(jié)合使用。另外一種選擇，任何半抗原性或抗原性化合物可以用于與抗體，例如抗trail受體抗體組合。

分子也可以直接綴合于產(chǎn)生信號的化合物，例如，與酶或熒光基團綴合。作為標記物感興趣的酶將主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化還原酶，特別是過氧化物酶。作為標記模塊有用的熒光化合物包括但不限于，例如，熒光素和它的衍生物、羅丹明和它的衍生物、丹磺酰、傘形酮等等。作為標記模塊有用的化學(xué)發(fā)光化合物包括但不限于，例如，螢光素和2,3-二氫酞嗪二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)，例如，魯米諾。對于可以使用的各種標記和信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述，參見，美國專利no.4,391,904。

檢測標記物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。因而，例如，當標記物是放射性標記時，檢測的手段包括閃爍計數(shù)器或放射自顯影中的感光膠片。當標記物是熒光標記物時，它可以通過用合適波長的光線激發(fā)熒光染料并檢測產(chǎn)生的熒光來檢測。熒光可以通過目視、通過感光膠片、通過使用電子探測器例如電荷耦合器件(chargecoupleddevices，ccd)或光電倍增器等等來檢測。類似地，酶標記物可以通過提供合適的酶底物并檢測產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測。最后，簡單的比色標記物可以僅通過觀察與標記物相關(guān)的顏色來檢測。因而，在各種浸漬測定中，綴合的金子常常呈現(xiàn)粉色，而各種綴合的珠子呈現(xiàn)珠子的顏色。

某些測定模式不需要使用標記的成分。例如，凝集測定可以用于檢測目標抗體，例如抗trail受體抗體的存在。在這種情況下，抗原包被的顆粒通過包含目標抗體的樣品來凝聚。在這種形式中，沒有組分需要被標記，目標抗體的存在通過簡單的目測檢查來檢測。

藥物組合物的制劑。本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑可以摻入適合于施用的藥物組合物中。藥物組合物一般包含至少一種trail受體結(jié)合劑和處于適合于向受試者施用的形式的藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體部分地根據(jù)要施用的特定組合物，以及根據(jù)用于施用組合物的特定方法來確定。因而，存在著各種各樣的適合的藥物組合物的制劑用于施用所述抗體組合物(參見，例如，remington'spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.，easton，pa18^thed.，1990)。藥物組合物一般地被配制為無菌的，基本上等滲的，并完全符合美國食品和藥品管理局的所有的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(gmp)規(guī)范。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”、“生理學(xué)上可耐受的”和其語法上的變體，當涉及組合物、載體、稀釋劑和試劑時，可互換使用，表明所述材料能夠施用給受試者而不產(chǎn)生阻止所述組合物的施用的程度的不良生理影響。例如，“藥學(xué)上可接受的賦形劑”是指在制備一般安全、無毒、可取的藥物組合物中有用的賦形劑，并且包括對于獸醫(yī)學(xué)用途以及人類藥物用途可接受的賦形劑。這些賦形劑可以是固體、液體、半固體，或?qū)τ跉忪F劑組合物來說，是氣體。“藥學(xué)上可接受的鹽和酯”是指藥學(xué)上可接受的并具有希望的藥理學(xué)性質(zhì)的鹽和酯。這些鹽包括在酸性質(zhì)子存在于trail受體結(jié)合劑中時可以形成、并能夠與無機或有機堿反應(yīng)的鹽。適合的無機鹽包括與堿金屬，例如鈉和鉀、鎂、鈣和鋁形成的無機鹽。適合的有機鹽包括與有機堿，例如胺堿，例如，乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、n-甲基葡糖胺等等形成的有機鹽。這些鹽還包括與無機酸(例如，鹽酸和氫溴酸)和有機酸(例如，乙酸、檸檬酸、順丁烯二酸和烷烴和芳烴-磺酸，例如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成鹽。藥學(xué)上可接受的酯包括從存在于trail受體結(jié)合劑上的羧基、磺酰氧基和膦羧基(phosphonoxy)基團形成的酯，例如，c1-6烷基酯。當存在兩個酸性基團時，藥學(xué)上可接受的鹽或酯可以是單酸單鹽或酯，或二鹽或酯；類似地，當存在超過兩個酸性基團時，某些或者所有這些基團可以被鹽化或酯化。本技術(shù)中述及的trail受體結(jié)合劑可以以未鹽化或未酯化的形式存在，或處于鹽化和/或酯化形式，對這樣的trail受體結(jié)合劑的提述意圖包括最初的(未鹽化和未酯化的)化合物和它的藥學(xué)上可接受的鹽或和酯。并且，本技術(shù)中提述的某些trail受體結(jié)合劑可以以超過一種立體異構(gòu)形式存在，這種trail受體結(jié)合劑的提述意圖包括所有單立體異構(gòu)體和這些立體異構(gòu)體的所有混合物(無論是外消旋的還是相反)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以無困難地確定本技術(shù)的特定藥物和組合物的適當?shù)慕o藥時間、順序和劑量。

這些載體或稀釋劑的優(yōu)選的實例包括但不限于，水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂質(zhì)體和非水媒介物，例如不揮發(fā)的油。這些介質(zhì)和化合物用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或化合物與trail受體結(jié)合劑不相容，則考慮其在治療組合物中的使用。補充的活性化合物也可以摻入到組合物中。

本技術(shù)的藥物組合物被配制以適合于它預(yù)期的施用途徑。本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑組合物可以通過胃腸外的、表面的、靜脈內(nèi)的、口服的、皮下的、動脈內(nèi)的、皮內(nèi)的、穿表皮的、直腸的、顱內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的、肌肉內(nèi)的途徑，或作為吸入物來施用。免疫原劑如trail受體多肽的最典型的施用途徑是皮下途徑，而其他途徑可以是同樣有效的。第二最常規(guī)的途徑是肌內(nèi)注射。這種類型的注射最一般地在手臂或腿部肌肉中進行。在某些方法中，試劑被直接注射到積累了沉積物(deposits)的特定的組織中，例如顱內(nèi)注射。肌肉內(nèi)注射或靜脈內(nèi)輸注(intramuscularinjectiononintravenousinfusion)對于trail受體結(jié)合劑，例如抗trail受體抗體的施用是優(yōu)選的。在某些方法中，本技術(shù)的特定的trail受體結(jié)合劑直接注射到顱骨中。在某些方法中，trail受體結(jié)合劑作為持續(xù)釋放組合物或裝置，例如medipad^tm設(shè)備，來施用。

本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑任選地可以與其他試劑組合地施用，所述其他試劑在治療各種疾病，包括各種trail受體相關(guān)疾病中是至少部分有效的。在向受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)施用的情況下，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑也可以與提高試劑血腦屏障的跨越的其他試劑一起施用。

用于胃腸外、皮內(nèi)或皮下施用的溶液或懸浮液可以包括以下的成分：無菌的稀釋劑例如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑；抗菌化合物例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸酯；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合化合物例如乙二胺四乙酸(edta)；緩沖劑例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于調(diào)整張度的化合物例如氯化鈉或葡萄糖。可以使用酸或堿，例如鹽酸或氫氧化鈉，調(diào)節(jié)ph值。胃腸外的制品可以封裝到由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多劑量小瓶中。

適合于可注射使用的藥物組合物一般包括無菌水溶液(在可溶于水時)或分散體和用于無菌可注射溶液或分散體的臨時制備的無菌粉劑。對于靜脈內(nèi)施用，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、克列莫佛(cremophor)eltm(basf；parsippany，n.j.)或磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)。在所有情況下，組合物應(yīng)當是無菌的，并應(yīng)當具有易于通針(easysyringeability)的程度的流動性。它在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須保持不受抗微生物例如細菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等等)以及其適合的混合物。適當?shù)牧鲃有钥梢酝ㄟ^下述方式維持：例如，通過使用包衣例如卵磷脂；在分散體的情況下通過維持所需的粒子大??；以及通過使用表面活性劑?？梢酝ㄟ^各種抗菌和抗真菌化合物，例如對羥苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等，來實現(xiàn)對微生物作用的防護。在很多情況下，組合物中優(yōu)選包括等滲化合物，例如糖類、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的化合物，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以實現(xiàn)可注射組合物的延長的吸收。

可以通過將trail受體結(jié)合劑以所需的量摻入到具有一種上文列舉的成分或上文列舉的成分的組合的適合的溶劑中，根據(jù)需要，繼之以過濾滅菌，來制備無菌可注射溶液。一般地，通過將結(jié)合劑摻入到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)以及來自以上列舉那些的其他所需成分的無菌運載體中，來制備分散體。對于用于制備無菌可注射溶液其無菌粉劑來說，制備方法是通過真空干燥和凍干產(chǎn)生粉劑，這樣的粉劑包含活性成分以及任何附加的期望的成分，后者來自所述成分的事先經(jīng)無菌過濾的溶液。本技術(shù)的試劑可以以儲庫注射劑(depotinjection)或植入制劑的形式施用，這樣的試劑可以配制成允許活性成分的持續(xù)或脈沖釋放的形式。

口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可以包裝入膠囊中或壓縮成片劑。對于口服治療施用來說，粘合劑可以與賦形劑混合，以片劑、錠劑或膠囊的形式使用?？诜M合物也可以使用液體載體制備來用作漱口水，其中所述液體載體中的化合物口服地施用并被吸入漱口并吐出或被吞咽?？梢园ㄋ帉W(xué)上相容的結(jié)合化合物，和/或佐劑材料作為組合物的一部分。片劑、藥丸、膠囊、錠劑等等可以含有任何以下的成分，或性質(zhì)類似的化合物：粘合劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解化合物，例如海藻酸、乙醇酸淀粉鈉(primogel)或玉米淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或氫化植物油(sterotes)；助流劑，例如膠體二氧化硅；甜味化合物，例如蔗糖或糖精；調(diào)味化合物，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味劑。

對于通過吸入施用，trail受體結(jié)合劑以來自壓縮容器或分配器的氣溶膠噴霧形式來施用，所述容器或分配器含有適合的推進劑例如氣體，如二氧化碳，或噴霧器。

全身性施用也可以通過穿粘膜或穿表皮的方式。對于穿粘膜或穿表皮施用，適合于需透過的障礙物的滲透劑可以用于制劑中。這種滲透劑一般是本領(lǐng)域已知的，包括，例如，對于穿粘膜施用，清洗劑(detergents)、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。穿粘膜施用可以通過使用鼻噴霧或栓劑來實現(xiàn)。對于穿表皮施用，如本領(lǐng)域一般已知的，將trail受體結(jié)合劑配制到軟膏劑(ointments)、油膏劑(salves)、凝膠劑或乳膏劑中。

trail受體結(jié)合劑也可以制備為用于直腸遞送的栓劑(例如，具有常規(guī)的栓劑基質(zhì)，例如可可脂和其他甘油酯)或滯留灌腸劑(retentionenemas)的形式的藥物組合物。

在一個實施方式中，用能夠保護trail受體結(jié)合劑免于從體內(nèi)快速消除的載體制備trail受體結(jié)合劑，例如控釋制劑，包括植入物和微封裝的遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯(polyorthoesters)和聚乳酸。這類配制劑的制備方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些材料也可以自alzacorporation和novapharmaceuticals，inc.購得。脂質(zhì)體懸液(包括帶有針對病毒抗原的單克隆抗體的、靶向受感染細胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥學(xué)上可接受的載體。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制備，例如，如美國專利no.4,522,811中描述的。

特別有利的是以單位劑型配置口服的或胃腸外的組合物，以便于施用和劑量的均勻化。在此使用的單位劑型是指適合作為單位劑量用于要治療的受試者的、物理上離散的單位；每個單位含有經(jīng)過計算可產(chǎn)生期望治療效果的預(yù)定量的結(jié)合劑以及與之結(jié)合的藥物載體。本技術(shù)的單位劑型的規(guī)格由下列因素決定并且直接依賴于它們：結(jié)合劑的獨特特征和要實現(xiàn)的特定治療效果、以及用于治療受試者的trail受體結(jié)合劑配制技術(shù)的固有限制。

本技術(shù)的核酸分子可以插入到載體中，用作基因治療載體。可以通過，例如，靜脈內(nèi)注射、局部施用(參見，例如，美國專利no.5,328,470)或通過立體定向(stereotactic)注射(參見，例如chen等人，1994.proc.natl.acad.sci.usa91:3054-3057)將基因治療載體遞送給受試者?；蛑委熭d體的藥物制劑可以包括處在可接受的稀釋劑中的基因治療載體，或可以包含內(nèi)部包埋有基因遞送載體的緩釋基質(zhì)。另外一種選擇，當可以從重組細胞完整地產(chǎn)生整個基因遞送載體例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，藥物配制劑可以包括一個或多個產(chǎn)生該基因遞送系統(tǒng)的細胞。所述藥物組合物可以與施用說明書一起裝入容器、包裝袋或分配器中。

trail受體結(jié)合的測量。在一個實施方式中，trail受體結(jié)合測定是指一種測定模式，其中將trail受體多肽和trail受體結(jié)合劑在適合于trail受體多肽和trail受體結(jié)合劑之間的結(jié)合的條件下混合，并評估trail受體多肽和trail受體結(jié)合劑之間的結(jié)合的量。將結(jié)合的量與合適的對照進行比較，其中所述對照可以是在不存在trail受體多肽的情況下的結(jié)合量、存在非特異性免疫球蛋白組合物(composition)的情況下的結(jié)合量，或二者皆是。結(jié)合量可以通過任何適合的方法來評估。結(jié)合測定方法包括，例如，elisa、放射受體結(jié)合測定、閃爍迫近測定、細胞表面受體結(jié)合測定、熒光能量轉(zhuǎn)移測定、液相層析、膜過濾測定等等。用于結(jié)合trail受體結(jié)合劑的trail受體多肽的直接測量的生物物理學(xué)測定有，例如，核磁共振、熒光、熒光偏振、表面等離子體共振(biacor芯片)等等。通過本領(lǐng)域已知的標準測定方法測定特異性結(jié)合，例如，放射性配體結(jié)合測定、elisa、fret、免疫沉淀、spr、nmr(2d-nmr)、質(zhì)譜法等等。如果候選trail受體結(jié)合劑的特異性結(jié)合比不存在候選trail受體結(jié)合劑的情況下觀察到的結(jié)合大至少百分之一，則候選trail受體結(jié)合劑作為本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑是有用的。

trail受體結(jié)合劑生物學(xué)活性的測量。本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑，例如抗trail受體抗體和抗trail受體抗體相關(guān)多肽，可以被具體指定為生物學(xué)活性的激動劑或拮抗劑，其含有本文所公開的特定活性。例如，作為trail受體結(jié)合劑的trail受體激動劑和拮抗劑可以利用本領(lǐng)域已知的方法來產(chǎn)生。參見，例如，wo96/40281；美國專利no.5,811,097；deng等人，blood92:1981-1988，1998；chen等人，cancerres.，58:3668-3678，1998；harrop等人，j.immunol.161:1786-1794，1998；zhu等人，cancerres.，58:3209-3214，1998；yoon等人，j.immunol.，160:3170-3179，1998；prat等人，j.cell.sci.，111:237-247，1998；pitard等人，j.immunol.methods，205:177-190，1997；liautard等人，cytokinde，9:233-241，1997；carlson等人，j.biol.chem.，272:11295-11301，1997；taryman等人，neuron，14:755-762，1995；muller等人，structure，6:1153-1167，1998；bartunek等人，cytokinem，8:14-20，1996。生物學(xué)活性，即trail受體結(jié)合劑的激動劑或拮抗劑性質(zhì)，可以利用任何被開發(fā)用于測量trail受體多肽的生物學(xué)活性的常規(guī)體內(nèi)和體外測定來表征。

vii.trail受體結(jié)合劑的用途

概述。本技術(shù)的結(jié)合劑在涉及trail受體多肽的定位和/或定量的本領(lǐng)域已知方法中是有用的(例如，用于測量適合的生物學(xué)樣品中的trail受體多肽的水平，用于診斷方法，用于為所述多肽顯像等等)。在一個實施方式中，含有抗體衍生的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的trail受體結(jié)合劑作為藥理學(xué)活性組合物(以下稱“治療劑”)是有用的。結(jié)合劑對于通過標準技術(shù)，例如親和層析或免疫沉淀來分離trail受體多肽是有用的。本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑可以有助于純化來自生物樣品例如細胞的天然的免疫反應(yīng)性trail受體多肽或免疫反應(yīng)性trail受體樣多肽、以及在宿主系統(tǒng)中表達的重組產(chǎn)生的免疫反應(yīng)性trail受體多肽或trail受體樣多肽。此外，trail受體結(jié)合劑可以用于檢測免疫反應(yīng)性trail受體多肽或免疫反應(yīng)性trail受體樣多肽(例如，在細胞溶胞產(chǎn)物中或細胞上清液中)以評估免疫反應(yīng)性多肽的表達豐度和表達模式。trail受體結(jié)合劑可以用于診斷來監(jiān)視組織中免疫反應(yīng)性trail受體和/或免疫反應(yīng)性trail受體樣免疫反應(yīng)性多肽的水平，作為臨床測試程序的一部分，例如用來確定給定治療方式的效力。如上所述，通過偶聯(lián)(即物理地連接)本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑到可檢測的物質(zhì)，可以使檢測更容易。

a.trail受體的檢測和定量

trail受體多肽表達的檢測。一種示例性的用于檢測生物樣品中存在與否trail受體多肽或trail受體樣多肽的方法包括：從測試受試者獲得生物樣品，使所述生物樣品接觸能夠檢測trail受體多肽或trail受體樣多肽的trail受體結(jié)合劑，從而檢測trail受體多肽或trail受體樣多肽在所述生物樣品中的存在。trail受體結(jié)合劑的一個實例是針對seqidno:17產(chǎn)生的抗體，能夠結(jié)合trail受體多肽或trail受體樣多肽。在一些實施方式中，該trail受體結(jié)合劑是抗體。在一些實施方式中，該抗體包含可檢測的標記。術(shù)語“標記的”對于結(jié)合劑而言意圖包括通過將結(jié)合劑與可檢測物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)而直接標記該結(jié)合劑，以及通過與直接被標記的另一個化合物反應(yīng)而間接標記該結(jié)合劑。間接標記的實例包括使用熒光標記的第二抗體檢測第一抗體。

在一些實施方式中，本技術(shù)的檢測方法可用于體外生物樣品中和體內(nèi)檢測trail受體多肽或trail受體樣多肽。用于檢測trail受體多肽或trail受體樣多肽的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、western印跡、免疫沉淀和免疫熒光。此外，用于檢測trail受體多肽或trail受體樣多肽的體內(nèi)技術(shù)包括向受試者中導(dǎo)入標記的trail受體結(jié)合劑，例如抗trail受體抗體。例如，可以用放射性標記物標記抗體，所述放射性標記物在受試者中的存在和位置可以通過標準顯像技術(shù)來檢測。在一個實施方式中，所述生物樣品含有來自測試受試者的多肽分子。

免疫測定和顯像。本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑可以采用基于抗體的技術(shù)用于測定生物樣品中trail受體多肽水平或trail受體樣多肽水平。例如，可以用標準的免疫組織學(xué)方法來研究組織中的蛋白質(zhì)表達。jalkanen，m.等人，j.cell.biol.101:976-985，1985；jalkanen，m.等人，j.cell.biol.105:3087-3096，1987。對于檢測蛋白質(zhì)基因表達有用的其他基于抗體的方法包括免疫分析，例如，酶聯(lián)免疫吸附分析(elisa)和放射免疫分析(ria)。適合的抗體分析標記物是本領(lǐng)域已知的，包括酶標記物，例如，葡萄糖氧化酶，和放射性同位素或其他放射性試劑，例如，碘(¹²⁵i、¹²¹i)、碳(¹⁴c)、硫(³⁵s)、氚(³h)、銦(¹¹²in)和锝(⁹⁹mtc)，以及熒光標記物，例如熒光素和羅丹明，以及生物素。

除了分析生物樣品中的分泌的trail受體多肽水平或trail受體樣多肽水平之外，分泌的trail受體多肽水平或trail受體樣多肽水平也可以通過顯像來體內(nèi)檢測。用于trail受體多肽水平或trail受體樣多肽的體內(nèi)顯像的trail受體結(jié)合劑，例如，抗trail受體抗體標記物或標示物包括可通過x射線照相術(shù)、nmr或esr檢測的那些。對于x射線照相術(shù)，適合的標記物包括放射性同位素，例如鋇或銫，其產(chǎn)生可檢測的輻射，但對受試者不是明顯有害的。nmr和esr的適合的標示物包括具有可檢測的特征性自旋的標示物，例如，氘，其可以通過標記相關(guān)scfv克隆的營養(yǎng)物來摻入到trail受體結(jié)合劑中。

將已經(jīng)用合適的可檢測顯像模塊，例如放射性同位素(例如，¹³¹i、¹¹²in、⁹⁹mtc)、不透射線的物質(zhì)、或可通過核磁共振檢測的材料，進行標記的trail受體結(jié)合劑導(dǎo)入(例如，通過胃腸外、皮下或腹膜內(nèi)導(dǎo)入)受試者中。本領(lǐng)域中要理解的是，受試者的體格(size)和使用的顯像系統(tǒng)將決定產(chǎn)生診斷圖像所需的顯像模塊的量。對于放射性同位素模塊來說，對于人類受試者，注射的放射性的量通常范圍將是約5到20毫居里的⁹⁹mtc。標記的trail受體結(jié)合劑然后將優(yōu)先地積累在細胞中含有特異性目標多肽的位置。例如，在s.w.burchiel等人，tumorimaging:theradiochemicaldetectionofcancer13(1982)中描述了體內(nèi)腫瘤顯像。

因而，本技術(shù)提供了醫(yī)學(xué)狀況的診斷方法，其涉及：(a)通過測量個體的細胞或體液中本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑的結(jié)合來測定多肽的表達；(b)將基因表達的水平與標準的基因表達水平相比較，與標準表達水平相比所分析的多肽基因表達水平方面的提高或降低指示醫(yī)學(xué)狀況。

診斷用途。本技術(shù)的trail受體結(jié)合組合物在診斷方法中是有用的。因此，本技術(shù)提供了使用可用于診斷受試者中與trail受體相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥有關(guān)的結(jié)合劑的方法?？梢赃@樣地選擇本技術(shù)的結(jié)合劑，使得它們對trail受體多肽具有任何水平的表位結(jié)合特異性以及非常高的結(jié)合親和力。一般地，結(jié)合劑的結(jié)合親和力越高，在免疫測定中可以實施越嚴格的洗滌條件，來除去非特異性結(jié)合的材料而不移除目標多肽。因而，在診斷測定中有用的本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑通常具有至少10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²m^-1的結(jié)合親和力。進一步地，理想的是用作診斷試劑的trail受體結(jié)合劑具有足夠的動力學(xué)啟動速率(kineticon-rate)以在至少12小時、優(yōu)選的至少五(5)小時、更優(yōu)選的至少一(1)小時中在標準條件下達到平衡。

本技術(shù)的某些方法采用了抗trail受體抗體的多克隆制備物以及抗trail受體抗體組合物作為診斷試劑，其他方法采用了單克隆分離物。相比由一種單克隆抗trail受體抗體組成的組合物，多克隆混合物的使用具有許多優(yōu)勢。通過結(jié)合到trail受體多肽、多克隆抗trail受體抗體或其他多肽上的多個位點，可以產(chǎn)生比結(jié)合到trail受體多肽或trail受體樣多肽上單個位點的單克隆更強的(用于診斷的)信號。進一步地，多克隆制備物可以結(jié)合到原型目標序列的多種變體(例如，等位變體、種間變體、株系變體、藥物誘導(dǎo)的逃逸變體(escapevariant))，而單克隆抗體僅可以結(jié)合原型序列或較上述范圍為窄的變體。然而，在存在或潛在存在近相關(guān)抗原的情況下，單克隆的抗trail受體抗體對于檢測單一抗原是有利的。

在采用根據(jù)上述方法制備的多克隆人類抗trail受體抗體的方法中，制備物一般包含具有針對目標多肽的不同表位特異性的trail受體結(jié)合劑(例如抗體)的配列(assortment)。在某些采用單克隆抗體的方法中，理想的是具有不同的表位結(jié)合特異性的兩種抗體。表位結(jié)合特異性上的差異可以通過競爭性結(jié)合測定法來測定。

雖然作為人類抗體的trail受體結(jié)合劑可以用作任何類型的樣品的診斷試劑，它們作為對于人類生物樣品的診斷試劑是最有用的。trail受體結(jié)合劑可以用于在各種標準的測定模式中檢測給定的trail受體多肽。這些模式包括免疫沉淀、western印跡、elisa、放射免疫測定和免疫測定分析(immunometricassay)。參見harlow&lane，antibodies，alaboratorymanual(coldspringharborpublications，newyork，1988)；美國專利no.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,879,262；4,034,074，3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876。生物樣品可以從受試者的任何組織或體液獲得。

免疫測定或夾心分析是本技術(shù)的診斷方法的優(yōu)選的形式。參見美國專利no.4,376,110，4,486,530，5,914,241和5,965,375。這些分析使用固定到固相上的一種trail受體結(jié)合劑，例如，抗trail受體抗體或抗trail受體抗體的群體，以及另一種抗trail受體抗體或抗trail受體抗體的群體。一般地，對溶液抗trail受體抗體或抗trail受體抗體的群體加以標記。如果使用抗體群體，所述群體一般含有結(jié)合于目標多肽的不同表位特異位點的抗體。因而，對于固相和溶液抗體可以使用相同的群體。如果使用抗trail受體單克隆抗體，則對于固體和溶液相使用具有不同的結(jié)合特異性的第一和第二trail受體單克隆抗體。固相和溶液抗體可以依序地或同時地與目標抗原接觸。如果固相抗體首先接觸，則分析稱為正向分析。反之，如果溶液抗體首先接觸，則分析稱為反向分析。如果目標與兩種抗體同時地接觸，則分析稱為同時分析。在使抗trail受體抗體接觸trail受體多肽之后，將樣品溫育一定時期，通常從約10分鐘到約24小時，通常是約1小時。然后進行洗滌步驟來除去樣品中沒有特異性地結(jié)合于用作診斷試劑的抗trail受體抗體的成分。當固相抗體和溶液抗體在不同的步驟中結(jié)合時，可以在任一或兩個結(jié)合步驟之后進行洗滌。在洗滌之后對結(jié)合加以定量，定量一般通過檢測連接到固相上的標記物來進行，其中所述標記物是通過被標記的溶液抗體的結(jié)合而連接到固相的。通常，對于給定的一對抗體或一對抗體群體，以及給定的反應(yīng)條件，從含有已知濃度的目標抗原的樣品制備標準曲線。然后通過標準曲線的內(nèi)插來讀取被測試的樣品中trail受體多肽的濃度。被分析物可以根據(jù)在平衡狀態(tài)結(jié)合的標記溶液抗體的量，或通過在達到平衡之前一系列時間點上結(jié)合的標記溶液抗體的動力學(xué)測量來測量。這種曲線的斜率是樣品中trail受體多肽的濃度的度量。

用于上述方法的適合的支持物包括，例如，硝酸纖維素膜、尼龍膜和衍生化的尼龍膜，以及顆粒，例如瓊脂糖、基于葡聚糖的凝膠、浸漬片(dipsticks)、顆粒、微球體、磁性顆粒、試管、微量滴定孔、sephadex^tm(amershampharmaciabiotech，piscatawayn.j.)等等。固定可以通過吸附或通過共價附接來實現(xiàn)。任選地，抗trail受體抗體可以連接到接頭分子，例如，生物素，用于附接于結(jié)合在表面上的接頭，例如抗生物素蛋白上。

預(yù)測醫(yī)學(xué)。本技術(shù)還涉及預(yù)測醫(yī)學(xué)(predictivemedicine)的領(lǐng)域，其中為了預(yù)后(預(yù)測)目的使用診斷分析、預(yù)后分析、藥物基因組學(xué)以及監(jiān)控臨床試驗等來預(yù)防性地處理個體。因而，本技術(shù)的一個方面涉及用于確定生物樣品(即血液、血清、細胞、組織)中trail受體多肽表達的診斷分析，以確定受試者是否患有與異常的trail受體多肽表達相關(guān)的疾病或病癥，或具有發(fā)生這樣的病癥的風險。

本技術(shù)還提供了預(yù)后(或預(yù)測)分析，用于確定個體是否存在發(fā)展出與trail受體多肽表達或活性相關(guān)的病癥的風險。這些分析可以用于預(yù)后或預(yù)測目的，以便在以trail受體多肽為特征、或與trail受體多肽相關(guān)的病癥發(fā)作之前預(yù)防性地處理個體。此外，在本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑對trail受體多肽相對于對其多態(tài)型具有更高親和力的情況下(反之亦然)，本技術(shù)的方法也可以用于評估個體是表達trail受體多肽或是表達trail受體多肽的多態(tài)型。

在受試者的特定組織中(或在血液中)，某些多肽的水平可能是當給定藥物施用給受試者時該藥物的毒性、效力、清除速率或代謝速率的指示。在此描述的方法也可以用于測定這樣的多肽在受試者中的水平以幫助預(yù)測這些受試者對這些藥物的反應(yīng)。本技術(shù)的另一個方面提供了一種方法來測定個體中trail受體多肽的表達，從而為該個體選擇合適的治療性或預(yù)防性化合物(在此稱為“藥物基因組學(xué)”)。利用藥物基因組學(xué)，可以根據(jù)個體的基因型選擇用于個體的治療或預(yù)防性處理的化合物(例如藥物)(例如，檢查個體的基因型來確定個體對于特定化合物的響應(yīng)能力)。

本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑與trail受體多肽或trail受體樣多肽的結(jié)合，例如，可以被利用來鑒定具有發(fā)生與trail受體多肽或trail受體樣多肽表達或活性相關(guān)的病癥(如上文描述的)的風險的受試者。另外一種方式，可以利用預(yù)后分析來鑒定具有或存在風險發(fā)生所述疾病或病癥的受試者。因而，本技術(shù)提供了一種方法來鑒定與異常的trail受體多肽或trail受體樣多肽表達或活性相關(guān)的疾病或病癥，其中從受試者獲得測試樣品，檢測trail受體結(jié)合劑，其中存在trail受體結(jié)合劑的改變是受試者具有或有風險發(fā)生與異常的trail受體多肽或trail受體樣多肽表達或活性相關(guān)的疾病或病癥的診斷依據(jù)。如本文所用，“測試樣品”是指從感興趣的受試者獲得的生物樣品。

此外，在此描述的預(yù)后分析可以用于確定受試者是否可以施用化合物(例如，激動劑、拮抗劑、擬肽(peptidomimetics)、多肽、肽、核酸、小分子或其他藥物候選物)來治療與異常的trail受體多肽或trail受體樣多肽表達或活性相關(guān)的疾病或病癥。例如，這種方法可用于確定是否可以用化合物有效地治療受試者的trail受體多肽或trail受體樣多肽相關(guān)的病癥。因而，本技術(shù)提供了用于確定是否可以用化合物有效地治療受試者的與異常的trail受體多肽或trail受體樣多肽表達或活性相關(guān)的病癥的方法，其中獲得測試樣品，并利用trail受體結(jié)合劑檢測trail受體多肽或trail受體樣多肽(例如，其中存在trail受體多肽或trail受體樣多肽是可以施用所述化合物來治療該受試者的與異常的trail受體多肽或trail受體樣多肽表達或活性相關(guān)的病癥的診斷依據(jù))。

從受試者獲得血液或組織樣品，測定其中trail受體多肽或trail受體樣多肽的水平，并與獲自沒有所述疾病的個體的血液樣品或相同組織類型的樣品中存在的水平相比較。與獲自健康受試者的樣品相比，在獲自懷疑患有trail受體多肽或trail受體樣多肽相關(guān)疾病的受試者的樣品中trail受體多肽或trail受體樣多肽的過高豐度(或過低豐度)是在被測試的受試者中與trail受體多肽或trail受體樣多肽相關(guān)的疾病的指示。做出陽性診斷可能需要進一步的測試。

在許多疾病中，某些trail受體多肽或trail受體樣多肽分子的過量表達(或減量表達)的程度是受試者是否患有可能響應(yīng)于特定種類的治療或處理的疾病的指示。因而，檢測樣品中trail受體多肽或trail受體樣多肽的方法可以用作預(yù)后的方法，例如，來評估受試者所述治療或處理應(yīng)答的可能性。測定來自所述受試者的適合的組織或血液樣品中相關(guān)的預(yù)后性多肽的水平，并與適合的對照，例如患有相同疾病但是對治療應(yīng)答良好的受試者中的水平相比較。與對照相比在樣品中預(yù)后性多肽過量表達(或減量表達)的程度可以是受試者將不會良好地應(yīng)答處理或治療的可能性的預(yù)示。相對于對照的過量表達(或減量表達)越多，受試者將對治療有應(yīng)答的可能性越小。

已經(jīng)知道，在多種疾病中，本文中稱為“預(yù)測性多肽”的某些目標多肽的過量表達(或減量表達)的程度是受試者是否將發(fā)病的指示。因而，檢測樣品中trail受體多肽或trail受體樣多肽的方法可以用作預(yù)測受試者是否將發(fā)生疾病的方法。測定來自處于發(fā)生疾病的風險中的受試者的適合的組織或血液樣品中相關(guān)的預(yù)測性多肽的水平，并與適合的對照，例如不具有發(fā)生所述疾病的風險的受試者中的水平相比較。與對照相比在樣品中預(yù)測性多肽過量表達(或減量表達)的程度可以是受試者將發(fā)生疾病的可能性的預(yù)示。相對于對照的過量表達(或減量表達)越多，受試者將發(fā)生疾病的可能性越高。

本文描述的方法可以，例如，通過使用包含至少一種探針試劑(例如本文所述的trail受體結(jié)合劑)的預(yù)包裝的診斷試劑盒來進行，所述試劑盒可以方便地使用，例如在臨床醫(yī)療設(shè)施中診斷表現(xiàn)涉及trail受體多肽或trail受體樣多肽的疾病或病狀的癥狀或家族史的受試者。此外，其中表達trail受體多肽或trail受體樣多肽的任何細胞類型或組織均可以在本文描述的預(yù)后分析中加以利用。

b.trail受體結(jié)合劑的預(yù)防性和治療性用途

1.概述

本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑(例如，具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體；具有重鏈cdr氨基酸序列syfih，wiypgnvntkysekfkg和geagyfd和輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava，wastrht和qqhyrtpw；具有如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列；huctb006抗體)可用于預(yù)防或治療疾病。在一些實施方式中，本技術(shù)提供了治療患有(或易患有)病癥或具有與異常的trail受體結(jié)合劑表達或活性相關(guān)的病癥的受試者的預(yù)防和/或治療方法。因此，本技術(shù)提供了用于預(yù)防和/或治療受試者中與trail受體相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的方法，包括向有需要的受試者施用有效量的trail受體結(jié)合劑。例如，受試者可以施用本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑組合物以盡量替代不存在或降低的trail受體多肽(例如胰島素)的水平，以補充不同多肽(例如抗trail受體抗體)的不存在或降低的水平，以抑制多肽的活性(例如癌基因)，以激活trail受體多肽(例如結(jié)合受體)的活性，通過與游離配體(例如用于減少炎癥的可溶性tnf受體)競爭來降低膜結(jié)合受體的活性，或以產(chǎn)生期望的反應(yīng)(例如，血管生長)。

本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑可用于預(yù)防和治療應(yīng)用于受試者中的各種疾病，包括但不限于：治療、抑制或預(yù)防疾病，病癥或狀況，包括惡性疾病，病癥或與該疾病或病癥相關(guān)的病癥，例如與增加的細胞相關(guān)的疾病存活或抑制凋亡，例如癌癥(例如濾泡性淋巴瘤、p53突變的癌和激素依賴性腫瘤，包括但不限于結(jié)腸癌、心臟腫瘤、胰腺癌、黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、肺癌、腸癌、睪丸癌、胃癌、成神經(jīng)細胞瘤、粘液瘤、肌瘤、淋巴瘤、內(nèi)皮瘤、成骨細胞瘤、破骨細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、卡波西肉瘤和卵巢癌)；自身免疫性疾病(例如，多發(fā)性硬化癥、干燥綜合征、格雷夫病、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性糖尿病、膽汁性肝硬化、貝切特氏病、克羅恩病、多發(fā)性肌炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫相關(guān)性腎小球腎炎、自身免疫性胃炎、自身免疫性血小板減少性紫癜和類風濕性關(guān)節(jié)炎)以及病毒感染(例如皰疹病毒，痘病毒和腺病毒)；炎癥；移植物抗宿主病(急性和/或慢性)；急性移植排斥反應(yīng)和慢性移植排斥反應(yīng)。本公開的抗原結(jié)合多肽，其變體或衍生物用于抑制癌癥，特別是上面或下面段落中列出的癌癥的生長，進展和/或轉(zhuǎn)移。

本公開的抗體或變體或其衍生物可治療、預(yù)防、診斷和/或預(yù)后的與細胞存活增加相關(guān)的其它疾病或狀況包括但不限于惡性腫瘤的進展和/或轉(zhuǎn)移和相關(guān)疾病如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴細胞白血病，急性骨髓性白血病(包括成髓細胞、早幼粒細胞、骨髓單核細胞、單核細胞和紅白血病))和慢性白血病(例如慢性骨髓性(粒細胞性)白血病和慢性淋巴細胞性白血病))，真性紅細胞增多癥，淋巴瘤(例如霍奇金病和非霍奇金病)，多發(fā)性骨髓瘤，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥，重鏈疾病和實體瘤包括但不限于肉瘤和癌，例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆(wilm)腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聲神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤、腦膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、成神經(jīng)細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤。

本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑可用于受試者的潛在預(yù)防和治療應(yīng)用，包括但不限于涉及骨細胞發(fā)育、分化和活化的那些；在血液循環(huán)中的細胞的疾病或病理中，例如紅細胞和血小板；各種免疫病癥和/或病理；肺部疾病和病癥；自身免疫性疾病和炎性疾??；心血管疾?。淮x疾?。簧臣膊?、腎臟疾病、糖尿病、腦外傷、癌癥生長和轉(zhuǎn)移；病毒感染、癌癥治療、牙周?。唤M織再生；急性淋巴細胞白血??；膠質(zhì)瘤；神經(jīng)系統(tǒng)疾病；神經(jīng)退行性疾病；阿爾茨海默氏病；帕金森病和造血障礙。

在一些實施方式中，藥物有效量的抗trail-r2抗體通過與靶細胞接觸誘導(dǎo)細胞死亡。識別trail-r2的抗體或識別trail-r2的人源化抗體的藥學(xué)有效量是給予個體后足以引起期望效果的量。施用藥物有效量的trail-r2識別抗體的期望效果包括靶細胞的死亡，靶細胞生長的抑制，trail-r2的刺激和與靶細胞中的trail-r2的結(jié)合。靶細胞是表達trail-r2的細胞，例如包括異常生長細胞如人癌細胞和白血病細胞。還包括具有病理狀況的細胞，其中細胞增殖異常或失調(diào)，如惡性或良性癌癥的細胞。因此，在一些實施方式中，抗trail受體結(jié)合劑可用于預(yù)防或治療癌癥生長和/或轉(zhuǎn)移的方法，所述方法例如但不限于在有需要的受試者中的乳腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、腦癌、胰腺癌和結(jié)腸直腸癌。在一個實施方式中，trail受體結(jié)合劑具有體外細胞凋亡誘導(dǎo)活性，其中所述結(jié)合劑可以以等于或低于10μg/ml的濃度，誘導(dǎo)至少30％的細胞死亡，優(yōu)選至少50％、70％、90％，更優(yōu)選100％細胞死亡。在一個實施方式中，trail受體結(jié)合劑具有體內(nèi)細胞凋亡誘導(dǎo)活性，其中當用等于或小于10mg/kg體重的劑量治療時，結(jié)合劑可以減少人類癌癥異種移植物模型中至少30％的腫瘤大小，優(yōu)選至少50％、70％、90％，更優(yōu)選100％。

當體內(nèi)用于治療時，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑，例如抗trail受體抗體以有效量(即具有期望的治療效果的量)施用給所述受試者。在一些實施方式中，施用為胃腸外。對于胃腸外施用，在一些實施方式中，trail受體結(jié)合劑將與藥學(xué)上可接受的胃腸外施用載體相結(jié)合，以單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳劑)配制。這些載體本身是無毒的，非治療性的。

劑量和給藥方案將取決于trail受體相關(guān)疾病或病癥的程度、使用的特定trail受體結(jié)合劑的特征，例如它的治療指數(shù)，受試者和受試者的病史。在一些實施方式中，trail受體結(jié)合劑在1-2周的時間內(nèi)連續(xù)地進行靜脈內(nèi)施用來治療血管系統(tǒng)中的細胞，以及皮下和腹膜內(nèi)施用來治療局部的淋巴結(jié)。

使用抗trail受體igm抗體對于某些應(yīng)用是優(yōu)選的。然而，igg分子由于更小，比igm分子更有能力定位到某些類型的感染細胞。有證據(jù)表明，體內(nèi)的補體激活產(chǎn)生了多種生物學(xué)效果，包括炎癥性反應(yīng)的誘導(dǎo)和巨噬細胞的活化(unanue和benecerraf，textbookofimmunology，2ndedition，williams&wilkins，p.218(1984))。伴隨炎癥的提高的血管舒張可以提高各種試劑定位到受感染細胞中的能力。因此，本技術(shù)指定的類型的trail受體抗體組合可以通過多種方式治療性地使用。另外，抗原，例如純化的trail受體多肽，其片段或類似物(hakomori，ann.rev.immunol.2:103，1984)或與這些抗原相關(guān)的抗獨特型抗體(nepom等人，proc.natl.acad.sci.usa81:2864，1985；koprowski等人，proc.natl.acad.sci.usa81:216，1984)可以用于在人類受試者中誘導(dǎo)主動免疫應(yīng)答。這樣的應(yīng)答包括形成能夠活化人類補體的抗體，以實現(xiàn)期望的生物學(xué)效果，例如破壞目標細胞。

2.特征為trail受體水平升高的疾病和病癥

對于以trail受體多肽水平或生物學(xué)活性提高(相對于不患有所述疾病或病癥的受試者)為特征的疾病和病癥，可以用拮抗(即降低或抑制)活性的基于trail受體結(jié)合劑的治療化合物來加以治療，所述化合物可以以治療性或預(yù)防性的方式施用?？梢岳玫闹委熁衔锇?，但不限于：(i)前述的trail受體結(jié)合劑；和(ii)編碼trail受體結(jié)合劑的核酸。

對于以trail受體多肽水平或生物學(xué)活性降低(相對于不患有所述疾病或病癥的受試者)為特征的疾病和病癥，可以用提高trail受體活性(即是trail受體活性激動劑)的基于trail受體結(jié)合劑的治療化合物來加以治療。上調(diào)活性的治療劑可以以治療性或預(yù)防性方式來施用?？梢岳玫闹委焺┌ǖ幌抻?，提高生物利用率的trail受體結(jié)合劑。

提高或降低的水平可以容易地通過定量trail受體結(jié)合劑誘導(dǎo)的肽和/或rna來檢測，定量是通過獲得受試者的組織樣品(例如來自活檢組織)并體外分析它的rna或肽水平，表達的trail受體多肽的結(jié)構(gòu)和/或活性(或前述多肽的mrna)。本領(lǐng)域公知的方法包括但不限于，免疫測定(例如通過western印跡分析、免疫沉淀以及隨后十二烷基硫酸鈉(sds)聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細胞化學(xué)等等)和/或雜交測定來檢測mrna的表達(例如northern測定、斑點印跡、原位雜交等等)。

3.預(yù)防方法

在一個方面，本技術(shù)提供了一種方法，通過向所述受試者施用調(diào)節(jié)trail受體多肽表達或至少一種trail受體多肽活性的trail受體結(jié)合劑(例如，具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體；具有重鏈cdr氨基酸序列syfih，wiypgnvntkysekfkg和geagyfd和輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava，wastrht和qqhyrtpw；具有如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列；huctb006抗體)，來預(yù)防受試者中與異常的trail受體表達或活性相關(guān)的疾病或狀況。

處于由異常的trail受體多肽表達或活性引起或促發(fā)的疾病的風險中的受試者可以通過例如在此描述的診斷或預(yù)后分析的任何或組合來鑒定。在預(yù)防性的應(yīng)用中，針對有風險發(fā)生或易感于疾病或狀況(即免疫疾病)的受試者施用trail受體結(jié)合劑的藥物組合物或藥物，施用的量以足夠消除或降低疾病風險、降低疾病嚴重度、或延遲疾病的發(fā)作，包括疾病的生物化學(xué)、組織學(xué)和/或行為癥狀，疾病的并發(fā)癥，以及在疾病的發(fā)展期間呈現(xiàn)的中間病理表型。預(yù)防性trail受體結(jié)合劑(例如，具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體；具有重鏈cdr氨基酸序列syfih，wiypgnvntkysekfkg和geagyfd和輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava，wastrht和qqhyrtpw；具有如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列；huctb006抗體)的施用可以發(fā)生在出現(xiàn)異常的特征癥狀之前，從而預(yù)防疾病或病癥，或者延遲其發(fā)展。取決于異常的類型，例如，可以用trail受體結(jié)合劑作為trail受體激動劑或trail受體拮抗劑來治療所述受試者。合適的化合物可以根據(jù)在此描述的篩選分析來確定。

4.治療方法

本技術(shù)的另一個方面包括以治療為目的調(diào)節(jié)受試者中trail受體多肽表達或活性的方法。本技術(shù)的調(diào)節(jié)方法包括用本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑(例如，具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體；具有重鏈cdr氨基酸序列syfih，wiypgnvntkysekfkg和geagyfd和輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava，wastrht和qqhyrtpw；具有如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列；huctb006抗體)接觸細胞，所述試劑調(diào)節(jié)與細胞相關(guān)的trail受體多肽活性中的一種或多種活性。在治療應(yīng)用中，對懷疑患有或已經(jīng)患有疾病的受試者施用組合物或藥物，施用的量足夠治愈、或至少部分地延滯所述疾病的癥狀(生物化學(xué)的、組織學(xué)的和/或行為的)，包括它的并發(fā)癥和疾病的發(fā)展中的中間病理表型。足夠?qū)崿F(xiàn)治療或預(yù)防性治療的量被定義為治療或預(yù)防有效量。

在此描述了調(diào)節(jié)trail受體多肽活性的化合物，可以包括，例如編碼trail受體結(jié)合劑或trail受體結(jié)合劑相關(guān)多肽的核酸。在一個實施方式中，trail受體結(jié)合劑刺激一種或多種trail受體多肽活性。這種刺激性化合物的實例包括trail受體結(jié)合劑和已經(jīng)被導(dǎo)入細胞中，編碼trail受體結(jié)合劑的核酸分子。在另一個實施方式中，trail受體結(jié)合劑抑制一種或多種trail受體多肽活性。這些調(diào)節(jié)方法可以在體外進行(例如通過將細胞和trail受體結(jié)合劑一起培養(yǎng))，或另外一種選擇，在體內(nèi)進行(例如通過向受試者施用所述trail受體結(jié)合劑)。因而，本技術(shù)提供一種治療患有trail受體相關(guān)疾病或病癥的個體的方法，所述疾病或病癥以trail受體多肽或編碼trail受體多肽的核酸分子的異常的表達或活性為特征。在一個實施方式中，所述方法包括施用trail受體結(jié)合劑(例如通過在此描述的篩選分析方法鑒定的化合物)，或調(diào)節(jié)(例如上調(diào)或下調(diào))trail受體多肽表達或活性的組合trail受體結(jié)合劑。在另一個實施方式中，所述方法包括施用trail受體結(jié)合劑或編碼trail受體結(jié)合劑的核酸分子，作為補償降低的或異常的trail受體多肽表達或活性的療法。在trail受體多肽被異常下調(diào)的情況中，對trail受體多肽活性的刺激是期望的。

5.癌癥和惡性腫瘤治療

如上所述，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑(例如，具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體；具有重鏈cdr氨基酸序列syfih，wiypgnvntkysekfkg和geagyfd和輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava，wastrht和qqhyrtpw；具有如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列；huctb006抗體)在治療和預(yù)防治療方法的情景中是有用的。已經(jīng)保藏了產(chǎn)生本技術(shù)抗體的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006，并且已經(jīng)分配了登錄號cgmcc1691。

大多數(shù)腫瘤細胞，例如本文詳述的那些細胞表達細胞表面trail-r2，并且對本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑敏感的。在惡性腫瘤治療的情景中，本技術(shù)的抗體(例如，具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體；具有重鏈cdr氨基酸序列syfih，wiypgnvntkysekfkg和geagyfd和輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava，wastrht和qqhyrtpw；具有如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列；huctb006抗體)能夠誘導(dǎo)表達trail-r2的腫瘤細胞凋亡，具有很強的體內(nèi)殺腫瘤活性。因此，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑可用于在有需要的受試者中治療癌癥。

關(guān)于癌癥治療，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑與化學(xué)治療劑一起施用時顯示出令人驚奇和意想不到的協(xié)同作用。也就是說，trail受體結(jié)合劑和化學(xué)治療劑的組合導(dǎo)致比單獨使用化合物或組合的加成效果更大的效果。作為舉例而不是限制，組合的協(xié)同細胞毒性作用導(dǎo)致一個或多個更大的腫瘤消退，較少的腫瘤生長，減小的腫瘤體積，更強的腫瘤生長抑制和與單獨施用化學(xué)治療劑或單獨使用trail受體結(jié)合劑的相比，改善的受試者健康(例如，較少的體重減輕)。另外地或作為選擇地，在一些實施方式中，組合允許使用較低劑量的trail受體結(jié)合劑、化學(xué)治療劑或兩者來施用，以達到與單獨的試劑相同或更好的結(jié)果。另外地或作為選擇地，在一些實施方式中，trail受體結(jié)合劑，例如具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006(例如huctb006)相同的表位特異性的單克隆抗體和化學(xué)治療劑的組合可更有效地減少或消除腫瘤或腫瘤生長(例如，在更短的時間內(nèi)，更低的劑量，更少的劑量或更少的治療)，或者比單獨使用任一化合物的治療更有效地預(yù)防或減少轉(zhuǎn)移。

如上所述，當本文公開的trail受體結(jié)合劑與化學(xué)治療劑組合使用來治療癌癥時，對于殺死腫瘤細胞和/或抑制腫瘤細胞增殖，提供驚人的和意想不到的協(xié)同作用，或甚至顯著的協(xié)同作用。作為舉例而不是限制，在一些實施方式中，trail受體結(jié)合劑和化學(xué)治療劑的組合療法對腫瘤細胞的活力具有顯著的協(xié)同或協(xié)同的細胞毒性作用。

另外地或作為選擇地，在一些實施方式中，trail受體結(jié)合劑和化學(xué)治療劑的組合治療的協(xié)同作用是針對腫瘤體積和腫瘤重量。

在一些實施方式中，癌癥/腫瘤是結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和白血病中的一種或多種。

在一些實施方式中，與trail受體結(jié)合劑組合使用的化學(xué)治療劑是以下中的一種或多種：長春花生物堿、破壞微管形成的試劑(例如秋水仙堿及其衍生物)、抗血管生成劑、治療性抗體、egfr靶向劑、酪氨酸激酶靶向劑(如酪氨酸激酶抑制劑)、過渡金屬絡(luò)合物、蛋白酶體抑制劑、抗代謝物(如核苷類似物)、烷化劑、鉑類藥劑、蒽環(huán)類抗生素、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、大環(huán)內(nèi)酯類、治療性抗體、類維生素a(如全反式視黃酸或其衍生物)；格爾德霉素或其衍生物(如17-aag)、阿霉素、秋水仙堿、環(huán)磷酰胺、放線菌素、博來霉素、多柔比星、多柔比星、表柔比星、絲裂霉素、甲氨蝶呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡鉑、卡莫司汀(bcnu)、甲基ccnu、順鉑、依托泊苷、干擾素、喜樹堿及其衍生物、苯芥膽甾醇(phenesterine)、紫杉烷及其衍生物(如紫杉醇(taxol)、紫杉醇(palitaxel)及其衍生物，泰索帝及其衍生物等等)、拓撲替康、長春花堿、長春新堿、他莫昔芬、哌泊舒凡(piposulfan)、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康、hkp、ortataxel、吉西他濱、奧沙利鉑、長春瑞濱、卡培他濱、拉帕替尼、索拉非尼、厄洛替尼、愛必妥，包含硫代秋水仙堿衍生物和載體蛋白(例如白蛋白)的納米顆粒、抗腫瘤劑包括但不限于卡鉑、(vinorelbine)，蒽環(huán)類拉帕替尼(gw57016)、吉西他濱卡培他濱順鉑、5-氟尿嘧啶(5-fu)、表柔比星(epirubicin)、環(huán)磷酰胺，及其衍生物，和本領(lǐng)域公認的其它標準化學(xué)治療劑。在一些實施方式中，化學(xué)治療劑是5-氟尿嘧啶或紫杉醇(taxol)。

鑒于令人驚奇和意想不到的協(xié)同作應(yīng)，在一些實施方式中，組合療法允許較低劑量或更少劑量的化學(xué)治療劑，從而降低對正常細胞的毒性。在這方面，在一些實施方式中，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑的施用在化學(xué)療法(例如輻射、化學(xué)治療的聯(lián)合循環(huán))以及施用腫瘤壞死因子、干擾素或其它物質(zhì)的過程中進行細胞保護或免疫調(diào)節(jié)劑的過程中進行。因此，本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑和可用于輔助治療的化合物可以與需要施用的受試者同時并依序或分開施用。

6.測定基于trail受體結(jié)合劑的治療劑的生物學(xué)效應(yīng)

在本技術(shù)的各種實施方式中，進行合適的體外或體內(nèi)測定以確定特定的基于trail受體結(jié)合劑的治療劑的效果，以及是否指示其施用用于治療受試者中的受影響組織。

在各種實施方式中，體外測定可以用涉及受試者疾病的類型的代表性細胞進行，以確定給定的基于trail受體結(jié)合劑的治療劑是否對細胞類型施加期望的效果。用于治療的化合物可以在合適的動物模型系統(tǒng)中測試，包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴、兔等，然后在人類受試者中測試。類似地，對于體內(nèi)測試，可以在施用于人類受試者之前使用本領(lǐng)域已知的任何動物模型系統(tǒng)。

7.治療方案和有效劑量

一些組合物包括多種(例如兩種或更多)本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑的組合。在一些組合物中，組合物的每一種trail受體結(jié)合劑都是結(jié)合trail受體多肽的獨特的、預(yù)先選擇的表位的單克隆抗體或人類序列抗體。

對于本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑，例如抗trail受體抗體或抗trail受體抗體-細胞毒素綴合物而言，其用于治療本文所述的trail受體相關(guān)狀況和疾病的有效劑量取決于許多不同的因素而變化，包括施用的方式、目標部位、受試者的生理狀態(tài)、受試者是人類還是動物、使用的其他藥物，以及治療是預(yù)防性還是治療性的。通常，受試者是人類，但非人哺乳動物包括轉(zhuǎn)基因哺乳動物也可以被治療。治療劑量需要被滴定以優(yōu)化安全性和效力。

一般地，本技術(shù)的組合物(compositions)的足以實現(xiàn)治療或預(yù)防效果的有效量，范圍為從約0.000001mg/千克體重/天到約10,000mg/千克體重/天。在一些實施方式中，劑量范圍從約0.0001mg/千克體重/天到約100mg/千克體重/天。對于施用trail受體結(jié)合劑，例如抗trail受體抗體，劑量范圍每周從約0.0001到100mg/kg/周，或每周約0.01到5mg/kg宿主體重。例如劑量可以是每周1mg/kg體重或10mg/kg體重，或在每周1-10mg/kg的范圍內(nèi)。在一些實施方式中，抗體的單個劑量的范圍是0.1-10,000微克/千克體重。在一些實施方式中，載體中的抗體濃度為每個遞送毫升0.2到2000微克。示范性的治療方式需要每兩周施用一次，或每月一次，或每3到6個月一次。在一些方法中，具有不同的結(jié)合特異性的兩種或更多trail受體結(jié)合劑同時地施用，在這種情況下，施用的每種抗體的劑量落入所標明的范圍內(nèi)。trail受體結(jié)合劑，例如抗trail受體抗體通常在多種場合施用。單次施用之間的間隔可以是每周、每月或每年。間隔也可以是不規(guī)則的，通過測量受試者中抗體的血液水平來指示。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量來實現(xiàn)血漿trail受體結(jié)合劑(例如抗trail受體抗體)濃度為1-1000μg/ml，在一些方法中25-300μg/ml。另外一種選擇，trail受體結(jié)合劑(例如抗trail受體抗體)可以作為持續(xù)釋放配制劑施用，在這種情況下需要的施用頻率較低。劑量和頻率取決于受試者中trail受體結(jié)合劑的半衰期而變化。一般地，人類抗trail受體抗體顯示的半衰期最長，接著是人源化抗trail受體抗體、嵌合抗trail受體抗體、和非人類抗trail受體抗體。施用的劑量和頻率可以取決于治療是預(yù)防性的還是治療性的而變化。在預(yù)防性的應(yīng)用中，用一段較長的時間以相對低頻率的間隔施用相對低的劑量。一些受試者終身持續(xù)接受治療。在治療應(yīng)用中，有時是需要相對短間隔的相對高劑量，直到疾病的發(fā)展被降低或終止，優(yōu)選地，直到受試者顯示疾病的癥狀的部分或完全改善。此后，本專利可以施用預(yù)防性的方案(thepatentcanbeadministeredaprophylacticregime)。編碼trail受體免疫原的核酸的劑量范圍是每位受試者從約10ng到1g、100ng到100mg、1μg到10mg或30-300μgdna。傳染性病毒載體的劑量為每劑10-100或更多個病毒顆粒不等。

8.毒性

在一些實施方式中，在此描述的有效量(例如劑量)的trail受體結(jié)合劑將提供治療益處而不產(chǎn)生對受試者的實質(zhì)上的毒性。在此描述的trail受體結(jié)合劑的毒性可以在細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏欣脴藴仕帉W(xué)程序，例如通過測定ld50(對50％的群體致死的劑量)或ld100(對100％的群體致死的劑量)來確定。毒性作用的和治療作用之間的比例是治療指數(shù)。利用這些細胞培養(yǎng)測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)，可制定對人類使用無毒的劑量范圍。在此描述的trail受體結(jié)合劑的劑量優(yōu)選地處于一定范圍的循環(huán)濃度內(nèi)，所述濃度包括毒性很小或沒有毒性的有效劑量。取決于采用的劑型和使用的施用途徑，劑量可以在這個范圍內(nèi)變動?？梢杂舍t(yī)師個人根據(jù)受試者的狀況選擇確切的配方、施用途徑和劑量。參見，例如fingl等人，in:thepharmacologicalbasisoftherapeutics，ch.1(1975)。

9.試劑盒

本技術(shù)的范圍還涵蓋包含trail受體結(jié)合劑組合物(例如，具有與cgmcc登錄號1691的小鼠-小鼠雜交瘤ctb006相同的表位特異性的單克隆抗體；具有重鏈cdr氨基酸序列syfih，wiypgnvntkysekfkg和geagyfd和輕鏈cdr氨基酸序列kasqdvstava，wastrht和qqhyrtpw；具有如seqidno:16所示的重鏈氨基酸序列和如seqidno:14所示的輕鏈氨基酸序列；huctb006抗體)和使用說明書的試劑盒。所述試劑盒可用于檢測生物樣品中trail受體多肽或trail受體樣多肽的存在。例如所述試劑盒可包含：能夠結(jié)合生物樣品中trail受體多肽或trail受體樣多肽的、經(jīng)標記的trail受體結(jié)合劑；用于測定樣品中trail受體多肽或trail受體樣多肽的量的手段；以及用于將trail受體多肽或trail受體樣多肽的量與標準品比較的手段。試劑盒成分(例如試劑)可以包裝在適合的容器中。所述試劑盒可以進一步包括使用該試劑盒檢測trail受體多肽或trail受體樣多肽的說明。

在一個實施方式中，本技術(shù)的組合物試劑盒(compositionkit)包含本技術(shù)的trail受體結(jié)合劑與疾病抑制化合物的組合，其中所述化合物是抗腫瘤藥物，例如放射性同位素、化學(xué)治療劑、治療性抗體或細胞因子。在一些實施方式中，疾病抑制化合物是化學(xué)治療劑。在一些實施方式中，化學(xué)治療劑是紫杉醇(taxol)或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)。

提供以下實施例以更充分地說明本技術(shù)的優(yōu)選的實施方式。這些實施例決不應(yīng)看作是限制本技術(shù)的范圍，本技術(shù)的范圍由附隨的權(quán)利要求確定。

實施例

實施例1huctb006的結(jié)合特異性和親和性的表征

1.1結(jié)合特異性

通過化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmunoassay，cleia)評估了huctb006的結(jié)合特異性。dr4-his–ec(批號:090222-p，0.72mg/ml，大腸桿菌)、dcr1-his(重組人trailr3/tnfrsf10c，novoproteinscience，批號:0328670)、dcr2-his(重組人trailr4/tnfrsf10d，sinobiological，批號lc06ju1502)和opg-his(重組人骨保護素(recombinanthumanosteroprotegerin)/tnfrsf11b,wuxipharmatechco.ltd，批號:20120717)被涂布在微板上，然后其被封閉(blocked)。

huctb006被稀釋至200、40和8ng/ml，然后加入孔中。在37下孵育1小時后，洗滌板。用hrp標記的二級抗體和底物溶液檢測huctb006與固定化抗原的結(jié)合。結(jié)果顯示，如圖1所示，沒有mctb006或huctb006與這些被涂布的抗原的交叉反應(yīng)，表明huctb006具有良好的結(jié)合特異性。

1.2親和性

通過表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance，spr)測定了huctb006對dr5的結(jié)合親和力。在spr測定中，使用標準胺偶聯(lián)，huctb006被固定在cm5biacore傳感器芯片上。非交聯(lián)蛋白質(zhì)被去除，并用乙醇胺封閉未反應(yīng)的位點。純化的重組人dr5-rfc蛋白的系列濃度連續(xù)流過傳感器表面。在每次測定之間，傳感器表面用10mm甘氨酸-hcl(ph2.5)重新制備。通過表面上的折射率的變化來檢測hdr5-rfc與活化表面的結(jié)合，記錄為ru(即共振單位(resonanceunits))。曲線由ru軌跡生成，并通過擬合算法進行評估，如圖2所示，將原始數(shù)據(jù)與明確的結(jié)合模型進行比較(biaevalution^tm2.0軟件)。

實施例2huctb006治療的體外有效性

2.1huctb006在人正常組織細胞系中的細胞毒性

幾種人正常組織細胞系，包括人肺上皮成纖維細胞wi-38、人胚胎肺成纖維細胞hfl-1、人臍靜脈上皮細胞huv-ec-c和人肝分化細胞，其來自肝臟誘導(dǎo)細胞(獲取自北大第三醫(yī)院)。細胞在37℃和5％co2以及含有10％fbs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。wi-38的培養(yǎng)基為mem，hfl-1和huv-ec-c的培養(yǎng)基為f-12k。細胞用奧沙利鉑處理24小時，然后不同濃度的ctb006被加入合用組。結(jié)果在處理后24小時測定，如圖3和圖4所示。被檢查的人正常組織細胞對ctb006不敏感，表明huctb006對人正常組織細胞沒有細胞毒性。

2.2ctb006在人腫瘤細胞系中的細胞毒性

用62.5、125、250、500或1000ng/mlhuctb006或不同濃度的化療藥物處理18個人類腫瘤細胞系，其作為陽性對照。細胞在37℃和5％co2以及含有10％fbs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。sk-hep-1、hepg2、hct116、sw480、widr(1×neaa)、mia-paca-2(2.5％馬血清)mda-mb-231(1mmnapyr，1xmem-neaa，1xmemvitamin)的培養(yǎng)基是dmem。colo205、bxpc3(2mm谷氨酰胺，10mmhepes)、panc2.03(15fbs，1mmnapyr、1xmem-neaa，10mm人胰島素，10mmhepes)、h2122、ovcar3(1mmnapyr，10μg/ml人胰島素，10mmhepes，2.5g/l葡萄糖)、molt-4(hepes，2.5g/l葡萄糖(glucose))、jurkat(hepes，2.5g/l葡萄糖(glucose))的培養(yǎng)基是rpmi-1640，sk-mes-1的培養(yǎng)基是eagle'smem，2-lmp和dy36t2的培養(yǎng)基是imem，sum102(5μg/ml胰島素)的培養(yǎng)基是f-12k。細胞存活率通過atplite測定試劑盒測定。如果ic50值低于62.5ng/ml，則在第二輪實驗中用更高濃度的ctb006處理細胞以確定ic50值。

結(jié)果表明，huctb006對這18個人類腫瘤細胞系有抗腫瘤活性，包括肝癌細胞系(如圖5所示，sk-hep-1和hepg2)，結(jié)腸直腸癌細胞系(如圖6和圖7所示，colo205、hct116、sw480和widr)，胰腺癌細胞系(如圖8所示，mia-paca-2、bxpc3和panc2.03)肺癌細胞系(如圖9所示h2122和sk-mes-1)，乳腺癌細胞系(如圖10和11所示，mda-mb-231、2-lmp、dy36t2和sum102)，卵巢癌細胞系(如圖12所示ovcar3)和急性t淋巴細胞白血病細胞系(如圖13所示，molt-4和jurkat)。

各種腫瘤細胞系對ctb006顯示出不同的敏感性，其中一些比其他細胞更敏感，如colo205，bxpc3，jurkat和mda-mb-231。對huctb006具有更高的敏感性的細胞系如表1所示，ic50值幾乎接近10ng/ml，表明huctb006對各種人類腫瘤細胞系具有有效和廣譜的抗腫瘤活性。

表1.huctb006對人腫瘤細胞系的ic50值

實施例3.huctb006和化療藥物組合對人腫瘤細胞系的細胞毒性作用

藥物相互作用系數(shù)(即cdi，coefficientofdruginteraction)被用來分析huctb006和化療藥物組合的協(xié)同作用(caoss等人，potentiationofantimetaboliteantitumoractivityinvivobydipyridamoleandamphotericinb.cancerchemotherpharmacol1989；24：181-186)。cdi計算如下：cdi＝ab/a×b。根據(jù)各組化學(xué)發(fā)光，ab是合用組(combinationgroups)與對照組的比(ratio)；a或b是單一藥劑組(singleagentgroup)與對照組的比。cdi值小于、等于或大于1表示藥物組合分別是協(xié)同的，加和的或拮抗的。cdi小于0.7表明藥物組合是顯著協(xié)同的。

3.1huctb006和5-fu組合對胃癌細胞系bgc823的細胞毒性作用

胃癌細胞系bgc823作為禮物獲贈。細胞在37℃，5％co2和含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用不同濃度的ctb006和125μm5-fu處理了細胞，如下表2所示。如表2所示，cdi值均小于0.7，表明huctb006和125μm5-fu對bgc823細胞系的細胞毒性作用是顯著協(xié)同的，如圖14所示。細胞用5-fu處理24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組(combinedgroup)中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表2.ctb006和5-fu組合對于bgc823的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

3.2huctb006和5-fu組合對胰腺癌細胞系panc2.03的細胞毒性作用

用不同濃度的huctb006和62.5μm5-fu處理了胰腺癌細胞系panc2.03細胞，cdi值均小于1，表明huctb006和62.5μm5-fu的細胞毒性作用對panc2.03細胞系有協(xié)同作用。此外，當ctb006的濃度高于125ng/ml時，huctb006和62.5μm5-fu對panc2.03細胞系的細胞毒性作用是顯著協(xié)同的，如圖15所示。在37℃和5％co2以及含有15％fbs、1mmnapyr、1xmem-neaa、10mm人胰島素和10mmhepes的rpmi1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)panc2.03。細胞用5-fu處理24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表3.ctb006和5-fu組合對于panc2.03的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

3.3huctb006和紫杉醇(paclitaxel)組合對肺癌細胞系的細胞毒性作用

3.3.1a549細胞系

用不同濃度的huctb006和20μg/ml紫杉醇(paclitaxel)處理了肺癌細胞系a549細胞，cdi值均小于1，如表4所示，表明huctb006和20μg/ml紫杉醇對a549細胞系的細胞毒性作用是協(xié)同的。此外，當ctb006的濃度高于250ng/ml時，huctb006和20μg/ml紫杉醇對a549細胞系的細胞毒性作用是顯著協(xié)同的，如圖16所示。在37℃和5％co2以及含有10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用紫杉醇處理24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表4.ctb006和紫杉醇組合對于a549的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

3.3.2h460細胞系

用不同濃度的huctb006和5μg/ml紫杉醇(paclitaxel)組合處理了肺癌細胞系h460細胞。cdi值均小于1，如表5所示，表明huctb006和5μg/ml紫杉醇組合對h460細胞的細胞毒性作用具有協(xié)同作用。此外，當huctb006的濃度高于50ng/ml時，huctb006和5μg/ml紫杉醇組合對h460細胞的細胞毒性作用是顯著協(xié)同的，如圖17所示。在37℃和5％co2以及含有10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用紫杉醇處理24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表5.ctb006和紫杉醇組合對于a549的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

3.4huctb006和化療藥物組合對肝癌細胞系的細胞毒性作用

3.4.1huh-7細胞系

用不同濃度的huctb006和20μm5-fu的組合處理了肝癌細胞系huh-7細胞。cdi值均小于1，如表6所示，表明huctb006和20μm5-fu組合對huh-7細胞的細胞毒性作用是協(xié)同的。此外，當huctb006濃度為1000ng/ml時，huctb006和20μm5-fu組合對huh-7細胞的細胞毒性作用是顯著協(xié)同的，如圖18所示。在37℃，5％co2和含有10％fbs和2mm谷氨酰胺的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用5-fu處理24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表6.huctb006和5-fu組合對于huh-7的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

3.4.27402細胞系

用不同濃度的huctb006和40μm吉西他濱(gemcitabine)組合處理了肝癌細胞系7402細胞，如表7所示，cdi值均小于1，表明huctb006和40μm吉西他濱組合對7402的細胞毒性作用是協(xié)同的。此外，當huctb006的濃度為500ng/ml時，huctb006和40μm吉西他濱組合對7402細胞的細胞毒性作用是顯著協(xié)同的，如圖19所示。在37℃和5％co2以及含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用吉西他濱處理24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表7.huctb006和吉西他濱組合對于7402的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

實施例4.huctb006和靶向藥物組合對人腫瘤細胞系的細胞毒性作用

4.1huctb006和靶向藥物組合對結(jié)腸直腸癌細胞系的細胞毒性作用

4.1.1sw480細胞系

用不同濃度的huctb006和10μm或5μm靶向藥物的組合處理了結(jié)腸直腸癌細胞系sw480細胞。靶向藥物包括索拉非尼(sorafenib)、拉帕替尼(lapatinib)和厄洛替尼(erlotinib)。cdi值顯示在表8中。當用不同濃度的huctb006和10μm厄洛替尼或5μm厄洛替尼或5μm拉帕替尼的組合處理sw480細胞時，cdi值小于0.7，表明huctb006和10μm厄洛替尼的組合、ctb006和5μm厄洛替尼的組合，或huctb006和5μm拉帕替尼的組合，對sw480細胞的細胞毒性作用是顯著協(xié)同的，如圖20所示。此外，huctb006和10μm拉帕替尼對sw480細胞的細胞毒性作用在huctb006的濃度為62.5ng/ml時具有顯著的協(xié)同作用。另外，62.5ng/mlhuctb006和10μm索拉非尼的組合、62.5ng/mlhuctb006和5μm索拉非尼的組合以及125ng/mlhuctb006和5μm索拉非尼組合對sw480細胞的細胞毒性作用均具有協(xié)同作用，因為cdi值小于1。在37℃和5％co2以及含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼處理24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表8.huctb006和靶向藥物組合對于sw480的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

4.1.2widr細胞系

用不同濃度的huctb006和靶向藥物(包括索拉非尼、拉帕替尼、厄洛替尼、愛必妥和赫賽汀)的組合處理了結(jié)腸直腸癌細胞系widr細胞。cdi值顯示在表9中。當使用不同濃度的huctb006和10μm索拉非尼或5μm厄洛替尼的組合處理widr細胞時，cdi值小于0.7，表明huctb006和10μm索拉非尼的組合或huctb006和5μm厄洛替尼的組合對widr細胞的細胞毒性是顯著協(xié)同的，如圖21所示。此外，當huctb006的濃度為1000ng/ml時，huctb006和5μm索拉非尼的組合或huctb006和5μm拉帕替尼的組合對widr細胞的細胞毒性作用是協(xié)同的。另外，250ng/ml，125ng/ml和62.5ng/mlhuctb006和10μm拉帕替尼或10μm厄洛替尼組合對widr細胞的細胞毒性作用是協(xié)同作用的，因為cdi值小于1。huctb006和愛必妥或ctb006和赫賽汀組合對widr細胞的細胞毒性作用都是拮抗的，因為cdi值均高于1。在37℃和5％co2以及含有10％的fbs和1×neaa的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用索拉非尼、拉帕替尼、厄洛替尼、愛必妥或赫賽汀處理了24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表9.huctb006和靶向藥物組合對于widr的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

4.2huctb006和靶向藥物組合對胃癌細胞系的細胞毒性作用

4.2.1bgc823細胞系

用不同濃度的huctb006和靶向藥物(包括索拉非尼、拉帕替尼、厄洛替尼和愛必妥)組合處理了胃癌細胞系bgc823細胞。cdi值顯示在表10中。當用不同濃度的huctb006和索拉非尼或厄洛替尼組合處理bgc823細胞時，cdi值小于0.7，表明huctb006和索拉非尼或厄洛替尼組合對bgc823細胞的細胞毒性作用是顯著協(xié)同的，如圖22所示。此外，除了125ng/mlctb006和10μm拉帕替尼的組合外，huctb006和10μm拉帕替尼對bgc823細胞的細胞毒性作用是協(xié)同的。另外，huctb006和愛必妥的組合對bgc823細胞的細胞毒性作用全部是拮抗的，因為cdi值高于1。在37℃和5％co2以及含有10％的fbs的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用索拉非尼、拉帕替尼、厄洛替尼或愛必妥處理了24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表10.huctb006和靶向藥物組合對于bgc823的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

4.2.2nugc3細胞系

用不同濃度的huctb006和靶向藥物(包括索拉非尼、拉帕替尼、厄洛替尼和愛必妥)組合處理了胃癌細胞系nugc3細胞。cdi值顯示在表11中。當用不同濃度的huctb006和10μm索拉非尼組合處理nugc3細胞時，cdi值小于1，表明huctb006和索拉非尼組合對nugc3細胞的細胞毒性作用是協(xié)同的或顯著協(xié)同的，如圖23所示。另外，huctb006和其它靶向藥物的組合對nugc3細胞的細胞毒性作用全部是拮抗的，因為cdi值高于1。在37℃和5％co2以及含有10％的fbs的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用索拉非尼、拉帕替尼、厄洛替尼或愛必妥處理了24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表11.huctb006和靶向藥物組合對于nugc3的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

4.3h460細胞系

用不同濃度的huctb006和靶向藥物(包括索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼)組合處理了肺癌細胞系h460細胞，cdi值顯示在表12中。當用huctb006和索拉非尼或huctb006和厄洛替尼組合處理h460細胞時，cdi值均小于0.7，表明ctb006和索拉非尼或厄洛替尼組合對h460細胞的細胞毒性作用是顯著協(xié)同的，如圖24所示。此外，當huctb006濃度為1000ng/ml時，huctb006和10μm拉帕替尼對h460細胞的細胞毒性作用是協(xié)同的，甚至是顯著協(xié)同的。在37℃和5％co2以及含有10％的fbs的rpmi1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼處理了24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表12.huctb006和靶向藥物組合對于h460的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

4.4huctb006和靶向藥物組合對乳腺癌細胞系的細胞毒性作用

4.4.1sk-br3細胞系

用不同濃度的huctb006和10μm或5μm靶向藥物(包括索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼)的組合處理了乳腺癌細胞系sk-br3細胞。cdi值顯示在表13中。當sk-br3細胞用不同濃度的huctb006和10μm索拉非尼組合處理時，cdi值小于0.7，當sk-br3細胞用不同濃度的huctb006和5μm索拉非尼組合處理時，cdi值小于1，表明huctb006和10μm或5μm索拉非尼組合對sk-br3細胞的細胞毒性作用是顯著協(xié)同的，如圖25所示。此外，當huctb006的濃度為1000、250和62.5ng/ml時，huctb006和10μm厄洛替尼組合對sk-br3細胞的細胞毒性作用是協(xié)同的。huctb006和拉帕替尼組合對sk-br3細胞的細胞毒性作用是拮抗的，因為cdi值高于1。在37℃和5％的co2，以及含有10％fbs的mccoy’s5a培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼處理了24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表13.huctb006和靶向藥物組合對于sk-br3的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

4.4.2sum102細胞系

用不同濃度的huctb006和10μm或5μm靶向藥物(包括索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼)的組合處理了乳腺癌細胞系sum102細胞。cdi值顯示在表14中。當sum102細胞用不同濃度的huctb006和拉帕替尼或厄洛替尼組合處理時，cdi值均大于1，表明huctb006和拉帕替尼或huctb006和厄洛替尼組合對sum102細胞的細胞毒性作用是拮抗的，如圖26所示。huctb006和索拉非尼組合對sum102細胞的細胞毒性作用除了250ng/mlhuctb006和10μm索拉非尼的組合以及125ng/mlhuctb006和5μm索拉非尼的組合外，其它都是拮抗的。細胞在37℃，5％co2和含有10％fbs和5μg/ml胰島素的f-12k培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞用索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼處理了24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表14.huctb006和靶向藥物組合對于sum102的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

4.4.3dy36t2細胞系

用不同濃度的huctb006和10μm或5μm靶向藥物(包括索拉非尼、拉帕替尼和厄洛替尼)的組合處理了乳腺癌細胞系dy36t2細胞。cdi值如表15所示。當用不同濃度的huctb006和10μm索拉非尼的組合處理dy36t2時，cdi值遠高于1，表明huctb006和10μm索拉非尼組合對dy36t2細胞的細胞毒性作用顯著拮抗，如圖27所示。當huctb006的濃度為1000、125和62.5ng/ml時，huctb006和5μm索拉非尼組合對dy36t2細胞的細胞毒性作用是協(xié)同的。huctb006和拉帕替尼組合對dy36t2細胞的細胞毒性作用除了125ng/mlhuctb006和5μm拉帕替尼的組合外，是拮抗的。此外，當用不同濃度的huctb006和厄洛替尼組合處理dy36t2時，大多數(shù)cdi值小于1，表明huctb006和厄洛替尼組合對dy36t2細胞的細胞毒性作用是協(xié)同的。細胞在37℃和5％co2以及含有10％fbs的imem培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。細胞用索拉非尼、拉帕替尼或厄洛替尼處理了24小時，然后將不同濃度的huctb006加入到合用組中，并在處理后24小時測定結(jié)果。

表15.huctb006和靶向藥物組合對于dy36t2的cdi

*協(xié)同作用(cdi<1)；**顯著協(xié)同作用(cdi<0.7)。

實施例5、體內(nèi)功效-人腫瘤細胞

在裸小鼠的皮下模型中使用四種人腫瘤細胞系(即兩個結(jié)腸癌、一個肺癌和一個胰腺癌)測驗huctb006的有效性。結(jié)果表明，即使在低劑量或微劑量下，huctb006抑制了結(jié)腸癌細胞、肺癌細胞和胰腺癌細胞的腫瘤生長，與此同時，huctb006單獨治療也顯示出與化療藥物相同的治療效果。結(jié)果是可重復(fù)的。

5.1huctb006在人類腫瘤細胞皮下模型中的療效

5.1.1藥物

huctb006(批號h61042f-p01)獲自北京同為時代生物科技有限公司(beijingcotimesbiotechco.,ltd.)；伊立替康和吉西他濱均獲自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司(jiangsuhengruimedicineco.,ltd.)；紫杉醇得自北京聯(lián)合制藥廠(beijingunionpharmaceuticalfactory)。首先將藥物粉末溶解在ns中以達到5mg/ml的濃度，然后通過0.2μm過濾膜(pall，注射器式過濾器(syringefilter))過濾。

5.1.2細胞和培養(yǎng)

h2122、colo205和mia-paca-2細胞系購自atcc。細胞在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。h2122和colo205細胞在1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；mia-paca-2細胞在dmem中培養(yǎng)；以及widr細胞在imem中培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基含有10％fcs。

5.1.3動物

動物是從軍事醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(動物證書號：scxk-(軍)2007-004)或維通利華實驗室(vitalriverlaboratories，動物證書號：scxk(京)2006-0009)購買的四(4)至六(6)周齡裸鼠。

5.1.4儀器

ivc購自蘇州豐石實驗動物設(shè)備有限公司(suzhoufengshilaboratoryanimalequipmentco.,ltd.)；游標卡尺購自北京亞中博科有限公司(beijingyazhongbokeco.ltd.)；電子天平為(bt25s，max21g，d＝0.01mg)和

5.1.5動物實驗

腫瘤細胞(即mia-paca-2、widr、h2122、colo205)以每只小鼠5×10⁶個細胞被接種在裸鼠的側(cè)腹中。當腫瘤的平均體積達到約時，將小鼠分組。劑量計劃如表16所示進行?！皅w”＝每周劑量?！皅3d”＝每三天一次?！癰iw”＝每兩周一次。

表16.動物實驗的劑量計劃

ns(即普通鹽水，normalsaline)，ctb006和伊立替康靜脈內(nèi)給藥(即i.v.intravenously)；紫杉醇和吉西他濱腹膜內(nèi)給藥(即i.p.intraperitoneally)。

每周測量兩次小鼠的體重和長軸/短軸，使用以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積＝1/2×長軸×短軸。使用以下公式計算腫瘤生長抑制(tgi，tumorgrowthinhibition)：tgi(％)＝(1-t/c)×100?！皌”表示實驗組的平均腫瘤體積(cm³)，“c”表示對照組的平均腫瘤體積(cm³)。動物隨時處于監(jiān)測之中。每周測量兩次小鼠的體重和長/短軸。當實驗結(jié)束后，處死小鼠，提取腫瘤并稱重。

5.1.6統(tǒng)計方法

腫瘤體積以平均值±標準誤差表示。使用spss16.0，one-wayanova，lsd(均勻性方差(homogeneityofvariance))或dunnettt3(方差的非均勻性(non-homogeneityofvariance))進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)變換使用log，置信區(qū)間為95％。p<0.05表示顯著差異。

5.2huctb006對人胰腺癌腫瘤細胞mia-paca-2皮下模型的治療作用

如圖28所示，huctb006對mia-paca-2皮下模型的腫瘤生長有影響。在34天治療期間，測量和計算了腫瘤體積。與對照組相比，所有實驗組的腫瘤體積格外顯著地降低，如表17所示。當使用四個huctb006劑量組(即10mg/kg、1mg/kg、0.6mg/kg和0.2mg/kg)和吉西他濱組(即60mg/kg)的腫瘤體積計算時，腫瘤生長抑制(tgi)分別為77.49％、73.86％、62.38％、47.58％和52.60％；使用腫瘤重量計算，tgi分別為89.71％、80.32％、71.09％、58.15％和55.66％?；谀[瘤體積或腫瘤重量的tgi顯示出huctb006治療的劑量依賴性反應(yīng)。huctb006劑量越高，腫瘤生長抑制越多。出乎意料和令人驚訝的是，huctb006組的一些動物顯示腫瘤消退，其在化療組(例如吉西他濱)中未發(fā)現(xiàn)。

表17.huctb006對mia-paca-2皮下模型腫瘤生長的作用

表中的顯著性(即*p<0.05)是通過比較治療組與對照組來確定的。在治療組中，較多個數(shù)的*表示更顯著的差異(¹腫瘤體積顯著變化的時間由第一次治療后的第幾天來表示；²第一次治療后第7天腫瘤體積明顯減小；從第13天起，與對照組相比無顯著差異；³huctb0061mg/kg組、huctb0060.2mg/kg組和吉西他濱組之間無顯著差異；⁴huctb0060.6mg/kg組、huctb0060.2mg/kg組和吉西他濱組之間無顯著差異；⁵huctb0060.2mg/kg組和huctb00610mg/kg組之間有顯著差異，但是與其他組比較無顯著差異)

在重復(fù)實驗中，結(jié)果相似。根據(jù)四個huctb006劑量組和吉西他濱組的腫瘤體積計算，tgi分別為58.99％、87.52％、85.35％、59.52％和34.33％。根據(jù)腫瘤重量計算，tgi分別為71.93％、92.02％、91.39％、72.38％和31.30％?；谀[瘤體積或重量的tgi顯示出huctb006治療的劑量依賴性反應(yīng)。出乎意料和令人驚訝的是，huctb006組的一些動物顯示腫瘤消退，其在化療組(例如吉西他濱)中未發(fā)現(xiàn)。

如圖29所示，對照組和huctb006治療組的體重隨時間緩慢增加，說明huctb006的毒性低。相比之下，吉西他濱治療組的小鼠體重在第三次給藥后顯著下降，戒斷一次后恢復(fù)。此后，體重維持在可接受的水平。結(jié)果在重復(fù)實驗中相似。

5.3huctb006在人結(jié)腸癌腫瘤細胞colo205皮下模型中的療效

如圖30所示，huctb006治療對人結(jié)腸癌腫瘤細胞系colo25有影響。結(jié)果是由治療后第28天的腫瘤體積計算的。如表18所示，除了huctb0060.2mg/kg組，所有實驗組的腫瘤體積與對照組相比顯著降低。當使用四種不同劑量的ctb006治療組和伊立替康組的腫瘤體積計算時，tgi分別為85.24％、80.07％、84.78％、35.62％和89.81％；使用腫瘤重量計算，tgi分別為88.15％、81.78％、84.07％、33.30％和91.54％；顯示了huctb006治療的劑量依賴性反應(yīng)。在本實驗中，出人意料和令人驚訝的是，huctb006治療組的四只動物顯示腫瘤消退，而在伊立替康組中沒有發(fā)現(xiàn)。

表18.huctb006治療對colo205皮下模型腫瘤生長的作用

表中的顯著性(即*p<0.05)是通過比較治療組與對照組來確定的(¹第一次治療后的天數(shù)。²第7天與第10天之間腫瘤體積明顯減小，其后與對照組相比無顯著差異。³第一次治療后第3天腫瘤體積明顯增加，但第7天與第10天之間無明顯差異；自17天起，腫瘤體積顯著地減小，第28天無顯著差異)。

在重復(fù)實驗中，獲得了相似的結(jié)果。使用四種huctb006給藥治療組和伊立替康組的腫瘤體積計算的tgi分別為87.12％、93.65％、79.75％、56.16％和91.64％；使用腫瘤重量計算的tgi分別為89.90％、94.33％、82.34％、58.68％和93.76％；顯示了huctb006治療的劑量依賴性反應(yīng)。在實驗中，沒有在任何組中觀察到腫瘤消退。

如圖31所示，自第10天起，對照組的體重緩慢下降，但所有huctb006治療組均未發(fā)生明顯變化。對照組體重下降可能與腫瘤快速增長有關(guān)。結(jié)果在重復(fù)實驗中相似。

5.3ctb006在人類結(jié)腸癌腫瘤細胞widr皮下模型中的治療效果

如圖32所示，huctb006治療對皮下模型中widr細胞的腫瘤生長有影響。治療后第27天用腫瘤體積計算結(jié)果。如表19所示，與對照組的腫瘤體積相比，除了huctb0060.07mg/kg組外，所有實驗組的腫瘤體積顯著降低。四種huctb006劑量組和伊立替康組的腫瘤生長抑制(tgi)使用腫瘤體積計算分別為57.34％，49.42％，18.71％，6.61％和81.34％；使用腫瘤重量計算，tgi分別為63.81％，53.48％，21.13％，11.99％和82.33％；顯示ctb006治療的劑量依賴性反應(yīng)。

在重復(fù)實驗中，獲得了類似的結(jié)果。用四組不同劑量的huctb006組和伊立替康組的腫瘤體積計算，tgi分別為53.77％，53.73％，54.98％，36.21％和71.13％。當使用腫瘤重量計算時，tgi分別為53.75％，49.85％，57.56％，39.94％和72.30％；顯示ctb006治療的劑量依賴性反應(yīng)，如表19所示。

表19.huctb006治療對widr皮下模型腫瘤的作用

表中的顯著性(即*p<0.05)是通過比較治療組與對照組來確定的。如字母數(shù)相同，則無顯著差異(¹huctb0060.22mg/kg組與huctb0060.07mg/kg組無顯著差異，p＝0.224)。

如圖33所示，在實驗中，所有組的體重沒有顯示任何顯著的變化。結(jié)果在重復(fù)實驗中相似。

5.4huctb006在人類肺癌腫瘤細胞h2122皮下模型中的療效

如圖34所示，huctb006治療對皮下模型中h2122細胞的腫瘤生長有影響。結(jié)果在處理后第38天使用腫瘤體積算得。與對照組的腫瘤體積相比，除huctb0060.2mg/kg組和ctb0060.6mg/kg組外，所有實驗組腫瘤體積均明顯減小，如表20所示。使用腫瘤體積計算，四個不同劑量的huctb006組和紫杉醇組腫瘤生長抑制(tgi)分別為91.23％、92.08％、51.06％、11.56％和48.38％；使用腫瘤重量計算的tgi分別為8.62％、92.48％、45.66％、6.45％和47.18％，顯示了huctb006治療的劑量依賴性反應(yīng)。在本實驗中，出乎意料和令人驚訝的是，huctb006治療組的一些動物顯示腫瘤消退，而化療紫杉醇組則沒有觀察到。

在重復(fù)實驗中，獲得了類似的結(jié)果。四組不同劑量的huctb006組和紫杉醇組腫瘤生長抑制率(tgi)使用腫瘤體積計算，分別為91.69％、60.12％、67.66％、35.26％、54.28％；使用腫瘤重量計算，tgi分別為92.25％、64.21％、65.94％、32.46％和50.44％；顯示了huctb006治療的劑量依賴性反應(yīng)。在本實驗中，出乎意料和令人驚訝的是，ctb006治療組的一些動物顯示腫瘤消退，而化療紫杉醇組則沒有觀察到。

表20.huctb006治療對h2122皮下模型腫瘤的作用

表中的顯著性(即*p<0.05)是通過比較治療組與對照組來確定的。如字母數(shù)相同，則無顯著差異(¹huctb0065.4mg/kg組與huctb0060.6mg/kg組比較無明顯差異；huctb0065.4mg/kg組與紫杉醇組比較無明顯差異。²huctb0061.8mg/kg組與紫杉醇組比較有明顯差異。³huctb0060.6mg/kg組與其他組比較無明顯差異。⁴huctb0061.8mg/kg組與huctb0060.6mg/kg組比較無明顯差異。⁵huctb0060.2mg/kg組與紫杉醇組比較有明顯差異)。

如圖35所示，紫杉醇組、huctb0060.2mg/kg組和對照組體重均有降低，但維持在可接受水平。結(jié)果在重復(fù)實驗中相似。

實施例6.體內(nèi)功效-人體腫瘤組織

在裸鼠皮下模型中測驗了huctb006治療對于五種人腫瘤組織的有效性，結(jié)果顯示ctb006治療與化療藥物聯(lián)合使用具有協(xié)同作用或疊加作用，ctb006治療效果優(yōu)于單用化療藥物。

6.1huctb006在患者原發(fā)性腫瘤組織皮下模型中的治療效果

6.1.1藥物

huctb006獲自北京同為時代生物科技有限公司(beijingcotimesbiotechco.,ltd.)/深圳市龍瑞藥業(yè)有限公司(shenzhenlonnryonnpharmaceuticalco.,ltd.)；紫杉醇(taxel)得自北京sl藥業(yè)有限公司(beijingslpharmaceuticalco.,ltd.)/北京聯(lián)合制藥廠(beijingunionpharmaceuticalfactory)；卡鉑(carboplatin)從齊魯藥業(yè)有限公司獲得(qilupharmaceuticalco.,ltd.)；inf-α-2b得自schering-plough(brinny)co.，ltd.；伊立替康獲自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司(jiangsuhengruimedicineco.,ltd.)

6.1.2組織

結(jié)腸癌組織cs146獲自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院；結(jié)腸癌組織cs182和cs263以及肺癌組織cs113和cs225均獲自朝陽醫(yī)院。

6.1.3動物

動物是從軍事醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(動物證書號：scxk-(軍)2007-004)或維通利華實驗室(vitalriverlaboratories，動物證書號：scxk(京)2006-0009)購買的四(4)至六(6)周齡裸鼠。購自北京hfk生物科學(xué)有限公司(beijinghfkbioscienceco.ltd.，動物證書號：scxk(京)2009-0004)或維通利華實驗室(動物證書號：scxk(京)2012-0001)的nod/scid小鼠在四(4)至五(5)周齡時進行植入。

6.1.4儀器

動物實驗相關(guān)儀器與5.1.4相同。此外，脫水器(tissue-tek，viptm5jr)和嵌入機(tectm)購自日本櫻花(japansakura)；削片機(leica)購自leicamicrosystemslimited；石蠟膨化機和烘焙機購自天津天力航空機電有限公司(tianjintianliaviationelectro-mechanicalco.ltd.)。電熱恒溫干燥箱購自上海益恒科技有限公司(shanghaiyihengtechnologyco.ltd.)；顯微鏡購自olypus(日本)。

6.1.5動物實驗

將來自患者的新鮮原發(fā)腫瘤組織植入nod/scid小鼠的側(cè)腹中，其隨后發(fā)育成原發(fā)性腫瘤，然后轉(zhuǎn)移到裸鼠的側(cè)腹部，使腫瘤達到指數(shù)生長期，腫瘤命名為1#腫瘤等等。當腫瘤體積和數(shù)量達到通過要求時，將其植入裸鼠的右側(cè)。當腫瘤的平均體積達到時，將小鼠分組。劑量計劃按表21所示進行。

表21.動物實驗劑量表(huctb006在本表中以ctb006表示)

huctb006和伊立替康靜脈內(nèi)給藥，5-fu、紫杉醇、卡鉑和順鉑腹膜內(nèi)給藥。當兩種藥物一起給藥時，化療藥物在抗體治療前超過4小時給藥。

每周測量兩次小鼠的體重和長軸/短軸，腫瘤生長抑制(tgi)和腫瘤體積的計算如5.1.5。另外，為了評估藥物組合對腫瘤生長的協(xié)同作用，金正均(jinzhengjun)q值判斷方法采用下式：q＝ea+b/(ea+eb-ea×eb)。ea+b是藥物組合的抑制率，ea和eb是單獨給藥時藥物治療的抑制率。q<0.85表示拮抗劑作用，0.85≤q<1.15表示加和作用，q≥1.15表示協(xié)同作用。監(jiān)測動物，當實驗結(jié)束時，處死小鼠，提取腫瘤并稱重。所有動物實驗遵循動物福利規(guī)定和實驗動物使用的管理。

6.1.6統(tǒng)計方法

腫瘤體積以平均值±標準誤差表示。使用spss16.0，one-wayanova，lsd(均勻性方差)或dunnettt3(方差的非均勻性)進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)變換使用log，置信區(qū)間為95％。p<0.05表示差異顯著。

6.2huctb006和5-fu的組合在患者原發(fā)腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs146,2#)皮下模型的治療作用

如圖36所示，huctb006和5-fu的組合對皮下模型中患者原發(fā)腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs146,2#)的腫瘤有作用。huctb006沒有，但5-fu有對皮下模型中cs146的生長的抑制作用。結(jié)果用治療后第30天的腫瘤體積計算，tgi為37.95％。ctb006和5-fu的組合在皮下模型中對cs146(結(jié)腸癌)的生長具有顯著的抑制作用。結(jié)果用治療后第30天的腫瘤重量計算，tgi為58.18％。使用金正均q值判斷法計算藥物組合的協(xié)同作用，q＝1.32，顯示huctb006和5-fu的組合治療意外和驚人的協(xié)同作用。

6.3huctb006和伊立替康的組合在患者原發(fā)腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs182，5#)皮下模型中的治療效果

如圖37和表22所示，huctb006和伊立替康的組合對皮下模型中來源于患者原發(fā)腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs182,5#)的腫瘤有效果。使用治療后第27天的腫瘤體積計算結(jié)果。與對照組腫瘤體積相比，伊立替康組和huctb006+伊立替康組腫瘤體積顯著減小，huctb006、伊立替康、ctb006+伊立替康組腫瘤生長抑制率(tgi)分別為-21.15％、90.36％和95.00％。使用金正均q值判斷方法計算藥物組合的協(xié)同作用，q＝1.07，顯示加和作用。當用腫瘤重量計算時，tgi分別為-9.22％，93.46％和98.29％。使用金正均q值判斷方法計算藥物組合的協(xié)同作用，q＝1.06，也顯示加和作用。

表22.huctb006與伊立替康組合對皮下模型中患者原發(fā)腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs182，5#)腫瘤的作用

表中的顯著性通過比較治療組與對照組來確定(即*p<0.05)(¹與預(yù)先給藥相比，腫瘤體積減少的時間)。

6.4huctb006和伊立替康的組合在患者原發(fā)性腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs263，1#)皮下模型中的治療效果

如圖38和表23所示，huctb006和伊立替康的組合對皮下模型中來源于患者原發(fā)腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs263，1#)的腫瘤有效果。使用治療后第35天的腫瘤體積計算結(jié)果。

與對照組腫瘤體積相比，伊立替康組和huctb006+伊立替康組的腫瘤體積顯著減小，ctb006、伊立替康和huctb006+伊立替康組的腫瘤生長抑制率(tgi)分別為9.42％，95.15％和96.52％。使用金正均q值判斷法計算藥物組合的協(xié)同作用，q＝1.01，顯示加和作用。當使用腫瘤重量計算時，tgi分別為16.11％、99.58％和99.25％。使用金正均q值判斷方法計算藥物組合的協(xié)同作用，結(jié)果q＝1.00，也顯示加和作用。

在本實驗中，huctb006+伊立替康合用組中的兩只動物在第24天和第31天顯示腫瘤消退。在伊立替康組中，一只動物在第35天顯示腫瘤消退。

在病理檢查中，合用組(即huctb006+伊立替康)三個樣本中的兩個未顯示任何腫瘤細胞的存在，并且甲狀腺腫含有如圖38所示的纖維結(jié)締組織。在解剖和病理檢查中，有4個樣本沒有顯示任何腫瘤細胞，化療組至少有一個樣本有腫瘤細胞，表明組合治療效果好于單獨化療組。

表23.huctb006與伊立替康組合對皮下模型中患者原發(fā)腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs263，1#)腫瘤的作用

表中的顯著性通過比較治療組與對照組來確定(即*p<0.05)(¹與預(yù)先給藥相比，腫瘤體積減少的時間)。

6.5huctb006、紫杉醇和卡鉑組合在患者原發(fā)性腫瘤組織(肺癌，cs113，3#)皮下模型中的治療效果

如圖39所示，huctb006、紫杉醇和卡鉑的組合對皮下模型中來源自患者原發(fā)腫瘤組織(肺癌，cs113，3#)的腫瘤有效果。

紫杉醇+卡鉑組和huctb006+紫杉醇+卡鉑組對皮下模型中cs113(即肺癌)的生長均具有抑制作用。當使用治療后第23天的腫瘤體積計算時，紫杉醇+卡鉑組和huctb006+紫杉醇+卡鉑組的tgi分別為81.01％和95.25％，顯示出效果顯著。使用金正均q值判斷方法計算藥物組合的協(xié)同作用，q＝1.16，顯示出協(xié)同作用。

如圖39所示，在第37天，huctb006+紫杉醇+卡鉑組的80％動物(4/5)顯示腫瘤消退；在第50天，所有動物(5/5)顯示腫瘤消退；而在紫杉醇+卡鉑組中只有一只動物(1/5)顯示腫瘤消退。這也表明合用組(即huctb006+紫杉醇+卡鉑)的治療效果出乎意料且令人驚訝地比單獨化療組更好。

6.6huctb006與順鉑的組合在患者原發(fā)性腫瘤組織(肺癌，cs225，1#)皮下模型中的治療效果

如圖40所示，huctb006和順鉑的組合對皮下模型中來源自患者原發(fā)性腫瘤組織(即肺癌，cs225，1#)的腫瘤有效果。

表24.huctb006和順鉑組合對皮下模型中原發(fā)性腫瘤組織(結(jié)腸癌，cs225，1#)患者腫瘤的作用

表中的顯著性通過比較治療組與對照組來確定(即*p<0.05)(¹與預(yù)先給藥相比，腫瘤體積減少的時間)。

用治療后第37天的腫瘤體積計算結(jié)果。與對照組腫瘤體積相比，huctb006+順鉑組腫瘤體積明顯減小。huctb006、順鉑和huctb006+順鉑組的腫瘤生長抑制率(tgi)分別為19.65％、31.45％和55.33％。使用金正均q值判斷方法計算藥物組合的協(xié)同作用，q＝1.23，顯示出協(xié)同作用。當使用腫瘤重量計算時，tgi分別為-25.23％、32.66％和45.00％。使用金正均q值判斷方法計算藥物組合的協(xié)同作用，q＝2.87，也顯示出協(xié)同作用。

實施例7.配合huctb006治療的dr5定量試劑盒的開發(fā)

7.1試劑

使用的試劑是北京同為時代生物科技有限公司制備的抗dr5抗體，克?。篴10，批號：20110808，1.2mg/ml；北京同為時代生物科技有限公司制備的重組dr5-rfc抗原，批號：20100415，1mg/ml；北京同為時代生物科技有限公司制備的hrp抗dr5，克?。?b9，批號：20100825；購自kpl的化學(xué)發(fā)光底物溶液，批號：110546；購自thermofisher的bca試劑盒，產(chǎn)品號：23227，批號：mf158389；北京同為時代生物科技有限公司制備的細胞和組織裂解液；其他化學(xué)試劑來自北京化工廠(中國)的，全部為分析純，和雙蒸水。

7.2儀器

使用的儀器是化學(xué)發(fā)光酶標儀bhp9504，北京浜松光子科技有限公司；自動化微孔板清洗機，dem-，北京拓普分析設(shè)備有限公司；電均熱培養(yǎng)箱，dhp-9162，上海羿恒科技有限公司；渦流振蕩器，ms2，ika；微板振動器，mh-1，海門其林貝爾設(shè)備有限公司；離心機，microfuge16，貝克曼庫爾特(beckmancoulter)；10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl微量移液器，eppendorf。

7.3緩沖溶液

緩沖溶液為涂層溶液：0.02mol/l磷酸鹽緩沖液(ph＝7.2)；封閉液：0.02mol/l磷酸鹽緩沖液(pbs，ph＝7.2，加1％bsa和0.05％proclin-300)；和洗滌液：0.02mol/lpbs。

7.4人類腫瘤細胞系中dr5的測定

對于dr5檢測，存在閾值(即0.2ng/ml)。低于閾值的細胞系對huctb006不敏感，部分高于閾值的細胞系對huctb006敏感。因此，不受理論的約束，可以認為下游胱天蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)僅在dr5表達達到有限閾值時被激活，然后誘導(dǎo)腫瘤細胞系的凋亡。換句話說，dr5的高表達可以誘導(dǎo)細胞凋亡途徑。

表25.人腫瘤細胞裂解液中dr5濃度與huctb006體外細胞毒性敏感性的相關(guān)性

圖41顯示了人腫瘤細胞裂解液中dr5濃度與huctb006體外細胞毒敏感性的相關(guān)性。

7.5臨床患者癌組織中dr5的測定

將臨床癌癥患者的癌組織和相對相鄰組織溶解于裂解液中，然后用bca試劑盒測定總蛋白濃度。然后將裂解溶液中的總蛋白質(zhì)水平稀釋至8mg/ml，并使用cleia試劑盒測定dr5水平。結(jié)果顯示于表26。

表26.癌組織與相鄰組織間dr5水平的比較

通過ihc測定癌組織和相對相鄰組織的dr5表達，并與cleia結(jié)果進行比較。如圖42所示，cleiadr5水平和ihc結(jié)果之間存在良好的相關(guān)性，cleia試劑盒和ihc檢測到的dr5表達是匹配的。

實施例8.ctb006相關(guān)序列

ctb006相關(guān)序列如下。

鼠ctb006輕鏈可變區(qū)核酸序列如下表27所示。

鼠ctb006輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如下表28所示。

鼠ctb006輕鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列如下表29所示。

鼠ctb006輕鏈cdr1氨基酸序列如下表30所示。

鼠ctb006輕鏈cdr2氨基酸序列如下表31所示。

鼠ctb006輕鏈cdr3氨基酸序列如下表32所示。

鼠ctb006重鏈可變區(qū)核酸序列如下表33所示。

鼠ctb006重鏈可變區(qū)氨基酸序列如下表34所示。

鼠ctb006重鏈可變區(qū)核酸和氨基酸序列如下表35所示。

鼠ctb006重鏈cdr1氨基酸序列如下表36所示。

鼠ctb006重鏈cdr2氨基酸序列如下表37所示。

鼠ctb006重鏈cdr3氨基酸序列如下表38所示。

人嵌合ctb006輕鏈核酸序列如下表39所示。

人嵌合ctb006輕鏈氨基酸序列如下表40所示。

人嵌合ctb006輕鏈核酸和氨基酸序列如下表41所示。

人嵌合ctb006重鏈核酸序列如下表42所示。

人嵌合ctb006重鏈氨基酸序列如下表43所示。

人嵌合ctb006重鏈核酸和氨基酸序列如下表44所示。

等同物

本發(fā)明不限于本申請中描述的特定實施方式，其旨在作為本發(fā)明的各個方面的單一說明。在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明進行許多修改和變化，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。除了本文列舉的那些之外，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的功能上等效的方法和裝置對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將從上述描述中變得顯而易見。這些修改和變化旨在落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明僅由所附權(quán)利要求的措辭以及這些權(quán)利要求的等同物的全部范圍來限制。應(yīng)當理解，本發(fā)明不限于當然可以變化的特定方法、試劑、化合物組合物或生物系統(tǒng)。還應(yīng)當理解，本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方式的目的，而不是限制性的。