本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及大腸桿菌(E.Coli)細(xì)胞DNA的檢測(cè)引物及方法。
背景技術(shù)：
：在現(xiàn)代，生物重組制品已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥健康領(lǐng)域，發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。這些生物制品包括重組蛋白藥物、基因重組疫苗、生物抗原抗體以及各種細(xì)胞因子等。重組生物制品的應(yīng)用與人類健康事業(yè)息息相關(guān)，國(guó)際上對(duì)其的質(zhì)量控制和安全性檢測(cè)都具有極其嚴(yán)格的要求。重組生物蛋白絕大多數(shù)由大規(guī)模的基因改造工程宿主細(xì)胞生產(chǎn)，細(xì)胞中復(fù)雜的非目標(biāo)產(chǎn)物是終產(chǎn)物中主要的雜質(zhì)來(lái)源，直接影響生物制品的安全性。其中殘余的生物遺傳物質(zhì)DNA是一個(gè)非常重要的污染，因此，對(duì)它的檢測(cè)是重要的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)。在重組生物蛋白制品中，殘余DNA多來(lái)源于培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞多為原核細(xì)胞、外源哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及腫瘤來(lái)源細(xì)胞。理論上，存在于生物制品中的微量DNA雜質(zhì)，都有可能傳遞與腫瘤或病毒相關(guān)的基因，并導(dǎo)致癌變或其它病理變化。當(dāng)一定量的殘留DNA與制品一同進(jìn)入人體后，含有致癌基因的DNA片段就可能誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，則這種DNA通過(guò)表達(dá)后具備感染性，從而導(dǎo)致一系列的不良后果。大腸桿菌因以下原因而成為基因工程的常見(jiàn)宿主菌：首先，人們對(duì)大腸桿菌的細(xì)胞形態(tài)及生理生化特性比較了解，對(duì)于培養(yǎng)基的配制與運(yùn)載體的導(dǎo)入等技術(shù)也更容易把握；其次，細(xì)菌質(zhì)粒是基因工程常用的運(yùn)載體，而大腸桿菌質(zhì)粒又是最常用的質(zhì)粒，因?yàn)榇竽c桿菌質(zhì)粒上有諸如抗青霉素基因等易于檢測(cè)的標(biāo)記基因，并且容易使目的基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)；再次，大腸桿菌本身自然是最適合大腸桿菌質(zhì)粒行使其功能的場(chǎng)所；第四，大腸桿菌是一種典型的兼性厭氧行細(xì)菌，其體積小，表面積與體積的比例很大，并且能利用氧氣進(jìn)行徹底生物氧化釋放大量能量，因而能夠與外界迅速進(jìn)行物質(zhì)和能量交換，并 在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化。如此使得大腸桿菌新陳代謝極其迅速，而其所需的培養(yǎng)條件很溫和，容易達(dá)到，其在經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)勢(shì)是顯而易見(jiàn)的。根據(jù)相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)來(lái)自大腸桿菌生產(chǎn)的生物制品，其宿主DNA的限量為10ng/劑(SFDA)。關(guān)于生物制品中宿主細(xì)胞殘余DNA的限量檢測(cè)，過(guò)去比較普遍的采用分子雜交的半定量方法。該方法基于傳統(tǒng)的分子基因雜交技術(shù)，需要的檢測(cè)條件相對(duì)簡(jiǎn)單，檢測(cè)限在10pg左右基本能夠滿足一些疫苗和治療性生物制品的檢測(cè)需求。但由于該方法存在時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、穩(wěn)定性、敏感性、特異性較差等缺點(diǎn)，已經(jīng)不能滿足日益嚴(yán)苛的檢測(cè)要求，在一些發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)淘汰。Taqman探針檢測(cè)屬于實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，是一種快速的高通量檢測(cè)方法，它在PCR擴(kuò)增過(guò)程中加入一個(gè)特異性的熒光探針，通過(guò)熒光信號(hào)的變化反映產(chǎn)物的增加情況，從而能夠定量分析樣本中的初始模板。近年來(lái)，由于taqman探針技術(shù)在特異性、靈敏性、準(zhǔn)確性方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其在檢測(cè)基因突變、基因定量等疾病相關(guān)檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的承認(rèn)及應(yīng)用。然而，該方法仍然存在樣本需要預(yù)處理、各實(shí)驗(yàn)室引物探針設(shè)計(jì)不同、沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等等問(wèn)題，對(duì)以上問(wèn)題仍需要進(jìn)一步研究、解決。此外，目前的食品或保健品通常是動(dòng)物來(lái)源、合成來(lái)源、植物來(lái)源或微生物來(lái)源的。然而，動(dòng)物來(lái)源或合成來(lái)源的食品或保健品在制備過(guò)程中易受污染，例如動(dòng)物組織中的病毒或化學(xué)試劑的殘留。因此，通常將植物來(lái)源或微生物來(lái)源的食品視作天然來(lái)源，從而得到的產(chǎn)品在市場(chǎng)上具備更高的售價(jià)。為對(duì)食品或保健品作溯源，可檢測(cè)食品或保健品中的大腸桿菌DNA。然而，監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)食品或保健品本身的大腸桿菌殘留量會(huì)有嚴(yán)格的限制，這就要求檢測(cè)食品或保健品中的大腸桿菌殘留DNA的方法或物質(zhì)手段能夠具有高靈敏度，從而既能檢測(cè)食品或保健品中的大腸桿菌殘留DNA是否符合規(guī)定，又能證明該食品或保健品是天然來(lái)源，即，大腸桿菌來(lái)源的。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)生物制品中可能的宿主細(xì)胞殘留DNA，一般選擇高度重復(fù)序列或多拷貝序列作為檢測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，如針對(duì)CHO細(xì)胞設(shè)計(jì)的各種引物對(duì)。但是與CHO的基因組相比，大腸桿菌的基因組相對(duì)小很多，因此，適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞的檢測(cè)引物設(shè)計(jì)思路往往不適合于大腸桿菌。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者深入研究了細(xì)菌的16srDNA和23srDNA基因，rDNA序列分析已經(jīng)成為細(xì)菌分類和檢測(cè)、評(píng)價(jià)種系關(guān)系的一個(gè)理想工具。由于16SrDNA和23srDNA存在屬內(nèi)及屬間高度的同源性的現(xiàn)象，很多研究人員把rDNA作為大腸桿菌來(lái)源的生物制品的宿主細(xì)胞DNA檢測(cè)的靶序列，其能夠達(dá)到一定的檢測(cè)靈敏 度。但是，在QPCR擴(kuò)增體系中所用的絕大多數(shù)的DNA聚合酶為大腸桿菌重組酶，因此，QPCR體系中不免存在微量大腸桿菌核糖體DNA，這將導(dǎo)致QPCR陰性孔ct值偏高。綜上所述，本領(lǐng)域急需檢測(cè)生物制品中大腸桿菌細(xì)胞DNA的方法，該方法應(yīng)具備特異性、靈敏性、操作簡(jiǎn)便、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一等優(yōu)點(diǎn)，從而能用于生物制品質(zhì)量控制或溯源分析。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)生物制品、食品或保健品中殘余大腸桿菌細(xì)胞DNA的引物對(duì)以及包含所述引物對(duì)的檢測(cè)體系和檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供利用本發(fā)明的引物對(duì)檢測(cè)生物制品、優(yōu)選食品或保健品中殘余大腸桿菌細(xì)胞DNA的方法。本發(fā)明還有一目的是提供用于設(shè)計(jì)檢測(cè)生物制品、食品或保健品中殘余大腸桿菌細(xì)胞DNA的引物對(duì)的多核苷酸序列。在第一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)大腸桿菌(E.Coli)細(xì)胞基因組DNA的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物和反向引物結(jié)合于大腸桿菌細(xì)胞基因組DNA上SEQIDNO:1所示序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第45-83位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第130-165位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-120bp；或者所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第660-699位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第735-769位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-110bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第53-72位，所述反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第136-155位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100-110bp；或者所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第670-689位，所述反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第744-763位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-100bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物和反向引物的長(zhǎng)度為18-22bp；優(yōu)選20bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為59-61℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對(duì)值≤2℃。在具體的實(shí)施方式中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示；或者所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示。在第二方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)試劑，所述檢測(cè)試劑包含本發(fā)明第一方面所述的引物對(duì)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第45-83位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第130-165位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-120bp；或者所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第660-699位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第735-769位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-110bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第53-72位，所述反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第136-155位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100-110bp；或者所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第670-689位，所述反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第744-763位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-100bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物和反向引物的長(zhǎng)度為18-22bp；優(yōu)選20bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為59-61℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對(duì)值≤2℃。在具體的實(shí)施方式中，所述引物對(duì)中的正向引物如SEQIDNO:2所示，所述引物對(duì)中的反向引物如SEQIDNO:3所示；或者，所述引物對(duì)中的正向引物如SEQIDNO:6所示，所述引物對(duì)中的反向引物如SEQIDNO:7所示。在具體的實(shí)施方式中，所述檢測(cè)試劑還包含探針。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述探針如SEQIDNO:4或8所示。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述檢測(cè)試劑的檢測(cè)靈敏度為1fg/μl。在具體的實(shí)施方式中，所述檢測(cè)試劑包含SEQIDNO:2所示正向引物、SEQIDNO:3所示反向引物、SEQIDNO:4所示探針；或者SEQIDNO:6所示正向引物、SEQIDNO:7所示反向引物、SEQIDNO:8所示探針。在第三方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)大腸桿菌細(xì)胞基因組DNA的方法，所述方法包括：利用本發(fā)明第一方面所述的引物對(duì)或本發(fā)明第二方面所述的檢測(cè)試劑，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR，并檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法用于確定食品或保健品是大腸桿菌來(lái)源生產(chǎn)的。在第四方面，本發(fā)明提供一種PCR試劑盒，所述試劑盒中包括容器以及位于所述容器中的本發(fā)明第一方面所述的引物對(duì)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第45-83位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第130-165位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-120bp；或者所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第660-699位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第735-769位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-110bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第53-72位，所述反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第136-155位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100-110bp；或者所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第670-689位，所述反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第744-763位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-100bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物和反向引物的長(zhǎng)度為18-22bp；優(yōu)選20bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為59-61℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對(duì)值≤2℃。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑盒中還裝有探針。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述探針如SEQIDNO:4或8所示。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑盒中還裝有標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。在第五方面，本發(fā)明提供一種PCR方法，包括步驟：在一PCR檢測(cè)體系中，利用本發(fā)明第一方面所述的引物對(duì)擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第45-83位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第130-165位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-120bp；或者所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第660-699位；其中的反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第735-769位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-110bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第53-72位，所述反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第136-155位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100-110bp；或者所述正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第670-689位，所述反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第744-763位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-100bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物和反向引物的長(zhǎng)度為18-22bp；優(yōu)選20bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為59-61℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對(duì)值≤2℃。在第六方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的引物對(duì)或本發(fā)明第二方面所述的檢測(cè)試劑的用途，用于檢測(cè)待測(cè)對(duì)象中是否存在大腸桿菌DNA。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述待測(cè)對(duì)象包括生物制品、食品或保健品。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述引物對(duì)與檢測(cè)體系用于確定所述食品或保健品是大腸桿菌來(lái)源生產(chǎn)的。在第七方面，本發(fā)明提供SEQIDNO:1所示序列在設(shè)計(jì)檢測(cè)生物制品、食品或保健品中殘余大腸桿菌細(xì)胞DNA的引物對(duì)中的作用。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說(shuō)明圖1顯示了對(duì)不同大腸桿菌菌株的基因組分析比對(duì)。圖2顯示了參考品的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:2和3所示。圖3顯示了參考品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:2和3所示。圖4顯示了參考品的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:6和7所示。圖5顯示了參考品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:6和7所示。圖6顯示了CHO干擾實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:2和3所示。圖7顯示了CHO干擾實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中：橙色(■)為E.coli標(biāo)準(zhǔn)曲線；藍(lán)色(●)為加入CHO基因的干擾曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:2和3所示。圖8顯示了人干擾實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:2和3所示。圖9顯示了人干擾實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中：橙色(■)為E.coli標(biāo)準(zhǔn)曲線；綠色(●)為加入人基因的干擾曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:2和3所示。圖10顯示了畢赤酵母干擾實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:2和3所示。圖11顯示了畢赤酵母干擾實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中：橙色(■)為E.coli標(biāo)準(zhǔn)曲線；粉色(●)為加入畢赤酵母基因的干擾曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:2和3所示。圖12顯示了CHO干擾實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:6和7所示。圖13顯示了CHO干擾實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中：橙色(■)為E.coli標(biāo)準(zhǔn)曲線；藍(lán)色(●)為加入CHO基因的干擾曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:6和7所 示。圖14顯示了人干擾實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:6和7所示。圖15顯示了人干擾實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中：橙色(■)為E.coli標(biāo)準(zhǔn)曲線；綠色(●)為加入人基因的干擾曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:6和7所示。圖16顯示了畢赤酵母干擾實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:6和7所示。圖17顯示了畢赤酵母干擾實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中：橙色(■)為E.coli標(biāo)準(zhǔn)曲線；粉色(●)為加入畢赤酵母基因的干擾曲線，其中利用的引物對(duì)如SEQIDNO:6和7所示。具體實(shí)施方式經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)針對(duì)單拷貝的大腸桿菌基因組DNA的SEQIDNO:1所示區(qū)段設(shè)計(jì)的引物，不僅能夠高度靈敏地檢測(cè)大腸桿菌細(xì)胞基因組DNA，還能區(qū)分CHO細(xì)胞、畢赤酵母以及人類等干擾性DNA；本發(fā)明的引物對(duì)還能檢測(cè)各種大腸桿菌菌株。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便快捷、特異性和靈敏性高。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明的引物對(duì)本文所用的術(shù)語(yǔ)“引物”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的意義。本發(fā)明的大腸桿菌細(xì)胞基因組DNA特異性引物不是針對(duì)外源基因本身或病毒載體本身設(shè)計(jì)，而是針對(duì)大腸桿菌細(xì)胞基因組DNA上SEQIDNO:1所示區(qū)段設(shè)計(jì)的。換言之，本發(fā)明的引物可以特異性結(jié)合于大腸桿菌細(xì)胞基因組DNA上SEQIDNO:1所示區(qū)段。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和本領(lǐng)域的公知常識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，針對(duì)SEQIDNO:1所示區(qū)段可以設(shè)計(jì)多種引物對(duì)。因此，本發(fā)明的引物對(duì)不限于實(shí)施例中具體得到的引物對(duì)。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第45-83位；反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第130-165位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-120bp；或者，本發(fā)明的正向引物結(jié)合于SEQID NO:1所示序列的第660-699位；反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第735-769位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-110bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第53-72位，反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第136-155位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100-110bp；或者，本發(fā)明的正向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第670-689位，反向引物結(jié)合于SEQIDNO:1所示序列的第744-763位，并且所述引物對(duì)所擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為90-100bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物和反向引物的長(zhǎng)度為18-22bp；優(yōu)選20bp。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為59-61℃，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對(duì)值≤2℃。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的正向引物如SEQIDNO:2所示，反向引物如SEQIDNO:3所示；或者，本發(fā)明的正向引物如SEQIDNO:6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。本發(fā)明的引物對(duì)在檢測(cè)大腸桿菌殘留DNA時(shí)能夠同時(shí)具備高靈敏度和高特異性，從而既能準(zhǔn)確而靈敏地檢測(cè)產(chǎn)品，例如食品或保健品中的大腸桿菌殘留量，進(jìn)而準(zhǔn)確判斷該產(chǎn)品是否符合食品或藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)于食品或保健品中大腸桿菌殘留的要求；同時(shí)又可以佐證所檢測(cè)的食品或保健品是大腸桿菌來(lái)源，即微生物來(lái)源，而非動(dòng)物來(lái)源，例如動(dòng)物的血制品中提取的或是合成來(lái)源的。換言之，本發(fā)明的引物對(duì)在準(zhǔn)確而靈敏地判斷某產(chǎn)品是否符合食品或藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)于其中大腸桿菌殘留的要求的同時(shí)可以完成對(duì)該食品或保健品的溯源工作。探針本文所用的術(shù)語(yǔ)“引物”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的意義，即，一小段單鏈DNA或者RNA片段，用于檢測(cè)與其互補(bǔ)的核酸序列。鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和本領(lǐng)域的公知常識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在知曉引物對(duì)的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)正向引物和反向引物結(jié)合位點(diǎn)之間的模板序列自主設(shè)計(jì)探針，并檢測(cè)該探針與引物對(duì)的技術(shù)效果。在具體的實(shí)施方式中，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)需要具體設(shè)計(jì)探針，所述探針可以處于液相中，也 可以固定于固相上；可以在擴(kuò)增前結(jié)合，也可以在擴(kuò)增后結(jié)合。因此，本發(fā)明的探針并不限于實(shí)施例中具體公開(kāi)的探針。本發(fā)明的引物對(duì)也不限于與實(shí)施例中具體公開(kāi)的探針配對(duì)使用。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的探針如SEQIDNO:4或8所示。本發(fā)明的檢測(cè)試劑本發(fā)明還提供一種檢測(cè)大腸桿菌細(xì)胞基因組DNA的檢測(cè)試劑，所述檢測(cè)試劑包含本發(fā)明的引物對(duì)以及探針等實(shí)施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg2+等等。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的檢測(cè)試劑包含SEQIDNO:2所示正向引物、SEQIDNO:3所示反向引物、SEQIDNO:4所示探針；或者，SEQIDNO:6所示正向引物、SEQIDNO:7所示反向引物、SEQIDNO:8所示探針。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明檢測(cè)試劑的檢測(cè)靈敏度達(dá)到1fg/μL。在本發(fā)明的引物對(duì)或檢測(cè)試劑的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測(cè)大腸桿菌細(xì)胞基因組DNA的方法，所述方法包括：利用本發(fā)明的引物對(duì)或檢測(cè)試劑，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR，并檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在具體的實(shí)施方式中，所述方法用于確定食品或保健品是大腸桿菌來(lái)源生產(chǎn)的。在本發(fā)明的引物對(duì)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供一種PCR試劑盒，所述試劑盒中包括容器以及位于所述容器中的上述本發(fā)明引物對(duì)。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的PCR試劑盒還裝有用于實(shí)施PCR的其它所需成分以及使用該試劑盒作PCR檢測(cè)的使用說(shuō)明書(shū)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑盒中還裝有標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。在本發(fā)明的引物對(duì)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供利用本發(fā)明的引物對(duì)擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物的PCR方法。用途鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和本領(lǐng)域的公知常識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉本發(fā)明的引物對(duì)或檢測(cè)試劑可以用于檢測(cè)待測(cè)對(duì)象中是否存在大腸桿菌DNA。在具體的實(shí)施方式中，所述待測(cè)對(duì)象包括生物制品、食品或保健品。本發(fā)明的引物對(duì)或檢測(cè)試劑能夠高靈敏度地檢測(cè)食品或保健品中的大腸桿菌殘留DNA，從而既能證明所檢測(cè)的食品或保健品符合監(jiān)管機(jī)構(gòu)的規(guī)定，又能證明該食品或保健品是天然來(lái)源，即，大腸桿菌來(lái)源的。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物對(duì)與檢測(cè)體系用于確定所述食品或保健品是大腸桿菌來(lái)源生產(chǎn)的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括:1.本發(fā)明的引物對(duì)或檢測(cè)試劑能夠高度靈敏地檢測(cè)大腸桿菌細(xì)胞基因組DNA；2.本發(fā)明的引物對(duì)或檢測(cè)試劑能夠區(qū)分CHO細(xì)胞、畢赤酵母以及人類等干擾性DNA；3.本發(fā)明的引物對(duì)或檢測(cè)試劑能夠檢測(cè)各種大腸桿菌菌株；4.本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便快捷、特異性和靈敏性高。5.本發(fā)明的引物對(duì)或檢測(cè)試劑以及檢測(cè)方法能夠在檢測(cè)食品護(hù)保健品是否符合食品或藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)于大腸桿菌殘留的要求的同時(shí)對(duì)食品或保健品進(jìn)行溯源，以便驗(yàn)證食品或保健品是否天然來(lái)源的。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。材料與方法1.樣本處理試劑：(柱純化回收)包括蛋白酶K20mg/ml，預(yù)處理緩沖液，結(jié)合緩沖液，洗滌緩沖液，洗脫緩沖液，結(jié)合柱，收集管，1.5ml離心管。2.DNA檢測(cè)體系：2xTaqmanmix：含有Taq酶、dNTP、Mg2+、本發(fā)明引物及探針等成分。摻加標(biāo)準(zhǔn)品，陰性質(zhì)控，DNA稀釋液3.檢測(cè)儀器：ABI7500。4.實(shí)驗(yàn)操作及過(guò)程4.1基因組DNA提取純化(根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行)1)在1.5ml離心管中加入20μlProteinaseK(具體體積根據(jù)樣本大小可調(diào)整)。2)加入樣本，加入200μl緩沖液GB，抽打混勻或振蕩混勻。3)將離心管置于56℃，直至組織完全消化。4)每孔加入200μl無(wú)水乙醇，抽打混勻或振蕩混勻，室溫放置5分鐘。5)每孔加入15μl磁珠懸浮液B，抽打混勻或振蕩混勻。6)將離心管放置于磁力架上靜置30秒，待磁珠完全吸附時(shí)小心去除液體。7)將離心管從磁力架上取下，加入500μl緩沖液GD，抽打混勻或振蕩混勻。8)將離心管放置于磁力架上靜置30秒，待磁珠完全吸附時(shí)小心去除液體。9)將離心管從磁力架上取下，加入600μl漂洗液PW，抽打混勻或振蕩混勻。10)將離心管放置于磁力架上靜置30秒，待磁珠完全吸附時(shí)小心去除液體；11)重復(fù)操作步驟9、10，液體盡量去除干凈。12)離心管于磁力架上，室溫晾干10-15分鐘。13)將離心管從磁力架上取下，加入50-100μl洗脫液TB，抽打混勻振蕩混勻，置于56℃，孵育10分鐘。14)將離心管放置于磁力架上靜置30秒，待磁珠完全吸附時(shí)小心將DNA溶液轉(zhuǎn)移至收集板，并于適當(dāng)條件保存。4.2檢測(cè)4.2.1準(zhǔn)備工作：購(gòu)買自中國(guó)食品藥品檢定研究院的E.coli細(xì)胞基因組DNA(96.2ng/μL，批號(hào)270027-201101)為標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水梯度稀釋成以下5個(gè)濃度梯度，分別為100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL。NTC為無(wú)樣本陰性質(zhì)控(DNA稀釋液)。檢測(cè)體系：30ul20μLTaqmanmix+10μL樣品＝30μL實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序優(yōu)選為：95℃預(yù)變性2min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待檢樣本中大腸桿菌細(xì)胞DNA的量。實(shí)施例1.發(fā)明人根據(jù)SEQIDNO:1所示序列，設(shè)計(jì)了以下引物對(duì)和探針：29B-103F：GAAAGTAACACCAGCGTGCG(SEQIDNO:2)；29B-103R：CCAATGCATTAACGCTGGCA(SEQIDNO:3)；探針，T29B-103：CGGTGCTGCGACGGCGGAGT(SEQIDNO:4)；擴(kuò)增產(chǎn)物：GAAAGTAACACCAGCGTGCGCATCAGCAGTGACAACGACTTAAACGGTGCTGCGACGGCGGAGTAGAGTACGCAGCTAATTGCTGCCAGCGTTAATGCATTGG(SEQIDNO:5)。發(fā)明人通過(guò)QPCR實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了上述引物對(duì)的性能，其中，QPCR體系為：18.2μLmix+0.6μL正向引物(29B103F)+0.6μL反向引物(29B103R)+0.6μL探針T29B103+10μLDNA；QPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線為：大腸桿菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和圖3所示。其中圖2是參考品擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增曲線顯示出明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期。圖3是參考品標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖3可知，當(dāng)參考品濃度為10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL時(shí)，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.52，相關(guān)系數(shù)(R2)＝0.999，擴(kuò)增效率為92.35％。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1fg/μl。實(shí)施例2.發(fā)明人根據(jù)SEQIDNO:1所示序列，設(shè)計(jì)了以下引物對(duì)和探針：29B-94F：AATCACCCCCTCATGTGCTG(SEQIDNO:6)；29B-94R：GAAAAACATGCACGCCCGAT(SEQIDNO:7)；探針T29B-94：CACGAATGGCATCGTTTGTTTCAGGCTG(SEQIDNO:8)；擴(kuò)增產(chǎn)物：AATCACCCCCTCATGTGCTGCACGAATGGCATCGTTTGTTTCAGGCTGCCAGAGTAAACTGGCATGTTCCAGTAATCGGGCGTGCATGTTTTTC(SEQIDNO:9)。發(fā)明人通過(guò)QPCR實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了上述引物對(duì)的性能，其中，QPCR體系(30μL)為：18.2μLmix+0.6μL正向引物(29B94F)+0.6μL反向引物(29B94R)+0.6μL探針T29B94+10μLDNA；QPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線：大腸桿菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4和圖5所示。其中圖4是參考品擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增曲線顯示出明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期。圖5是參考品標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖5可知，當(dāng)參考品濃度為10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL時(shí)，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.36，相關(guān)系數(shù)(R2)＝0.999，擴(kuò)增效率為98.44％。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1fg/μl。實(shí)施例3.干擾實(shí)驗(yàn)：步驟：用DNA稀釋液將大腸桿菌DNA梯度稀釋成濃度為200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL五個(gè)濃度梯度。將CHO/人/畢赤酵母三種干擾DNA稀釋成濃度為2ng/μL。(CHODNA來(lái)源中國(guó)食品藥品檢定研究院；人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827來(lái)源中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院,用takara基因提取試劑盒提?。划叧嘟湍讣?xì)胞來(lái)源中國(guó)食品藥品檢定研究院,用takara基因提取試劑盒提取)QPCR體系：18.2μLmix+0.6μL正向引物-29B103F+0.6μL反向引物-29B103R+0.6μL探針T29B103+5μL大腸桿菌DNA+5μLH2O/CHO/人/畢赤酵母DNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：DNAR2slopeE大腸桿菌+H2O0.999-3.306100.7％大腸桿菌+CHO0.998-3.295101.1％大腸桿菌+人0.998-3.095110.4％大腸桿菌+畢赤酵母0.999-3.202105.3％實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6～圖11所示。從產(chǎn)生的曲線可以看出，CHO/人/畢赤酵母DNA污染對(duì)SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示引物對(duì)的檢測(cè)結(jié)果明顯沒(méi)有造成影響。該引物對(duì)具備優(yōu)異的特異性。實(shí)施例4.干擾實(shí)驗(yàn)：步驟：用DNA稀釋液將大腸桿菌DNA梯度稀釋成濃度為200pg/μL、20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL五個(gè)濃度梯度。將CHO/人/畢赤酵母三種干擾DNA稀釋成濃度為2ng/μL。QPCR體系：18.2μLmix+0.6μL正向引物-29B94F+0.6μL反向引物-29B94R+0.6μL探針T29B94+5μL大腸桿菌DNA+5μLH2O/CHO/人/畢赤酵母DNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：DNAR2slopeE大腸桿菌+H2O0.998-3.174106.5％大腸桿菌+CHO0.999-3.205105.1％大腸桿菌+人0.999-3.33499.5％大腸桿菌+畢赤酵母0.997-3.077111.3％實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12～圖17所示。從產(chǎn)生的曲線可以看出，CHO/人/畢赤酵母DNA污染對(duì)SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示引物對(duì)的檢測(cè)結(jié)果明顯沒(méi)有造成影響。該引物對(duì)具備優(yōu)異的特異性。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3