本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和基因治療領(lǐng)域，涉及一種基于GFAP啟動(dòng)子和慢病毒載體的肝星狀細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝纖維化是大多數(shù)慢性肝病的共同特征，主要表現(xiàn)是細(xì)胞外基質(zhì)的大量積累，而肝星狀細(xì)胞是參與該過(guò)程的主要細(xì)胞【1】。肝星狀細(xì)胞主要分布在肝竇間隙內(nèi)，緊貼肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，占肝中細(xì)胞總量的5％-10％。在正常肝中，肝星狀細(xì)胞處在靜息狀態(tài)，并且富含脂滴、維生素A和視黃醇等，當(dāng)受到病毒、毒素、酒精等導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的肝損傷時(shí)，靜息的肝星狀細(xì)胞就會(huì)轉(zhuǎn)化成類成纖維細(xì)胞，在此過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞發(fā)生形態(tài)以及功能改變，比如增殖、收縮性、趨藥性、膠原和細(xì)胞因子的增加等等【2】，過(guò)多的膠原的沉積導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量的積累以及肝纖維化。

肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化發(fā)生過(guò)程中的主要過(guò)程，因此肝星狀細(xì)胞是抗纖維化治療的重要的靶細(xì)胞，主要的治療手段包括肝星狀細(xì)胞活化的抑制，活化的肝星狀細(xì)胞的消除，細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及細(xì)胞因子的治療等等【3-4】。已有研究表明對(duì)促肝纖維化的細(xì)胞因子TGFβ、PDGF和TNF-α的靶向肝星狀細(xì)胞的敲除可以作為肝纖維化基因治療的方法【5-7】。比如，通過(guò)天然抑制劑【7】、抗體【8】和RNA干擾【9】等方法降低TGFβ的表達(dá)或者抑制該信號(hào)通路的活性，可以降低膠原的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。

在肝纖維化的肝星狀細(xì)胞靶向的基因治療中，細(xì)胞特異性和高效性的遞送系統(tǒng)是非常關(guān)鍵的，一些抗纖維化的藥劑則不能通過(guò)細(xì)胞特異的靶向定位肝星狀細(xì)胞。因此，肝星狀細(xì)胞特異的啟動(dòng)子啟動(dòng)肝星狀細(xì)胞特異的基因可以攻克難關(guān)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP是一種中間纖維，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中特異性高表達(dá)【10】。已有研究表明人的GFAP promoter可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異的lacZ報(bào)告基因的表達(dá)【11】。與肝中其他肝細(xì)胞相比，GFAP在肝星狀細(xì)胞中也是特異性高表達(dá)的【12-13】。在用更昔洛韋處理由鼠的GFAP promoter啟動(dòng)的單純皰疹病毒胸苷激酶基因的基因小鼠時(shí)，可以使活化的肝星狀細(xì)胞特異性缺失【14】。另外，由GFAP promoter介導(dǎo)的可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)的質(zhì)粒敲減肝星狀細(xì)胞中TGF-β的表達(dá)可以顯著降低TGF-β1和膠原在蛋 白和RNA水平的表達(dá)【6】。而且，由GFAP promoter啟動(dòng)的表達(dá)PDGFR-β shRNA的質(zhì)粒通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)(HBT)的轉(zhuǎn)染方式可以特異性敲減四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷中PDGFR-β基因的表達(dá)【5】。因此，高效、特異、穩(wěn)定的遞送系統(tǒng)成為本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于GFAP啟動(dòng)子和慢病毒載體的載體系統(tǒng)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述載體系統(tǒng)的制備和應(yīng)用。

非病毒性的基因遞送方式在小鼠和大鼠中轉(zhuǎn)染效率較高【15】【5】，但是HBT方式在實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用上均有局限性。裸質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中只能短暫表達(dá)，而為了維持體內(nèi)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)就需要不斷重復(fù)給予，在HBT中經(jīng)尾靜脈大量快速的注射將增加靜脈壓，肝梗死，短暫心臟休克甚至死亡【16】。而病毒基因遞送載體如慢病毒載體則可以有很高的遞送效率和持續(xù)穩(wěn)定的基因表達(dá)，對(duì)動(dòng)物身體的損傷也較低，不過(guò)也有潛在的生物危害，可能會(huì)增加免疫原性【17-18】。慢病毒表達(dá)載體已經(jīng)可以成功的遞送到腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞和肝中肝星狀細(xì)胞中表達(dá)外源基因【18-20】。細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的整合可以在星形膠質(zhì)細(xì)胞中選擇性表達(dá)外源基因【18】。但是由GFAP promoter介導(dǎo)的體內(nèi)外源基因的特異性高效表達(dá)的慢病毒基因遞送體系在肝星狀細(xì)胞中還沒(méi)有檢測(cè)過(guò)，因此本發(fā)明構(gòu)建了由GFAP promoter介導(dǎo)的慢病毒載體，利用熒光素酶作為檢測(cè)指標(biāo)，并通過(guò)尾靜脈注射遞送至小鼠肝中，然后檢測(cè)體內(nèi)熒光素酶的活性和表達(dá)，結(jié)果顯示在尾靜脈注射后，人的GFAP promoter可以介導(dǎo)小鼠肝星狀細(xì)胞中熒光素酶的特異性表達(dá)，提示GFAP promoter與慢病毒遞送體系的整合將為肝纖維化的基因治療提供潛在的臨床應(yīng)用。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上完成。

本發(fā)明提供了一種基于GFAP啟動(dòng)子和慢病毒載體的載體系統(tǒng)，利用GFAP啟動(dòng)子作為慢病毒載體中的啟動(dòng)子。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，擴(kuò)增GFAP啟動(dòng)子的引物序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。

所述GFAP啟動(dòng)子的是人GFAP啟動(dòng)子或者小鼠GFAP啟動(dòng)子。

本發(fā)明提供了上述載體系統(tǒng)的制備方法，即利用GFAP啟動(dòng)子作為慢病毒載體中的啟動(dòng) 子。該方法包括以下步驟：

(1)擴(kuò)增并獲得GFAP啟動(dòng)子的DNA片段；

(2)將GFAP啟動(dòng)子的DNA片段克隆到慢病毒載體中。

其中，步驟(1)中GFAP啟動(dòng)子的擴(kuò)增引物可以采用如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物。

步驟(2)中將GFAP啟動(dòng)子克隆到pGL3-Basic或者pCDH-GFP載體中。pGL3-Basic或者pCDH-GFP載體均可通過(guò)市售獲得。

較好的，可以將所述的GFAP啟動(dòng)子中ATG突變?yōu)門(mén)TG。

另一方面，本發(fā)明提供了所述的載體系統(tǒng)的應(yīng)用，即利用該載體系統(tǒng)將外源基因?qū)塍w外培養(yǎng)的細(xì)胞。較好的，所述的細(xì)胞是肝星狀細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，構(gòu)建了由GFAP promoter介導(dǎo)的慢病毒載體，利用熒光素酶作為檢測(cè)指標(biāo)，檢測(cè)由GFAP promoter介導(dǎo)的慢病毒載體對(duì)外源基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)的特異性和有效性。結(jié)果在肝星狀細(xì)胞和小鼠肝中均檢測(cè)到特異性熒光素酶的表達(dá)。

本發(fā)明構(gòu)建了包含GFAP promoter的慢病毒載體體系，并且在體內(nèi)外檢測(cè)了該體系在肝星狀細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)的特異性和有效性。我們還驗(yàn)證了經(jīng)尾靜脈注射慢病毒的小鼠肝中GFAP promoter介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞特異性熒光素酶的表達(dá)，我們結(jié)果顯示GFAP promoter介導(dǎo)的慢病毒載體在基因操作中是非常有用的工具并且為肝纖維化的基因治療提供潛在的臨床應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1：在LX-2和JS1細(xì)胞中人的GFAP promoter的介導(dǎo)效率更高。

將pGL3-basic、pGL3-hGFAP-p-luci、pGL3-mGFAP-p-luci和pGL3-promoter轉(zhuǎn)染了LX-2和JS1細(xì)胞后，用雙報(bào)告基因檢測(cè)luciferase的表達(dá)情況，其中海參luciferase作為內(nèi)參，pGL3-basic作為陰性對(duì)照，pGL3-promoter作為陽(yáng)性對(duì)照。所有數(shù)據(jù)分析都是根據(jù)三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)完成(**P<0.01，*P<0.05)。

圖2：三種病毒對(duì)L-02、JS1和LX-2細(xì)胞的感染效果。

所有圖片都是在熒光顯微鏡下拍攝，綠色熒光圖片下面是其白光圖片，圖片放大倍數(shù)是200×。

圖3：在JS1和LX-2細(xì)胞中人的GFAP promoter介導(dǎo)的luciferase的表達(dá)和活性顯著高于L-02細(xì)胞。A.Western blot驗(yàn)證L-02、JS1和LX-2細(xì)胞中l(wèi)uciferase的表達(dá)。B. 是用軟件Image J計(jì)算灰度值，以β-actin作為內(nèi)參得到的luciferase表達(dá)的相對(duì)值。C.是通過(guò)單報(bào)告基因檢測(cè)GFAP promoter的介導(dǎo)效果，以同一種細(xì)胞的CMV promoter作為內(nèi)參，在JS1和LX-2中的由GFAP promoter介導(dǎo)的luciferase的活性顯著高于L-02細(xì)胞(**P<0.01，*P<0.05)。

圖4：小鼠肝中病毒的分布圖。

將注射了3種病毒的小鼠處死，取肝做冷凍切片，通過(guò)雙熒光染色檢測(cè)luciferase和GFAP的表達(dá)。a,b,c,d中藍(lán)色的熒光表示GFAP蛋白；e,f,g,h中紅色熒光表示luciferase；i,j,k,l是合并后的圖片(a和e合并得到i，b和f合并得到j(luò)，c和g合并得到k，d和h合并得到l)；m,n,o,p中綠色熒光表示GFP；q,r,s,t中紫光表示DAPI，顯示的是細(xì)胞核所在位置。對(duì)于注射了pCDH-hGFAP-p-luci病毒的小鼠的肝做了匯管區(qū)(第3列)和損傷部位(第4列)的檢測(cè)。

圖5：GFAP promoter靶向肝星狀細(xì)胞中l(wèi)uciferase的表達(dá)圖

對(duì)注射了pCDH-GFAP-p-luci病毒的小鼠的肝切片做雙免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)luciferase和Desmin(A)以及α-Sma(B)。A.黃色箭頭表示匯管區(qū)，白色箭頭表示損傷區(qū)域。

具體實(shí)施方式

在肝纖維化的基因治療中，肝星狀細(xì)胞(HSCs)是一種非常重要的靶細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞特異的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)基因小鼠中介導(dǎo)靶向肝星狀細(xì)胞的外源基因的表達(dá)。在本研究中，我們構(gòu)建了包含由GFAP啟動(dòng)子介導(dǎo)的熒光素酶的慢病毒載體，并且檢測(cè)了體內(nèi)外肝星狀細(xì)胞靶向的外源基因表達(dá)的特異性和效率。在體外，我們選用介導(dǎo)效率較高的人的GFAP promoter，并用CMV promoter作為陽(yáng)性對(duì)照分別介導(dǎo)熒光素酶在小鼠肝星狀細(xì)胞(JS1)、人肝星狀細(xì)胞(LX-2)以及人肝細(xì)胞(L02)中的表達(dá)。在體內(nèi)，我們通過(guò)尾靜脈注射將包裝的病毒載體注射到四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠體內(nèi)，通過(guò)活體成像和WB檢測(cè)慢病毒載體在小鼠體內(nèi)的分布情況，并通過(guò)免疫共定位，如肝星狀細(xì)胞特異性marker檢測(cè)肝星狀細(xì)胞特異的表達(dá)情況。結(jié)果表明，GFAP promoter可以介導(dǎo)熒光素酶在肝星狀細(xì)胞的表達(dá)，且在體內(nèi)，病毒主要分布在小鼠腹部，說(shuō)明人的GFAP promoter可以作為慢病毒遞送體系特異靶向定位小鼠HSC中熒光素酶的表達(dá)，為肝纖維化的基因治療提供潛在的臨床應(yīng)用。

下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，而不會(huì)限制本發(fā)明。

材料和方法：

細(xì)胞系：

人肝星狀細(xì)胞系LX-2【21】，小鼠肝星狀細(xì)胞JS1【22-23】，人肝細(xì)胞L02和人胚胎腎細(xì)胞HEK-293T。所有細(xì)胞均用10％FBS的DMEM培養(yǎng)。

實(shí)施例1由GFAP promoter介導(dǎo)的報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)先前研究【11】構(gòu)建了由GFAP promoter介導(dǎo)的報(bào)告基因質(zhì)粒和慢病毒質(zhì)粒。從人基因組上擴(kuò)增GFAP promoter的片段，引物是F：5’-tcactgcttacgcccaggtc-3’(SEQ ID NO 1)，R：5’-gcgagcagcggaggtgat3’(SEQ ID NO 2)，經(jīng)割膠回收后，與p-GEM-T Easy Vector連接、經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選后，挑菌搖菌測(cè)序鑒定后，抽提質(zhì)粒。以PEGM-T-HGFAP-promoter為模板，擴(kuò)增Hgfap-p序列，引物是：h-GFAP-P-NheI-F：

5’-cctcgctagc(NheI)tcactgcttacgcccaggtc-3’(SEQ ID NO 3)，h-GFAP-P-HindIII-R：

5’-cctcaagctt(HindIII)gcgagcagcggaggtgat(SEQ ID NO 4)-3’，經(jīng)割膠回收后，用NheI和HindII I限制性內(nèi)切酶雙酶切，與NheI和HindIII限制性內(nèi)切酶雙酶切的pGL3-Basic連接、經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌、搖菌、菌落PCR鑒定、測(cè)序鑒定等得到質(zhì)粒pGL3-NheI-hGFAP-promoter-HindIII-Basic。以其為模板，用引物如下：F：

5’-agcagagccagagcaggttggagaggagacgcatca-3’(SEQ ID NO 5)，R：

5’-tgatgcgtctcctctccaacctgctctggctctgct-3’(SEQ ID NO 6)，用DpnI酶切后，轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌、搖菌、測(cè)序鑒定，得到質(zhì)粒pGL3-NheI-mutant-hGFAP-promoter-HindIII-Basic，即pGL3-hGFAP-P-luci。GFAP promoter區(qū)中ATG突變?yōu)門(mén)TG。同樣方法經(jīng)擴(kuò)增引物F：5’-tctccagcgttgctgacaaacct-3’(SEQ ID NO 7)，R：5’-gcggcgcgcagaggtgatg-3’(SEQ ID NO 8)合成mouse-GFAP-promoter；經(jīng)酶切引物M-GFAP-P-NheI-F：

5’-cctcgctagctctccagcgttgctgacaaacct-3’(SEQ ID NO 9)：M-GFAP-P-HindIII-R：

5’-cctcaagcttgcggcgcgcagaggtgatg-3’(SEQ ID NO 10)，得到質(zhì)粒pGL3-NheI-mouseGFAP-promoter-HindIII-Basic，然后經(jīng)點(diǎn)突變引物F：

5’-gatgcgtctccgctccaacctgccctgcctctgct-3’(SEQ ID NO 11)，R：

5’-agcagaggcagggcaggttggagcggagacgcatc-3’(SEQ ID NO 12)獲得pGL3-NheI-mutant-mGFAP-promoter-HindIII-Basic，即pGL3-mGFAP-P-luci。

以質(zhì)粒pGL3-NheI-mutant-hGFAP-promoter-HindIII-Basic為模板，以引物F：

5’-cctcactagttcactgcttacgcccaggtc-3’(SEQ ID NO 13)，R：

5’-ggagctgactgggttgaag-3’(SEQ ID NO 14)，擴(kuò)增得到含有SpeI酶切位點(diǎn)的DNA片段，經(jīng)割膠回收后，用SpeI和BamHI限制性內(nèi)切酶雙酶切，與用SpeI和BamHI限制性內(nèi)切酶雙酶切的pCDH-GFP連接、經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌、搖菌、菌落PCR鑒定、測(cè)序鑒定等得到質(zhì)粒pCDH-hGFAP-P-luci，替換了pCDH-GFP的CMVpromoter，并將luciferase的片段插入到載體中。構(gòu)建質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照組是用NheI和BamHI限制性內(nèi)切酶分別將pGL3-Basic、pCDH-GFP雙酶切后，經(jīng)PCR清潔回收，連接、轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌、搖菌、測(cè)序鑒定等得到質(zhì)粒pCDH-CMV-luci，不改變載體本身的promoter。陰性對(duì)照組是質(zhì)粒pCDH-GFP。

實(shí)施例2報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

LX-2和JS1細(xì)胞按照每孔10⁵個(gè)細(xì)胞進(jìn)行24孔板鋪板，培養(yǎng)24小時(shí)后，分別轉(zhuǎn)染pGL3-hGFAP-p-luci，pGL3-mGFAP-p-luci以及陰性對(duì)照pGL3-basic和陽(yáng)性對(duì)照pGL3-promoter(luciferase driven by SV-40promoter)，每孔0.8ug，并用lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染內(nèi)參pRL-CMV(luciferase driven by CMV promoter)，每孔8ng，每一種均做4個(gè)復(fù)孔，3次重復(fù)。24-48小時(shí)后做報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，先用1*PBS洗兩遍，吸干液體，用1*passive lysis buffer室溫裂解15分鐘，然后提取上清用雙報(bào)告基因檢測(cè)體系檢測(cè)熒光素酶的活性。

實(shí)施例3體外感染

將病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pSD分別與質(zhì)粒pCDH-hGFAP-p-Luci，pCDH-CMV-Luci和pCDH-GFP共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集上清，2000g離心5分鐘，并用0.45um過(guò)濾器過(guò)濾，取一部分病毒分別感染JS1、LX-2和L02，另一部分則經(jīng)過(guò)25000g超速離心2小時(shí)，得到的白色沉淀用PBS溶解后凍存在-80℃，用于病毒滴度檢測(cè)和尾靜脈注射。在顯微鏡下觀察有90％的細(xì)胞在熒光顯微鏡下顯示綠光后，可做單報(bào)告基因檢測(cè)，并收集蛋白檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)。

如圖2A-B所示，盡管GFAP promoter的介導(dǎo)效果沒(méi)有CMV promoter強(qiáng)，但是JS1和LX-2兩種細(xì)胞中GFAP promoter介導(dǎo)的熒光素酶的表達(dá)顯著高于在L02細(xì)胞中的表達(dá)。單報(bào)告基因結(jié)果如圖2C所示，JS1和LX-2兩種細(xì)胞中由GFAP promoter介導(dǎo)的熒光素酶的活性也顯著高于L02細(xì)胞，這表明使用人的GFAP promoter的慢病毒遞送體系可以在體外特異性靶向介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞中基因的表達(dá)。

實(shí)施例4體內(nèi)肝纖維化模型的建立和感染

取4周大BalB/C雄性小鼠，體重約是20g，隨機(jī)分成兩組，一組小鼠腹腔注射橄欖油作為陰性對(duì)照，另一組小鼠按照四氯化碳與橄欖油1:4的體積比腹腔注射，第一次5ul/ug，其余都是2.5ul/ug，每3天注射一次。4周后，隨機(jī)選取2只誘導(dǎo)小鼠，取肝做天狼星紅染色進(jìn)行肝纖維化水平的檢測(cè)。然后將兩組小鼠各隨機(jī)分成3組，并分別注射LV-pCDH-hGFAP-p-Luci、LV-pCDH-CMV-Luci和LV-pCDH-GFP，劑量是每只小鼠2*10⁷Tu，每天一次，注射兩次。所有小鼠均由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有實(shí)驗(yàn)都符合復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)的要求。

實(shí)施例5體內(nèi)活體成像

注射病毒12天后，腹腔注射D-luciferin，劑量150mg/kg，10-15分鐘后用IVIS imaging system檢測(cè)小鼠體內(nèi)熒光素酶大致分布在腹腔，然后處死小鼠取肝、腎，檢測(cè)GFP表達(dá)。

實(shí)施例6熒光素酶和綠色熒光蛋白的蛋白檢測(cè)和免疫熒光檢測(cè)

將取得的肝組織包埋于OCT中并快速放于液氮中冷凍凝固，然后凍存于-80℃，做冷凍切片，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程確保每只小鼠的取樣部位盡量相同。將冷凍切片放于4％的多聚甲醛中固定15分鐘，用TBS-T洗滌3次，每次3-5分鐘，用免疫熒光封閉液封閉1小時(shí)，然后用一抗孵育4℃過(guò)夜，經(jīng)TBS-T洗滌3次，每次3-5分鐘，加熒光二抗室溫孵育1小時(shí)，再用TBS-T洗滌3次，每次3-5分鐘，最后用熒光顯微鏡拍照。因小鼠各組織之間沒(méi)有合適內(nèi)參，先用BCA試劑盒定量后，再用考馬斯亮藍(lán)顯示蛋白總量，最后做WB檢測(cè)肝腎中GFP的含量，以顯示病毒所在位置的表達(dá)。

SEQUENCE LISTING

<110> 復(fù)旦大學(xué)

<120> 一種基于GFAP啟動(dòng)子和慢病毒載體的載體系統(tǒng)

<130> 20150308

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

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<212> DNA

<213> Artificial

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<213> Artificial

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<213> Artificial

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