本發(fā)明屬于生物技術(shù)和藥用植物基因工程領域，主要涉及利用生物信息學和分子生物學手段，分析人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆在林下參中高表達的抗病基因及其編碼產(chǎn)物與應用。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明的目的是提供一個與人參抗病相關的蛋白G38及其基因g38，以用于提高植物的病性能。人參(PanaxginsengC.A.Meyer)是五加科(Araliaceae)人參屬的一個種，是名貴的中藥材，被譽為“百草之王”，其應用歷史悠久。研究表明,人參皂苷在調(diào)節(jié)免疫力、抗壓、抗疲勞、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖、保肝護肝、增強記憶力等方面有著很好的功效,因此具有廣闊的應用前景和可觀的經(jīng)濟價值。但人參的生長緩慢，隨著人們對野生資源的開發(fā)，野生人參日益稀少。按人參栽培方式不同可以分為林下參和園參，林下參是人工將人參種子播種在適合人參生長的森林中，其生長、發(fā)育完全在自然條件下完成；園參是在完全在人工條件下完成播種、生長、發(fā)育。園參在人工栽培條件下，肥水充足，生長快，一般5年即可長至15-20cm，重100-200g；而林下參生長5年，主根長只有3-4cm，重約5-15g。雖然園參生長速度快，但是它的藥效成分比林下參少，因此價值也低。由于園參種植密度大，病蟲害多，一般5年時必須采收，否則病害的積累會導致植株死亡，給參農(nóng)帶來毀滅性的損失。而林下參抗病性強，可以生長數(shù)十年，且隨著生長年限的增長，營養(yǎng)成分的含量和經(jīng)濟價值增加。隨著后基因組時代的到來,轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學等各種組學技術(shù)相繼出現(xiàn),其中轉(zhuǎn)錄組學是率先發(fā)展起來以及應用最廣泛的技術(shù)。遺傳學中心法則表明,遺傳信息在精密的調(diào)控下通過信使RNA(mRNA)從DNA傳遞到蛋白質(zhì)。因此,mRNA被認為是DNA與蛋白質(zhì)之間生物信息傳遞的一個“橋梁”,而所有表達基因的身份以及其轉(zhuǎn)錄水平,綜合起來被稱作轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)[2]。轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和,主要包括mRNA和非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎和出發(fā)點,了解轉(zhuǎn)錄組是解讀基因組功能元件和揭示細胞及組織中分子組成所必需的,并且對理解機體發(fā)育和疾病具有重要作用。隨著新一代測序(Next-generationsequencing,NGS)平臺的市場化,RNA-Seq(RNAsequencing)技術(shù)的應用已經(jīng)徹底改變了轉(zhuǎn)錄組學的思維方式。RNA-Seq,即RNA測序又稱轉(zhuǎn)錄組測序,是最近發(fā) 展起來的利用深度測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù),該技術(shù)能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測,在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達水平的同時,還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本。本發(fā)明通過對5個產(chǎn)地6份樣品的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)在林下參中高表達的抗病相關基因。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一個與病性相關的蛋白G38及其基因g38，以用于提高植物的抗病性能。本發(fā)明通過比較具有抗病性的野生型長白林下參(CBA)和抗病性較差的栽培品種長白栽培參(CBB)、集安栽培參(JAB)、撫松栽培參(FSB)中基因轉(zhuǎn)錄本的差異，分離獲得一個在野生型的長白林下參中高表達、與抗病相關的蛋白G38及其基因高g38，該基因可用于提高植物的抗病性能。發(fā)明所提供的與抗病性相關的g38基因，來源于五加科人參屬中國人參(PanaxginsengC.A.Mey)，編碼具有下述氨基酸序列的蛋白質(zhì)：序列表中的SEQIDNO：1由243個氨基酸殘基組成，為蛋白G38。本發(fā)明中人參與抗病性相關的G38的編碼基因既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組DNA序列，或者是與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的編碼基因可以具有序列表中SEQIDNO：2的核苷酸序列。含有本發(fā)明基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增g38任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明提供了一個與抗病性相關的基因g38。其氨基酸序列與植物抗病基因數(shù)據(jù)庫PRGDB00155469基因的氨基酸序列同源性達73.03％，Evalue為2e-24。本發(fā)明的另一個目的是提供一種提高植物抗病性的方法。本發(fā)明所提供的提高植物抗病性的方法，是將編碼本發(fā)明與抗病性相關的基因?qū)胫参锝M織、細胞或器官，植物抗病性獲得提高。在上述提高植物抗病性的方法中，本發(fā)明中煙草與抗病性相關的g38基因既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列；與所述基因具有90％以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組基因序列用已知的方法進行分離和/或修飾和/或設計得到的。本領域的技術(shù)人員應該理解的是，特定基因序列中核苷酸同 一性的微小改變可能會導致該基因效能的降低或者加強，而且在一些應用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會和全長序列同樣有效地發(fā)揮作用?；蛐蛄凶兓蚩s短的方法，以及測試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明中人參與抗病性相關g38基因或其同源序列可通過植物表達載體導入植物組織、細胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBin系列載體(如pBin19等)、pBI系列載體(如pBI101等)、GatewayTW系列載體(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表達載體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物中復制的載體，如pENTER-TOPO、pUC系列載體或pBluescript系列載體等。使用本發(fā)明中人參與抗病性相關的g38基因或其同源序列構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型(ABA、干旱、鹽堿或化學誘導等)啟動子。所述組成性表達啟動子可為花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，玉米Ubiquitin啟動子或水稻actin1啟動子等；所述組織特異性表達啟動子可為根特異性表達啟動子、葉片特異性表達啟動子、維管特異性表達啟動子、種子特異性表達啟動子、花特異性表達啟動子或花粉特異性表達啟動子，如2S1啟動子(GenBank號：NM_118848.2，GI:30687489)和NapinA(GenBank號：M64633.1，GI:349405)啟動子等；所述誘導型啟動子可為受低溫、干旱、ABA、乙烯、鹽堿或化學等誘導的啟動子。上述啟動子可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子和/或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因、慶大霉素標記物或卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因的宿主植物細胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進行篩選，含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因的宿主植物細胞、組織或器官可由潮 霉素進行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進行篩選后還可采用Southern、PCR或點雜交等分子檢測手段對轉(zhuǎn)基因植株進行檢測，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。其中，本發(fā)明以pCAMBIA1300為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有本發(fā)明人參與耐逆性相關的g38基因的植物表達載體命名為pCactF-g38。攜帶有本發(fā)明人參與耐逆性相關的g38基因或其同源序列的植物表達載體可通過使用原生質(zhì)體-化學介導法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。此外，通過將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明人參與耐逆性相關的g38基因或其同源序列的轉(zhuǎn)基因植株進行繼代培養(yǎng)后，可從中進一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。此外，還可對該轉(zhuǎn)基因植株進行擴繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的抗病性進一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物的擴繁包括無性繁殖和/或種子繁殖。本發(fā)明的方法對雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官既可來源于煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹、松樹、桉樹、馬鈴薯或牧草等雙子葉植物，也可來源于水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。本發(fā)明提供了一個與抗病性相關的基因g38。實驗證明，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化煙草可提高煙草抗真菌病害能力，且對煙草的正常生長和經(jīng)濟性狀沒有明顯的影響。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锟共⌒詸C制的研究，以及提高植物的抗病性及相關性狀的改良具有重要的理論及實際意義，將在植物的抗病基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。附圖說明圖1是人參樣品總RNA電泳圖，其中1為長白林下參，2為長白栽培參，3為集安栽培參，4為撫松栽培參，5為遜克栽培參，6為寬甸石柱參。圖2是realtimePCR驗證基因g38在各材料中的相對表達量；RQ為基因表達相對值，CBA為長白林下參，CBB為長白栽培參、JAB為集安栽培參、FSB為撫松栽培參、XKB為遜克栽培參、KDC為寬甸石柱參。圖3是ORF預測。圖4功能域預測分析。圖5表達載體pCactF的T-DNA區(qū)圖譜。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；hyg表示潮霉素抗性；p35S表示35S基因的啟動子；T35S表示35S基因的終止子；pAct表示Actin基因的啟動子；3flag表示3倍的flag標簽序列；OCS表示ocs基因的終止子；HindIII、KpnI、SpeI、XbaI、SalI和PstI分別表示限制性內(nèi)切酶的酶切位點。具體實施方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物和測序均由上海英駿生物技術(shù)公司合成，PCR試劑盒購自東洋紡(上海)生物科技有限公司(TOYOBO)、載體構(gòu)建過程中的核酸內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自紐英倫生物技術(shù)有限公司(NEB)，pEASY-T1連接試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)公司，方法均參照試劑盒提供的方法進行。實驗中所用的載體pHPG由本實驗改造所得，基本骨架來自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。實施例1.樣品采集2012年9月，采集5年生的林下參和栽培參，林下參的產(chǎn)地為長白，栽培參的產(chǎn)地為長白，集安，撫松，遜克。采集人參根，清洗干凈后液氮速凍低溫保存。其中CBA為長白林下參，CBB、JAB、FSB、XKB、KDC分別為長白、集安、撫松、遜克、寬甸栽培參。實施例2.RNA提取首先對-80℃保存的樣本于液氮中充分研磨，然后用Qiagen’sRNeasyplantminikit提取總RNA，應用DNaseI(NEB)去除殘留DNA完成RNA的純化，最后用1％瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性(圖1)，用Nanodrop2000核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度。實施例3.RNA-Seq和denovo拼接利用oligo(dT)的磁珠從總RNA中富集mRNA，接著將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物(randomhexamers)合成第一條cDNA鏈，然后構(gòu)建測序文庫，利用第二代SolexaHiSeq2000進行RNA測序。通過去掉接頭和低質(zhì)量的序列后，共獲得1.364×108個高質(zhì)量的reads,共計2.08×107basepairs。運用Trinity軟件對測序結(jié)果進行Denovo拼接，共獲得82,448個基因。實施例4.基因注釋和基因差異表達將獲得的轉(zhuǎn)錄組與NCBInon-redundantproteindatabase(NR)、swissprot和TAIR10數(shù)據(jù)庫比對，共有102395個轉(zhuǎn)錄子(約60.7％)有功能注釋。依照文獻(TrapnellCetal.，DifferentialgeneandtranscriptexpressionanalysisofRNA-seqexperimentswithTopHatandCufflinks.Natureprotocols2012,7(3):562-578；AndersSetal.，HTSeq-Apythonframeworktoworkwithhigh-throughputsequencingdata.bioRxivpreprint2014,doi:10.1101/002824；AndersSetal.，Differentialexpressionanalysisforsequencecountdata.Genomebiology2010,11(10):R106)中的方法，依次運用程序Tophat-HTSeq-DESeq進行基因表達分析，有822個轉(zhuǎn)錄子具有顯著性差異表達(具有顯著差異的標準：經(jīng)均一化后每個轉(zhuǎn)錄本上覆蓋的reads大于10，兩個轉(zhuǎn)錄本的log2(Fold_change)大于2或者小于-2，P值小于0.05)。用BlastX比對植物抗病基因數(shù)據(jù)庫PRGDB(http://prgdb.org)，共有5482個轉(zhuǎn)錄子獲得抗病基因注釋，其中基因g38在長白林下參(CBA)中表達顯著高于其它材料，即林下參高于各地的栽培參材料，具體結(jié)果詳見表1。經(jīng)計算，基因g38在CBA中分別與KDC、CBB、FSB、JAB、XKB的表達值的log2(Fold_change)依次為3.0573，3.2713，2.7503，2.4000，2.8788，大于2，說明基因g38在CBA中的表達顯著高于其它材料。表1各材料中g(shù)38的相對表達值品種名稱CBAKDCCBBFSBJABXKBG38的相對表達值45.50775.46684.713376.763258.621946.18698實施例5.抗病基因表達驗證根據(jù)生物信息分析數(shù)據(jù)，以拼接的g38轉(zhuǎn)錄本(其序列位于序列表中SEQIDNO：3)為模板，設計realtimePCR引物(realtimePCR引物(38realF5-TGAAATCAAAGAGGGTAAACAA，SEQIDNO:4；38realR5-TGGTCAAGTATGTGAAGGT-3，SEQIDNO:5)。以稀釋10倍的cDNA為模板，用7500FastReal-TimePCRSystem(AppliedBiosystems)定量分析，反應體系為：以GAPDH為內(nèi)參(F5-CTGTGGATGTCTCTGTGGTA-3，SEQIDNO:6；R5-CTCCGACTCCTCCTTGATAG-3，SEQIDNO:7)，用相對定量2-ΔΔCtmethod方法統(tǒng)計基因表達量。從實驗結(jié)果可以看出，基因g38在CBA中表達量高于其它材料，與生物信息學分析結(jié)果一致。圖2為基因g38在各材料中的相對表達量，縱坐標為基因表達相對值，CBA為林下參，具有抗病性強的特點，將其g38基因為1，其它材料的數(shù)值是與CBA相除的相對值，橫坐標表示各實驗材料。實施例6.功能預測應用blastx，將基因g38的拼接轉(zhuǎn)錄本序列與植物抗病基因數(shù)據(jù)庫PRGDB(http://prgdb.org)比對，結(jié)果列于表3?；驈?54-810bp與推測的抗病基因PRGDB00155469的1519-1607bp具有同源性，value為2.00E-24，說明二者具有較高的的相似度。根據(jù)轉(zhuǎn)錄本序列，推測有6種開放閱讀框。(圖3)根據(jù)同源比對的結(jié)果，以324-590bp為閱讀框，向5`端找ATG，因此推測該基因具有抗病功能的開放閱讀框為序列3的69-797bp。表3基因在抗病數(shù)據(jù)庫blastx結(jié)果實施例7.基因克隆根據(jù)預測的ORF序列，即序列SEQIDNO:3的69-797bp。，從基因的編碼起始位點ATG開始設計5’端引物，于終止密碼處設計3’端引物：引物38F：5'-ATGTCAGCTGCAGTAGCCG-3'，SEQIDNO:8引物38R：5'-CTAATTGAAGATGGACATATGGAA-3'，SEQIDNO:9提取人參根的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，RT-PCR方法，用以上引物擴增得到全長基因。具體反應為：取約2μg的總RNA，加入1μl10×DNasebuffer，1μl的DNase，補DEPC處理過的水至10μl體系，混勻，37℃溫育30min后，加入1μl的RQDNasestopsolution,65℃溫育10min以終止反應后，加入2μlOligo(dT)18primer(0.1μg/μl)，4μl5×First-strandbuffer，1μlRibonucleaseinhibitor(40U/μl)，2μl4×dNTP(各10mM)，1μlMMLVReverseTranscriptase(200U/μl)，小心混勻，37℃保溫1小時。然后90℃處理5分鐘，冰上冷卻，離心收集即獲得相應的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。將得到的cDNA稀釋10倍，取1μl作為PCR反應的模板，上、下游引物(10μM)各1μl，LATaq酶(5U/μl)0.5μl，4×dNTPs(各10mM)1μl，2×buffer(Mg2+)25μl，H2O20.5μl。PCR反應條件為預熱95℃5min，變性94℃1min，退火56℃30sec，延伸72℃2min10sec，35個循環(huán)。反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)擴增獲得了大小與預期結(jié)果相符的DNA片段。回收并純化上述片段，將其連接入載體pEASY-T1(全式金公司)中，通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)TOP10菌株，挑選陽性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm的搖床中培養(yǎng)12-16小時，提取質(zhì)粒，得到含有目的片段的重組質(zhì)粒。經(jīng)測序，基因全長度為738bp，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示，所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。實施例8.植物表達載體構(gòu)建從基因的編碼起始位點ATG開始設計含有SalII酶切位點的5’端引物，于終止密碼處設計PstI酶切位點的3’端引物：引物3：5'-gtcgacATGGAAGTAATGCTGCTCAG-3'，SEQIDNO:10引物4：5'-ctgcagCTAAGCTAGACTAATGGTGAGGA-3'，SEQIDNO:11引物3中g(shù)tcgac序列為限制性內(nèi)切酶SalI的酶切位點，下劃線標識的序列為g38基因的編碼序列；引物4中ctgcag序列為限制性內(nèi)切酶PstI的酶切位點，下劃線標識的序列為g38基因的編碼序列。以測序正確含有g(shù)38的克隆載體為模板，取1μl作為PCR反應的模板，上、下游引物(10μM)各1.5μl，KOD-Plus-Neo酶(1U/μl)1μl，4×dNTPs(各2mM)5μl，10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo5μl，25mMMgSO45μl，H2O30μl。PCR反應條件為預熱94℃2min，變性94℃10sec，退火60℃30sec，延伸68℃30sec，30個循環(huán)。反應結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)擴增獲得了大小與預期結(jié)果相符的DNA片段。回收并純化上述片段，上述引物PCR克隆含有酶切位點的g38DNA片段，用SalI和PstI雙酶切,切下目的片段，連入同樣進行雙酶切的pCactF植物表達載體，得到pCactF-g38，挑取菌落PCR鑒定為陽性的菌落進行測序驗證。植物表達載體pCactF的T-DNA區(qū)圖譜如圖5所示。實施例9.轉(zhuǎn)基因煙草的獲得用農(nóng)桿菌介導法將按具體實施方式4獲得的含有酶切位點的基因g38轉(zhuǎn)化煙草，具體方法如下：利用熱激法將上述重組載體pCactF-g38轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL0菌株(公司保菌)，利用農(nóng)桿菌對煙草進行共轉(zhuǎn)化。將獲得的煙草轉(zhuǎn)基因植株的部分葉片，按常規(guī)方法提取總DNA，在正向引物5’-ACTCACCGCGACGTCTGT-3’(SEQIDNO:12)和反向引物5’-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3’(SEQIDNO:13)的引導下，PCR擴增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，經(jīng)擴增獲得1009bpDNA片段的為陽性轉(zhuǎn)基因植株，檢測結(jié)果表明用上述方法獲得了轉(zhuǎn)化有pCactF-g38的轉(zhuǎn)基因煙草。實施例10.抗病性檢測收獲T1代轉(zhuǎn)基因煙草種子，用含有30mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基篩選獲得12株陽性植株。當幼苗長至4葉時，移栽至育苗缽中。當幼苗長至6葉時，做抗病能力檢測。取患有枯萎病的煙草葉片，用剪刀剪碎后放在200ml無菌水中，200rpm搖床震蕩20min，用無菌紗布過濾掉葉片后，噴施植株。以非轉(zhuǎn)基因煙草為對照。10天后進行病情調(diào)查，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因苗中有3株1片真葉明顯萎蔫，7株4片真葉輕度萎蔫，5株2片葉子黃化或萎蔫，3株1片真葉黃化，1株沒有發(fā)病癥狀。而非轉(zhuǎn)基因的煙草中有12株枯死，5株2片真葉萎蔫，2株1片真葉輕度萎蔫。說明轉(zhuǎn)g38基因的煙草抗病性比野生型對照的抗病能力強。具體統(tǒng)計結(jié)果見表4。本實施例中病情分級標準為：0級：無癥狀；1級：1片子葉黃化；2級：2片子葉黃化或萎蔫；3級：1片真葉輕度萎蔫；4級：1～2片真葉明顯萎蔫；5級：全株嚴重萎蔫或枯死。其中2以下為抗病，3以上為感病類型。表4：轉(zhuǎn)g38基因煙草抗病能力檢測結(jié)果統(tǒng)計表0級1級2級3級4級5級轉(zhuǎn)基因135730野生型0002512綜合上述結(jié)果，人參g38基因編碼的蛋白G38，與抗病相關，可以提高人參的抗病性。SEQUENCELISTING<110>未名興旺系統(tǒng)作物設計前沿實驗室(北京)有限公司<120>一種提高人參抗病性的基因g38及其編碼蛋白<130><160>13<170>PatentInversion3.3<210>1<211>242<212>PRT<213>中國人參（PanaxginsengC.A.Mey）<400>1MetSerAlaAlaValAlaAlaAlaAlaAlaHisIleAsnArgCysAsn151015ProThrThrIleThrThrAlaThrAsnSerGluAlaAsnTyrAsnThr202530TyrIleProAsnGlyHisHisSerProProProProProProProPhe354045SerArgTyrGluSerGlnLysArgArgAspTrpAsnThrLeuGlyGln505560TyrLeuLysAsnHisArgProProLeuThrLeuSerArgCysSerGly65707580AlaHisValLeuGluPheLeuArgTyrLeuAspGlnPheGlyLysThr859095LysValHisAlaAsnAsnCysProPhePheGlyHisProHisProPro100105110AlaProCysProCysProLeuLysGlnAlaTrpGlySerLeuAspAla115120125LeuValGlyArgLeuArgAlaAlaPheGluGluHisGlyGlySerPro130135140GluThrAsnProPheGlyAlaArgAlaValArgLeuTyrLeuArgGlu145150155160ValArgAspSerGlnAlaLysAlaArgGlyIleAlaTyrGluLysLys165170175LysArgLysLysProHisProGlnGlnGlnGlnProGlnAspHisAsp180185190LeuAspHisAspHisLysSerAsnGlyHisGluMetIleGlyGlnGln195200205GlyTyrThrGlyGlnValCysGluGlyGlyPheAspGlyLeuGlyMet210215220AlaGlySerSerAspHisSerArgCysSerMetPheHisMetSerIle225230235240PheAsn<210>2<211>729<212>DNA<213>中國人參（PanaxginsengC.A.Mey）<400>2atgtcagctgcagtagccgccgcagctgcccatattaaccggtgcaaccccaccaccatc60accaccgccactaactctgaagccaactacaacacctacattcctaacggtcatcactct120ccacctccaccaccaccaccgttcagccgttacgagtcccaaaaacgccgagactggaac180acattgggtcaatacctaaaaaaccaccgccccccactcactctctcccggtgcagcgga240gcccacgtactagagttcctccggtacctcgaccaattcggaaagacaaaagtccacgca300aacaactgtccatttttcggtcaccctcacccgccagcaccgtgtccttgcccactcaaa360caagcgtggggtagcctcgacgctctcgtgggccgcctccgtgccgcatttgaagagcac420ggtgggtcccccgagaccaacccatttggcgcacgcgccgtccggttgtatttgagggaa480gtgagggactctcaggctaaggctagagggatagcttatgaaaagaagaaaaggaagaag540ccacatccgcagcaacaacagccgcaagatcatgatcttgatcacgatcataagtcaaat600ggtcatgagatgattggtcaacaggggtatactggtcaagtatgtgaaggtggttttgat660ggtttggggatggcgggttcatcggatcattctcggtgctccatgttccatatgtccatc720ttcaattag729<210>3<211>955<212>DNA<213>中國人參（PanaxginsengC.A.Mey）<400>3aaacgcttgtaaactcatacctcattcaattcaacaaagtaaaatatagccaaaaaaaag60aagataatcatgtcagctgcagtagccgccgcagctgcccatattaaccggtgcaacccc120accaccatcaccaccgccactaactctgaagccaactacaacacctacattcctaacggt180catcactctccacctccaccaccaccaccgttcagccgttacgagtcccaaaaacgccga240gactggaacacattgggtcaatacctaaaaaaccaccgccccccactcactctctcccgg300tgcagcggagcccacgtactagagttcctccggtacctcgaccaattcggaaagacaaaa360gtccacgcaaacaactgtccatttttcggtcaccctcacccgccagcaccgtgtccttgc420ccactcaaacaagcgtggggtagcctcgacgctctcgtgggccgcctccgtgccgcattt480gaagagcacggtgggtcccccgagaccaacccatttggcgcacgcgccgtccggttgtat540ttgagggaagtgagggactctcaggctaaggctagagggatagcttatgaaaagaagaaa600aggaagaagccacatccgcagcaacaacagccgcaagatcatgatcttgatcacgatcat660aagtcaaatggtcatgagatgattggtcaacaggggtatactggtcaagtatgtgaaggt720ggttttgatggtttggggatggcgggttcatcggatcattctcggtgctccatgttccat780atgtccatcttcaattagtaattagggtttatgtttgtttaccctctttgatttcaagta840ttatttattttgggggttttgttaattaatgggtaatggaaaggttttttttagaaccct900actttggatgaattgtcaatggttttagcggcaatatattatggaaattgttaaa955<210>4<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>4tgaaatcaaagagggtaaacaa22<210>5<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>5tggtcaagtatgtgaaggt19<210>6<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>6ctgtggatgtctctgtggta20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>7ctccgactcctccttgatag20<210>8<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>8atgtcagctgcagtagccg19<210>9<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>9ctaattgaagatggacatatggaa24<210>10<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>10gtcgacatggaagtaatgctgctcag26<210>11<211>29<212>DNA<213>人工合成<400>11ctgcagctaagctagactaatggtgagga29<210>12<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>12actcaccgcgacgtctgt18<210>13<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>13ttcctttgccctcggacg18當前第1頁1 2 3