基于陸地棉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物與應(yīng)用本案為申請?zhí)?01410284580.1的分案申請技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及基于陸地棉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物與應(yīng)用，特別涉及基于陸地棉Coker312莖尖轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR引物及其應(yīng)用，屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，也是最重要的紡織纖維作物。其栽培種有4個,包括2個二倍體棉種,即草棉(Gossypium.herbaceum)和亞洲棉(G.arboreum)以及2個四倍體棉種,即陸地棉(G.hirsutum)和海島棉(G.barbadense)。由于陸地棉的產(chǎn)量高,適應(yīng)性的特點(diǎn)，使之成為栽培種中的重要品種。但目前育成的陸地棉品種多樣性水平降低，遺傳基礎(chǔ)狹窄，導(dǎo)致在生產(chǎn)上難以區(qū)分和識別，從而制約著產(chǎn)量和品質(zhì)的進(jìn)一步提高。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記成為改善這一問題的首選方法。簡單重復(fù)序列(SSR)是一種高度多態(tài)和共顯性標(biāo)記，因而被廣泛用于分子標(biāo)記遺傳分析。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,許多物種中已開發(fā)出大量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),這些數(shù)據(jù)在新標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用過程中具有重要意義。蘿卜(RaphanussativusL.),辣椒(CapsicumannuumL.),芝麻(SesamumindicumL.)等作物中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的挖掘，為其識別和開發(fā)新的EST-SSR標(biāo)記提供可靠性。目前利用轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)新的分子標(biāo)記在棉花中已有應(yīng)用，來德勇等利用陸地棉花發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘了670個新的EST-SSR標(biāo)記；陳浩東等從達(dá)爾文氏棉轉(zhuǎn)錄組序列中開發(fā)了780對EST-SSR引物，并詳細(xì)分析了EST-SSR位點(diǎn)的特征，引物的多態(tài)性及可轉(zhuǎn)移性；呂遠(yuǎn)大等基于海島棉纖維發(fā)育EST序列開發(fā)出380對SSR引物；Jena等在草棉轉(zhuǎn)錄組99780個Unigene中，查找出12471個SSR位點(diǎn)，分布于8900條EST中。目前，棉花中開發(fā)的EST-SSR主要與纖維發(fā)育基因相關(guān)，與棉花早期形態(tài)建成相關(guān)的基因SSR標(biāo)記開發(fā)尚未見報道。莖端組織與植物葉原基、芽原基的發(fā)生以及植物頂端生長優(yōu)勢密切相關(guān)，開發(fā)與此相關(guān)的EST-SSR既能增加棉花EST-SSR標(biāo)記的數(shù)量，又能深入探究EST-SSR標(biāo)記基因的功能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于陸地棉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物與應(yīng)用?；陉懙孛耷o尖轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)出的EST-SSR引物具有擴(kuò)增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，可有效用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、高密度圖譜的構(gòu)建、品種純度和真實性鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC056的引物，該引物為一對，核苷酸序列分別為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。上述EST-SSR標(biāo)記SCRC056的引物在遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC056定位于chr.16(D7)上20.4cM處，位于chr.16(D7)上15.4cM的標(biāo)記BNL2734與chr.16(D7)上24.4cM的標(biāo)記CGR6280之間，與標(biāo)記BNL2734相距5cM，與標(biāo)記CGR6280相距4cM。一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC371的引物，該引物為一對，核苷酸序列分別為SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。上述EST-SSR標(biāo)記SCRC371的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC371定位于chr.18(D13)上63.2cM處，位于chr.18(D13)上52.7cM的標(biāo)記SHIN1403與chr.18(D13)上78.4cM的標(biāo)記CGR5021之間，與標(biāo)記SHIN1403相距10.5cM。一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC878的引物，該引物為一對，核苷酸序列分別為SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。上述EST-SSR標(biāo)記SCRC878的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC878定位于chr.2(A2)上42.5cM處，位于連鎖群末端,與位于chr.2(A2)上35.5cM的標(biāo)記HAU880距離最近，相距7.0cM。一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC1022的引物，該引物為一對，核苷酸序列分別為SEQIDNO.7和SEQIDNO.8。上述EST-SSR標(biāo)記SCRC1022的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC1022定位于chr.23(D9)上19.5cM處，位于chr.23(D9)上16.6cM的標(biāo)記CGR5392與chr.23(D9)上24.4cM的標(biāo)記HAU2017之間，與標(biāo)記CGR5392相距2.9cM，與標(biāo)記HAU2017相距4.9cM。上述的EST-SSR標(biāo)記的引物進(jìn)行棉花遺傳多樣性分析的方法，步驟如下：(1)DNA提取利用改良的CTAB法提取待測樣品總DNA(2)引物擴(kuò)增及電泳檢測以步驟(1)提取的待測樣品為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色。PCR體系(10μL)包括1.0μL10×TaqBuffer(含Mg2+)，0.2μLdNTP，0.1μL(2.5U)Taq酶，上下游引物各0.6μL,2.0μL(20～50ng)DNA模板，加無菌蒸餾水至10μL。PCR程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃45s，(Tm)℃45s,72℃45s,共32個循環(huán)；72℃延伸7min；25℃保存。PCR產(chǎn)物加入2.0μL溴酚藍(lán)后點(diǎn)樣，采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳在ElectrophoresisPowerSupply-EPS301(MadeinSweden)核酸電泳系統(tǒng)中進(jìn)行。取1.2μL樣品，以Takara20bpDNALadderMarker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，300W恒功率電泳40min，銀染顯色。(3)數(shù)據(jù)統(tǒng)計。采用兩種數(shù)據(jù)統(tǒng)計的方法：①記錄多態(tài)性位點(diǎn)。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和引物擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計數(shù)據(jù)。同一等位點(diǎn)出現(xiàn)清晰條帶記錄為“1”，無條帶記錄為“0”；②差異性條帶記錄。以引物在親本中擴(kuò)增出的條帶為標(biāo)準(zhǔn)，親本1的帶型記錄為“1”，親本2的帶型記錄為“2”，出現(xiàn)于親本帶型不一樣的第一種帶型記錄為“3”，以此類推。所述遺傳多樣性分析為：采用上述(3)中①方法統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，利用PopGene32計算引物的多態(tài)性信息含量(PIC)。所述高密度遺傳圖譜的構(gòu)建是采用上述步驟(3)中②記錄的數(shù)據(jù)采用Jion-Map4.0軟件構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜(LOD值＝6.5)，以Kosambi函數(shù)作圖；采用MapChart2.2繪圖軟件繪制遺傳圖譜。有益效果本發(fā)明所述的EST-SSR引物均來自陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組序列，與以往的陸地棉纖維相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組中開發(fā)出的SSR引物存在功能差別，所述的引物在陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組中分布均勻、多態(tài)性豐富、擴(kuò)增穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶易于鑒定，并且成功連鎖到高密度遺傳圖譜上，豐富了陸地棉基于轉(zhuǎn)錄組發(fā)掘SSR引物的數(shù)量，可有效用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、高密度圖譜的構(gòu)建、品種純度和真實性鑒定。附圖說明圖1為SSRLocator軟件搜索結(jié)果示意圖；圖2為引物SCRC056在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；圖中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號，7、魯原343，8、3-79，9、海7124，10、阿須莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號；圖3為引物SCRC371在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；圖中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號，7、魯原343，8、3-79，9、海7124，10、阿須莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號；圖4為引物SCRC878在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；圖中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號，7、魯原343，8、3-79，9、海7124，10、阿須莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號；圖5為引物SCRC1022在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；圖中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號，7、魯原343，8、3-79，9、海7124，10、阿須莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號；圖6為5對引物在重組自交系親本中擴(kuò)增后的電泳結(jié)果圖；圖中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，5對引物：SCRC056(Ⅰ)、SCRC371(Ⅱ)、SCRC584(Ⅲ)、SCRC878(Ⅳ)、SCR1022C(Ⅴ)；1、親本1，2、親本2；圖7為4對引物在遺傳圖譜上的定位示意圖。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實施例陸地棉Coker312轉(zhuǎn)錄組EST-SSR在棉屬種間及種內(nèi)多態(tài)性分析中的應(yīng)用1.棉花基因組DNA的提取(1)材料從棉花種質(zhì)材料中選取5個棉種共13份材料(見表1)，用于新開發(fā)引物的評價，包括擴(kuò)增效果和多態(tài)性分析。表1本發(fā)明中用于引物多態(tài)性分析的材料信息(2)CTAB法提取基因組DNA采用改良的CTAB法提取棉花DNA，具體步驟如下：1)取棉花供試材料的新鮮葉片0.2g，洗凈，擦干，撕碎后放入2mLA離心管中，加入液氮，使用Retsch(MM400)組織研磨儀進(jìn)行研磨。2)向離心管中加入700μL提取緩沖液(4℃保存，成分如表2所示)，渦旋均勻，冰浴10min，7200轉(zhuǎn)/min離心10min，棄去上清液。表2提取緩沖液配方(500mL)3)向沉淀中加入700μL裂解緩沖液(65℃預(yù)熱，成分如表3所示)，用槍頭輕輕攪勻，65℃水浴40min，過程中輕輕翻轉(zhuǎn)幾次。表3裂解緩沖液配方(500mL)4)水浴后，加入氯仿：異戊醇(體積比24:1)700μL，翻轉(zhuǎn)30次以上，15℃10000轉(zhuǎn)/min離心10min。5)將上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入0.6倍上清液體積的異丙醇(-20℃預(yù)冷)，翻轉(zhuǎn)直到出現(xiàn)絮狀沉淀，靜置10min，10000轉(zhuǎn)/min離心8min，棄去上清液。6)在沉淀中加入700μL70％乙醇洗滌(此步可以過夜)，10000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，置通風(fēng)處干燥無酒精氣味為止。7)加入700μLTE緩沖液，65℃水浴30min。8)DNA溶解后，加入700μL氯仿：異戊醇(體積比24:1)，緩慢翻轉(zhuǎn)30次以上，靜置5min后10000轉(zhuǎn)/min離心10min。9)取上清液轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中，加入0.1倍上清液體積的醋酸鈉，加入等上清液體積的異丙醇(-20℃)翻轉(zhuǎn)30次以上，靜置30min，10000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液。10)加入700μL70％乙醇洗滌DNA小團(tuán)，10000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液，晾干DNA小團(tuán)。11)加入200μLTE緩沖液，4℃保存。12)利用DNA濃度檢測儀檢測DNA濃度，1％(質(zhì)量比體積)的瓊脂糖凝膠電泳和EppendorfBiophotometerDNA濃度儀檢測DNA質(zhì)量。2.陸地棉Coker312莖尖轉(zhuǎn)錄組EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)(1)陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組序列SSR位點(diǎn)的查找基于陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組測序得到的73518條unigene序列，利用軟件MISA和SSRLocator查找2～10bp的SSR位點(diǎn)，查找條件分別≥6、5、4、4、4、3、3、3。(2)陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組SSR引物的設(shè)計根據(jù)步驟(1)中所獲得的SSR序列為中心，提取SSR上下游各200bp序列，如果上游或下游序列不足200bp則提取上游或下游的全部序列設(shè)計引物。以新設(shè)計的SSR引物為引物，以CMD(http：//www.cottonmarker.org/)的EST序列為模板運(yùn)行ePCR，獲得了無重復(fù)的新EST-SSR引物，命名為SCRCXXX(ShanDongCottonResearchCenter)。設(shè)計的主要參數(shù)為：引物長度18～21bp，最適長度20bp，PCR產(chǎn)物長度100～395；最適Tm值58℃。引物設(shè)計成功后由上海生物工程有限公司合成。(3)陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組SSR引物的擴(kuò)增和篩選選擇4份棉花材料，用于檢測陸地棉轉(zhuǎn)錄組EST-SSR標(biāo)記的擴(kuò)增情況。采用步驟(2)中合成的引物，以4份材料的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增效果篩選可穩(wěn)定擴(kuò)增、帶型清晰的引物650對。上述650對擴(kuò)增穩(wěn)定的引物，在本發(fā)明所使用的13份棉花材料中進(jìn)行擴(kuò)增，其中有83對引物在13份材料中能擴(kuò)出多態(tài)性條帶，選取其中23對條帶清晰，多態(tài)性信息豐富的條帶，在不同種間及種內(nèi)進(jìn)行多態(tài)性分析。表4基于陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的23對EST-SSR引物信息PCR體系(10μL)包括：1.0μL10×TaqBuffer(含Mg2+)，0.2μLdNTP，0.1μL(2.5U)Taq酶，上下游引物各0.6μL,2.0μl(20～50ng)DNA模板，加無菌蒸餾水至10μL。PCR程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性45s，(Tm)℃退火45s，72℃延伸45s，共32個循環(huán)；72℃延伸7min；25℃保存。PCR產(chǎn)物加入2.0μL溴酚藍(lán)后點(diǎn)樣，采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳在ElectrophoresisPowerSupply-EPS301(MadeinSweden)核酸電泳系統(tǒng)中進(jìn)行。取1.2μL樣品，以Takara20bpDNALadderMarker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，300W恒功率電泳40min，銀染顯色。(4)數(shù)據(jù)分析1)記錄多態(tài)性位點(diǎn)。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和引物擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計數(shù)據(jù)。同一等位點(diǎn)出現(xiàn)清晰條帶記錄為“1”，無條帶記錄為“0”；建立供試材料SSR多態(tài)性信息數(shù)據(jù)庫。利用PopGene32軟件計算，供試材料不同種內(nèi)及種間多態(tài)性信息(PIC)。在13份供試材料中，在總材料之間的PIC變幅：0.121～0.648，平均PIC為0.422，其中五個棉種間(Tm-1，3-79，阿非利加棉，雷蒙德氏棉，石系亞1號)的平均PIC＝0.424，明顯高于陸地棉與海島棉種間詳情見表5。表523對陸地棉EST-SSR引物在棉屬種間及種內(nèi)的多態(tài)性分析在上述引物中選擇在本實驗室重組自交系親本中有差異性條帶的引物(見圖6)，分別為：SCRC056，SCRC371，SCRC584，SCRC878，SCRC1022。使用這5對引物在重組自交系359個群體中記性擴(kuò)增。上述本實驗室重組自交系的構(gòu)建為采用魯棉研22號(父本)與魯原343(母本)雜交后，從F2代開始連續(xù)自交至F8代獲得，操作方法均為本領(lǐng)域常規(guī)手段。2)差異性條帶記錄。以引物在親本中擴(kuò)增出的條帶為標(biāo)準(zhǔn)，親本1的帶型記錄為“1”，親本2的帶型記錄為“2”，出現(xiàn)于親本帶型不一樣的第一種帶型記錄為“3”，以此類推。構(gòu)建遺傳圖譜數(shù)據(jù)庫。利用Jion-Map4.0軟件構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜(LOD值＝6.5)，以Kosambi函數(shù)作圖；采用MapChart2.2繪圖軟件繪制遺傳圖譜。上述5對引物中有4對成功連鎖到前期構(gòu)建的遺傳圖譜上(見圖7)，分別為SCRC056、SCRC371、SCRC878、SCRC1022。其中，標(biāo)記SCRC056定位于chr.16(D7)上20.4cM處，位于chr.16(D7)上15.4cM的標(biāo)記BNL2734與chr.16(D7)上24.4cM的標(biāo)記CGR6280之間，與標(biāo)記BNL2734相距5cM，與標(biāo)記CGR6280相距4cM；標(biāo)記SCRC371定位于chr.18(D13)上63.2cM處，位于chr.18(D13)上52.7cM的標(biāo)記SHIN1403與chr.18(D13)上78.4cM的標(biāo)記CGR5021之間，與標(biāo)記SHIN1403相距10.5cM；標(biāo)記SCRC878定位于chr.2(A2)上42.5cM處，位于連鎖群末端,與位于chr.2(A2)上35.5cM的標(biāo)記HAU880距離最近，相距7.0cM；標(biāo)記SCRC1022定位于chr.23(D9)上19.5cM處，位于chr.23(D9)上16.6cM的標(biāo)記CGR5392與chr.23(D9)上24.4cM的標(biāo)記HAU2017之間，與標(biāo)記CGR5392相距2.9cM，與標(biāo)記HAU2017相距4.9cM。