本發(fā)明涉及生物催化轉(zhuǎn)化
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種生物催化兒茶酚類化合物烴基化的方法。
背景技術(shù)：
：兒茶酚衍生物廣泛存在于自然界中，具有抗氧化，抗衰老，消除有害自由基等作用?；谄淠负朔恿u基修飾的化合物也多被用于制備新型醫(yī)藥中間體及具有生物活性的天然產(chǎn)物。Li等人合成系列兒茶酚類烷基化產(chǎn)物用于流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑的活性評(píng)價(jià)(J.Li,etal.Mar.Drugs2011,9,1887-1901)；等人合成糖基化的多巴胺用于潛在的抗帕金森藥物研究(C.etal.Carbohydr.Res.2000,327,353-365)；Fumeaux等人基于3,4-二羥基苯甲醛酚羥基的多種修飾合成了24種潛在的人咖啡多酚代謝物(R.Fumeaux,etal.Org.Biomol.Chem.2010,8,5199-5211)。傳統(tǒng)的化學(xué)烴基化方法(G.L.Plourde,etal.Molecules,2002,7,697-705；US19730427200)通常在強(qiáng)堿催化作用下與鹵代烷烴反應(yīng)，或?qū)翰璺宇惢衔锱c醇、三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯經(jīng)光延反應(yīng)生成(X.Wang,etal.Synlett2010,19,2947-2949)。反應(yīng)條件苛刻，環(huán)境不友好。當(dāng)所需烴基化的兒茶酚類化合物含多個(gè)親核基團(tuán)時(shí)，反應(yīng)均需考慮酚羥基以外親核基團(tuán)的選擇性保護(hù)及脫保護(hù)，增大合成難度。兒茶酚類化合物含兩個(gè)酚羥基，現(xiàn)有烴基化方法的區(qū)域選擇性均依賴于酚羥基的酸性，偏好烴基化酸性較強(qiáng)的酚羥基，對(duì)酚羥基酸性無(wú)明顯差異的兒茶酚類化合物無(wú)選擇性。例如，在對(duì)以兒茶酚烴基化結(jié)構(gòu)為研究的神經(jīng)氨酸酶、兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的合成中，具有強(qiáng)吸電子基團(tuán)的兒茶酚類化合物如3,4-二羥基苯甲酸甲酯的化學(xué)單烴基化產(chǎn)物以4-位酚羥基修飾為主，為合成3-位酚羥基取代產(chǎn)物，則需對(duì)反應(yīng)物先進(jìn)行雙烴基化，隨后借助Pd/C催化還原獲得3-位烴基化修飾產(chǎn)物，而Pd/C的催化還原本身也具有一定選擇性(M.Hayashida,etal.Chem.Pharm.Bull.2006,54,1299-1303)。兒茶酚類化合物選擇性烴基化新方法的開(kāi)發(fā)將為兒茶酚衍生物的合成及應(yīng)用提供更廣闊的發(fā)展空間。生物催化具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、選擇性強(qiáng)等突出優(yōu)點(diǎn)，是拓展和替代傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)合成的重要方法。兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT，E.C.2.1.1.6)廣泛存在于哺乳動(dòng)物的多種組織中，以輔酶S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基化供體，可對(duì)兒茶酚類化合物酚羥基進(jìn)行選擇性甲基化修飾，釋放等當(dāng)量的副產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)。反應(yīng)底物范圍廣，具有良好的化學(xué)及區(qū)域選擇性，其區(qū)域選擇性不依賴于底物結(jié)構(gòu)化學(xué)性質(zhì)。天然COMT催化兒茶酚類化合 物甲基化偏好性生成間位取代產(chǎn)物，通過(guò)對(duì)COMT定向進(jìn)化可調(diào)整其區(qū)域偏好性(J.Zhang,etal.J.Am.Chem.Soc.2011,133,17134-17137)。COMT可通過(guò)發(fā)酵方式批量制備，表達(dá)COMT的工程菌株也曾被開(kāi)發(fā)用于生產(chǎn)食用香料香蘭素(K.Li,etal.J.Am.Chem.Soc.1998,120,10545-10546)。良好的生物催化潛力激發(fā)我們開(kāi)發(fā)并利用COMT的催化潛力于催化兒茶酚類化合物的烴基化。對(duì)COMT的輔酶特異性進(jìn)行拓展，以甲基取代的SAM類似物為烴基化供體，實(shí)現(xiàn)兒茶酚類酚羥基選擇性烴基化。目前，相似的策略在小分子烷基化上報(bào)道僅有兩例。利用來(lái)源于抗生素香豆霉素A1及新生霉素生物合成路徑中的甲基轉(zhuǎn)移酶Novo及CouO催化香豆素類化合物的付克烷基化(H.Stecher,etal.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,9546-9548)；利用rebeccamycin生物合成路徑中的甲基轉(zhuǎn)移酶RebM催化rebeccamycin同系物羥基烷基化(S.Singh,etal.Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,3965-3969)。盡管專利(WO2013029075A1；AT511856A1)曾對(duì)這種烴基化方法進(jìn)行報(bào)道，其權(quán)利要求烴基化對(duì)象為所有含親核中心的小分子化合物，方法涉及元件包括烴基化的硫鹽及SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶含COMT—其權(quán)利要求范圍廣而不具體，無(wú)對(duì)應(yīng)兒茶酚烴基化修飾適用對(duì)象，具體操作方法及對(duì)應(yīng)實(shí)施案例。利用該方法制備烴基化產(chǎn)物需消耗化學(xué)當(dāng)量的SAM類似物，如能實(shí)現(xiàn)SAM類似物的循環(huán)再生，則可使反應(yīng)更具經(jīng)濟(jì)性及實(shí)用性，但目前還未見(jiàn)SAM類似物循環(huán)再生利用的報(bào)道。本發(fā)明以SAM類似物為烴基化供體，利用COMT催化兒茶酚類化合物的烴基化，通過(guò)添加固體酸催化劑可實(shí)現(xiàn)SAM類似物的循環(huán)利用。這種酶催化兒茶酚類化合物烴基化的方法反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，操作簡(jiǎn)單，原料適用范圍廣，烴基化供體可循環(huán)再生，催化轉(zhuǎn)化率高，化學(xué)及區(qū)域選擇性好，其區(qū)域選擇性不依賴反應(yīng)物酚羥基酸性，以間位取代產(chǎn)物為主。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種具體的生物催化兒茶酚類化合物酚羥基烴基化的方法。反應(yīng)式如下：反應(yīng)可直接獲得單烴基化取代產(chǎn)物。當(dāng)烴基化對(duì)象為烴 基化產(chǎn)物以間位修飾產(chǎn)物為主，間位產(chǎn)物占總單烴基化產(chǎn)物的70-99.9％；當(dāng)烴基化對(duì)象為烴基化產(chǎn)物以間位修飾產(chǎn)物為主，間位產(chǎn)物占總單烴基化產(chǎn)物的70-99.9％。反應(yīng)式中R1為a)氫原子，b)鹵素原子，c)羥基，d)羧基，e)氰基，f)氨基，g)硝基，h)醛基，i)C1-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基，例如甲基、乙基、烯丙基等，j)含雜原子的C1-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基，例如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基等，k)低級(jí)?；?，l)環(huán)烷基羰基，m)低級(jí)烷基磺?；琻)環(huán)烷基，o)雜環(huán)烷基；R為C2-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基，或含有雜原子的C2-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基；或R為其中R2為C1-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基，或含雜原子C1-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基；術(shù)語(yǔ)“雜原子”是指N，S或O原子；術(shù)語(yǔ)“鹵素原子”是指氟、氯、溴或碘原子；術(shù)語(yǔ)“低級(jí)酰基”是指(C1-10烷基)-CO基團(tuán)，例如乙?；⒈；⒍□；?、異丁?；?、新戊?；?、戊?；?、異戊?；?；術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基羰基”是指(環(huán)烷基)-C(O)–基團(tuán)，例如環(huán)丙基羰基、環(huán)丁基羰基、環(huán)戊基羰基、環(huán)己基羰基等；術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基磺?；笔侵?C1-10烷基)-SO2–基團(tuán)，例如甲烷磺?；?、乙烷磺?；?、丁烷磺?；?、戊烷磺?；?、己烷磺?；?；術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”是指3到7元飽和環(huán)烴類，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基等；術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)烷基”是指4到7元飽和雜環(huán)基，所述雜環(huán)基包含-NH-、-O-或-S-作為環(huán)的成員并通過(guò)碳原子成鍵。例如四氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫吡喃基、吡咯烷-2-基、哌啶-2-基等。烴基化的具體方法為，以SAM類似物為烴基供體，在溶液中，溫度為10-40℃，反應(yīng)1-72h，以生物催化劑催化兒茶酚類化合物酚羥基的烴基化，得到相應(yīng)的產(chǎn)物；其中SAM類似物的用量與兒茶酚類化合物的物質(zhì)的量的比為1：0.1-100，生物催化劑的用量與兒茶酚類化合物的物質(zhì)的量的比為1：0.1-100，溶液的pH為5.5-8.5。所涉及的SAM類似物具有如下通式：其中R為C2-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基如乙基、異丙基、烯丙基等，或含有N，S或O原子的C1-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基如3-氯烯丙基、3-氨基烯丙基、C4H9OCH2-、CF3CH2-、HOCH2-等；或R為其中R2為C1-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基如甲基、乙基、異丙基、烯丙基等，或含N，S或O原子的C1-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基如3-氯烯丙基、3-氨基烯丙基、C4H9OCH2-、CF3CH2-、HOCH2-等；其中，R為時(shí)為優(yōu)選烴基供體；R3為H或C1-C9飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基如氫、甲基、乙基、異丙基、烯丙基等，或含有N，S或O原子的C1-C9飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基如羥基、氨基、3-氯烯丙基、3-氨基烯丙基、CH3OCH2-、CF3CH2-、HOCH2-等。所述的SAM類似物可以通過(guò)在反應(yīng)體系中添加固體酸催化劑和R-X原位再生；所述固體酸催化劑為SiO2、Al2O3、ZrO2、ZnO、SiO2-Al2O3、SiO2-MgO、SiO2-ZrO2、B2O3-Al2O3、Cr2O3-Al2O3、ZrO2-TiO2、ZnO-TiO2、MoO3-Al2O3、MgO-B2O3、天然沸石、ZnCl2、AlCl3、MnSO4、CuSO4、十二鉬磷酸、十鉬二釩磷酸、十二鎢磷酸中的一種或二種以上的混合物，固體酸催化劑用量為SAM類似物物質(zhì)的量的0.1-3倍；R-X中-X為-I、-Br、o-CH3-Ph-SO3-、CF3SO3-、CH3SO3-，R為C2-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基，或含有N，S或O的C2-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基；或R為其中R2為C1-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基，或含N，S或O的C1-C10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基；R-X用量為SAM類似物物質(zhì)的量的1-30倍。在反應(yīng)體系中添加固體酸催化劑和R-X時(shí)，需要同時(shí)添加有機(jī)溶劑以溶解R-X，有機(jī)溶劑為己烷、戊烷、石油醚、甲醇、乙醇、異 丙醇、二甲基亞砜、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺中的一種或二種以上的混合物。本發(fā)明的具體實(shí)施包括以下幾個(gè)典型方案，概述如下：A)將COMT純蛋白，SAM類似物及兒茶酚類化合物，在pH5.5-8.5含有物質(zhì)的量濃度為0-20mM鎂的氯鹽、硝酸鹽、溴鹽、硫酸鹽或磷酸鹽，0-10mM二硫蘇糖醇，0-10mM乙二胺四乙酸二鈉鹽中的一種或二種以上的混合物和體積百分濃度為0-50％有機(jī)溶劑的水溶液中，10-40℃，恒溫反應(yīng)1-72h。加入等體積乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相柱層析分離純化獲得目標(biāo)產(chǎn)物。B)將含有COMT的細(xì)胞裂解液，SAM類似物及兒茶酚類化合物，在pH5.5-8.5含有物質(zhì)的量濃度為0-20mM鎂的氯鹽、硝酸鹽、溴鹽、硫酸鹽或磷酸鹽，0-10mM二硫蘇糖醇，0-10mM乙二胺四乙酸二鈉鹽中的一種或二種以上的混合物和體積百分濃度為0-50％有機(jī)溶劑的水溶液中，10-40℃，恒溫反應(yīng)1-72h。加入等體積乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相柱層析分離純化獲得目標(biāo)產(chǎn)物。C)將含有COMT純蛋白和/或細(xì)胞裂解液，SAM類似物，兒茶酚類化合物，固體酸催化劑，R-X和體積百分濃度為0-50％的有機(jī)溶劑，在pH5.5-8.5含有物質(zhì)的量濃度為0-20mM鎂的氯鹽、硝酸鹽、溴鹽、硫酸鹽或磷酸鹽，0-10mM二硫蘇糖醇，0-10mM乙二胺四乙酸二鈉鹽中的一種或二種以上的混合物和體積百分濃度為0-50％有機(jī)溶劑的水溶液中，10-40℃，恒溫反應(yīng)1-72h。加入等體積乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相層析柱分離純化獲得目標(biāo)產(chǎn)物。其中，COMT純蛋白為商品化酶制劑。COMT純蛋白也可參照文獻(xiàn)(N.J.H.Cotton,etal.J.Biol.Chem.2004,279,23710-23718)構(gòu)建重組表達(dá)COMT的菌株，再通過(guò)常規(guī)蛋白質(zhì)純化技術(shù)獲得；細(xì)胞裂解液來(lái)源于一種表達(dá)兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶的宿主，包括但不限于原核微生物如大腸桿菌、真核微生物如釀酒酵母、動(dòng)物細(xì)胞株如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞或哺乳動(dòng)物腎臟組織。SAM類似物參照文獻(xiàn)方法(Y.Zhang,etal.Chembiochem.2013,14,1438-1443)，以R-X為原料合成；在實(shí)施方案C)中，利用添加固體催化劑及R-X，原位循環(huán)再生SAM類似物，具體反應(yīng)原理如下：利用COMT催化反應(yīng)可生成等當(dāng)量的SAH，在固體酸催化下可與R-X反應(yīng)，原位合成SAM類似物。在中性或偏酸性反應(yīng)體系中再生效果最佳，堿性及不添加固體酸催化劑不能實(shí)現(xiàn)SAM類似物的再生。本發(fā)明特點(diǎn)在于是一種生物催化兒茶酚類化合物酚羥基單烴基化的方法，反應(yīng)條件溫和，具備良好的化學(xué)選擇性及區(qū)域選擇性；烴基化供體可再生，催化轉(zhuǎn)化率高；良好的化學(xué)選擇性體現(xiàn)在當(dāng)R1含-NH2、-OH、-COOH、-SH等一個(gè)或多個(gè)親核反應(yīng)官能團(tuán)時(shí)，反應(yīng)只針對(duì)兒茶酚母核酚羥基烴基化，生成單烴基化產(chǎn)物；良好的區(qū)域選擇性體現(xiàn)在反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)以或?yàn)橹?，占總烴基化產(chǎn)物產(chǎn)量的65-99％，區(qū)域選擇性與酚羥基的酸性無(wú)關(guān)；催化轉(zhuǎn)化率高體現(xiàn)在通過(guò)調(diào)節(jié)生物催化劑用量，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間及使用SAM類似物循環(huán)再生策略可使兒茶酚類化合物在烴基化反應(yīng)中完全轉(zhuǎn)化。具體實(shí)施方式：以下實(shí)施例有助于了解本專利，但不局限于本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例中所用的SAM類似物參考文獻(xiàn)(Y.Zhang,etal.Chembiochem.2013,14,1438-1443)合成；按照文獻(xiàn)(N.J.H.Cotton,etal.J.Biol.Chem.2004,279,23710-23718)構(gòu)建表達(dá)COMT的大腸桿菌重組菌株，并按照文獻(xiàn)(J.X.Wang,etal.ProteinExpr.Purif.2007,53,97-103)表達(dá)純化COMT；按照文獻(xiàn)(E.H.Hansen,etal.Appl.Environ.Microbiol.2009,75,2765-2774)構(gòu)建表達(dá)COMT的釀酒酵母重組菌株；表達(dá)COMT的大腸桿菌重組菌株或釀酒酵母重組菌株全細(xì)胞裂 解液制備具體操作為將收集到的表達(dá)COMT的菌體重懸于含10％甘油的水相體系中，菌體超聲破碎后4℃離心，獲得上清液可溶蛋白。倉(cāng)鼠腎臟活性COMT的提取按照文獻(xiàn)(B.T.Zhu,etal.J.Biol.Chem.1994,269,292-299)進(jìn)行。實(shí)施例1將純化的COMT(終濃度6.3mg/mL)，Allyl-SAM(終濃度4.0mM)，兒茶酚(終濃度4.0mM)于30mL含有50mMTris-Cl,pH8.0，1mMMgCl2，0.5mMEDTA的溶液中，40℃反應(yīng)1h。加入30mL質(zhì)量濃度為26％的NaCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，乙酸乙酯/石油醚(1/10，v/v)為洗脫劑，得目標(biāo)產(chǎn)物2-(烯丙氧基)苯酚1，產(chǎn)率48.3％。目標(biāo)產(chǎn)物11HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.61(d,J＝5.2Hz,2H),5.42(dd,J＝13.6,36.6Hz,2H),5.64(s,1H),6.01-6.11(m,2H),6.79-6.94(m,4H)；13CNMR(160MHz,CDCl3)δ69.8,112.2,114.7,118.2,120.0,121.7,132.8,145.5,146.0；HRMS:CalculatedforC9H11O2([M+H]+):151.0714；obtained:151.0719。實(shí)施例2將純化的COMT(終濃度8.5mg/mL)，Allyl-SAM(終濃度4.0mM)，2,3-二羥基萘酚(終濃度6.0mM)，烯丙基溴(終濃度4mM),Al2O3(0.4mM)于20mL含有60％50mMNaH2PO4，pH5.5，1mMMgCl2，1mMDTT，40％甲醇的溶液中，10℃攪拌反應(yīng)72h。加入20mL的26％的NaCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，乙酸乙酯/石油醚(1/10,v/v)為洗脫劑，得目標(biāo)產(chǎn)物2-(烯丙氧基)萘酚2，產(chǎn)率為80.2％。目標(biāo)產(chǎn)物21HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.75(dt,J1＝5.6Hz,J2＝1.2Hz,2H),5.35-5.50(m,2H),5.93(s,1H),6.09-6.18(m,1H),7.13(s,1H),7.27(s,1H),7.28-7.34(m,2H),7.66(dd,J＝7.4,1.8Hz,2H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ69.7,107.0,109.5,118.7,123.8,124.4,126.3,126.4,128.9,129.7,132.4,145.7,146.3；HRMS:CalculatedforC13H11O2([M-H]－):199.0759；obtained:199.0765。實(shí)施例3：將表達(dá)COMT的大腸桿菌重組菌株全細(xì)胞裂解液(終濃度5.8mg/mL)，Allyl-SAM(終濃度4.0mM)，多巴胺(終濃度4.0mM)于30mL含有50mMTris-Cl,pH8.5，1mMDTT，20mMMgCl2，10mMEDTA的溶液中，37℃反應(yīng)5h后，加入30mL的26％的NaCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，甲醇/二氯甲烷(1/10,v/v)為洗脫劑，得目標(biāo)產(chǎn)物3m，產(chǎn)率20.1％。目標(biāo)產(chǎn)物3m1HNMR(400MHz,D2O)δ3.15(t,J＝7.4Hz,2H),4.55(t,J＝6.0Hz,2H),5.21-5.34(m,2H),5.93-6.04(m,1H),6.72-6.93(m,3H)；HRMS:CalculatedforC11H16NO2([M+H]+):194.1181；obtained:194.1176；HPLC測(cè)定反應(yīng)液中兩種異構(gòu)體的比例，流動(dòng)相為70％50mMNa2HPO4，pH2.5，1mM1-庚烷磺酸鈉，30％甲醇，檢測(cè)280nm紫外吸收信號(hào)，異構(gòu)體比例為3m:3p＝3.5:1。實(shí)施例4：將表達(dá)COMT的大腸桿菌重組菌株全細(xì)胞裂解液(終濃度5.8 mg/mL)，Allyl-SAM(終濃度4.0mM)，(終濃度4.0mM)，于30mL含有50mMHEPES,pH8.0，1mMMgCl2，0.5mMEDTA，1mMDTT的溶液中，37℃反應(yīng)12h，加入30mL1MHCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，產(chǎn)物柱層析分離，乙酸乙酯/石油醚(1/10,v/v)為洗脫劑，得目標(biāo)產(chǎn)物4m，產(chǎn)率40.8％。目標(biāo)產(chǎn)物4m1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.69(d,J＝5.2Hz,2H),5.34-5.46(dd,J＝8.0,12.0Hz,2H),6.02-6.12(m,1H),6.99(d,J＝8.8Hz,2H),7.60(d,J＝1.6Hz,2H)，7.74(dd,J＝0.4,1.8Hz,2H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ70.0,113.5,114.4,118.9,125.3,132.2,145.1,150.9,171.2；HRMS:CalculatedforC10H11O4([M+H]+):175.0657；obtained:175.0649；NMR測(cè)定反應(yīng)生成異構(gòu)體比例，反應(yīng)液經(jīng)Millipore’sUltra-0.510K超濾離心管離心除蛋白后加入1mL1NHCl酸化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除水，剩余固體殘留物重懸于D2O中NMR測(cè)定。兩種異構(gòu)體通過(guò)芳香環(huán)氫化學(xué)位移區(qū)分，產(chǎn)物以4m為主，通過(guò)計(jì)算峰面積比值獲得異構(gòu)體比例為4m:4p＝50:1。實(shí)施例5：將表達(dá)COMT的釀酒酵母重組菌株全細(xì)胞裂解液(終濃度6.2mg/mL)，Allyl-SAM(終濃度4.0mM)，(終濃度4.0mM)于30mL含有50mMTris-Cl,pH8.0，1mMMgCl2，10mMDTT的溶液中，37℃反應(yīng)12h。加入30mL1MHCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，乙酸乙酯/石油醚(1/10，v/v)為洗脫劑，得目標(biāo)產(chǎn)物5m，產(chǎn)率59.2％。目標(biāo)產(chǎn)物5m1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.28(s,9H),4.61(d,J＝5.6Hz,2H),6.99(dd,J＝39,13Hz,2H),5.49(s,1H)，6.02-6.11(m,3H),8.86-8.90(m,3H)；HRMS:CalculatedforC13H17O2([M-H]－):205.1229；obtained:205.1238；HPLC測(cè)定反應(yīng)液中兩種異構(gòu)體的比例，流動(dòng)相為45％50mMNa2HPO4，pH5.2，55％甲醇，檢測(cè)270nm紫外吸收信號(hào)，異構(gòu)體比例為5m:5p＝1:0。實(shí)施例6：將表達(dá)COMT的釀酒酵母重組菌株全細(xì)胞裂解液(終濃度7.1mg/mL)，Allyl-SAM(終濃度4.0mM)，(終濃度4.0mM)于30mL含有50mMTris-Cl,pH8.0，1mMMgCl2，0.5mMEDTA,8mMDTT的溶液中，37℃反應(yīng)2h，加入30mL1MHCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，乙酸乙酯/石油醚(1/10，v/v)為洗脫劑，得目標(biāo)產(chǎn)物6m，產(chǎn)率30.2％。目標(biāo)產(chǎn)物6m1HNMR(400MHz,CDCl3):δ4.62(dt,J＝5.6,1.4Hz,2H),5.28-5.43(m,2H),5.43(s,1H)，6.01-6.10(m,1H),6.65-6.68(m,1H),6.71-6.71(m,1H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ65.1,102.7,104.0,104.2,113.4,113.6,113.7,127.3,128.9,129.0,141.9,142.0,144.4,146.7；HRMS:CalculatedforC9H9FO2([M+H]+):169.0665；obtained:169.0659；HPLC測(cè)定反應(yīng)液中兩種異構(gòu)體的比例，流動(dòng)相為50％50mMNa2HPO4，pH5.2，50％甲醇，檢測(cè)276nm紫外吸收信號(hào)，異構(gòu)體比例為6m:6o＝7.4:1。實(shí)施例7：將純化的COMT(終濃度8.5mg/mL)，Allyl-SAM(終濃度4.0mM)，(終濃度6.0mM)，烯丙基溴(終濃度120mM),AlCl3(12mM)于30mL含有80％50mMTris-Cl,pH7.0，1mMMgCl2，0.5mMEDTA，20％正己烷的溶液中，20℃反應(yīng)72h，加入30mL1MHCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，乙酸乙酯/石油醚(1/20，v/v)為洗脫劑，分離主產(chǎn)物7m，產(chǎn)率75.6％。目標(biāo)產(chǎn)物7m1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.85(s,3H),4.58(dt,J＝6.0,1.0Hz,2H),5.25-5.39(m,2H),5.76(s,1H)，6.02-6.12(m,1H),6.48(dd,J＝4.4,1.2Hz,1H),6.61(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),6.94(t,J＝8.2Hz,1H)；HRMS:CalculatedforC10H12O3([M+H]+):181.0865；obtained:181.0859；HPLC測(cè)定反應(yīng)液中兩種異構(gòu)體的比例，流動(dòng)相為65％50mMNa2HPO4，pH5.2，35％甲醇，檢測(cè)276nm紫外吸收信號(hào)，異構(gòu)體比例為7m:7o＝2.1:1。實(shí)施例8：將純化的COMT(終濃度8.5mg/mL)，Allyl-SAM(終濃度4.0mM)，(終濃度6.0mM)，烯丙基溴(終濃度20mM),ZnCl2(2mM)于30mL含有80％50mMTris-Cl,pH7.0，0.5mMEDTA，2mMDTT，20％丙酮的溶液中，20℃反應(yīng)72h，加入30mL1MHCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，乙酸乙酯/石油醚(1/10，v/v)為洗脫劑，分離主產(chǎn)物8m，產(chǎn)率80.5％。目標(biāo)產(chǎn)物8m1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.11(t,J＝6.8Hz,3H),1.31-1.38(m,4H),1.72(m,2H),3.18(t,J＝7.2Hz,2H),4.78(d,J＝5.2Hz,2H),5.27-5.34(m,2H),5.38(s,1H)，6.08-6.11(m,1H),7.21(d,J＝4.4Hz,1H),7.32(d,J＝4.4Hz,1H),7.51(s,1H)；HRMS:CalculatedforC14H21O4S([M+H]+):285.1116；obtained:285.1110；HPLC測(cè)定反應(yīng)液中兩種異構(gòu)體的比例，流動(dòng)相為65％50mMNa2HPO4，pH5.2，35％甲醇，檢測(cè)276nm紫外吸收信號(hào)，異構(gòu)體比例為8m:8p＝3.1:1。實(shí)施例9：將純化的COMT(終濃度8.5mg/mL)，Allyl-SAM(終濃度4.0mM)，(終濃度6.0mM)，烯丙基溴(終濃度10mM),目標(biāo)產(chǎn)物9m1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.37-1.68(m,6H),1.89(m,2H),2.78(m,1H),4.72(d,J＝5.8Hz,2H),5.28-5.34(m,2H),5.62(s,1H)，6.12-6.17(m,1H),6.78(d,J＝6.8Hz,1H),6.90(d,J＝6.7Hz,1H),7.12(s,1H)；HRMS:CalculatedforC14H19O2([M+H]+):219.1340；obtained:219.1349；HPLC測(cè)定反應(yīng)液中兩種異構(gòu)體的比例，流動(dòng)相為55％50mMNa2HPO4，pH5.2，45％甲醇，檢測(cè)276nm紫外吸收信號(hào)，異構(gòu)體比例為9m:9p＝5.9:1。實(shí)施例10：將表達(dá)COMT的大腸桿菌重組菌株全細(xì)胞裂解液(終濃度5.8mg/mL)，Allyl-SAM(終濃度4.0mM)，(終濃度4.0mM)于30mL含有50mMHEPES,pH8.0，1mMMgCl2，0.5mMEDTA，2mMDTT的溶液中，37℃反應(yīng)12h，加入30mL1MHCl終止反應(yīng)，產(chǎn)物柱層析分離，乙酸乙酯/石油醚(1/60,v/v)為洗脫劑，得目標(biāo)產(chǎn)物10m，產(chǎn)率20.8％。目標(biāo)產(chǎn)物10m1HNMR(400MHz,CDCl3)δ2.52-2.68(m,2H),3.42-3.48(m,1H),4.58-4.68(m,4H),5.39(s,1H)，5.41-5.51(m,2H),6.09(m,1H),6.74(d,J＝7.2Hz,1H),6.88(d,J＝7.0Hz,1H),7.21(s,1H)；HRMS:CalculatedforC13H15O4([M+H]+):235.0926；obtained:235.0927；HPLC測(cè)定反應(yīng)液中兩種異構(gòu)體的比例，流動(dòng)相為55％50mMNa2HPO4，pH5.2，45％甲醇，檢測(cè)276nm紫外吸收信號(hào)，異構(gòu)體比例為10m:10p＝7.1:1。實(shí)施例11：將倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞裂解液(終濃度7.8mg/mL)，(終濃度4.0mM)，兒茶酚(終濃度4.0mM)于30mL含有50mMMops,pH6.5，1mMDTT，10mMMgCl2，10mMEDTA的溶液中，20℃反應(yīng)5h。加入30mL1MHCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，乙酸乙酯/石油醚(1/10，v/v)為洗脫劑，分離產(chǎn)物11，產(chǎn)率20.1％。目標(biāo)產(chǎn)物111HNMR(400MHz,D2O)δ3.48(s,1H),4.54(s,1H),6.02-6.33(m,4H)；13CNMR(400MHz,D2O)δ33.2,57.4,80.6,84.8,115.7,115.9,131.2,131.3,146.5,148.7；HRMS:CalculatedforC10H12NO2([M+H]+):178.0823；obtained:178.0820；實(shí)施例12：將純化的COMT(終濃度6.3mg/mL)，(終濃度4.0mM)，兒茶酚(終濃度4.0mM)于30mL含有50mMTris-Cl,pH8.0，1mMMgCl2，0.5mMEDTA的溶液中，40℃反應(yīng)1h。加入30mL質(zhì)量濃度為26％的NaCl止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，乙酸乙酯/石油醚(1/5，v/v)為洗脫劑，分離產(chǎn)物12產(chǎn)率20.1％。目標(biāo)產(chǎn)物121HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.76-1.78(m,2H),1.91-1.95(m,2H),2.28-2.38(m,4H),2.78(t,J＝6.8Hz,2H),3.62(t,J＝5.2Hz,2H),4.75(s,1H),5.39(s,1H),6.12(s,2H)6.85-6.96(m,4H)；HRMS:CalculatedforC16H23N2O3([M+H]+):291.1664；obtained:291.1658。實(shí)施例13：將表達(dá)COMT的大腸桿菌重組菌株全細(xì)胞裂解液(終濃度5.8mg/mL)，(終濃度4.0mM)，(終濃度4.0mM)，于30mL含有50mMHEPES,pH8.0，1mMMgCl2，0.5mMEDTA，1mMDTT的溶液中，37℃反應(yīng)12h，加入30mL1MHCl終止反應(yīng)，產(chǎn)物柱層析分離，乙酸乙酯/石油醚(1/70,v/v)為洗脫劑，獲得目標(biāo)產(chǎn)物13m產(chǎn)率為30.9％；主產(chǎn)物13m1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.69(d,J＝5.2Hz,2H),5.34-5.46(dd,J＝8.0,12.0Hz,1H),6.02-6.12(m,1H),6.99(d,J＝8.8Hz,2H),7.60(d,J＝1.6Hz,2H)，7.74(dd,J＝0.4,1.8Hz,2H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ70.0,113.5,114.4,118.9,125.3,132.2,145.1,150.9,171.2；HRMS:CalculatedforC10H10ClO4([M+H]+):229.0268；obtained:229.0254。NMR測(cè)定反應(yīng)生成異構(gòu)體比例，反應(yīng)液經(jīng)Millipore’sUltra-0.510K超濾離心管離心除蛋白后加入1mL1NHCl酸化，旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)除水，剩余固體殘留物重懸于D2O中NMR測(cè)定。兩種異構(gòu)體通過(guò)芳香環(huán)氫化學(xué)位移區(qū)分，通過(guò)計(jì)算峰面積比值獲得異構(gòu)體比例為13m:13p＝20:1。實(shí)施例14：將表達(dá)COMT的釀酒酵母重組菌株全細(xì)胞裂解液(終濃度7.1mg/mL)，(終濃度4.0mM)，(終濃度4.0mM)于30mL含有50mMTris-Cl,pH8.0，1mMMgCl2，0.5mMEDTA,8mMDTT的溶液中，37℃反應(yīng)2h，加入30mL1MHCl終止反應(yīng)，產(chǎn)物柱層析分離，乙酸乙酯/石油醚(1/10-1/2,v/v)為洗脫劑，獲得目標(biāo)產(chǎn)物14m，產(chǎn)率30.2％；主產(chǎn)物14m1HNMR(400MHz,CDCl3):δ2.98(s,1H),4.62(dt,J＝5.6,1.4Hz,2H),5.28-5.43(m,1H),5.43(s,1H)，6.01-6.10(m,1H),6.65-6.68(m,1H),6.71-6.71(m,1H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ65.1,80.6,80.1,102.7,104.0,104.2,113.4,113.6,113.7,127.3,128.9,129.0,141.9,142.0,144.4,146.7；HRMS:CalculatedforC11H10FO2([M+H]+):193.0620；obtained:193.0617。HPLC測(cè)定反應(yīng)液中兩種異構(gòu)體的比例，流動(dòng)相為50％50mMNa2HPO4，pH5.2，50％甲醇，檢測(cè)276nm紫外吸收信號(hào)，異構(gòu)體比例為14m:14o＝6.3:1。實(shí)施例15：將表達(dá)COMT的釀酒酵母重組菌株全細(xì)胞裂解液(終濃度6.2mg/mL)，(終濃度4.0mM)，(終濃度4.0mM)于30mL含有50mMTris-Cl,pH8.0，1mMMgCl2，10mMDTT的溶液中，37℃反應(yīng)12h。加入30mL1MHCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，乙酸乙酯/石油醚(1/20，v/v)為洗脫劑，獲得 目標(biāo)產(chǎn)物15m，產(chǎn)率37.2％；主產(chǎn)物15m1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.28(s,9H)，2.14(s,3H)，4.61(d,J＝5.6Hz,2H),5.49(s,1H)，8.86-8.90(m,3H)；HRMS:CalculatedforC13H18O3([M+H]+):223.1289；obtained:223.1280；HPLC測(cè)定反應(yīng)液中兩種異構(gòu)體比例，流動(dòng)相為45％50mMNa2HPO4，pH5.2，55％甲醇，檢測(cè)276nm紫外吸收信號(hào)，異構(gòu)體比例為15m:15p＝5.2:1。實(shí)施例16：將表達(dá)COMT的大腸桿菌全細(xì)胞裂解液(終濃度8.5mg/mL)，(終濃度4.0mM)，(終濃度6.0mM)，烯丙基溴(終濃度120mM),AlCl3(12mM)碘代異丁烷(終濃度90mM),SiO2(2mM)于20mL含有70％50mMHEPES,pH6.5，5mMMgCl2，1mMEDTA，1mMDTT，30％正己烷的溶液中，室溫25℃攪拌反應(yīng)30h。加入20mL1MHCl終止反應(yīng)，離心去除沉淀，上清乙酸乙酯萃取三次，有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除溶劑，粗產(chǎn)物硅膠層析柱分離，乙酸乙酯/石油醚(1/20-1/10，v/v)為洗脫劑，獲得目標(biāo)產(chǎn)物16m，產(chǎn)率89.8％。主產(chǎn)物16m1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.01(d,J＝2.2Hz,6H),2.12(m,1H),3.69(d,J＝2.7Hz,2H),3.89(s,1H),6.48(dd,J＝4.4,1.4Hz,1H),6.67(dd,J＝7.7,1.4Hz,1H),6.99(t,J＝7.8Hz,1H)；HRMS:CalculatedforC11H17O3([M+H]+):197.1133；obtained:197.1129。HPLC測(cè)定反應(yīng)液中兩種異構(gòu)體的比例，流動(dòng)相為50％50mMNa2HPO4，pH5.2，50％甲醇，檢測(cè)276nm紫外吸收信號(hào)，異構(gòu)體比例為16m:16o＝3:1。表1為實(shí)施例1-16羥基化的兒茶酚類及其對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。1實(shí)施例1-16羥基化的兒茶酚類及其對(duì)應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)實(shí)施例17：選取化合物2，3m，4m，5m，8m，13m，15m進(jìn)行流感病毒H1N1神經(jīng)氨酸酶體外活性抑制評(píng)價(jià)，活性檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)(J.Li,etal.Mar.Drugs2011,9,1887-1901)，以神經(jīng)氨酸酶抑制劑Tamiflu作為正對(duì)照。如表-2所示，濃度為50μM的兒茶酚類烴基化物分別具有對(duì)神經(jīng)氨酸酶15.8-130.8％的抑制活性，其中化合物4m與13m具有較高活性抑制能力，分別為Tamiflu的120.6％和130.8％。表-2神經(jīng)氨酸酶活性抑制測(cè)定結(jié)果化合物編號(hào)神經(jīng)氨酸酶活性抑制化合物編號(hào)神經(jīng)氨酸酶活性抑制Tamiflu100％5m55.2％215.8％8m50.3％3m26.5％13m130.8％4m120.6％15m48.8％由以上實(shí)施例可見(jiàn)，通過(guò)生物催化制備的兒茶酚類化合物4m和13m比Tamiflu更高的抑制神經(jīng)氨酸酶活性。亦可說(shuō)明本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，具備良好的化學(xué)選擇性及區(qū)域選擇性；烴基化供體可再生，催化轉(zhuǎn)化率高。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3