本發(fā)明涉及一種CTC分離純化方法，具體的涉及一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底及其制備方法與應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)臨床CTC分離技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)，是指從源發(fā)瘤體脫落進(jìn)入人體外周血的腫瘤細(xì)胞。循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)后遷移到身體其他組織部位造成腫瘤的轉(zhuǎn)移，也被稱(chēng)為擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞。CTC與癌癥轉(zhuǎn)移、治療效果、癌癥復(fù)發(fā)、用藥指導(dǎo)及預(yù)后密切相關(guān)，因而被作為癌癥轉(zhuǎn)移早期診斷和治療的重要生物標(biāo)志物。對(duì)CTC的研究有望闡明癌癥轉(zhuǎn)移、藥物敏感及耐藥性產(chǎn)生的內(nèi)在機(jī)理，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥病人的個(gè)體化有效治療。為了得到純度高及生物活性良好的樣本，發(fā)展CTC的高效捕獲和分離技術(shù)具有極其重要的意義。

目前基于CTC分離的納米結(jié)構(gòu)基底的研究已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域和方向。經(jīng)過(guò)近幾年的研究發(fā)展，已將硅納米柱、碳納米管、石墨烯、納米粒子以及納米纖維等納米結(jié)構(gòu)材料應(yīng)用于CTC捕獲基底的研究中。然而目前的研究結(jié)果表明三維納米結(jié)構(gòu)在提高CTC捕獲效率的同時(shí)，也增加了對(duì)血細(xì)胞的吸附，這實(shí)際上會(huì)降低CTC的捕獲純度。而CTC的分子鑒定和功能分析需要更高純度的CTC樣品。Hsian-Rong Tseng課題組通過(guò)在微流控芯片上電紡PLGA聚合物納米纖維捕獲CTC，并采用激光微切割技術(shù)對(duì)單個(gè)的CTC進(jìn)行收集，并進(jìn)行分子生物學(xué)分析。然而，此方法非常耗時(shí)，且很難操作，也容易對(duì)細(xì)胞造成破壞。

另外，CTC被捕獲在界面上后，實(shí)現(xiàn)其生物活性的保持，則要求基底界面的組成具有更好的細(xì)胞相容性。然而對(duì)于細(xì)胞相容性更好的天然生物高分子，包括殼聚糖，目前還沒(méi)有應(yīng)用于基于納米粒子界面的CTC捕獲的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種生物相容性良好的基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底，該基底在納米界面上對(duì)分子識(shí)別作用進(jìn)行設(shè)計(jì)，將抗粘附分子與親和捕獲分子的作用進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，能夠有效抑制細(xì)胞非特異性捕獲且同時(shí)提高靶細(xì)胞的特異性識(shí)別，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)CTC的高效捕獲及純化。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述CTC捕獲與純化基底的方法，該方法工藝簡(jiǎn)單 便捷，成本低，并且對(duì)不同性質(zhì)的材料具有普適性。

本發(fā)明的又一目的在于提供所述CTC捕獲與純化基底的用途。

為實(shí)現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底，包括粒徑100-1000nm殼聚糖納米粒子，連接于殼聚糖納米粒子表面的抗粘附分子以及與所述抗粘附分子連接的CTC親和捕獲分子。

進(jìn)一步的，所述CTC捕獲與純化基底包括主要由分布在基材表面的復(fù)數(shù)殼聚糖納米粒子組成的三維納米結(jié)構(gòu)。

其中，采用的殼聚糖納米粒子表面具有良好的細(xì)胞相容性。

進(jìn)一步的，所述抗粘附分子旨在降低細(xì)胞在界面上的非特異粘附，可以包括各種功能化的聚乙二醇(PEG)分子，亦即，帶有功能基團(tuán)的聚乙二醇分子，所述功能基團(tuán)包括氨基和/或羧基，且不限于此。

在一較佳實(shí)施方案之中，所述抗粘附分子可采用NH₂-PEG-COOH。

進(jìn)一步的，所述CTC親和捕獲分子用以實(shí)現(xiàn)CTC細(xì)胞的高特異捕獲，其可以包括EpCAM適配體(DNA分子)或EpCAM適配體的各種飾化產(chǎn)物，例如DNA-NH₂，且不限于此。

一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底的制法，其包括：

(1)將分子量為Mw 40000～50000Da的低分子量殼聚糖溶于有機(jī)酸體系中形成均相透明殼聚糖溶液；

(2)以靜電紡絲裝置將所述殼聚糖溶液通過(guò)電噴方式施加于基材表面，形成殼聚糖納米粒子；

(3)在所述殼聚糖納米粒子表面枝接抗粘附分子；

(4)將CTC親和捕獲分子與連接在所述殼聚糖納米粒子表面的抗粘附分子偶聯(lián)，獲得所述CTC捕獲與純化基底。

在一較為優(yōu)選的實(shí)施方案之中，步驟(1)包括：將低分子量殼聚糖加入有機(jī)酸體系中，于室溫下攪拌4-8h后，獲得均相透明殼聚糖溶液，所述有機(jī)酸溶液包括濃度為60v/v％-90v/v％的乙酸或甲酸溶液。

在一較為優(yōu)選的實(shí)施方案之中，步驟(2)包括：將步驟(1)所獲殼聚糖溶液在靜電紡絲裝置中電噴0.1-4h，在基材表面制得殼聚糖納米粒子。

其中，所述基材可以是玻璃片、單晶硅片、金屬鋁片、有機(jī)薄膜、金屬等，且不限于此。

在一較為優(yōu)選的實(shí)施方案之中，步驟(3)包括：

將步驟(2)所獲殼聚糖納米粒子在氨水與甲醇的混合溶液(例如，氨水與甲醇的體積比 為4:96)中靜置1-4h，而后于40-60℃真空干燥24h以上；

以及，將所述殼聚糖納米粒子置于濃度為2.5v/v％的戊二醛溶液中反應(yīng)2-4h，然后于濃度為0.1wt％-1wt％的氰基硼氫化鈉溶液中浸漬12-24h，之后與濃度為0.1-10mg/mL的NH₂-PEG-COOH溶液反應(yīng)8-24h，從而在所述殼聚糖納米粒子表面枝接PEG分子。

在一較為優(yōu)選的實(shí)施方案之中，步驟(4)包括：在中性條件下，使CTC親和捕獲分子在具有活化羧基的偶聯(lián)試劑的作用下，與表面枝接有PEG分子的殼聚糖納米粒子進(jìn)行偶聯(lián)。

進(jìn)一步的，步驟(4)包括：

在中性條件下，使EpCAM適配體在具有活化羧基的偶聯(lián)試劑EDC及NHS(例如，其中EDC的濃度為0.2mol/L，NHS的濃度為0.05mol/L)的作用下，與NH₂-PEG-COOH接枝的殼聚糖納米粒子偶聯(lián)；

以及，將所述殼聚糖納米粒子置于濃度為0.1-1M的乙醇胺溶液中反應(yīng)10-60min，以封閉未完全反應(yīng)的NHS基團(tuán)，獲得所述CTC捕獲與純化基底。

在一更為具體的實(shí)施案例之中，一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底的制備方法可以包括如下步驟：

a)采用低分子量殼聚糖在有機(jī)酸體系中，于室溫下攪拌4-8h后，獲得均相透明殼聚糖溶液；

b)將步驟a中殼聚糖溶液在靜電紡絲裝置中進(jìn)行電噴0.1-4h，在基材表面制得殼聚糖納米粒子；

c)將步驟b所獲的分布于基材表面的殼聚糖納米粒子置于氨水和甲醇的混合溶液中靜止1-4h，而后置于真空干燥箱40-60℃干燥24h；

d)將步驟c中的殼聚糖納米粒子表面置于濃度為2.5v/v％的戊二醛溶液中反應(yīng)2-4h，然后浸入濃度為0.1wt％-1wt％的氰基硼氫化鈉溶液中12-24h，而后與濃度為0.1-10mg/mL的NH₂-PEG-COOH溶液反應(yīng)8-24h，將PEG分子接枝到殼聚糖表面；

e)在中性條件下，使?jié)舛葹?.1-10μM的適配體DNA-NH₂在活化羧基的偶聯(lián)試劑例如EDC和NHS的作用下，與NH₂-PEG-COOH接枝的殼聚糖進(jìn)行偶聯(lián)；

f)將步驟e中的獲得殼聚糖納米粒子表面置于濃度為0.1-1M的乙醇胺溶液中反應(yīng)10-60min，以封閉未完全反應(yīng)的NHS基團(tuán)，即制得所述基底。

前述的任一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底在CTC捕獲和純化中的應(yīng)用。

例如，其中的一種應(yīng)用方案可以是：一種裝置，其包含前述的任一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底。

又例如，其中的一種應(yīng)用方案可以是：一種CTC純化方法，包括：將被捕獲的CTC在 所述CTC捕獲與純化基底上原位培養(yǎng)。

其中，因CTC與血液細(xì)胞的增殖屬性差異，將已捕獲的細(xì)胞進(jìn)行原位培養(yǎng)可以進(jìn)一步提高靶細(xì)胞的純度。所述“原位培養(yǎng)”即：捕獲后的細(xì)胞在該基底后續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程中“優(yōu)勝劣汰”，換言之：靶細(xì)胞(CTC)保證活性并持續(xù)增殖，而血細(xì)胞將逐漸失去活性被淘汰。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有如下有益效果：

1)基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底可以提供細(xì)胞相容性良好的“軟”三維納米界面，能夠更好的與細(xì)胞納米結(jié)構(gòu)匹配和作用；

2)該CTC捕獲與純化基底在修飾特異捕獲分子的基礎(chǔ)上，引入抗粘附分子能夠保證高效捕獲靶細(xì)胞的前提下降低非靶細(xì)胞的非特異粘附；

3)該CTC捕獲與純化基底所捕獲CTC具有良好生物活性，能在界面進(jìn)行細(xì)胞的原位培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)CTC的進(jìn)一步純化。原位培養(yǎng)可以大量擴(kuò)增CTC，提高CTC的數(shù)量，這對(duì)CTC的分子鑒定等研究非常有幫助。

4)利用本發(fā)明的制備方法，可以制備不同粒徑的均一納米粒子表面，其簡(jiǎn)單便捷，成本低，實(shí)用性強(qiáng)。

5)本發(fā)明所述制備方法，所述的靜電紡絲納米粒子的制備方法對(duì)不同性質(zhì)的材料有普適性。

6)本發(fā)明所述制備方法可在不同基材上制備，包括玻璃片、單晶硅片、金屬鋁片、有機(jī)薄膜、金屬表面等。

附圖說(shuō)明

下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的闡述。

圖1是本發(fā)明一實(shí)施方案之中利用一種基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底進(jìn)行CTC捕獲以及純化的原理圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中以電噴工藝制備的不同納米粒徑的殼聚糖納米粒子表面的SEM照片；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中對(duì)殼聚糖納米粒子基底進(jìn)行界面修飾的原理圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中利用基底A、B、C三種不同界面捕獲細(xì)胞的熒光照片；

圖5a-圖5c是本發(fā)明實(shí)施例1中不同粒徑及界面修飾的基底的捕獲效率對(duì)比圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中殼聚糖納米粒子P4基底對(duì)不同細(xì)胞株捕獲特異性的考察結(jié)果圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例1中殼聚糖納米粒子P4基底對(duì)不同比例混合細(xì)胞株的捕獲行為的考察結(jié)果圖；

圖8a是本發(fā)明實(shí)施例1中殼聚糖納米粒子P4基底對(duì)已捕獲靶細(xì)胞/白細(xì)胞按10⁴/106比例混合捕獲后的原位培養(yǎng)純化效果的考察圖；

圖8b是本發(fā)明實(shí)施例1中殼聚糖納米粒子P4基底對(duì)已捕獲靶細(xì)胞/白細(xì)胞按10/106比例混合捕獲后的原位培養(yǎng)純化效果的考察圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)實(shí)際需要而做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本案發(fā)明人經(jīng)長(zhǎng)期研究和實(shí)踐，提出了本發(fā)明的技術(shù)方案，即，提供了一種基于殼聚糖納米粒子的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)捕獲與純化基底及其制備方法。

具體而言，本發(fā)明的一個(gè)方面包括：通過(guò)選擇細(xì)胞相容性良好的殼聚糖構(gòu)筑三維納米結(jié)構(gòu)“軟”基底，并引入抗粘附分子降低細(xì)胞在界面上的非特異粘附，以及，利用CTC親和捕獲分子實(shí)現(xiàn)CTC細(xì)胞的高特異捕獲；隨后基于CTC與血液細(xì)胞增殖屬性差異，通過(guò)被捕獲細(xì)胞原位培養(yǎng)的方式進(jìn)一步提高靶細(xì)胞的純度。

本發(fā)明的另一個(gè)方面包括：利用電噴低分子量殼聚糖稀溶液的方法構(gòu)筑結(jié)構(gòu)均一的殼聚糖納米粒子，然后將抗粘附分子，例如聚乙二醇(PEG)分子，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)連接在殼聚糖納米粒子表面，而后將親和捕獲分子，例如上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)適配體，與PEG分子結(jié)合，獲得所述基底。

本發(fā)明提供的CTC捕獲與純化基底具備良好的細(xì)胞相容性，能保持表面附著細(xì)胞的活性，且制備簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，并能實(shí)現(xiàn)所捕獲CTC細(xì)胞的原位培養(yǎng)純化。

實(shí)施例1該基于殼聚糖納米粒子的CTC捕獲與純化基底的制備方法的具體步驟如下：

a)采用低分子量殼聚糖在有機(jī)酸體系中，于室溫下攪拌4-8h后，獲得均相透明殼聚糖溶液。

b)將步驟a中殼聚糖溶液在靜電紡絲裝置中進(jìn)行電噴0.1-4h，在玻璃基板表面制得殼聚糖納米粒子。通過(guò)調(diào)整電噴液性質(zhì)、電噴參數(shù)及電噴時(shí)間制得不同納米粒徑及密度的殼聚糖納米粒子表面P1、P2、P3、P4、P5。所制得的不同殼聚糖納米粒子表面結(jié)構(gòu)形貌見(jiàn)圖2。

c)將步驟b中的殼聚糖納米粒子表面置于氨水/甲醇溶液(氨水與甲醇的體積比為4:96)中靜止1-4h，而后置于真空干燥箱40-60℃干燥24h。得到未經(jīng)修飾的殼聚糖納米粒子基底A，即bare殼聚糖納米粒子基底。

d)將步驟c中的殼聚糖納米粒子表面置于2.5v/v％的戊二醛溶液中反應(yīng)2-4h，然后浸 入0.1wt％-1wt％的氰基硼氫化鈉溶液中12-24h，而后與0.1-10mg/mL的NH₂-PEG-COOH反應(yīng)液作用8-24h，將PEG分子接枝到殼聚糖表面。得到PEG修飾的殼聚糖納米粒子基底B，即PEG殼聚糖納米粒子基底。

e)在中性條件下，使0.1-10μM的適配體DNA-NH₂在活化羧基的偶聯(lián)試劑EDC/NHS(其中EDC的濃度為0.2mol/L，NHS的濃度為0.05mol/L)的作用下，與NH₂-PEG-COOH接枝的殼聚糖進(jìn)行偶聯(lián)。

f)將步驟e中的獲得殼聚糖納米粒子表面置于0.1-1M的乙醇胺溶液中反應(yīng)10-60分鐘，以封閉未完全反應(yīng)的NHS基團(tuán)。得到適配體修飾的殼聚糖納米粒子基底C，即PEG-aptamer(PEG-DNA)殼聚糖納米粒子基底。其修飾流程圖如圖3所示。

實(shí)施例2以EpCAM陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為模型細(xì)胞，考察了納米結(jié)構(gòu)表面P4對(duì)癌細(xì)胞的捕獲行為。圖4為3種不同修飾界面的P4表面對(duì)MCF-7細(xì)胞的不同捕獲行為。經(jīng)PEG-aptamer修飾的表面(圖4，a))細(xì)胞捕獲量最大，同時(shí)PEG修飾的表面(圖4，c))細(xì)胞粘附量最小。

實(shí)施例3以EpCAM陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為模型細(xì)胞，系統(tǒng)地考察了不同微納米結(jié)構(gòu)表面對(duì)癌細(xì)胞的捕獲效率和特異性。同時(shí)，每種納米結(jié)構(gòu)表面均構(gòu)筑了未做任何修飾的bare界面和只做PEG修飾的界面作為對(duì)照。將已培養(yǎng)兩天而且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞利用0.25％的胰酶消化剝離，而后棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打均勻，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液至10⁵/ml。將已修飾完成的納米基底置于24孔板中，向每個(gè)孔中注入1ml已配置的細(xì)胞懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育10-60min后，利用PBS清洗3-5次，利用熒光顯微鏡觀(guān)察捕獲到的細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在PEG修飾的表面上細(xì)胞粘附量雖略有增加但是明顯被抑制，即PEG的引入能夠有效的減少細(xì)胞的非特異性粘附(圖5a)。為了更為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)各表面的細(xì)胞捕獲行為，圖5b，5c分別匯總了不同結(jié)構(gòu)PEG-aptamer表面與PEG表面細(xì)胞捕獲率的比值和不同結(jié)構(gòu)PEG表面與bare表面細(xì)胞捕獲率的比值，以更為細(xì)致準(zhǔn)確的分析各表面細(xì)胞的特異性捕獲量和非特異性粘附情況。通過(guò)綜合比較最終選擇了P4表面作為接下來(lái)細(xì)胞捕獲基底的結(jié)構(gòu)模型，既保證了細(xì)胞的高效捕獲同時(shí)盡可能的抑制了細(xì)胞的非特異性粘附。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)調(diào)控基底的表面納米結(jié)構(gòu)和界面性質(zhì)可以得到具備高效捕獲性能的3D納米結(jié)構(gòu)基底。

實(shí)施例4測(cè)試適配體的特異性

選擇了另外2種EpCAM-陽(yáng)性細(xì)胞株P(guān)C-3和Sk-Br-3，2種EpCAM-陰性細(xì)胞株293T和CCRM-CEM以及新鮮提取的白細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)。適配體的捕獲特異性的評(píng)估結(jié)果匯 總見(jiàn)圖6)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適配體修飾的殼聚糖納米粒子表面對(duì)EpCAM-陽(yáng)性細(xì)胞株均具有較高的捕獲效率而對(duì)EpCAM-陰性細(xì)胞株和人類(lèi)白細(xì)胞的捕獲率均較低。

實(shí)施例5所述基底對(duì)混合細(xì)胞株捕獲特異性考察

首先制備白細(xì)胞溶液：采集靜脈血2ml注入盛有0.1ml肝素的試管中混勻，加入等體積的PBS等倍稀釋血液。吸取淋巴細(xì)胞分層液2ml加入離心管中，再將稀釋血液小心沿管壁加至分層液上，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。室溫2000r/min離心20min。管內(nèi)可分為四層，用毛細(xì)吸管輕輕吸出灰白色的單個(gè)核細(xì)胞，加入另一支已含有5ml PBS的離心管中，混勻。室溫下,以1500rpm離心10min，可去除混雜的血小板。棄上清，重復(fù)洗滌一次。用完全RPMI-16401ml定容，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液至10⁶/ml。

向每毫升白細(xì)胞溶液中加入5,10,100,1000,10000個(gè)已預(yù)先用DIO染色的MCF-7細(xì)胞制備成混合細(xì)胞樣本待用。將修飾好的玻片安裝在4孔培養(yǎng)板中，每孔中加入1ml制備好的細(xì)胞懸液，置于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)30-45min后，用PBS清洗2-5次。利用熒光顯微鏡觀(guān)察捕獲到的細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。

殼聚糖納米粒子表面對(duì)不同比例靶細(xì)胞的人工混合樣本的捕獲行為結(jié)果顯示適配體修飾的殼聚糖納米粒子表面對(duì)靶細(xì)胞的捕獲具有極高的特異性。尤其當(dāng)靶細(xì)胞含量極低時(shí)，該表面對(duì)MCF-7細(xì)胞的捕獲率高達(dá)90％，而對(duì)白細(xì)胞的捕獲效率不足2％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。

實(shí)施例6已捕獲混合細(xì)胞株的原位培養(yǎng)

對(duì)靶細(xì)胞量為10⁴(1mL含10⁶個(gè)白細(xì)胞)的溶液樣本進(jìn)行了捕獲和原位培養(yǎng)(圖8a)。結(jié)果顯示，捕獲后的靶細(xì)胞純度大概為35％±5％。經(jīng)過(guò)兩天的原位培養(yǎng)我們可以觀(guān)察到，殼聚糖納米粒子表面的白細(xì)胞逐漸失去活性而被“淘汰”，同時(shí)靶細(xì)胞開(kāi)始增殖。4天后，靶細(xì)胞的純度高達(dá)99％以上，實(shí)現(xiàn)了靶細(xì)胞的增殖純化。

對(duì)靶細(xì)胞數(shù)目極少(5-10個(gè))的混合細(xì)胞樣本的捕獲和原位培養(yǎng)行為進(jìn)行了考察(圖8b)。當(dāng)靶細(xì)胞注入量為7時(shí)，7個(gè)細(xì)胞全部被捕獲且保持活性。2天后，白細(xì)胞開(kāi)始失去活性逐漸被淘汰，而同時(shí)靶細(xì)胞開(kāi)始增殖，7天后靶細(xì)胞數(shù)目達(dá)到200左右，其純度達(dá)到90％。

綜述之，本發(fā)明構(gòu)筑了具有良好細(xì)胞相容性的殼聚糖納米粒子表面(亦即前述的三維納米結(jié)構(gòu))，該表面具有較高的細(xì)胞捕獲特異性和靈敏度，且通過(guò)對(duì)已捕獲細(xì)胞的原位培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞的增殖純化。

上述實(shí)例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。