本發(fā)明屬于多糖純化領(lǐng)域，特別涉及一種純化細(xì)菌莢膜多糖的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌感染性疾病是對(duì)人群危害較大的疾病，目前臨床上用于治療細(xì)菌感染性疾病的藥物主要是抗生素，但抗生素等抗菌藥物的濫用導(dǎo)致耐藥菌迅速增加，使其不能有效控制感染。細(xì)菌性疫苗能提高易感人群對(duì)細(xì)菌的抵抗力，降低病原菌感染的發(fā)生率，因此，細(xì)菌性疫苗在細(xì)菌感染性疾病的控制和預(yù)防中的作用不可小覷。目前已有多種細(xì)菌疫苗上市，主要分為滅活疫苗、減毒活疫苗、組分疫苗等。其中，細(xì)菌莢膜多糖疫苗是一類非常重要的組分疫苗。
細(xì)菌莢膜多糖疫苗的制備過程中需要盡可能多地去除雜質(zhì)蛋白和內(nèi)毒素， 以減少疫苗的副反應(yīng)?，F(xiàn)有的去除細(xì)菌莢膜多糖中雜質(zhì)蛋白的方法有三種：首先，用苯酚抽提法去除雜蛋白，用超速離心去除內(nèi)毒素，但苯酚具有很強(qiáng)的毒性，有強(qiáng)烈的腐蝕性，對(duì)工作人員的健康造成危害；苯酚對(duì)環(huán)境也具有嚴(yán)重的危害。其次，用柱層析法去除雜蛋白純化莢膜多糖，但此方法處理量小，成本高，不同細(xì)菌莢膜多糖的所需要的純化方法不同，還沒有企業(yè)用于疫苗生產(chǎn)。最后，有關(guān)文獻(xiàn)和專利報(bào)道用乙醇沉淀法去除蛋白，但此法需要用大量的乙醇，乙醇是易燃試劑，對(duì)廠房及設(shè)備要求比較高，工藝不容易放大，而且對(duì)不同的莢膜多糖純化效果有很大的差別。
介于以上諸多缺點(diǎn)，因此，目前急需一種更加安全、環(huán)保，并能夠大量獲得細(xì)菌莢膜多糖的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種純化細(xì)菌莢膜多糖的方法。本發(fā)明利用更加安全環(huán)保，且高通量的非離子表面活性劑，通過相分離法純化細(xì)菌莢膜多糖，能夠有效地去除細(xì)菌莢膜多糖中的內(nèi)毒素及雜蛋白，從而建立了一種安全、環(huán)保、高效的細(xì)菌莢膜多糖的純化方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，所述純化方法包括以下步驟：
（a）溶解多糖：用預(yù)冷的NaAC、NaCl混合溶解液，溶解含有細(xì)菌莢膜多糖的粗糖，得到混合液A；
（b）抽提純化：向步驟（a）中得到的混合液中，加入非離子表面活性劑，冰浴5~15min，然后置于室溫下放置20~40min，再進(jìn)行固液分離，收集上清液；
（c）收集步驟（b）中得到的上清液，對(duì)于上清液，重復(fù)步驟（b）的處理3~5次，收集最后的上清液，即混合液B；
（d）向混合液B中加入無水乙醇至乙醇終濃度為70~90%，混合均勻，4℃靜置40~60min，再進(jìn)行固液分離，以去除非離子表面活性劑，收集沉淀物A；
（e）用CaCl2溶液溶解步驟（d）所述的沉淀物A，超濾后，收集上清液，向其中加入無水乙醇至終濃度70~90%，4℃靜置40~60min，再進(jìn)行固液分離，收集沉淀物B；
（f）用無水乙醇和丙酮清洗步驟（e）得到的沉淀物B，分別清洗1~3次，干燥后，即得到所述純化后的細(xì)菌莢膜多糖。
進(jìn)一步的，步驟（b）中所述的非離子表面活性劑為TritonX100、tritonX114和Tween-20中的一種。優(yōu)選的，所述步驟（b）中所述的非離子表面活性劑為TritonX114，利用鹽溶液溶解所述的TritonX114，使TritonX114的濃度達(dá)到0.5%~10%，優(yōu)選的，所述TritonX114的濃度為2%。所述鹽溶液為MgCl2、MgSO4、NaCl、CaCl2、KCl、NH4Cl、NaAC或（NH4）2SO4溶液。
進(jìn)一步的，步驟（a）中所述NaAC、NaCl混合溶解液中，NaAC、NaCl的濃度分別為0.3M~0.4M，3.5%~10%，且所述混合溶解液的pH值為6.5~7.2。優(yōu)選的，所述混合溶解液的濃度為0.4M NaAC/6% NaCl。
進(jìn)一步的，步驟（e）中溶解沉淀物A的溶液為0.05M~0.1M的CaCl2溶液或0.5M~1M的NaCl溶液。
進(jìn)一步的，所述含有細(xì)菌莢膜多糖的粗糖來自于腦膜炎球菌、b型流感嗜血桿菌（Hib）或肺炎球菌，所述腦膜炎球菌包括A群、C群、Y群及W135群。
進(jìn)一步的，步驟（b）、步驟（d）、步驟（e）中所述的固液分離處理，均采用離心法，3次離心處理的條件分別為15000g，20℃離心30min；6500g，4℃離心30min；6500g，4℃離心30min。
本發(fā)明的另一目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種利用上述方法制備得到的細(xì)菌莢膜多糖。
進(jìn)一步的，當(dāng)所述含有細(xì)菌莢膜多糖的粗糖為A群腦膜炎球菌多糖時(shí)，得到的純化后的細(xì)菌莢膜多糖中，蛋白含量：0.26mg/g，核酸含量：2mg/g，磷含量：82.8mg/g，內(nèi)毒素：0.87EU/ug<IT<1.74EU/ug，分子大小，即kd值：Kd值<0.16。
進(jìn)一步的，當(dāng)所述含有細(xì)菌莢膜多糖的粗糖為C群腦膜炎球菌粗糖時(shí)，得到的純化后的細(xì)菌莢膜多糖中，蛋白含量：1.7mg/g，核酸含量：2.2mg/g，唾液酸含量：927mg/g，內(nèi)毒素：4.3EU/ug<IT<8.6EU/ug，分子大小，即kd值：Kd值<0.14。
近年來，相分離法已經(jīng)被用于生物制品如蛋白或病毒純化及濃縮中。相分離法的基礎(chǔ)是表面活性劑的重要特性——在一定條件下與水互溶形成一個(gè)均質(zhì)的液相，當(dāng)條件改變時(shí)，溶液變渾，表面活性劑形成的膠束聚集從水中析出，稱之為“云點(diǎn)”。表面活性劑是一類同時(shí)具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的雙極性分子，在溶液中表面活性劑的存在形式與其濃度和環(huán)境溫度有關(guān)，能夠單體、晶體、膠束 3種形式存在。以膠束形式存在時(shí)，表面活性劑分子的親水基團(tuán)同水分子以氫鍵相互作用，疏水鏈因疏水作用而聚集，從而幾個(gè)表面活性劑分子形成外部親水，內(nèi)部疏水的膠束結(jié)構(gòu)溶于水中。相分離法即是表面活性劑在一定條件下與水互溶形成一個(gè)均質(zhì)的液相，當(dāng)條件改變（如溶液鹽濃度、溫度等）時(shí)，表面活性劑形成的膠束會(huì)聚集成肉眼可見的顆粒，經(jīng)離心或自然沉降，從而與水溶液分成兩個(gè)相：一個(gè)是表面活性劑相；一個(gè)是水相。疏水性物質(zhì)由于溶于表面活性劑形成的膠束之中，分相后進(jìn)入表面活性相 ，而親水性物質(zhì)則留于水相。
TritonX114是一種非離子表面活性劑，具有低“云點(diǎn)”（22℃）的特性，對(duì)于維持生物大分子的穩(wěn)定性和生物活性非常有利。大量文獻(xiàn)報(bào)道，通過溶液溫度的升高， TritonX114可以有效地去除重組蛋白、病毒、DNA中的內(nèi)毒素。在去除內(nèi)毒素的過程中，內(nèi)毒素通過類脂A的烴基與表面活性劑尾部基團(tuán)聚集在膠束系統(tǒng)，從而從水相中分離出來。TritonX114可以溶解抽提膜蛋白，但到目前為止，沒有檢索到有文獻(xiàn)報(bào)道TritonX114可以去除可溶性菌體蛋白。由于蛋白的鹽析特性，在TritonX114水溶液中加入不同的鹽離子，蛋白有可能進(jìn)入表面活性劑相；同時(shí)細(xì)菌莢膜多糖不穩(wěn)定，易降解，需要盡量在低溫下操作。TritonX114的“云點(diǎn)”會(huì)隨溶液中鹽離子濃度的增加而降低，因此我們利用了TritonX114的鹽溶液純化細(xì)菌莢膜多糖。
TritonX114的鹽溶液處理細(xì)菌粗糖，在低溫時(shí)，tritonX114與糖溶液生成均勻的液相，在鹽離子的影響下，當(dāng)溫度改變時(shí)，達(dá)到tritonx114“云點(diǎn)”時(shí)，溶液變渾，疏水性內(nèi)毒素和蛋白等被TritonX114包被，通過離心，溶液分為：含有內(nèi)毒素和蛋白等表面活性劑相和含有糖的水相。經(jīng)過幾次抽提，可有效去除內(nèi)毒素和菌體蛋白。
本發(fā)明所述的純化莢膜多糖的方法，相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：
1、本發(fā)明利用非離子表面活性劑純化莢膜多糖，所述非離子表面活劑，與苯酚相比具有無腐蝕性無致癌性等特點(diǎn)并不會(huì)對(duì)環(huán)境造成危害；與柱層析相比，處理量大、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、容易擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模；
2、本發(fā)明采用Tritonx114鹽溶液抽提多糖，能夠有效的去除內(nèi)毒素和蛋白，而且多糖的得率能達(dá)到50%以上；
3、采用本發(fā)明所述的純化方法，分別抽提了A群腦膜炎球菌多糖和C群腦膜炎球菌多糖，所得多糖核酸、蛋白和內(nèi)毒素含量明顯降低，分子大小沒有明顯的變化，其他各項(xiàng)指標(biāo)均能達(dá)到2010版《中華人民共和國(guó)藥典》要求。
具體實(shí)施例
實(shí)施例1
一種純化細(xì)菌莢膜多糖的方法，所述純化方法包括以下步驟：
（a）溶解多糖：用預(yù)冷的NaAC、NaCl混合溶解液，溶解含有細(xì)菌莢膜多糖的粗糖，得到混合液A；
（b）抽提純化：向步驟（a）中得到的混合液中，加入非離子表面活性劑，冰浴5~15min，然后置于室溫下放置40~60min，再進(jìn)行固液分離，收集上清液；
（c）收集步驟（b）中得到的上清液，對(duì)于上清液，重復(fù)步驟（b）的處理3~5次，收集最后的上清液，即得到混合液B；
（d）向混合液B中加入無水乙醇至終濃度70~90%，混合均勻，4℃靜置20~40min，再進(jìn)行固液分離，收集沉淀物A；
（e）用CaCl2溶液溶解步驟（d）所述的沉淀物A，超濾后，收集上清液，向其中加入無水乙醇至終濃度70~90%，4℃靜置40~60min，再進(jìn)行固液分離，收集沉淀物B；
（f）用無水乙醇和丙酮清洗步驟（e）得到的沉淀物B，分別清洗1~3次，干燥后，即得到所述純化后的細(xì)菌莢膜多糖。所述干燥是通過真空干燥器來進(jìn)行的。
進(jìn)一步的，步驟（b）中所述的非離子表面活性劑為TritonX100、TritonX114和Tween-20中的一種。優(yōu)選的，所述步驟（b）中所述的非離子表面活性劑為TritonX114，利用鹽溶液溶解所述的TritonX114，使TritonX114的濃度達(dá)到0.5%~10%，優(yōu)選的，所述TritonX114的濃度為2%。所述鹽溶液為MgCl2、MgSO4、NaCl、CaCl2、KCl、NH4Cl、NaAC或（NH4）2SO4溶液。
進(jìn)一步的，步驟（a）中所述NaAC、NaCl混合溶解液中，NaAC、NaCl的濃度分別為0.3M~0.4M，3.5%~10%，且所述混合溶解液的pH值為6.5~7.2。優(yōu)選的，所述混合溶解液的濃度為0.4MNaAC/6%NaCl。
進(jìn)一步的，步驟（e）中溶解沉淀物A的溶液為0.05M~0.1M的CaCl2溶液或0.5M~1M的NaCl溶液。
進(jìn)一步的，所述含有細(xì)菌莢膜多糖的粗糖來自于腦膜炎球菌、Hib或肺炎球菌，所述腦膜炎球菌包括A群、C群、Y群及W135群。
所述粗糖的提取方法為：將已殺菌的培養(yǎng)液離心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，使多糖與十六烷基三甲基溴化銨解離；再加入乙醇至乙醇的最終濃度為25%，2-8攝氏度靜置1--3h或過夜，離心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷乙醇至乙醇的最終濃度為80%，充分振搖。離心收集沉淀，沉淀物用無水乙醇及丙酮分別洗滌，沉淀物即為含有細(xì)菌莢膜多糖的粗糖。
進(jìn)一步的，步驟（b）、步驟（d）、步驟（e）中所述的固液分離處理，均采用離心法，3次離心處理的條件分別為15000g，20℃離心30min；6500g，4℃離心30min；6500g，4℃離心30min。
實(shí)施例2
本實(shí)施例選用TritonX114作為非離子表面活性劑，從A群腦膜炎球菌粗糖中提取純化細(xì)菌莢膜多糖，具體的制備方法如下：
（a）溶解多糖：用400ml預(yù)冷的0.4MNaAC / 6%NaCl混合溶解液，溶解2.6g A群腦膜炎球菌粗糖，得到混合液A；
（b）抽提純化：向步驟（a）中得到的混合液中，加入104ml TritonX114，冰浴10min，然后置于室溫下放置30min，15000g、20℃離心30min，收集上清液；
（c）收集步驟（b）中得到的上清液，對(duì)于上清液，重復(fù)步驟（b）的處理3次，收集最后的上清液，即得到混合液B；
（d）向混合液B中加入無水乙醇至終濃度80%，混合均勻，4℃靜置20~40min，6500g、4℃離心30min，收集沉淀物A；
（e）用0.1M CaCl2溶液溶解步驟（d）所述的沉淀物A，超濾后，收集上清液，向其中加入無水乙醇至終濃度80%，4℃靜置30min，6500g、4℃離心30min，收集沉淀物B；
（f）用無水乙醇和丙酮清洗步驟（e）得到的沉淀物B，分別清洗2次，干燥后，即得到所述純化后的細(xì)菌莢膜多糖，質(zhì)量為1.67g。
檢測(cè)所述細(xì)菌莢膜多糖中的蛋白、核酸、內(nèi)毒素、分子大小（Kd值）等指標(biāo)，結(jié)果如下：
蛋白含量：0.26mg/g；
核酸含量：2mg/g；
磷含量：82.8mg/g；
內(nèi)毒素： <1.74EU/μg；
分子大小(kd值): Kd值<0.16 回收率96%；
TritonX114殘留量：低于檢測(cè)下限無法檢出，小于0.01%；
多糖得率為：64.2%。
實(shí)施例3
本實(shí)施例選用TritonX114作為非離子表面活性劑，從C群腦膜炎球菌粗糖中提取純化細(xì)菌莢膜多糖，具體的制備方法如下：
（a）溶解多糖：用400ml預(yù)冷的0.4MNaAC / 6%NaCl混合溶解液，溶解2.6g C群腦膜炎球菌粗糖，得到混合液A；
（b）抽提純化：向步驟（a）中得到的混合液中，加入104ml TritonX114，冰浴10min，然后置于室溫下放置30min，15000g、20℃離心30min，收集上清液；
（c）收集步驟（b）中得到的上清液，對(duì)于上清液，重復(fù)步驟（b）的處理3~5次，收集最后的上清液，即得到混合液B；
（d）向混合液B中加入無水乙醇至終濃度80%，混合均勻，4℃靜置20~40min，6500g、4℃離心30min，收集沉淀物A；
（e）用0.1M CaCl2溶液溶解步驟（d）所述的沉淀物A，超濾后，收集上清液，向其中加入無水乙醇至終濃度80%，4℃靜置30min，6500g、4℃離心30min，收集沉淀物B；
（f）用無水乙醇和丙酮清洗步驟（e）得到的沉淀物B，分別清洗2次，干燥后，即得到所述純化后的細(xì)菌莢膜多糖，質(zhì)量為1.67g。
檢測(cè)所述細(xì)菌莢膜多糖中的蛋白、核酸、內(nèi)毒素、分子大?。↘d值）等指標(biāo)，結(jié)果如下：
蛋白含量：1.7mg/g；
核酸含量：2.2mg/g；
唾液酸含量：927mg/g；
內(nèi)毒素： <8.6EU/μg；
分子大小(kd值): Kd值<0.14 回收率96%；
TritonX114殘留量：低于檢測(cè)下限無法檢出，小于0.01%；
多糖得率為：67.5%。