本發(fā)明屬于免疫學(xué)與表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，涉及應(yīng)用細(xì)胞因子白介素-2聯(lián)合帕米磷酸二鈉藥物協(xié)同誘導(dǎo)γδT細(xì)胞生成擴增的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

淋巴細(xì)胞是具有特異性免疫識別功能的細(xì)胞系，人和哺乳類動物的淋巴細(xì)胞系是由形態(tài)相似、功能各異的不均一細(xì)胞群所組成。按其個體發(fā)生、表面分子和功能的不同，可將淋巴細(xì)胞系分為T細(xì)胞和B細(xì)胞二個亞群，它們都起源于造血干細(xì)胞。其中的T細(xì)胞是由一群功能不同的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞組成，由于它在胸腺內(nèi)分化成熟故稱為T細(xì)胞。成熟T細(xì)胞由胸腺遷出隨血循環(huán)到周圍淋巴器官，在各自既定的區(qū)域定居、繁殖，受抗原激活即分化增殖，產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞，行使其免疫功能。T淋巴細(xì)胞激活后，分化增殖形成多種具有特殊性的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞株。不同功能成熟的T細(xì)胞可借其細(xì)胞膜表面分子不同加以鑒別，TCR(T cell receptor)是T細(xì)胞識別蛋白抗原的特異性受體，有兩種不同的類型，分別由兩條不同的跨膜多肽鏈組成，即αβTCR和γδTCR。在外周血和淋巴器官中，約有95％成熟T細(xì)胞的TCR分子是由α和β二條異二聚體肽鏈組成的，即αβTCR分子；而剩下的1-5％成熟T細(xì)胞的TCR是由γ和δ二條異二聚體肽鏈組成的，這種T細(xì)胞被稱為γδT細(xì)胞。在Kunzmann等首次發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞能夠大量擴增前，對γδT細(xì)胞的研究一直被人們忽略了，現(xiàn)在越多越多的學(xué)者開始致力于γδT細(xì)胞的研究。目前，γδT細(xì)胞的體外擴增和純化已經(jīng)成為一種成熟技術(shù)，該類細(xì)胞的生物學(xué)功能也日漸明確。人們已發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞在抗感染和抗腫瘤方面發(fā)揮著重要的作用，并且其過繼免疫治療腫瘤在臨床上也開始得到了應(yīng)用，有些患者已經(jīng)從中得到受益。因此，為了使更多的患者能夠接受γδT細(xì)胞免疫治療，如何降低γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)成本、簡化其培養(yǎng)步驟和提高其誘導(dǎo)效率成為γδT細(xì)胞臨床應(yīng)用的迫切需要解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是降低γδT細(xì)胞的培養(yǎng)成本和獲得大量的γδT細(xì)胞，提供一種γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法，涉及提供一種γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法，能為γδT細(xì)胞在臨床腫瘤免疫治療方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

本發(fā)明所述的一種γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

A.人單個核細(xì)胞的制備：取外周血標(biāo)本，肝素抗凝，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離制備外周血單個核細(xì)胞，用PBS緩沖液重懸洗滌細(xì)胞兩次；

B.紅細(xì)胞的去除：收集得到的單個核細(xì)胞紅細(xì)胞裂解液重懸，裂解殘存的紅細(xì)胞；

C.γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增：將步驟B所制備的單個核細(xì)胞接種到含有20％胎牛血清的完全RPMI 1640培養(yǎng)液中，接種當(dāng)日按第1天計算，在第1天加入帕米磷酸二鈉，在第3天加入白介素-2和帕米磷酸二鈉，接著在第6、9、12、15、18天進(jìn)行半量換液，每次換液時加入新鮮白介素-2和帕米磷酸二鈉；

D.γδT細(xì)胞數(shù)量含量的檢測：以CD3和TCRγδ雙陽性細(xì)胞作為γδT細(xì)胞的表型特征；

E.γδT細(xì)胞狀態(tài)的檢測：在第1和18天時用倒置相差顯微鏡查看細(xì)胞生長狀態(tài)；

F.γδT細(xì)胞的富集和獲得數(shù)量：采用免疫磁珠陽性分選方法無菌分選TCRγδ陽性細(xì)胞群，該群細(xì)胞內(nèi)富含γδT細(xì)胞，收集所有細(xì)胞計數(shù)獲得γδT細(xì)胞的數(shù)量；

G.富集后細(xì)胞純度和細(xì)胞毒性的檢測：富集后細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測其純度，并檢測其對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

根據(jù)本發(fā)明所述的γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法的進(jìn)一步特征，步驟B中，收集得到的單個核細(xì)胞用5ml紅細(xì)胞裂解液重懸，37℃水浴1分鐘，完全裂解殘存的紅細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明所述的γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法的進(jìn)一步特征，步驟D中，培養(yǎng)至第18天時，γδT細(xì)胞在培養(yǎng)細(xì)胞中的含量超過80％，誘導(dǎo)擴增速度開始減慢。

根據(jù)本發(fā)明所述的γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法的進(jìn)一步特征，步驟E中，培養(yǎng)至第18天時，γδT細(xì)胞生長狀態(tài)達(dá)到細(xì)胞透亮度好、形態(tài)不規(guī)則和聚集成 團，誘導(dǎo)擴增速度開始減慢。

本發(fā)明具有如下特點和優(yōu)點：

(1)本發(fā)明所述的γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)方法是通過應(yīng)用細(xì)胞因子白介素-2和帕米磷酸二鈉藥物聯(lián)合誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的增殖后，檢測細(xì)胞生長狀態(tài)、數(shù)量含量；采用MACS陽性分選富集后，檢測γδT細(xì)胞的純度、獲得細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞毒性作用以確保能用于臨床治療。

(2)誘導(dǎo)增殖和富集過程簡單易行，周期較短，成本低.

(3)誘導(dǎo)效率高，重復(fù)性好。

(4)增殖后細(xì)胞活力好，富集后細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞毒性作用均能保證臨床免疫治療腫瘤，能為γδT細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)，具有很好的推廣價值。

附圖說明

圖1是人外周血單個核細(xì)胞第1天時細(xì)胞生長狀態(tài)圖。

圖2是人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)18天后的細(xì)胞生長狀態(tài)圖。

圖3是誘導(dǎo)培養(yǎng)前人外周血單個核細(xì)胞的流式分析圖。

圖4是誘導(dǎo)培養(yǎng)第18天時培養(yǎng)細(xì)胞的流式分析圖。

圖5是誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞中γδT細(xì)胞隨時間增加的含量變化圖。

圖6是白介素-2和帕米磷酸二鈉不同組合誘導(dǎo)培養(yǎng)單個核細(xì)胞18天時γδT細(xì)胞的數(shù)量含量。

圖7是誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)TCRγδ+T細(xì)胞MACS分選后的流式分析圖。

圖8是TCRγδ+T細(xì)胞MACS陽性分選富集得到的γδT細(xì)胞的數(shù)量圖。

圖9是MACS陽性分選富集得到的γδT細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

本文中所用細(xì)胞因子白介素-2購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)有限公司，流式細(xì)胞術(shù)檢測所用的單克隆熒光抗體購自Biolegend公司，帕米磷酸二鈉(商品名Pamisol)購自澳大利亞科鼎有限公司，γδT細(xì)胞MACS分選試劑盒購自德國美天旎生物技術(shù)公司，非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測γδT細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，購自美國Promega公司。

本實驗重復(fù)了6名正常志愿者外周血標(biāo)本，均取得了類似效果。

實施例1：γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增

(1)在50ml離心管中加入15ml淋巴細(xì)胞分離液；

(2)取肝素抗凝靜脈血10ml與等量PBS緩沖液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面，室溫水平離心600g×20分鐘；

(3)離心后見管內(nèi)分為三層，上層為血漿和PBS緩沖液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶；

(4)用移液管插到云霧層，吸取單個核細(xì)胞，置入另一50ml離心管中，然后加入PBS緩沖液到50ml，4℃，300g×5分鐘離心，洗滌細(xì)胞2次；

(5)末次離心后，棄上清，收集得到的單個核細(xì)胞用5ml紅細(xì)胞裂解液重懸水浴1分鐘，裂解殘存的紅細(xì)胞，然后加入HBSS緩沖液到50ml，4℃，300g×5分鐘離心；

(6)離心后，棄上清，加入含有20％胎牛血清的完全RPMI 1640培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10⁶/ml；

(7)將細(xì)胞接種于12孔板，每個病人分別設(shè)立3個復(fù)孔，每孔2ml，各孔于第1天加入帕米磷酸二鈉，其終濃度為6μg/ml，在第3天加入白介素-2和帕米磷酸二鈉，其終濃度分別為500U/ml和6μg/ml，接著在第6、9、12、15、18天進(jìn)行半量換液。每次半量換液時加入新鮮白介素-2和帕米磷酸二鈉，每孔去除1ml培養(yǎng)液，再加入新鮮含20％胎牛血清的PRMI 1640完全培養(yǎng)液1ml，白介素-2和帕米磷酸二鈉終濃度分別仍是500U/ml和6μg/ml；

(8)接種細(xì)胞在37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)18天。

實施例2：流式細(xì)胞術(shù)檢測γδT細(xì)胞的數(shù)量含量

(1)在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果參見圖1，圖中可見在第1天時，少許碎片，細(xì)胞型態(tài)多樣，體積較小，體積大的細(xì)胞透亮度好，胞內(nèi)未見顆粒；在培養(yǎng)第18天時，結(jié)果參見圖2，在細(xì)胞生長圖可見細(xì)胞成團生長，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞體積比一般淋巴細(xì)胞大，透亮度好；

(2)分別收集第1、3、6、9、12、15、18天的細(xì)胞，收集的細(xì)胞每管10⁶，用3ml含有2％胎牛血清的PBS洗滌二次，每次傾倒前離心300g×5分鐘，傾倒后用濾紙吸干管口液體；

(3)用100μl含有2％胎牛血清的PBS重懸細(xì)胞，加入抗人TCRγδFITC單克隆抗體和抗人CD3APC單克隆抗體各5μl，充分混勻，4℃避光孵育30分鐘；

(4)3ml含有2％胎牛血清的PBS洗滌，4℃，300g×5分鐘離心，洗滌后傾倒用濾紙吸干管口液體，加入400μl 2％胎牛血清的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機檢測；

(5)流式細(xì)胞儀檢測：應(yīng)用FACSDiva軟件，每管至少獲取10000個細(xì)胞，以TCRγδAPC和CD3FITC雙陽性作為γδT細(xì)胞的表型特征，計算γδT細(xì)胞占總細(xì)胞的百分含量。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)白介素-2和帕米磷酸二鈉誘導(dǎo)前，單個核細(xì)胞中的γδT細(xì)胞大約只有3％；隨著誘導(dǎo)時間的增加,從第6天開始單個核細(xì)胞中的γδT細(xì)胞含量開始增加，到第18天時γδT細(xì)胞含量大約為82％。結(jié)果參見圖3、圖4、圖5，圖3是誘導(dǎo)培養(yǎng)前人外周血單個核細(xì)胞的流式分析圖，圖4是誘導(dǎo)擴增培養(yǎng)第18天時細(xì)胞的流式分析圖，圖5是誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞中γδT細(xì)胞隨時間增加的含量變化圖。上述結(jié)果表明加入白介素-2和帕米磷酸二鈉能有效誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的生成和增殖。圖3、4中FITC-A指anti-CD3FITC，APC-A指anti-TCR APC；圖中方框中細(xì)胞群表示γδT細(xì)胞，百分比表明其在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的含量。圖5則是根據(jù)流式檢測結(jié)果用柱形圖的方式表達(dá)γδT細(xì)胞在總細(xì)胞中隨時間增加的含量變化。

實施例3：白介素-2和帕米磷酸二鈉誘導(dǎo)擴增γδT細(xì)胞的最優(yōu)組合

(1)從人外周血中收集單個核細(xì)胞，加入含有20％胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10⁶/ml，單個核細(xì)胞分離方法同實施例1；

(2)將單個核細(xì)胞接種于24孔板，每孔1ml，根據(jù)白介素-2加入時間和帕米磷酸二鈉的終濃度設(shè)計不同組合，共15組，每組分別設(shè)立3個復(fù)孔，共45孔，白介素-2加入時間和帕米磷酸二鈉的終濃度如表1所示。培養(yǎng)基中白介素-2(IL-2)為500U/ml，帕米磷酸二鈉(PAM)儲存濃度為1000μg/ml，所有組第1天就加入帕米磷酸二鈉。

表1(單位：μl)

(3)接種細(xì)胞在37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)18天。

(4)第18天時分別收集每孔的細(xì)胞并計數(shù)，獲得每種組合的培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)，然后每管10⁶細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組合誘導(dǎo)培養(yǎng)后γδT細(xì)胞的數(shù)量含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測方法同實施例2。圖3表明在誘導(dǎo)培養(yǎng)前，約有3.2％的單個核細(xì)胞是γδT細(xì)胞，經(jīng)過白介素-2和帕米磷酸二鈉的不同組合聯(lián)合培養(yǎng)18天后各組γδT細(xì)胞的數(shù)量含量也不相同。結(jié)果參見圖6，圖6是白介素-2和帕米磷酸二鈉的不同組合誘導(dǎo)培養(yǎng)單個核細(xì)胞18天時γδT細(xì)胞的數(shù)量含量。在第1天就加入白介素-2和5種不同濃度的帕米磷酸二鈉都不能有效地提高γδT細(xì)胞的數(shù)量含量；在第3天就加入白介素-2和6μg/ml、9μg/ml、12μg/ml這3種濃度的帕米磷酸二鈉都能將γδT細(xì)胞的數(shù)量含量提高到80％以上。表2是細(xì)胞培養(yǎng)18天后，可獲得γδT細(xì)胞的數(shù)量：γδT細(xì)胞數(shù)量＝培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)×γδT細(xì)胞的數(shù)量含量。表2結(jié)果表明接種3×10⁶個單個核細(xì)胞后，用不同組合的白介素-2和帕米磷酸二鈉聯(lián)合培養(yǎng)18天最多可得3.062×10⁶個γδT細(xì)胞。根據(jù)獲得γδT細(xì)胞的數(shù)量和其在培養(yǎng)細(xì)胞的含量，還有IL-2和帕米磷酸二鈉使用的效價比來計算，可以得出白介素-2和帕米磷酸二鈉聯(lián)合培養(yǎng)γδT細(xì)胞的最優(yōu)組合是第3天加入白介素-2和帕米磷酸二鈉的終濃度為6μg/ml。

表2(γδT細(xì)胞數(shù)量＝培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)×γδT細(xì)胞含量)

實施例4：免疫磁珠細(xì)胞分選技術(shù)富集γδT細(xì)胞及γδT細(xì)胞的獲得數(shù)量

(1)MACS緩沖液，由pH 7.2PBS、0.5％牛白蛋白和3M乙二胺四乙酸(EDTA)組成，以下簡稱緩沖液；在第18天，收集培養(yǎng)的細(xì)胞并計數(shù)；

(2)4℃，300×g離心10分鐘，去除上清；

(3)以80μl緩沖液/10⁷重懸細(xì)胞；

(4)以20μl/10⁷加入抗TCRγδ半抗原抗體；

(5)混勻后4℃孵育15分鐘；

(6)以1ml/10⁷細(xì)胞加入緩沖液，4℃，300×g離心10分鐘，棄上清；

(7)再以80μl緩沖液/10⁷重懸細(xì)胞，和以20μl/10⁷加入半抗原微珠；

(8)混勻后4℃避光孵育15分鐘；

(9)以1ml/10⁷細(xì)胞加入緩沖液，300×g離心10分鐘，棄上清；

(10)在500μl緩沖液中重懸細(xì)胞；

(11)將LS柱放在相應(yīng)MACS分選器中，用2ml緩沖液潤洗分選柱；

(12)將細(xì)胞懸液加入分選柱中；

(13)讓細(xì)胞流出，用3×2ml緩沖液沖洗分選柱，每次等到前一次分選柱中液體流空時加入新的液體；

(14)將分選柱從分選器中移出，放在15ml無菌離心管上；

(15)在分選柱上加入5ml緩沖液，用分選柱配備的活塞快速將磁性標(biāo)記細(xì)胞推下來，推下來的細(xì)胞為富集后的細(xì)胞；

(16)留取富集后10⁶細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測富集后γδT細(xì)胞的純度，流式細(xì)胞術(shù)檢測方法同實施例2，圖7是誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)TCRγδ+T細(xì)胞MACS分選后的流式分析圖。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞的純度大于95％，這表明MACS微磁珠分選可以得到高純度的γδT細(xì)胞；

(17)收集所有富集后的細(xì)胞并計數(shù)，計算γδT細(xì)胞的擴增數(shù)量。結(jié)果參見圖8,圖8是TCRγδ+MACS陽性分選富集得到的γδT細(xì)胞數(shù)量圖。單個核細(xì)胞中的約有0.34×10⁶γδT細(xì)胞，經(jīng)過白介素-2和帕米磷酸二鈉聯(lián)合培養(yǎng)18天后可獲得約30×10⁶γδT細(xì)胞，細(xì)胞被擴增近100倍數(shù)。第1天時的γδT細(xì)胞 數(shù)量根據(jù)以下公式計算：γδT細(xì)胞數(shù)量＝CD3和TCRγδ雙陽性細(xì)胞百分比含量×準(zhǔn)備培養(yǎng)的細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果表明白介素-2和帕米磷酸二鈉聯(lián)合培養(yǎng)單個核細(xì)胞可以在較短時間內(nèi)獲得大量γδT細(xì)胞。

實施例5：富集后γδT細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的檢測

(1)此試驗中的效應(yīng)細(xì)胞為富集后γδT細(xì)胞。試驗中的靶細(xì)胞為NSCLC細(xì)胞、EBV-LCL細(xì)胞和正常B細(xì)胞。前兩者都是腫瘤細(xì)胞系，正常B細(xì)胞在此實驗中為空白對照；

(2)γδT細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用檢測，檢測板的設(shè)置如下，每組設(shè)置3個復(fù)孔：

A.效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)LDH釋放：把要用于實驗孔的每一濃度的效應(yīng)細(xì)胞按3個復(fù)孔加到含有培養(yǎng)基的孔中以獲得效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放值。終體積必須與實驗孔相同(用不含細(xì)胞的培養(yǎng)基來補足體積)；

B.實驗孔：向U-底96孔板的所有實驗孔中加入5000個靶細(xì)胞。將效應(yīng)細(xì)胞按3個復(fù)孔加入孔中，加入不同數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞來測試幾組效靶細(xì)胞比率(1:1,3:1,10:1和30:1)。效靶細(xì)胞合在一起的終體積是100μl/孔；

C.靶細(xì)胞自發(fā)LDH釋放：將靶細(xì)胞加入到含有培養(yǎng)基的3個復(fù)孔中，終體積必須與含有靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的實驗孔相等(用培養(yǎng)基調(diào)整體積)；

D.靶細(xì)胞最大LDH釋放：將靶細(xì)胞加入到含有培養(yǎng)基的3個復(fù)孔中，終體積必須和實驗孔相等。每100μl培養(yǎng)基加10μl的裂解液(10X)。在收獲上清前，使靶細(xì)胞在裂解液(10X)中孵育45分鐘；

E.體積校正對照：將10μl裂解液(10X)加入到含有100μl培養(yǎng)基(不含細(xì)胞)的3個復(fù)孔中。該對照用于校正加入裂解液(10X)引起的體積變化；

F.培養(yǎng)基背景：將100μl培養(yǎng)基加入3個復(fù)孔中。該對照用于校正酚紅和含有血清的培養(yǎng)基中的LDH活性引起的背景吸光值；

G.1500rpm離心板子4分鐘，以確保效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞充分接觸；

(3)細(xì)胞培養(yǎng)與上清的收獲：

A.在37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞毒性檢測板6小時。以保證靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞有充分的時間接觸；

B.在收集上清前45分鐘，向靶細(xì)胞最大釋放孔加入10μl裂解液(10X) /100μl靶細(xì)胞；

C.注意：如果靶細(xì)胞未被徹底裂解(通過鏡下觀察確定)，再加入5μl的裂解液(10X)；

D.孵育45分鐘后，1500rpm離心板子4分鐘；

E.測量LDH：

i.用排槍從每孔轉(zhuǎn)移50μl上清至一個新的96孔平底酶分析板中；

ii.向含有轉(zhuǎn)移過來的樣品上清的96孔酶分析板中每孔均加入50μl配好的底物。避光，室溫孵育30分鐘；

iii.每孔加入50μl終止液；

iv.用注射器針頭戳破大的氣泡，加入終止液后1小時內(nèi)在490或492nm測量吸光值；

(4)實驗結(jié)果的計算：

A.將所有實驗孔、靶細(xì)胞自發(fā)LDH釋放孔和效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)LDH釋放孔的吸光值減去培養(yǎng)基背景吸光值的均值；

B.將靶細(xì)胞最大LDH釋放對照的吸光值減去體積校正對照吸光值的均值；

C.將步驟A和B中獲得的經(jīng)過校正的值帶入下面公式，計算每種效靶比所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性百分比：

％細(xì)胞毒性＝(實驗-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)-靶細(xì)胞自發(fā))÷(靶細(xì)胞最大-靶細(xì)胞自發(fā))×100；

(5)根據(jù)計算結(jié)果，可得出γδT細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

圖8是MACS陽性分選富集得到的γδT細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。結(jié)果見圖9，經(jīng)過白介素-2和帕米磷酸二鈉聯(lián)合培養(yǎng)18天后純化得到的γδT細(xì)胞可以顯著性地殺傷腫瘤細(xì)胞，NSCLC細(xì)胞和EBV-LCL細(xì)胞的死亡率在30:1時達(dá)到最大值，分別為60％和44％，但γδT細(xì)胞幾乎不殺傷正常細(xì)胞。這些結(jié)果說明白介素-2和帕米磷酸二鈉聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞能特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞，可以考慮其用于腫瘤病人的免疫治療。