本發(fā)明涉及一種微流控芯片，尤其涉及一種雙層微流控芯片，進(jìn)一步涉及一種用于腫瘤細(xì)胞分選的雙層微流控芯片。
背景技術(shù)：
循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是脫離原發(fā)病灶，侵襲并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的癌細(xì)胞，可以作為診斷患者預(yù)后或腫瘤復(fù)發(fā)、揭示腫瘤轉(zhuǎn)移行為、合理指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療的指標(biāo)，是目前腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。但是腫瘤病人血液中CTCs的數(shù)目非常稀少，每毫升血液中僅含有1～100個(gè)CTCs，而每毫升血液中的有上百萬個(gè)白細(xì)胞及數(shù)目更多的紅細(xì)胞，所以想從血液中高效率的分選出純度較高的CTCs難度很大。
微流控芯片技術(shù)把生物和化學(xué)等領(lǐng)域所涉及的樣品制備、化學(xué)反應(yīng)、分離富集、檢測方法等操作單元集成到一塊幾平方厘米的玻片上。相比于常規(guī)的富集技術(shù)，它具有可控性、高通量、低消耗、可集成等特點(diǎn)，減少了分選過程中對目的細(xì)胞的損傷和污染。芯片通道直徑一般介于5～100μm之間，與體內(nèi)微血管和細(xì)胞大小相近，可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的培養(yǎng)、觀察、檢測等目的，并可在微小尺寸下實(shí)現(xiàn)高通量分析，既節(jié)省時(shí)間又節(jié)約試劑，在臨床診斷和疾病篩查領(lǐng)域具有良好的前景。
目前CTCs檢測包括富集和檢測兩步：常用的富集技術(shù)主要有免疫磁分選、密度梯度離心和細(xì)胞過濾等。檢測技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫組織化學(xué)技術(shù)(ICC)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)等。近年來，許多學(xué)者將微流控芯片與現(xiàn)有的CTCs分選檢測技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)了一 系列CTCs分選芯片，主要包括以下幾類：
①利用物理尺度的分選方法
通常情況下，CTCs的直徑介于12～25μm，白細(xì)胞的直徑介于8～14μm，紅細(xì)胞直徑介于6～8μm，相比于白細(xì)胞，CTCs的體積較大，但形變能力不如白細(xì)胞。依據(jù)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞在粒徑和變形能力方面的差別，可以用不同的物理方法對CTCs進(jìn)行分選。
②利用生物性質(zhì)的富集方法
CTCs可以借其表面標(biāo)志物區(qū)別于血液中的其他細(xì)胞，如多數(shù)上皮來源的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cellular adhesion molecule，EpCAM)，低表達(dá)CD45，而白細(xì)胞的EpCAM表達(dá)水平較低，CD45的表達(dá)水平卻較高，因此，可以利用不同細(xì)胞分子表達(dá)水平的差異來對CTCs進(jìn)行分選。
目前，只有美國Veridex公司研發(fā)的CellSearchTM系統(tǒng)成為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案，于2004年被美國食品藥品管理局(FDA)準(zhǔn)入臨床應(yīng)用。這是一項(xiàng)匯集了免疫磁性分選技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)法的分選檢測技術(shù)，通過在磁珠上固定EpCAM抗體而特異性地識(shí)別、結(jié)合靶細(xì)胞，在外加磁場的作用下完成腫瘤細(xì)胞的篩選。
目前已經(jīng)商品化的方法是美國Veridex公司研發(fā)的CellSearchTM系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠運(yùn)用免疫納米磁顆粒技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行捕獲分析，但該方法的缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，需要多步完成，常出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果。
最常用的物理尺度篩選方法是采用類似濾膜過濾的方法將較小的血細(xì)胞過濾掉，截留住粒徑較大的CTCs，從而達(dá)到CTCs分選富集的目的。該方法的缺點(diǎn)是分選速度太慢，效率偏低，芯片易被血細(xì)胞阻塞，造成分選操作無法進(jìn)行。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對技術(shù)現(xiàn)狀提供一種用于腫瘤細(xì)胞分選的雙層微流控芯片，其能快速分選富集CTCs。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種用于腫瘤細(xì)胞分選的雙層微流控芯片，包括第一芯片和位于第一芯片下方的第二芯片，所述第一芯片的表面具有樣品通道，與所述樣品通道相對的第二芯片的表面具有緩沖液通道，所述樣品通道與緩沖液通道交叉相通。
其中，所述第一芯片具有一個(gè)樣品入口，所述樣品通道包括若干組樣品通道組，每組所述樣品通道組包括若干條血液流道，所述樣品入口通過樣品導(dǎo)流通道組與每條血液流道的入口端連接；所述第一芯片對應(yīng)每組樣品通道組設(shè)有一個(gè)廢液出口，每個(gè)所述廢液出口通過廢液導(dǎo)流通道組與該廢液出口對應(yīng)的樣品通道組的每條血液流道的出口端連接。
其中，所述樣品通道包括偶數(shù)組樣品通道組，每組所述樣品通道組包括2n條血液流道，其中n為正整數(shù)，所述樣品導(dǎo)流通道組包括多層樣品導(dǎo)流通道，每層樣品導(dǎo)流通道分別包括橫向樣品導(dǎo)流通道和位于橫向樣品導(dǎo)流通道兩端的豎向樣品導(dǎo)流通道，最接近樣品通道的最內(nèi)層樣品導(dǎo)流通道的豎向樣品導(dǎo)流通道分別與相鄰的兩條血液流道連接，位于外層的樣品導(dǎo)流通道的兩根豎向樣品導(dǎo)流通道分別與相鄰的兩個(gè)內(nèi)層的樣品導(dǎo)流通道的橫向樣品導(dǎo)流通道連接，以此類推進(jìn)行樣品導(dǎo)流通道的層疊連接，所述樣品入口設(shè)置在最外層樣品導(dǎo)流通道的橫向樣品導(dǎo)流通道上。
其中，每組所述廢液導(dǎo)流通道組包括多層廢液導(dǎo)流通道，每層廢液導(dǎo)流通道分別包括橫向廢液導(dǎo)流通道和位于橫向廢液導(dǎo)流通道兩端的豎向廢液導(dǎo)流通道，最接近廢液通道的內(nèi)層廢液導(dǎo)流通道的豎向廢液導(dǎo)流通道分別與相鄰的兩條血液流道連接，位于外層的廢液導(dǎo)流通道的兩根豎向廢液導(dǎo)流通道分別與相 鄰的兩個(gè)內(nèi)層的廢液導(dǎo)流通道的橫向廢液導(dǎo)流通道連接，以此類推進(jìn)行廢液導(dǎo)流通道的層疊連接，對應(yīng)每組所述樣品通道組的廢液出口設(shè)置在位于該組樣品通道組最外層的廢液導(dǎo)流通道的橫向廢液導(dǎo)流通道上。
其中，所述豎向樣品導(dǎo)流通道、豎向廢液導(dǎo)流通道分別為直徑為5～50μm的柱狀結(jié)構(gòu)。
其中，相鄰的兩根所述豎向樣品導(dǎo)流通道之間的距離為10～100μm，相鄰的兩根所述豎向廢液導(dǎo)流通道之間的距離為10～100μm。
其中，所述血液流道的寬度為10～500μm，厚度為3～200μm。
其中，所述血液流道與緩沖液通道之間的夾角大于0°而小于180°。
其中，所述樣品通道與緩沖液通道之間的夾角為15°、30°、45°或60°。
其中，在進(jìn)行腫瘤細(xì)胞分選時(shí)，緩沖液在所述緩沖液通道內(nèi)的流速與血液樣品在樣品通道內(nèi)的流速比為1:0.5～1:5。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本雙層微流控芯片設(shè)計(jì)了高低不同的兩層結(jié)構(gòu)，其中高層的為樣品通道，低層的為緩沖液通道。當(dāng)用本雙層微流控芯片進(jìn)行腫瘤細(xì)胞分選時(shí)，尺度較大的CTCs會(huì)沿著較高的通道——即樣品通道流動(dòng)，尺度較小的白細(xì)胞和紅細(xì)胞則會(huì)被buffer(即緩沖液)從較低的流道——即緩沖液通道帶走，從而達(dá)到快速分選富集CTCs的效果。相對于CellSearch檢測方法，利用本雙層微流控芯片分析腫瘤細(xì)胞的技術(shù)不需要多步操作，可一步連續(xù)完成，操作簡單，檢測速度更多，富集的CTCs純度高，而且由于不使用抗體，該方法得到的CTCs保持較高的細(xì)胞活性，可以更好的用于后期檢測及腫瘤特異性研究。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實(shí)施例雙層微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
如圖1所示，本實(shí)施例的用于腫瘤細(xì)胞分選的雙層微流控芯片，包括第一芯片1和位于第一芯片1下方的第二芯片2，第一芯片1的表面具有樣品通道，與樣品通道相對的第二芯片2的表面具有緩沖液通道11，緩沖液通道11具有緩沖液入口19和緩沖液出口20。
第一芯片1具有一個(gè)樣品入口4，樣品通道包括若干組樣品通道組21，每組樣品通道組21包括若干條血液流道23，樣品入口4通過樣品導(dǎo)流通道組22與每條血液流道23的入口端連接；第一芯片1對應(yīng)每組樣品通道組21設(shè)有一個(gè)廢液出口3，每個(gè)廢液出口3通過廢液導(dǎo)流通道組8與該廢液出口3對應(yīng)的樣品通道組21的血液流道23的出口端連接。
血液流道23與緩沖液通道11交叉相通，樣品通道與緩沖液通道11之間的夾角大于0°而小于180°，例如15°、30°、45°或60°。
在本實(shí)施例中，樣品通道包括4組樣品通道組21，每組樣品通道組21包括4條血液流道23，樣品導(dǎo)流通道組22包括5層樣品導(dǎo)流通道，廢液導(dǎo)流通道組8包括3層廢液導(dǎo)流通道。
樣品導(dǎo)流通道組22有四層，分別是括第一層樣品導(dǎo)流通道13、第二層樣品導(dǎo)流通道14、第三層樣品導(dǎo)流通道15和第四層樣品導(dǎo)流通道16，每層樣品導(dǎo)流通道分別包括橫向樣品導(dǎo)流通道17和位于橫向樣品導(dǎo)流通道17兩端的豎向樣品導(dǎo)流通道18。第一層樣品導(dǎo)流通道13的兩根豎向樣品導(dǎo)流通道18分別與相鄰的兩條血液流道23的輸出端連接，第二層樣品導(dǎo)流通道14的兩根豎向樣品導(dǎo)流通道18分別與相鄰的第一層樣品導(dǎo)流通道13的橫向樣品導(dǎo)流通道17連接，第三層樣品導(dǎo)流通道15的兩根豎向樣品導(dǎo)流通道18分別與相鄰的第二層 樣品導(dǎo)流通道14的橫向樣品導(dǎo)流通道17連接，第四層樣品導(dǎo)流通道16的兩根豎向樣品導(dǎo)流通道18分別與相鄰的第三層樣品導(dǎo)流通道15的橫向樣品導(dǎo)流通道17連接，最后，樣品入口4設(shè)置在第四層樣品導(dǎo)流通道16的橫向樣品導(dǎo)流通道17上。
本實(shí)施例的第一芯片1設(shè)置了4個(gè)廢液出口3，每個(gè)廢液出口3與樣品通道的連接關(guān)系如下：每個(gè)廢液出口3通過一組廢液導(dǎo)流通道組8與該廢液出口3對應(yīng)的樣品通道組21的血液流道23連接，每組廢液導(dǎo)流通道組8有2層，分別為第一層廢液導(dǎo)流通道6和第二層廢液導(dǎo)流通道5，每層廢液導(dǎo)流通道分別包括橫向廢液導(dǎo)流通道10和位于橫向廢液導(dǎo)流通道10兩端的豎向廢液導(dǎo)流通道9。第一層廢液導(dǎo)流通道6的兩根豎向廢液導(dǎo)流通道9分別與相鄰的兩條血液流道23的輸出端連接，第二層廢液導(dǎo)流通道5的兩根豎向廢液導(dǎo)流通道9分別與相鄰的第一層廢液導(dǎo)流通道6的橫向廢液導(dǎo)流通道10連接，而對應(yīng)每組樣品通道組21的廢液出口3設(shè)置在位于該組樣品通道組的第二層廢液導(dǎo)流通道5的橫向廢液導(dǎo)流通道10上。
本實(shí)施例的豎向樣品導(dǎo)流通道18、豎向廢液導(dǎo)流通道9分別為直徑為5～50μm，如10μm、15μm、20μm、30μm、40μm、45μm的柱狀結(jié)構(gòu)。
相鄰的兩根豎向樣品導(dǎo)流通道18之間的距離為10～100μm，例如20μm、30μm、50μm、60μm、70μm、80μm，相鄰的兩根豎向廢液導(dǎo)流通道9之間的距離也為10～100μm，例如20μm、40μm、50μm、60μm、80μm。
本實(shí)施例的血液流道23的寬度為10～500μm，例如20μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm，厚度為3～200μm，例如10μm、50μm、100μm、150μm、160μm、180μm。
當(dāng)用本實(shí)施例的雙層微流控芯片進(jìn)行腫瘤細(xì)胞分選時(shí)，若控制緩沖液流速 與樣品流速的比例合適時(shí)，尺度較大的CTCs會(huì)沿著較高的樣品通道流動(dòng)，而尺度較小的白細(xì)胞和紅細(xì)胞則會(huì)被PBS(磷酸鹽緩沖液)從較低的緩沖液通道11帶走，從而達(dá)到快速分選富集CTCs的效果。因而可以作為一種新型的血液細(xì)胞快速分選裝置，為外周血檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞提供了有效的技術(shù)手段。
本實(shí)施中，緩沖液在緩沖液通道11內(nèi)的流速與血液樣品在樣品通道內(nèi)的流速比為1:0.5～1:5，例如1:1、1:2、1:3、1:4。
本實(shí)施例的雙層微流控芯片的制備方法如下：
(1)雙層光刻制備芯片模板：在用于制備第二芯片的基板——硅片上涂覆厚度為5μm～10μm的光刻膠SU 8；使用菲林掩模板制作光刻圖案，進(jìn)行第一次曝光，曝光時(shí)間在5s～20s之間；以第一次曝光后的結(jié)構(gòu)作為第一芯片的基板，上面涂覆厚度為25μm～40μm的光刻膠SU 8，使用菲林掩模板制作光刻圖案，然后通過光刻機(jī)上的顯微鏡對齊較低層結(jié)構(gòu)與較高層結(jié)構(gòu)的模板，進(jìn)行第二次曝光，曝光時(shí)間在5s～20s之間，兩層芯片總共的高度在40μm以上，制得模板；
(2)將制備好的模板在150℃條件下，烘烤30min，使模板堅(jiān)固；
(3)將模板放入一干凈的玻璃平皿中，TMCS(三甲基氯硅烷)熏蒸處理5min，從而防止模板與PDMS粘附在一起；
(4)將SYLGRAD 184與PDMS按質(zhì)量比1:5～1:20澆筑在模板表面，真空泵抽去PDMS和硅片(即基片)之間的空氣，在80℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘烤45min；
(5)用工具刀將芯片切出需要的大小和形狀，打孔器打孔；之后與一干凈的載玻片一起放入O2plasma中處理10s～30s；
(6)將PDMS芯片與載玻片封接在一起，在80℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘 烤2h，獲得本實(shí)施例的雙層微流控芯片。
以上內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。