本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種運用生物酶催化法高效制備、純化環(huán)二核苷酸cGAMP的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌和病毒的核酸會引發(fā)宿主免疫反應(yīng)，宿主通過對病原體產(chǎn)生的核酸感應(yīng)啟動免疫反應(yīng)。最近的研究表明環(huán)GMP-AMP 合成酶（cGAS）是一種關(guān)鍵的細(xì)胞質(zhì)DNA 感測器。cGAS 由雙鏈DNA 激活，催化合成一種非經(jīng)典的環(huán)二核苷酸2’,3’-cGAMP。cGAMP 作為第二信使通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體蛋白STING 結(jié)合促進(jìn)對干擾素β和其他細(xì)胞因子的感應(yīng)。關(guān)于STING 調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)的模型表明受體的結(jié)合會引發(fā)STING 的構(gòu)象變化，導(dǎo)致信號復(fù)合物中蛋白激酶TBK1 的召集和激活。轉(zhuǎn)錄因子IRF3 也隨之進(jìn)入信號復(fù)合物并被TBK1 磷酸化，磷酸化的IRF3 形成低聚體并轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核中，啟動干擾素β的表達(dá)。干擾素β能夠調(diào)控超過兩百種干擾素刺激基因的表達(dá)，它們能夠下調(diào)蛋白質(zhì)的合成、促進(jìn)細(xì)胞生長停滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而形成一種抗病毒的狀態(tài)來控制病毒的傳播。
在STING介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的模型中的研究表明，cGAMP的結(jié)合會導(dǎo)致STING發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)，從而導(dǎo)致信號復(fù)合物中蛋白激酶TBK1的富集和激活，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)控因子3（IRF3）的磷酸化，磷酸化的IRF3會發(fā)生寡聚并轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞核中，其在細(xì)胞核內(nèi)能夠誘導(dǎo)β干擾素（IFN-β）的表達(dá)，而IFN-β對200多種干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞因子基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，從而通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)、使得腫瘤細(xì)胞生長停滯和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來體現(xiàn)其抗腫瘤的功能。IFN-β已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于白血病、多發(fā)性硬化癥等的臨床治療，而cGAMP作為STING的激活劑，增強人體先天性免疫，誘導(dǎo)I-型干擾素的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而激活T細(xì)胞。因此，cGAMP具有應(yīng)用于抗腫瘤臨床治療的巨大潛質(zhì)。最近的兩項研究表明依賴于STING通路的胞質(zhì)DNA傳感能夠調(diào)節(jié)先天性免疫對于免疫原性腫瘤細(xì)胞的識別功能，并且能夠通過激活I(lǐng)型干擾素依賴的免疫效應(yīng)成為放射性治療的輔助療法。樹突狀細(xì)胞是體內(nèi)最主要的呈遞腫瘤相關(guān)抗原的一類抗原呈遞細(xì)胞，當(dāng)樹突狀細(xì)胞暴露于危險或炎癥信號時，它們對這項任務(wù)具有高度敏感性，能夠引起CD8+ T細(xì)胞的交叉激活反應(yīng)。I型干擾素（包含干擾素α和干擾素β）作為一類眾所周知的免疫激活因子家族，能夠?qū)渫粻罴?xì)胞誘導(dǎo)的交叉免疫產(chǎn)生最有效的活化作用。近期的體內(nèi)和體外研究都表明I型干擾素誘導(dǎo)的針對腫瘤特異性抗原的樹突狀細(xì)胞交叉免疫反應(yīng)是腫瘤免疫監(jiān)控的一種關(guān)鍵的機制，并且能夠促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞的腫瘤殺傷作用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
1、高效規(guī)?；苽渲亟M環(huán)二核苷酸cGMP-AMP合成酶（cGAS）的方法。
2、 運用重組的環(huán)二核苷酸cGMP-AMP合成酶cGAS催化,大規(guī)模制備環(huán)二核苷酸cGAMP。
3、環(huán)二核苷酸cGAMP規(guī)?；咝Х蛛x純化方法。
具體實施方式
高效規(guī)?；苽渲亟M環(huán)二核苷酸cGMP-AMP合成酶（cGAS）
（1）人源環(huán)二核苷酸cGAMP合成酶cGAS基因美國ATCC公司購買，通過基因工程手段將其成功克隆至購于Novagen公司的pET-28(a)載體內(nèi)，cGAS基因N-末端帶有SMT3融合標(biāo)簽，SMT3標(biāo)簽蛋白上含有6個組氨酸Ni-NTA柱親和標(biāo)簽。基因測序結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了人源環(huán)二核苷酸cGAMP合成酶cGAS基因表達(dá)質(zhì)粒。
（2）接種：以大腸桿菌 BL21 (DE3)為宿主菌（購于Novagen公司），轉(zhuǎn)化、挑斑于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。用于接種的搖瓶培養(yǎng)液使用濃度為 25 g/L 的 LB 培養(yǎng)液。搖瓶置于全控溫?fù)u床，240 rpm 振蕩培養(yǎng)過夜。種子的 OD600 測定值在 2－4 之間。接種量為工作體積的 2%-5%。
（3）發(fā)酵罐培養(yǎng) E. coli表達(dá)蛋白：
使用 New Brunswick Scientific BioFlo? 310 臺式發(fā)酵罐培養(yǎng) E. coli流加培養(yǎng)用的14 L 罐體及 Rushton 攪拌槳。通過位于系統(tǒng)控制器上的15英寸工業(yè)級彩色觸摸顯示屏，能控制調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、溫度、pH、溶氧、泡沫 / 液位、三個蠕動泵及通氣等。標(biāo)配一個熱質(zhì)量氣體流量計（TMFC）能提供供氣控制。初始培養(yǎng)基成分為：磷酸二氫鉀（KH2PO4，3.5 g/L）， 磷酸氫二鉀（K2HPO4，5.0 g/L），硫酸銨（(NH4)2SO4，5.0 g/L）， 酵母抽提物 (5.0 g/L)，消泡劑 (Breox Foam Control Agent FMT 30，1.00 ml/L)。高溫滅菌冷卻后，添加：七水硫酸鎂（25% 溶液，最終濃度為 4 ml/L），葡萄糖，（10g/L, 通常加入 50% 的溶液），K-12 微量金屬（最終濃度為 1 ml/L），硫胺（加入量根據(jù)儲備液濃度決定，最終濃度為 2.2 mg/L），二水氯化鈣（加入量根據(jù)儲備液濃度決定，最終濃度為 0.15g/L）?！綤-12 微量金屬溶液，包括 : 氯化鈉（NaCl，5 g/L），七水硫酸鋅（ZnSO4-7H2O，1 g/L），四水氯化錳（MnCl2-4H2O，4 g/L），六水氯化鐵（FeCl3-6H2O，4.75 g/L），五水硫酸銅（CuSO2-5H2O，0.4 g/L），硼酸（H3BO3，0.575 g/L），二水鉬酸鈉（NaMoO4-2H2O，0.5 g/L），6N 硫酸（H2SO4，~ 12.5 ml/L）?！?/p>
控制參數(shù)設(shè)定值：發(fā)酵運行時間為 22 小時，控制溫度為37°C, pH 為 7.0, DO 為 30%。初始攪拌轉(zhuǎn)速為 200rpm，其后由 DO 關(guān)聯(lián)控制轉(zhuǎn)速。初始培養(yǎng) 5 小時后，開始進(jìn)行流加培養(yǎng)，發(fā)酵 5 小時后，隨著碳源的耗盡，pH 值止于 7.1，BioCommand? 程序自動開啟補料泵。DO 和pH 也被精確控制。培養(yǎng) E. coli 獲得的菌體干重為 25 g/L。
（4）cGAS蛋白純化
菌體細(xì)胞溶于50mM Tris.HCl（pH 7.5）,用細(xì)胞碎儀（奧維斯丁中試型）破碎細(xì)胞，高速離心后得到含蛋白的上層清夜，然后用Ni-NTA（購于Qiagen公司）親和柱初步分離純化cGAS蛋白，用SDS-Page分析蛋白純度（85%），進(jìn)而用SUMO蛋白酶（購于Qiagen公司）酶切除去SMT3融合標(biāo)簽蛋白，再進(jìn)行第二次Ni-NTA親和柱分離純化。 最后用HiLoadTM Superdex 75 凝膠柱進(jìn)一步純化，得到95%純度cGAS酶蛋白，冷凍干燥后保存與-80度超低溫冷藏柜。
運用重組的環(huán)二核苷酸cGMP-AMP合成酶cGAS催化,大規(guī)模制備環(huán)二核苷酸cGAMP
運用制備的重組cGAS酶催化，高效專一性地制備環(huán)二核苷酸cGAMP。反應(yīng)體系為20升生物酶反應(yīng)器，反應(yīng)體系含cGAS （10 mM）, ATP （10 mM）,GTP (10 mM), MgCl2 (10 mM), DNA (0.2mg/ml), NaCl (100 mM)，反應(yīng)溫度37度，時間8小時。用分光光度計在260nm檢測產(chǎn)物和反應(yīng)物，反應(yīng)產(chǎn)率95%以上。
環(huán)二核苷酸cGAMP規(guī)模化高效分離純化方法
用100毫升體積離子交換柱(購于GE公司)分離純化，梯度洗脫cGAMP,得到純度高于95%的cGAMP。用-50度冷凍干燥機冷凍干燥后獲得約250克cGAMP凍干白色粉末樣品。