本發(fā)明涉及一種新型的肽縮合試劑及其制備方法，特別是一種肽縮合試劑3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯及其制備方法。

背景技術(shù)：

肽是由肽鍵相連的氨基酸短鏈，為天然存在的生物分子。肽在分子結(jié)構(gòu)上介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，肽鏈經(jīng)過不同程度的盤曲折疊，具有一定的空間結(jié)構(gòu)并呈現(xiàn)不同的生理功能。肽鏈亦屬于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能片段，除此之外，肽鏈還存在于許多天然產(chǎn)物以及上市藥物分子中，如神經(jīng)質(zhì)腦啡肽(Nature 1975,258,577；Brain Res.1975,88,295.)以及降血壓藥物賴諾普利(Bone 2008,43,813)。生命科學(xué)中的諸多重要課題，如細(xì)胞分化、生殖控制、免疫防御、抗衰防老、腫瘤病變及治療等，均與肽化學(xué)密切關(guān)聯(lián)，因而，肽合成技術(shù)的研發(fā)已成為生命科學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。

縮合試劑法是目前應(yīng)用最為廣泛的成肽反應(yīng)方法。目前已知的縮合試劑種類繁多，而最為常用的主要分為三種類型，即碳二亞胺型、磷鎓鹽型和脲鎓鹽型。二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)是最早應(yīng)用于成肽反應(yīng)中的碳二亞胺型縮合試劑(J.Am.Chem.Soc.1955,77,1067.)。雖然DCC的反應(yīng)活性較高，且具有廣譜的底物適用性，但該試劑的缺陷也不容忽視，如：消旋問題的產(chǎn)生(J.Am.Chem.Soc.1958,80,2902.)，必須通過額外加入外消旋抑制劑解決(Chem.Ber.1970,103,788；Chem.Ber.1970,103,2024.)；副產(chǎn)品N-?；宓漠a(chǎn)生不可避免；DCC參與反應(yīng)后會(huì)生成二環(huán)己基脲(DCU)，后者難溶于大部分有機(jī)溶劑，給后處理帶來了不便。磷鎓鹽型試劑如苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)，其產(chǎn)生的副產(chǎn)品六甲基磷酰胺(HMPA)是一類強(qiáng)致癌物質(zhì)。脲鎓鹽型試劑如苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，其副產(chǎn)品胍類化合物的產(chǎn)生同樣不能避免。另外，上述類型的縮合試劑成肽反應(yīng)時(shí)間較長，更為重要的是，它們無法實(shí)現(xiàn)回收再生，從而造成資源浪費(fèi)，這也限制了它們的大量應(yīng)用。

由于常用的縮合試劑在成肽反應(yīng)中存在諸多缺陷，因而亟需開發(fā)、合成一種能夠規(guī)避上述問題的新型縮合試劑。這種縮合試劑不僅要制備簡(jiǎn)便且適合大量制備；同時(shí)不會(huì)引發(fā)副反應(yīng)；有高的反應(yīng)活性；最為重要的是，該新型縮合試劑應(yīng)能夠通過簡(jiǎn)單的后處理即可以實(shí)現(xiàn)回收、再利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述存在的問題，提供一種肽縮合試劑3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯及其制備方法，該制備方法原料易得、操作簡(jiǎn)單且各步收率都較高；所合成的縮合試劑具有很高的反應(yīng)活性，可使得標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以及大位阻氨基酸的成肽反應(yīng)在30分鐘以內(nèi)完成；該縮合試劑參與完反應(yīng)后可通過簡(jiǎn)單的后處理實(shí)現(xiàn)回收再生，使大量使用成為可能。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種肽縮合試劑3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯，其分子式為C₁₆H₅F₆IO₄，分解溫度278℃，其結(jié)構(gòu)式如下：

所述化合物共含5個(gè)氫且全部為芳環(huán)上的氫，化學(xué)位移為8.19～8.75ppm；所述化合物共出現(xiàn)10個(gè)碳信號(hào)峰，其中與碘原子相連的碳化學(xué)位移為126.55ppm,兩個(gè)羰基碳化學(xué)位移為166.3ppm，與氟直接相連的兩個(gè)三氟甲基碳原子裂分為四重峰，化學(xué)位移為123.75ppm，耦合常數(shù)為271Hz，與三氟甲基相連的芳環(huán)碳原子被裂分為四重峰，化學(xué)位移為131.5ppm，耦合常數(shù)為33Hz，處于兩個(gè)三氟甲基之間的芳環(huán)碳裂分成多重峰，化學(xué)位移為122.7ppm；該化合物結(jié)構(gòu)對(duì)稱，只出現(xiàn)一個(gè)氟原子信號(hào)，為–61.0ppm。一種所述肽縮合試劑3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯的制備方法，包括如下步驟：

1)3,5-二甲基-3’,5’-雙三氟甲基-4-氨基聯(lián)苯(BTFP-1)的合成

將4-溴-2,6-二甲基苯胺溶于N,N-二甲基乙酰胺與水的混合溶劑中，然后攪拌下依次向該混合液中加入3,5-雙(三氟甲基)苯硼酸、三水合磷酸鉀、醋酸鈀，得到混合液，將混合液在100℃溫度下攪拌反應(yīng)4小時(shí)，降至室溫后用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌一次，最后用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去有機(jī)溶劑，得到粗產(chǎn)品，經(jīng)柱層析純化得淡黃色固體產(chǎn)品BTFP-1；

以4-溴-2,6-二甲基苯胺和3,5-雙(三氟甲基)苯硼酸為原料，通過Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)制備偶聯(lián)產(chǎn)品BTFP-1的反應(yīng)如(1)所示：

2)3,5-二甲基-3’,5’-雙三氟甲基-4-碘聯(lián)苯(BTFP-2)的合成

將上述BTFP-1溶解于無水乙腈中，再加入硫酸水溶液，得到反應(yīng)液，將反應(yīng)液冷卻至–5℃，然后在攪拌條件下緩慢滴加亞硝酸鈉水溶液，待滴加完畢后繼續(xù)在–5℃條件下攪拌1小時(shí)，然后加入尿素，并隨后向其中緩慢滴加碘化鉀水溶液，反應(yīng)體系溫度逐漸升至室溫，反應(yīng)過程要始終保持良好的攪拌狀態(tài)，反應(yīng)在–5℃至室溫的條件下共反應(yīng)8小時(shí)，待反應(yīng)結(jié)束后，用濃度為1N的氫氧化鈉水溶液將反應(yīng)體系調(diào)至pH為8-9，然后用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，依次用飽和硫代硫酸鈉水溶液和飽和食鹽水分別洗滌一次，最后用無水硫酸鎂干燥，旋蒸除去有機(jī)溶劑，得粗產(chǎn)品，經(jīng)柱層析純化得到白色固體產(chǎn)品BTFP-2；

BTFP-1通過重氮化碘化反應(yīng)合成BTFP-2的反應(yīng)如(2)所示：

3)3’,5’-雙三氟甲基-4-碘聯(lián)苯-3,5-二羧酸(BTFP-3)的合成

將上述BTFP-2溶于叔丁醇與水的混合溶劑中，加入高錳酸鉀，加熱至回流24小時(shí)，然后補(bǔ)加相同量的第二份高錳酸鉀，回流條件下繼續(xù)攪拌24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，趁熱抽濾以除去固體殘?jiān)?，濾餅用蒸餾水洗滌，收集濾液，然后旋蒸除去濾液中的叔丁醇，剩余的液相用5N的鹽酸酸化至體系pH為5-6，此時(shí)液相中有固體析出，過濾得到白色固體產(chǎn)品BTFP-3；

以BTFP-2為原料，通過氧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)甲基的氧化得到BTFP-3的反應(yīng)如(3)所示：

4)3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯(p-BTFP-Iodosodilactone)的合成

在BTFP-3中加入36.5wt％的濃鹽酸，反應(yīng)降至0℃，然后在避光的條件下，用恒壓滴液漏斗向其中滴加有效氯為10wt％的次氯酸鈉水溶液(安替富民)，滴加完畢，溫度可慢慢升至室溫，反應(yīng)在0℃至室溫的條件下共反應(yīng)12小時(shí)，過濾得白色固體產(chǎn)品p-BTFP-iodosodilactone，然后用蒸餾水洗滌至中性，置于通風(fēng)處晾干，制得目標(biāo)物。

以BTFP-3為起始原料，酸性條件下通過氧化反應(yīng)得到最終的縮合試劑p-BTFP-iodosodilactone的反應(yīng)如(4)所示：

所述步驟1)混合溶劑中N,N-二甲基乙酰胺與水的體積比為1:1，4-溴-2,6-二甲基苯胺在混合溶劑中的濃度為0.1毫摩爾/毫升；4-溴-2,6-二甲基苯胺、3,5-雙(三氟甲基)苯硼酸、三水合磷酸鉀和醋酸鈀的摩爾比為1：1.5：2：0.1；乙酸乙酯與4-溴-2,6-二甲基苯胺的用量比為150毫升:1克。

所述步驟2)BTFP-1在乙腈中的濃度為1毫摩爾/毫升；硫酸水溶液中98wt％的硫酸與水的體積比為1.1：26，BTFP-1與98wt％的硫酸的用量比為1毫摩爾：0.11毫升；亞硝酸鈉水溶液中亞硝酸鈉與蒸餾水的用量比為0.697克：3毫升，BTFP-1與亞硝酸鈉的摩爾比為1：1.01；尿素與BTFP-1的摩爾比為1:5；碘化鉀水溶液中碘化鉀與蒸餾水的用量比為4.53克：8.6毫升，BTFP-1與碘化鉀的摩爾比為1：2.68；BTFP-1與乙酸乙酯的用量比為3.33克：300毫升。

所述步驟3)混合溶劑中叔丁醇與水的體積比為1:1，BTFP-2在混合溶劑中 的濃度為0.1毫摩爾/毫升；兩份高錳酸鉀總量與BTFP-2的摩爾比為4:1；BTFP-2與洗滌用蒸餾水的用量比為4.44克：50毫升。

所述步驟4)BTFP-3與36.5wt％的濃鹽酸的用量比為1毫摩爾：10毫升；BTFP-3與次氯酸鈉水溶液的用量比為1毫摩爾：20毫升。

本發(fā)明的有益效果是：

3’,5’‐雙三氟甲基聯(lián)苯‐3,5‐二乙酸亞碘酰苯為一種新型的肽縮合試劑，其制備方法原料易得、操作簡(jiǎn)單且各步收率都較高；所合成的縮合試劑具有高的反應(yīng)活性，可使得標(biāo)準(zhǔn)氨基酸以及大位阻氨基酸的成肽反應(yīng)時(shí)間在30分鐘以內(nèi)完成；所得縮合試劑在反應(yīng)結(jié)束后可通過簡(jiǎn)單的后處理實(shí)現(xiàn)回收再生，使大量使用成為可能。

附圖說明

圖1為產(chǎn)品BTFP-1的核磁共振氫譜圖。

圖2為產(chǎn)品BTFP-2的核磁共振氫譜圖。

圖3為產(chǎn)品BTFP-3的核磁共振氫譜圖。

圖4為產(chǎn)品3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯的核磁共振氫譜圖。

圖5為產(chǎn)品3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯的核磁共振碳譜圖。

圖6為產(chǎn)品3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯的核磁共振氟譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例：

一種肽縮合試劑3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯，其分子式為C₁₆H₅F₆IO₄，分解溫度278℃，其結(jié)構(gòu)式如下：

所述肽縮合試劑3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯的制備方法，包括如下步驟：

1)3,5-二甲基-3’,5’-雙三氟甲基-4-氨基聯(lián)苯(BTFP-1)的合成

250毫升的單口圓底燒瓶中，加入2克4-溴-2,6-二甲基苯胺，隨后加入100毫升體積比為1:1的N,N-二甲基乙酰胺與水的混合溶劑，攪拌下依次向該混合液中加入3.87克3,5-雙(三氟甲基)苯硼酸，5.32克三水合磷酸鉀，225毫克醋酸鈀。將反應(yīng)升溫至100℃攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，降至室溫，用100毫升的乙酸乙酯萃取三次，共計(jì)300毫升，然后用水少量多次清洗去除DMA。合并有機(jī)相，飽和食鹽水洗滌一次，最后用無水硫酸鎂干燥。濃縮得粗產(chǎn)品，經(jīng)柱層析純化得產(chǎn)品BTFP-1，收率為88％。所得產(chǎn)品為淡黃色固體，熔點(diǎn)為108-110℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.94(s,2H),7.73(s,1H),7.22(s,2H),3.77(s,2H),2.26(s,6H).

圖1為產(chǎn)品BTFP-1的核磁共振氫譜圖，圖中表明：化合物BFTP-1共含13個(gè)氫，其中，芳環(huán)上共有5個(gè)氫，化學(xué)位移處于較低場(chǎng)，在7.22～7.94ppm之間；氨基上的兩個(gè)活性氫的化學(xué)位移為3.77ppm；與氨基相鄰的兩個(gè)甲基上的氫則出現(xiàn)在較高場(chǎng)，化學(xué)位移為2.26ppm，共有6個(gè)氫。

2)3,5-二甲基-3’,5’-雙三氟甲基-4-碘聯(lián)苯(BTFP-2)的合成

100毫升的單口圓底燒瓶中，加入3.33克BTFP-1，隨后加入10毫升無水乙腈，并使BTFP-1完全溶解于其中。接著加入預(yù)先配制好的硫酸水溶液(1.1毫升98wt％的濃硫酸溶于26毫升蒸餾水)。將反應(yīng)冷卻至–5℃，向反應(yīng)體系中緩慢地滴加亞硝酸鈉水溶液(0.697克亞硝酸鈉溶于3毫升蒸餾水)，在此過程中要保持良好的攪拌，待滴加完畢后，繼續(xù)在–5℃條件下攪拌1小時(shí)。1小時(shí)后向反應(yīng)體系中加入0.12克尿素，并隨后向其中緩慢滴加碘化鉀水溶液(4.53克碘化鉀溶于8.6毫升蒸餾水)。反應(yīng)體系溫度逐漸升至室溫，反應(yīng)過程要始終保持良好的攪拌狀態(tài)。待反應(yīng)結(jié)束后，用濃度為1N的氫氧化鈉水溶液將反應(yīng)體系調(diào)至pH為8，接著該堿性體系用100毫升的乙酸乙酯萃取三次，共計(jì)300毫升。合并有機(jī)相，依次用飽和硫代硫酸鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌一次，最后用無水硫酸鎂進(jìn)行干燥。濃縮得粗產(chǎn)品，經(jīng)柱層析純化得產(chǎn)品BTFP-2，收率為97％。產(chǎn)品為白色固體，熔點(diǎn)為128-130℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.98(s,2H),7.85(s,1H),7.27(s,2H),2.57(s,6H).

圖2為產(chǎn)品BTFP-2的核磁共振氫譜圖，圖中表明：化合物BFTP-2共含11個(gè)氫，其中，芳環(huán)上共有5個(gè)氫，化學(xué)位移處于較低場(chǎng)，在7.27～7.98ppm之間；與碘原子相鄰的兩個(gè)甲基上的氫則出現(xiàn)在較高場(chǎng)，化學(xué)位移為2.57ppm，共有6個(gè)氫。

3)3’,5’-雙三氟甲基-4-碘聯(lián)苯-3,5-二羧酸(BTFP-3)的合成

250毫升的單口圓底燒瓶中，加入4.44克BTFP-2，隨后加入100毫升體積比為1:1的叔丁醇與水的混合溶劑。接著向反應(yīng)體系中加入3.16克高錳酸鉀，加熱至回流，24小時(shí)后，補(bǔ)加另一份3.16克的高錳酸鉀，回流條件下繼續(xù)攪拌24 小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，趁熱抽濾以除去固體殘?jiān)?，濾餅用50毫升的蒸餾水洗滌，收集濾液。濃縮除去濾液中的叔丁醇，剩余的水相用5N的鹽酸酸化至體系pH為6，此時(shí)水相中有固體析出，過濾可得產(chǎn)品BTFP-3，收率為95％。所得產(chǎn)品為為白色固體。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝13.73(s,2H),8.51(s,2H),8.15(s,1H),8.12(s,2H).

圖3為產(chǎn)品BTFP-3的核磁共振氫譜圖，圖中表明：化合物BFTP-3共含7個(gè)氫，其中，芳環(huán)上共有5個(gè)氫，化學(xué)位移為8.12～8.51ppm；與碘原子相鄰的兩個(gè)羧基上的活性氫則出現(xiàn)在較低場(chǎng)，化學(xué)位移為13.73ppm，共有2個(gè)氫。

4)肽縮合試劑3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯(p-BTFP-Iodosodilactone)的合成

500毫升的單口圓底燒瓶中，加入5.04克BTFP-3，隨后加入100毫升的濃鹽酸。反應(yīng)降至0℃，在避光的條件下，用恒壓滴液漏斗向其中滴加200毫升有效氯為10％的次氯酸鈉水溶液(安替富民)。滴加完畢后，繼續(xù)攪拌，溫度可慢慢由0℃升至室溫，反應(yīng)結(jié)束后，過濾得產(chǎn)品p-BTFP-iodosodilactone，隨即用蒸餾水洗至洗滌液為中性，置于通風(fēng)處晾干，收率為90％。所得產(chǎn)品為白色固體，分解點(diǎn)溫度為278℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝8.75(s,2H),8.59(s,2H),8.19(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ＝166.3,143.6,140.7,133.5,131.5(q,J＝33.0Hz),130.3,129.4,126.55,123.75(q,J＝271Hz),122.7(m)；¹⁹F NMR(376MHz,DMSO-d₆):δ＝–61.0.

圖4為產(chǎn)品3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯的核磁共振氫譜圖，圖中表明：化合物p-BTFP-iodosodilactone共含5個(gè)氫，且全部為芳環(huán)上的氫，化學(xué)位移為8.19～8.75ppm。

圖5為產(chǎn)品3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯的核磁共振碳譜圖，圖中表明：化合物p-BTFP-iodosodilactone共出現(xiàn)10個(gè)碳信號(hào)峰，其中，與碘原子相連的碳化學(xué)位移為126.55ppm,兩個(gè)羰基碳化學(xué)位移為166.3ppm，由于氟原子對(duì)碳的裂分作用，使得與氟直接相連的兩個(gè)三氟甲基碳原子會(huì)裂分為四重峰，化學(xué)位移為123.75ppm，耦合常數(shù)為271Hz，與三氟甲基相連的芳環(huán)碳原子則同樣被裂分為四重峰，化學(xué)位移為131.5ppm，耦合常數(shù)為33Hz，而處于兩個(gè)三氟甲基之間的芳環(huán)碳，由于兩個(gè)三氟甲基的存在，則會(huì)裂分成多重峰，化學(xué)位移為122.7ppm。

圖6為產(chǎn)品3’,5’-雙三氟甲基聯(lián)苯-3,5-二乙酸亞碘酰苯的核磁共振氟譜圖，圖中表明：化合物p-BTFP-iodosodilactone由于結(jié)構(gòu)對(duì)稱，譜圖中只出現(xiàn)一個(gè)氟原子信號(hào)，為–61.0ppm。