本發(fā)明涉及一種選擇性分離凈化雙酚A及其結構類似物的雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球的制備及應用，屬于生物分析和新材料領域。

背景技術：

雙酚A被公認為是一種內分泌干擾物(Endocrine disrupting chemical,EDC)，其對人類的生殖和發(fā)育，神經(jīng)系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)，新陳代謝以及免疫系統(tǒng)的危害已經(jīng)得到廣泛證實。鑒于這種情況，美國環(huán)境保護局(USEPA)和歐洲食品安全局(EFSA)已經(jīng)規(guī)定了雙酚A每日最大攝入劑量的參考值，加拿大衛(wèi)生部也做了相關工作。歐盟已經(jīng)對用于食品生產(chǎn)的塑料制品雙酚A遷移量做了嚴格限制。為了應對這些限制和規(guī)定，許多制造商開始使用一些雙酚A的結構類似物作為替代原料。這些結構類似物有雙酚F、雙酚S、雙酚B、雙酚E、雙酚AF、雙酚AP以及雙酚Z等。目前，已經(jīng)有一些關于雙酚A結構類似物具有內分泌干擾效應的報道。有報道稱雙酚S、雙酚B、雙酚F具有與雙酚A類似的急性毒性，基因毒性以及雌激素效應。有研究表明雙酚B和雙酚AF能影響孕甾烷X受體的活性，該細胞核受體能直接影響外源性物質的代謝。在最近的一個有關雄性成年鼠的研究中，雙酚AF通過影響成鼠睪丸功能進而導致其體內睪酮濃度的降低。因此這些雙酚A結構類似物也會對人類健康構成一定潛在威脅。隨著這些雙酚A結構類似物工業(yè)使用量的逐年增加，其在自然界中的排放量也會隨之增加，進而加大了人體暴露的風險。因此建立準確可靠的分離分析方法，實現(xiàn)對雙酚A及其結構類似物在人生物樣品中存在情況的徹底認知在環(huán)境暴露和健康評估方面有著重要意義。

由于生物樣品成分的復雜性，實現(xiàn)對其所含雙酚類污染物的準確分析需要依托一定的分離凈化手段?；诜肿佑≯E技術的固相萃取材料就可以實現(xiàn)對復雜基質中目標物質的選擇性分離和凈化，這就為對復雜生物樣品的準確分析提供了可靠的基礎。分子印跡技術(Molecular imprinting technique)是制備對目標化合物具有特定識別能力材料的新技術。根據(jù)材料制備和識別過程中模板分子與功能單體間相互作用力的不同，可以將其分為共價法、非共價法和半共價法。其中非共價法的應用最為廣泛。

由于具有成本低、易于制備，機械強度和化學穩(wěn)定性好以及可以重復使用的優(yōu)點，聚合物被廣泛應用于分子印跡材料的制備。但是傳統(tǒng)的本體聚合制備的多孔塊狀聚合物，在被應用于固相萃取前必須經(jīng)過破碎、研磨和篩分的步驟，以獲得粒徑合適的材料。這不僅費時費力，而且獲得的材 料形狀不規(guī)則，產(chǎn)量也較低，通常只能得到約50％的材料。

鑒于這種情況，一些新的聚合物制備技術相繼問世，比如懸浮聚合和沉淀聚合。在懸浮聚合中，無論采用的連續(xù)相是傳統(tǒng)的水相還是新開發(fā)的全氟化碳和礦物油，所制備的聚合物微球粒徑分布都很寬，從幾微米到幾百微米，非常不利于材料在固相萃取中的應用。相對于懸浮聚合來說，沉淀聚合可以制備出高質量、粒徑均勻的聚合物微球，但是需要使用大量的有機溶劑，并且對反應溫度和攪拌速率這樣的合成條件要非常嚴格的控制。由于在制備印跡材料的過程中加入了模板分子，模板分子和功能單體的作用使得聚合物鏈的溶解性發(fā)生了改變。因此，即使是在同樣的合成條件下，所得的印跡材料和非印跡材料的粒徑差別也非常明顯。需要進一步指出的是沉淀聚合制備的聚合物微球粒徑通常為幾個微米或者幾百個納米，更加適合色譜分離分析而不是固相萃取應用。因此開發(fā)新的適用于固相萃取的分子印跡聚合物制備技術迫在眉睫。

皮克林乳液是由固體材料穩(wěn)定小油滴而形成的乳液，有水包油(O/W)和油包水(W/O)等種類。在1907年，S.U.Pickering發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象。到現(xiàn)在已經(jīng)有多種固體材料被用于制備皮克林乳液。有研究表明皮克林乳液的類型以及乳液油滴粒徑的大小可以通過用于穩(wěn)定界面固體材料的親疏水性和質量濃度進行改變和調整，因此皮克林乳液聚合為獲得高產(chǎn)率、粒徑分布窄的聚合物材料提供了新的途徑。直到近幾年才有將皮克林乳液應用于制備分子印跡聚合物微球的報道，而且數(shù)量也非常有限。到目前為止還沒有通過皮克林乳液聚合制備用于印跡雙酚類物質聚合物微球的相關報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種對人尿液樣品中雙酚類污染物具有高選擇性和良好凈化能力的分子印跡皮克林乳液聚合物微球的制備和應用方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：

(1)將模板分子雙酚A(BPA)、功能單體4-乙烯基吡啶(4-VP)、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)溶解于致孔劑甲苯中，超聲使之混合均勻，形成預聚合溶液，通入高純度氮氣除氧后備用；

(2)將SiO₂納米粒子分散于質量濃度為0.05-0.4％的曲拉通X-100水溶液；向該水溶液中加入預聚合溶液，形成皮克林乳液，通入氮氣除氧后密封；將得到的皮克林乳液在60-80℃的溫度下聚合8-24h，得到SiO₂-聚合物微球復合材料的水分散液；

(3)上述水分散液固液分離，所得固體用氫氟酸浸泡腐蝕6-24h，以除去制備的SiO₂-聚合物微球復合材料表面的SiO₂，分離固體得到聚合物微球；

(4)以甲醇和冰乙酸混合液為溶劑，在80-120℃的溫度下索氏提取12-48h以除去上述聚合物微球中的模板分子BPA，此后置于真空干燥箱 中于50-70℃干燥6-24h得到BPA印跡皮克林乳液聚合物微球。

上述步驟(1)中BPA：4-VP：EGDMA：AIBN摩爾比為1～2:2～8:10～40:0.00025～0.001；其中EGDMA與甲苯的體積比為1～2:1～4；致孔劑甲苯使用前要用分子篩干燥除水；步驟(1)中使用高純度氮氣是為防止向預聚合溶液中引入水；

上述步驟(2)中SiO₂納米粒子分散于曲拉通X-100水溶液中的濃度為0.01％～0.1％；預聚合溶液與分散有SiO₂納米粒子的曲拉通X-100水溶液的體積比例為1～2:2～8；所使用的SiO₂納米粒子粒徑大小為3～48nm；

上述步驟(3)中所述固液分離的操作步驟為：將水分散液抽濾，得到的固體依次用去離子水、無水乙醇和丙酮清洗，并真空干燥6-24h；所述分離固體的操作步驟為：抽濾，所得固體用去離子水洗至中性，再依次用無水乙醇和丙酮淋洗，真空干燥6-24h；使用的氫氟酸質量濃度為20-60％；

上述步驟(4)所述溶劑中甲醇和冰乙酸的體積比為9:1～9。

上述步驟(2)所述SiO₂的分散方式為超聲分散，超聲頻率為50-200Hz時間為5-20min

用于干燥致孔劑甲苯的分子篩孔徑為0.4nm，具體操作為與甲苯混合后靜置24-72h，完成后直接使用。

本發(fā)明所提供的雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球可以作為吸附劑在選擇性分離生物樣品中雙酚類污染物中得到應用。

所述生物樣品為人尿液樣品；所述雙酚類污染物為雙酚A、雙酚F、雙酚B、雙酚E、雙酚AF、雙酚S、雙酚AP和雙酚Z中的一種或二種以上；雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球作為固相萃取柱的填料用于分離凈化人尿液樣品中的雙酚類污染物。

所述分子印跡皮克林乳液聚合物微球作為固相萃取柱的填料。

所述分子印跡皮克林乳液聚合物微球用于分離純化人尿液樣品中的雙酚類污染物。

該雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球對雙酚A及其七種結構類似物具有很強的特異選擇性和凈化能力。該材料可用于復雜基質中雙酚類污染物的分離純化。

其中，制備與印跡材料相對應的非印跡材料的條件為：采用上述操作步驟(1)中相似的制備方法，區(qū)別在于不使用模板分子BPA；采用與上述操作步驟(2)中相同的合成條件；采用上述操作步驟(3)中相同的處理方法；不采用上述操作步驟(4)處理非印跡材料。

本發(fā)明的優(yōu)點是：與傳統(tǒng)的本體聚合相比，制備的雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球具有極高的產(chǎn)率(100％轉化為微球，附圖1b)和很窄的粒徑分布(見圖1)，同時對雙酚A具有較高的吸附容量和選擇性。與此同時，其對雙酚A及其結構類似物雙酚F、雙酚B、雙酚E、雙酚AF、雙酚S、雙酚AP和雙酚Z具有很強的類選擇性。本發(fā)明的分子印跡材料對復雜基質 中雙酚類物質具有超高特異選擇性，能夠有效的減小基質干擾，能夠快速、靈敏、準確、高效地對人尿液樣品進行分析。

附圖說明

圖1是實施例3中皮克林乳液制備照片(a和b分別為形成皮克林乳液前后對比照片)和實施例3制得的雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球(MIPMS，c)及與之對應的非印跡皮克林乳液聚合物微球(NIPMS，d)掃描電鏡圖片。

圖2是實施例3制備雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球(MIPMS)及與之對應的非印跡皮克林乳液聚合物微球(NIPMS)對雙酚A的等溫吸附曲線。

圖3是實施例3制備雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球(MIPMS)及與之對應的非印跡皮克林乳液聚合物微球(NIPMS)等溫吸附數(shù)據(jù)的斯卡查德模型分析結果。

圖4是實施例3制備雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球對雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)、雙酚B(BPB)、雙酚E(BPE)、雙酚AF(BPAF)、雙酚S(BPS)、雙酚AP(BPAP)、雙酚Z(BPZ)、四溴雙酚A(TBBPA)、雌素酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、雙烯雌酚(DNS)、己烯雌酚(DES)、正辛基酚(OP)以及正壬基酚(NP)的印跡因子評價結果。

具體實施方式

以下實施例中所使用的SiO₂納米粒子粒徑大小為12nm，購買于美國Sigma公司，貨號為718483。

實施例1

選擇性分離純化雙酚類污染物的雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球及與其相對應非印跡皮克林乳液聚合物微球的制備：

(1)將0.228g(1mmol)模板分子雙酚A(BPA)、0.42mL(4mmol)功能單體4-乙烯基吡啶(4-VP)、3.8mL(20mmol)交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和40mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)溶解于3.6mL的致孔劑甲苯中，100Hz超聲5min使之混合均勻，形成預聚合溶液，通入氮氣10min除氧后備用。

(2)將30mg的SiO₂納米粒子100Hz超聲10min分散于10mL質量濃度為0.2％的曲拉通X-100水溶液。再加入4mL步驟(1)所得預聚合溶液，手搖振蕩1.0min以形成穩(wěn)定的皮克林乳液，通入氮氣10min除氧后密封。將得到的皮克林乳液靜置于70℃的水浴中聚合16h，得到SiO₂-聚合物微球復合材料的水分散液。

(3)通過抽濾得到SiO₂-聚合物微球復合材料，并依次用去離子水、無水乙醇和丙酮清洗，并在真空干燥箱中干燥12h。用質量濃度40％的氫氟酸浸泡腐蝕除去制備的SiO₂-聚合物微球復合材料表面的SiO₂，腐蝕時間為12h，抽濾，得到固體聚合物微球，用去離子水洗至pH為7.0后再用無 水乙醇和丙酮淋洗，并在真空干燥箱中干燥12h。

(4)以甲醇和冰乙酸混合液(9:1，v/v)為溶劑，在100℃的溫度下索氏提取24h以除去聚合物微球中的模板分子BPA，此后產(chǎn)物置于真空干燥箱中于60℃干燥12h得到BPA印跡皮克林乳液聚合物微球。

其中，制備與上述BPA印跡皮克林乳液聚合物微球相對應的非印跡皮克林乳液聚合物微球的條件為：采用與上述操作步驟(1)中相似的制備條件，將0.42mL(4mmol)功能單體4-乙烯基吡啶(4-VP)、3.8mL(20mmol)交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和40mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)溶解于3.6mL的致孔劑甲苯中，100Hz超聲5min使之混合均勻，形成非印跡預聚合溶液，通入氮氣10min除氧后備用；采用與上述操作步驟(2)中相同的合成條件，將30mg的SiO₂納米粒子100Hz超聲10min分散于10mL質量濃度為0.2％的曲拉通X-100水溶液。再加入4mL上述制得的非印跡預聚合溶液，手搖振蕩1.0min以形成穩(wěn)定的皮克林乳液，通入氮氣10min除氧后密封。在70℃的水浴下聚合16h，得到SiO₂-聚合物微球復合材料的水分散液；采用與上述操作步驟(3)中相同的處理方法，通過抽濾得到SiO₂-聚合物微球復合材料，并依次用去離子水、無水乙醇和丙酮清洗，并在真空干燥箱中干燥12h。用質量濃度40％的氫氟酸浸泡腐蝕除去制備的SiO₂-聚合物微球復合材料表面的SiO₂，腐蝕時間為12h，抽濾，得到固體聚合物微球用去離子水洗至pH為7.0后再用無水乙醇和丙酮淋洗，并在真空干燥箱中干燥12h；不需采用上述操作步驟(4)處理即得到與上述步驟(4)制得的BPA印跡皮克林乳液聚合物微球相對應的非印跡皮克林乳液聚合物微球。

實施例2

對本發(fā)明提供方法制得的材料進行靜態(tài)吸附評價：

準確配置一系列濃度(0.02mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L)的BPA的乙腈溶液備用，取上述溶液各2ml分別置于單獨的樣品瓶中，每個樣品瓶中加入實施例1制備的雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球40mg，另取配置的系列濃度的BPA的乙腈溶液各2ml分別置于單獨的樣品瓶中，每個樣品瓶中加入實施例1制備的非印跡皮克林乳液聚合物微球40mg，將上述所有樣品瓶在25℃的恒溫水浴中以150轉/分的速度連續(xù)震蕩24h之后將固液混合物用0.22μm濾膜過濾。利用安捷倫1200型高效液相色譜分析濾液中剩余雙酚A的濃度，色譜條件如下：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm，250mm×4.6mm i.d.，美國)；流動相：甲醇/水(70:30，v/v)，每份樣品進樣體積為5μL；流速：1mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：225nm。每份樣品的初始BPA濃度與色譜分析所得剩余BPA濃度做差，然后乘每份樣品總體積，再換算到1g材料的吸附量，從而得到材料的吸附容量。將樣品中BPA的初始濃度和材料的吸附容量繪制成等溫吸附曲線，結果見圖2。很容易發(fā)現(xiàn)印跡材料對雙酚A的吸附能力明顯高于非印跡材料。再將印跡 材料及非印跡材料的等溫吸附數(shù)據(jù)用Scatchard模型進行分析，結果如圖3所示。對于印跡材料的吸附數(shù)據(jù)進行分析后得到兩條不同的直線，證明該發(fā)明材料存在高親和與低親和兩種不同的吸附位點，如圖3所示。利用通過斯卡查德分析得到兩條直線的斜率和截距，計算出高親和與低親和吸附位點對雙酚A的最大吸附量分別為5.799μmol g^-1和56.74μmol g^-1。

該發(fā)明的分子印跡皮克林乳液聚合物微球對雙酚A具有很好的選擇性和較高的吸附容量。

實施例3

評價本發(fā)明提供的方法制備的雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球對雙酚類污染物的印記因子：

所述雙酚類污染物包括：雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)、雙酚B(BPB)、雙酚E(BPE)、雙酚AF(BPAF)、雙酚S(BPS)、雙酚AP(BPAP)、雙酚Z(BPZ)、四溴雙酚A(TBBPA)、雌素酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、雙烯雌酚(DNS)、己烯雌酚(DES)、正辛基酚(OP)以及正壬基酚(NP)。

將實施例1制備的雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球及與之對應的非印跡皮克林乳液聚合物微球以甲醇為分散溶劑，分別裝入不銹鋼色譜柱(100mm×4.6mm i.d.)，得到印記柱和非印跡柱。通過液相色譜獲得上述雙酚類污染物在印跡柱和非印跡柱上的保留時間，進而獲得印跡因子的評價結果。具體步驟如下：分別配置上述雙酚類污染物的濃度為20ppm的乙腈溶液，色譜以乙腈為流動相，流動相流速為1mL/min，柱溫為25℃，檢測波長為220nm，每次手動進樣各20μL上述乙腈溶液中的一種到印跡柱及非印跡柱，通過色譜評價分別獲得分析物在印跡柱和非印跡柱上的保留時間(t_R)，利用丙酮代替上述色譜步驟中的雙酚類污染物乙腈溶液，得到印跡柱及非印跡柱的死時間t₀。通過容量因子計算公式k＝(t_R-t₀)/t₀計算分析物在印跡柱(k_MIPMS)和非印跡柱(k_NIPMS)上的容量因子。利用印跡因子計算公式IF＝k_MIPMS/k_NIPMS計算雙酚A印跡皮克林乳液聚合物微球對15種分析物的印跡因子。結果如圖4所示。

通過評價發(fā)現(xiàn)，所發(fā)明印跡材料對八種雙酚類污染物(BPA、BPF、BPB、BPE、BPAF、BPS、BPAP、BPZ)的印跡因子明顯高于其對TBBPA以及六種其他物質(E1、E2、DNS、DES、OP和NP)的印跡因子。由于TBBPA分子結構中有四個溴原子，使得其分子大小明顯大于印跡位點的空穴。因此印跡材料對TBBPA表現(xiàn)出了很低的印跡因子(1.102)。上述結果表明所發(fā)明印跡材料對八種雙酚類污染物具有良好的類選擇性。