本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增方法及體系。

背景技術(shù)：

解旋酶依賴擴(kuò)增(HDA)(Vincent等.(2004)，EMBO reports 5(8)：795-800)是一種在體外模擬復(fù)制叉，并在恒溫條件下進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增的方法。該方法的具體原理是：在ATP提供能量的情況下，解旋酶使得雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA，然后在單鏈結(jié)合蛋白的作用下，使得所形成的單鏈DNA穩(wěn)定在單鏈狀態(tài)，特異引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)，并在DNA聚合酶的作用下合成新鏈，或者利用耐熱的解旋酶，在較高溫度，且沒有單鏈結(jié)合蛋白的情況下，使得雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA，進(jìn)行新鏈的合成。

由于具有能在恒溫條件下進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增的能力，HDA不依賴較復(fù)雜的熱循環(huán)儀器，較適合在病人醫(yī)療點(diǎn)旁邊、小診所、藥店、或其它緊急事件現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)，即所謂即時(shí)檢驗(yàn)(point-of-care testing)。但是，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)條件或?qū)嶒?yàn)設(shè)備有限，往往缺乏保溫設(shè)施為反應(yīng)前的體系組合物提供低溫條件，HDA試劑需要在常溫條件下放置一段時(shí)間，而普通的DNA聚合酶在常溫條件下仍具有較高活性，這可能會(huì)導(dǎo)致引物二聚體或錯(cuò)配，從而影響最終HDA擴(kuò)增的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增方法，利用冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增，從而有效地避免或降低擴(kuò)增前常溫放置所帶來的負(fù)面影響。

本發(fā)明解決的技術(shù)問題還在于提供一種熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增方法，利用冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增，并結(jié) 合耐熱解旋酶的使用，克服了實(shí)驗(yàn)條件的限制，提高HDA擴(kuò)增的效率。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明實(shí)施例提供的熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增方法，利用冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增。

優(yōu)選地，所述冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶為N端缺失了280個(gè)氨基酸殘基的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶的突變型。

其中，所述冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶為第626個(gè)氨基酸殘基由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，或?07個(gè)氨基酸殘基由異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?，或前述兩種突變同時(shí)存在的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶。

本發(fā)明所采用的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，在較低溫度或者常溫條件下，其DNA聚合活性降到非常低的水平，只有當(dāng)溫度恢復(fù)到較高溫度時(shí)(熱啟動(dòng))，酶的活性才能恢復(fù)，利用冷敏感的DNA聚合酶進(jìn)行HDA擴(kuò)增，可以避免或降低擴(kuò)增前常溫放置帶來的負(fù)面影響，提高HDA擴(kuò)增的效率。需要說明的是，本發(fā)明的方案中，水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶野生型如Seq.NO.1所示，本發(fā)明所用到水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶為N端缺失了280個(gè)氨基酸殘基的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶(Seq.NO.2)的突變型，具體為第626個(gè)氨基酸殘基由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?Seq.NO.3)，或第707個(gè)氨基酸殘基由異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?Seq.NO.4)，或前述兩種突變同時(shí)存在的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶(Seq.NO.5)。

優(yōu)選地，該方法中所用解旋酶為耐熱解旋酶。更優(yōu)地，解旋酶為水生棲熱菌來源的UvrD。本發(fā)明的方法利用冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增，并結(jié)合耐熱解旋酶的使用，將反應(yīng)溫度維持在DNA雙鏈的解鏈狀態(tài)，無需單鏈結(jié)合蛋白，即可使得雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA，進(jìn)行新鏈的合成，從而克服了實(shí)驗(yàn)條件的限制，提高HDA擴(kuò)增的效率。

另外，本發(fā)明還提供了熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增體系，該體系包含冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶。

優(yōu)選地，所述冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶為N端缺失了280個(gè)氨基酸殘基的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶突變型。

優(yōu)選地，所述冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶為第626個(gè)氨基酸殘基由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔虻?07個(gè)氨基酸殘基由異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?，或前述兩種突變同時(shí)存在的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶。

優(yōu)選地，該熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增體系還包含：

耐熱解旋酶，ATP，

dATP，dTTP，dGTP，dCTP，

Tris，

硫酸鎂和/或氯化鎂，

氯化鈉和/或氯化鉀。

優(yōu)選地，解旋酶為水生棲熱菌來源的UvrD。

本發(fā)明實(shí)施例提供的熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增方法及其擴(kuò)增體系，具有如下有益效果：

本發(fā)明實(shí)施例提供的熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增方法，利用冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增。該水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，在較低溫度或者常溫條件下，其DNA聚合活性降到非常低的水平，只有當(dāng)溫度恢復(fù)到較高溫度時(shí)(熱啟動(dòng))，酶的活性才能恢復(fù)，利用冷敏感的DNA聚合酶進(jìn)行HDA擴(kuò)增，可以避免或降低擴(kuò)增前常溫放置帶來的負(fù)面影響，提高HDA擴(kuò)增的效率。本發(fā)明的方法利用冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增，并結(jié)合耐熱解旋酶的使用，將反應(yīng)溫度維持在DNA雙鏈的解鏈狀態(tài)，無需單鏈結(jié)合蛋白，即可使得雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA，進(jìn)行新鏈的合成，從而克服了實(shí)驗(yàn)條件的限制，提高HDA擴(kuò)增的效率。

附圖說明

圖1示出了實(shí)施例1熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。其中第1、3條帶為100拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第2、4條帶1000拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第1、2條帶為擴(kuò)增前25℃處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第3、4條帶為擴(kuò)增前冰上處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第5條帶為雙鏈DNA Marker。

圖2示出了實(shí)施例2熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。從左到右依次為1-5條帶，其中第1、3條帶為100拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第2、4條帶1000拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第1、2條帶為擴(kuò)增前25℃處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第3、4條帶為擴(kuò)增前冰上處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第5條帶為雙鏈DNA Marker。

圖3示出了實(shí)施例3熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。從左到右依次為1-5條帶，其中第1、3條帶為100拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第2、4條帶1000拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第1、2條帶為擴(kuò)增前25℃處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第3、4條帶為擴(kuò)增前冰上處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第5條帶為雙鏈DNA Marker。

圖4示出了參比實(shí)施例1非熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。從右到左依次為1-5條帶，其中第1、3條帶為100拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第2、4條帶1000拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第1、2條帶為擴(kuò)增前25℃處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第3、4條帶為擴(kuò)增前冰上處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第5條帶為雙鏈DNA Marker。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例提供的熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增方法，利用冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增。

其中，所述冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶為N端缺失了280個(gè)氨基酸殘基的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶的突變型。

其中，所述冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶為第626個(gè)氨基酸殘基由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，或?07個(gè)氨基酸殘基由異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?，或前述兩種突變同時(shí)存在的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶。

本發(fā)明所采用的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，在較低溫度或者常溫條件下，其DNA聚合活性降到非常低的水平，只有當(dāng)溫度恢復(fù)到較高溫度時(shí)(熱啟動(dòng))，酶的活性才能恢復(fù)，利用冷敏感的DNA聚合酶進(jìn)行HDA擴(kuò)增，可以避免或降低擴(kuò)增前常溫放置帶來的負(fù)面影響，提高HDA擴(kuò)增的效率。需要說明的是， 本發(fā)明的方案中，水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶野生型如Seq.NO.1所示，本發(fā)明所用到水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶為N端缺失了280個(gè)氨基酸殘基的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶(Seq.NO.2)的突變型，具體為第626個(gè)氨基酸殘基由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?Seq.NO.3)，或第707個(gè)氨基酸殘基由異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?Seq.NO.4)，或前述兩種突變同時(shí)存在的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶(Seq.NO.5)。

其中，該方法中所用解旋酶為耐熱解旋酶。更優(yōu)地，解旋酶為水生棲熱菌來源的UvrD。本發(fā)明的方法利用冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶，對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增，并結(jié)合耐熱解旋酶的使用，將反應(yīng)溫度維持在DNA雙鏈的解鏈狀態(tài)，無需單鏈結(jié)合蛋白，即可使得雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA，進(jìn)行新鏈的合成，從而克服了實(shí)驗(yàn)條件的限制，提高HDA擴(kuò)增的效率。

另外，本發(fā)明還提供了熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增體系，該體系包含冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶。

其中，所述冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶為N端缺失了280個(gè)氨基酸殘基的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶突變型。

其中，所述冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶為第626個(gè)氨基酸殘基由谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，或?07個(gè)氨基酸殘基由異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼幔蚯笆鰞煞N突變同時(shí)存在的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶。

該熱啟動(dòng)解旋酶依賴擴(kuò)增體系還包含：

耐熱解旋酶，ATP，

dATP，dTTP，dGTP，dCTP，

Tris，

硫酸鎂和/或氯化鎂，

氯化鈉和/或氯化鉀。

優(yōu)選地，解旋酶為水生棲熱菌來源的UvrD。

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是 全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)施手冊(cè)中所述的條件。

實(shí)施例1：本發(fā)明方法和體系對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增。

在本實(shí)施例中，使用本發(fā)明方法對(duì)含金黃色葡萄球菌基因組的FemA基因序列5’-tggtgccttt acagatagca tgccatacag tcatttcacg caaactgttg gccactatga gttaaagctt gctgaaggtt atgaaacaca tttagtggga ataaaaaaca ataataacga ggtcattgca gctt-3’(Seq.NO.6)的pMD-18T質(zhì)粒(購自大連寶生物公司)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)施例2、3和比較例一種也采用相同的模板。

(1)引物序列

上游引物序列：5'-TGGTGCCTTTACAGATAG-3'(Seq.NO.7)

下游引物序列：5'-AAGCTGCAATGACCTCGT-3'(Seq.NO.8)

(2)質(zhì)粒DNA模板的準(zhǔn)備

紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒的濃度，根據(jù)質(zhì)粒DNA的分子量，計(jì)算得每微升溶液中質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)，用TE緩沖液(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，pH7.5)稀釋至每微升溶液含109拷貝質(zhì)粒DNA，然后用TE緩沖液10倍梯度稀釋，連續(xù)稀釋7個(gè)梯度。

(3)HDA反應(yīng)體系

-5U冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶(Seq.NO.3)，

-6mmol/l MgSO4，

-50mmol/l KCl，

-30mmol/l Tris-HCl(pH8.8)，

-0.1％Triton X-100(v/v)，

-0.8mmol/l dNTPs，

-10μmol/l引物，

-1.5mmol/l ATP，

-Taq UvrD解旋酶，

-1μl質(zhì)粒DNA模板，

-反應(yīng)液總體積25μl。

(4)HDA反應(yīng)

HDA反應(yīng)試劑準(zhǔn)備完成后，按如下說明加入上述步驟(3)中所描述的模板量：

A組：

A1為100拷貝質(zhì)粒DNA，

A2為1000拷貝質(zhì)粒DNA，

將A組包括試劑于冰上放置10分鐘再進(jìn)行HDA反應(yīng)試劑。

B組：

B1為100拷貝質(zhì)粒DNA，

B2為1000拷貝質(zhì)粒DNA，

將A組包括試劑于25℃放置10分鐘再進(jìn)行HDA反應(yīng)。

HDA反應(yīng)為65℃恒溫金屬浴中保溫1小時(shí)。

(5)瓊脂糖凝膠電泳分析

1％瓊脂糖凝膠于1×TAE緩沖液中，在4v/cm場(chǎng)強(qiáng)條件下對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，電泳結(jié)束后用4×SYBR GreenⅠ染料染色20分鐘，然后觀察電泳結(jié)果如圖1所示。其中第1、3條帶為100拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第2、4條帶1000拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第1、2條帶為擴(kuò)增前25℃處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第3、4條帶為擴(kuò)增前冰上處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第5條帶為雙鏈DNA Marker。從圖中可以看出，在常溫下放置反應(yīng)體系一段時(shí)間，并不會(huì)有明顯的負(fù)面影響。

實(shí)施例2：本發(fā)明方法和體系對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增。

(1)引物序列

上游引物序列：5'-TGGTGCCTTTACAGATAG-3'(Seq.NO.7)

下游引物序列：5'-AAGCTGCAATGACCTCGT-3'(Seq.NO.8)

(2)質(zhì)粒DNA模板的準(zhǔn)備

紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒的濃度，根據(jù)質(zhì)粒DNA的分子量，計(jì)算得每微升溶液中質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)，用TE緩沖液(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，pH7.5)稀釋至每微升溶液含109拷貝質(zhì)粒DNA，然后用TE緩沖液10倍梯度稀釋，連續(xù)稀釋7個(gè)梯度。

(3)HDA反應(yīng)體系

-5U冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶(Seq.NO.4)，

-6mmol/l MgSO4，

-50mmol/l KCl，

-30mmol/l Tris-HCl(pH8.8)，

-0.1％Triton X-100(v/v)，

-0.8mmol/l dNTPs，

-10μmol/l引物，

-1.5mmol/l ATP，

-Taq UvrD解旋酶，

-1μl質(zhì)粒DNA模板，

-反應(yīng)液總體積25μl。

(4)HDA反應(yīng)

HDA反應(yīng)試劑準(zhǔn)備完成后，按如下說明加入上述步驟(3)中所描述的模板量：

A組：

A1為100拷貝質(zhì)粒DNA，

A2為1000拷貝質(zhì)粒DNA，

將A組包括試劑于冰上放置10分鐘再進(jìn)行HDA反應(yīng)試劑。

B組：

B1為100拷貝質(zhì)粒DNA，

B2為1000拷貝質(zhì)粒DNA，

將A組包括試劑于25℃放置10分鐘再進(jìn)行HDA反應(yīng)。

HDA反應(yīng)為65℃恒溫金屬浴中保溫1小時(shí)。

(5)瓊脂糖凝膠電泳分析

1％瓊脂糖凝膠于1×TAE緩沖液中，在4v/cm場(chǎng)強(qiáng)條件下對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，電泳結(jié)束后用4×SYBR GreenⅠ染料染色20分鐘，然后觀察電泳結(jié)果如圖2所示。其中第1、3條帶為100拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第2、4條帶1000拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第1、2條帶為擴(kuò)增前25℃處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第3、4條帶為擴(kuò)增前冰上處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第5條帶為雙鏈DNA Marker。從圖中可以看出，在常溫下放置反應(yīng)體系一段時(shí)間，并不會(huì)有明顯的負(fù)面影響。

實(shí)施例3：本發(fā)明方法和體系對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增。

(1)引物序列

上游引物序列：5'-TGGTGCCTTTACAGATAG-3'(Seq.NO.7)

下游引物序列：5'-AAGCTGCAATGACCTCGT-3'(Seq.NO.8)

(2)質(zhì)粒DNA模板的準(zhǔn)備

紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒的濃度，根據(jù)質(zhì)粒DNA的分子量，計(jì)算得每微升溶液中質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)，用TE緩沖液(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，pH7.5)稀釋至每微升溶液含109拷貝質(zhì)粒DNA，然后用TE緩沖液10倍梯度稀釋，連續(xù)稀釋7個(gè)梯度。

(3)HDA反應(yīng)體系

-5U冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶(Seq.NO.5)，

-6mmol/l MgSO4，

-50mmol/l KCl，

-30mmol/l Tris-HCl(pH8.8)，

-0.1％Triton X-100(v/v)，

-0.8mmol/l dNTPs，

-10μmol/l引物，

-1.5mmol/l ATP，

-Taq UvrD解旋酶，

-1μl質(zhì)粒DNA模板，

-反應(yīng)液總體積25μl。

(4)HDA反應(yīng)

HDA反應(yīng)試劑準(zhǔn)備完成后，按如下說明加入上述步驟(3)中所描述的模板量：

A組：

A1為100拷貝質(zhì)粒DNA，

A2為1000拷貝質(zhì)粒DNA，

將A組包括試劑于冰上放置10分鐘再進(jìn)行HDA反應(yīng)試劑。

B組：

B1為100拷貝質(zhì)粒DNA，

B2為1000拷貝質(zhì)粒DNA，

將A組包括試劑于25℃放置10分鐘再進(jìn)行HDA反應(yīng)。

HDA反應(yīng)為65℃恒溫金屬浴中保溫1小時(shí)。

(5)瓊脂糖凝膠電泳分析

1％瓊脂糖凝膠于1×TAE緩沖液中，在4v/cm場(chǎng)強(qiáng)條件下對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，電泳結(jié)束后用4×SYBR GreenⅠ染料染色20分鐘，然后觀察電泳結(jié)果如圖2所示。其中第1、3條帶為100拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第2、4條帶1000拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第1、2條帶為擴(kuò)增前25℃處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第3、4條帶為擴(kuò)增前冰上處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第5條帶為雙鏈DNA Marker。從圖中可以看出，在常溫下放置反應(yīng)體系一段時(shí)間，并不會(huì)有明顯的負(fù)面影響。

比較例1：利用水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶大片段進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增。

在本比較例中，使用非冷敏感型水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶(Seq.NO.2)進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增。也還是對(duì)含金黃色葡萄球菌基因組的FemA基因序列5’-tggtgccttt acagatagca tgccatacag tcatttcacg caaactgttg gccactatga gttaaagctt gctgaaggtt atgaaacaca tttagtggga ataaaaaaca ataataacga ggtcattgca gctt-3’(Seq.NO.6)的pMD-18T質(zhì)粒(購自大連寶生物公司)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

(1)引物序列

上游引物序列：5'-TGGTGCCTTTACAGATAG-3'(Seq.NO.7)

下游引物序列：5'-AAGCTGCAATGACCTCGT-3'(Seq.NO.8)

(2)質(zhì)粒DNA模板的準(zhǔn)備

紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒的濃度，根據(jù)質(zhì)粒DNA的分子量，計(jì)算得每微升溶液中質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)，用TE緩沖液(10mmol/l Tris-HCl，1mmol/l EDTA，pH7.5)稀釋至每微升溶液含109拷貝質(zhì)粒DNA，然后用TE緩沖液10倍梯度稀釋，連續(xù)稀釋7個(gè)梯度。

(3)HDA反應(yīng)體系

-非冷敏感的水生棲熱菌Ⅰ類DNA聚合酶(Seq.NO.2)，

-6mmol/l MgSO4，

-50mmol/l KCl，

-30mmol/l Tris-HCl(pH8.8)，

-0.1％Triton X-100(v/v)，

-0.8mmol/l dNTPs，

-10μmol/l引物，

-1.5mmol/l ATP，

-Taq UvrD解旋酶，

-1μl質(zhì)粒DNA模板，

-反應(yīng)液總體積25μl。

(4)HDA反應(yīng)

HDA反應(yīng)試劑準(zhǔn)備完成后，按如下說明加入上述步驟(3)中所描述的模板量：

A組：

A1為100拷貝質(zhì)粒DNA，

A2為1000拷貝質(zhì)粒DNA，

將A組包括試劑于冰上放置10分鐘再進(jìn)行HDA反應(yīng)試劑。

B組：

B1為100拷貝質(zhì)粒DNA，

B2為1000拷貝質(zhì)粒DNA，

將A組包括試劑于25℃放置10分鐘再進(jìn)行HDA反應(yīng)。

HDA反應(yīng)為65℃恒溫金屬浴中保溫1小時(shí)。

(5)瓊脂糖凝膠電泳分析

1％瓊脂糖凝膠于1×TAE緩沖液中，在4v/cm場(chǎng)強(qiáng)條件下對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，電泳結(jié)束后用4×SYBR GreenⅠ染料染色20分鐘，然后觀察電泳結(jié)果如圖2所示。其中第1、3條帶為100拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第2、4條帶1000拷貝質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，第1、2條帶為擴(kuò)增前25℃處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第3、4條帶為擴(kuò)增前冰上處理的試劑擴(kuò)增產(chǎn)物，第5條帶為雙鏈DNA Marker。從圖中可以看出，在常溫下放置反應(yīng)體系一段時(shí)間，會(huì)有明顯的負(fù)面影響。結(jié)合上述實(shí)施例1-3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，采用本發(fā)明的方法和體系對(duì)核酸模板進(jìn)行解旋酶依賴擴(kuò)增，從而有效地避免或降低擴(kuò)增前常溫放置所帶來的負(fù)面影響。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。