本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
中一種水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻是重要的糧食作物，為世界上大約一半的人口提供主食。提高水稻產(chǎn)量的研究一直是作物遺傳育種的主要目標(biāo)。水稻產(chǎn)量主要是由單位面積有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重三個(gè)因素所決定的，在穗數(shù)不變的前提下，增加每穗粒數(shù)能夠較大程度地提高水稻的產(chǎn)量。稻穗的形成過程是一個(gè)涉及腋生分生組織發(fā)育、花序結(jié)構(gòu)建成和籽粒發(fā)育的復(fù)雜生理生化過程，是眾多基因參與調(diào)控的一個(gè)復(fù)雜有序的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。然而在水稻花序結(jié)構(gòu)形成之后到開花之前，穗頂部已經(jīng)形成的小花容易發(fā)生退化，造成單個(gè)穗子實(shí)粒數(shù)減少，單株產(chǎn)量嚴(yán)重降低，這種在水稻育種和生產(chǎn)上普遍存在的現(xiàn)象即為水稻穗頂部小花退化現(xiàn)象。近年來，一些在水稻穗發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)控作用的重要基因陸續(xù)被克隆和研究，然而，水稻穗頂部退化性狀的遺傳和分子研究很少，而且退化的程度極易受環(huán)境條件的影響，從而增加了研究的難度。因此，深入研究穗頂部小穗退化現(xiàn)象的遺傳和分子機(jī)理，克隆鑒定引起穗頂部退化相關(guān)的功能基因，不僅能了解水稻穗頂部生長發(fā)育這一重要的生物學(xué)過程，同時(shí)也對分子遺傳改良提高水稻的產(chǎn)量的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)的蛋白及其編碼基因。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1在調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白，名稱為OsPAA1，來源于稻屬水稻(Oryzasativa)的正常穗型品種Kita-ake的氨基酸序列，在調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育中的應(yīng)用中，所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1為a)或b)或c)：a)氨基酸序列是SEQIDNo.1所示的蛋白質(zhì)；b)在SEQIDNo.1所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將SEQIDNo.1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。所述調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育可為調(diào)控水稻穗頂部小花發(fā)育。其中，SEQIDNo.1由488個(gè)氨基酸殘基組成。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在SEQIDNo.1所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的OsPAA1蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的OsPAA1蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)中的OsPAA1蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將SEQIDNo.2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1相關(guān)的生物材料在調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1相關(guān)的生物材料在調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育中的應(yīng)用中，與所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1相關(guān)的生物材料，為下述A1)至A20)中的任一種：A1)核酸分子1；所述核酸分子1為編碼所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子1的表達(dá)盒；A3)含有A1)所述核酸分子1的重組載體；A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子1的重組微生物；A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子1的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A13)含有A1)所述核酸分子1的轉(zhuǎn)基因植物組織；A14)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；A15)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；A16)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；A17)含有A1)所述核酸分子1的轉(zhuǎn)基因植物器官；A18)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；A19)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官；A20)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1相關(guān)的生物材料在調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育中的應(yīng)用或在培育水稻穗頂部退化的轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1相關(guān)的生物材料在調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育中的應(yīng)用或在培育水稻穗頂部退化的轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用中，與所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1相關(guān)的生物材料為下述B1)至B20)中的任一種：B1)核酸分子2；所述核酸分子2為降低所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因表達(dá)的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子2的表達(dá)盒；B3)含有B1)所述核酸分子2的重組載體；B4)含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；B5)含有B1)所述核酸分子2的重組微生物；B6)含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物；B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；B9)含有B1)所述核酸分子2的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；B10)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；B11)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；B12)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；B13)含有B1)所述核酸分子2的轉(zhuǎn)基因植物組織；B14)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；B15)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；B16)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；B17)含有B1)所述核酸分子2的轉(zhuǎn)基因植物器官；B18)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；B19)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官；B20)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。上文中，所述調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育可為調(diào)控水稻穗頂部小花發(fā)育。上述與所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1相關(guān)的生物材料在調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育中的應(yīng)用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述應(yīng)用中，所述核酸分子1為如下1)-5)中任一所示的基因：1)其編碼序列是SEQIDNo.2的cDNA分子或DNA分子；2)序列是SEQIDNo.3的cDNA分子或DNA分子；3)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的cDNA分子或基因組DNA分子；4)與2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的cDNA分子或基因組DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的cDNA分子或基因組DNA分子。上述用于編碼所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的核酸分子，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對本發(fā)明的編碼所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的核酸分子的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，與本發(fā)明分離得到的編碼所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的核酸分子的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且編碼所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的SEQIDNo.2的第1-1467位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；與本發(fā)明的SEQIDNo.3的第1-3342位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評 價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。其中，SEQIDNo.2由1467個(gè)核苷酸組成，其編碼序列是第1-1467位，編碼SEQIDNo.1所示的蛋白質(zhì)。上述與所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1相關(guān)的生物材料在調(diào)控水稻穗頂部生長發(fā)育中的應(yīng)用或在培育水稻穗頂部退化的轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述應(yīng)用中，所述核酸分子2如下式I所示的DNA片段：SEQ正向-X-SEQ反向(I)；所述SEQ正向是SEQIDNo.2中的第1-423位的核苷酸序列；所述SEQ反向的序列與所述SEQ正向的序列反向互補(bǔ)；所述X是所述SEQ正向與所述SEQ反向之間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互補(bǔ)。所述式I所示的DNA片段的核苷酸序列為SEQIDNo.4，SEQIDNo.4中第1-423位的核苷酸序列為SEQIDNo.2中的第1-423位的核苷酸序列，第429-1616位的核苷酸序列為ArabidopsisFAD2intron的核苷酸序列，第1623-2045位的核苷酸序列為SEQIDNo.2中的第1-423位的核苷酸序列反向互補(bǔ)的核苷酸序列。上述與所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1相關(guān)的生物材料中，所述表達(dá)盒是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的終止子，如A2)所述的含有編碼所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的核酸分子的表達(dá)盒，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的DNA。上述與所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1相關(guān)的生物材料中，所述表達(dá)盒是指能夠抑制宿主細(xì)胞中相應(yīng)蛋白的編碼基因表達(dá)的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的終止子，如B2)所述的含有降低所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因表達(dá)的核酸分子的表達(dá)盒，是指能夠在宿主細(xì)胞中抑制所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因表達(dá)的DNA。進(jìn)一步，A2)所述表達(dá)盒或B2)所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子T7lac、花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子CaMV35S、番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亞基(Smallsubunitofribulose-1,5-bisphospatecarboxylase,rbcs)基因啟動(dòng)子；來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol.120:979-992)；來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸曱酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國專利5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國專利5，057,422)；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128(CN101063139B(中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動(dòng)子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053))。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：T7終止子、根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(NOS終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcSE9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：Odell等(1985)，Nature，313:810；Rosenberg等(1987)，Gene,56:125；Guerineau等(1991)，Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)，Cell,64:671；Sanfacon等，GenesDev.，5:141；Mogen等(1990)，PlantCell,2:1261；Munroe等(1990)，Gene，91:151；Ballad等(1989)，NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等(1987)，NucleicAcidRes.,15:9627)?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述OsPAA1基因表達(dá)盒的重組載體，如pET-28a、pCAMBIA2301、pSP72、pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等?？捎矛F(xiàn)有的RNA干擾載體構(gòu)建含有降低所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因表達(dá)的DNA分子的表達(dá)盒的重組載體，如pLHRNAi。OsPAA1基因載體或降低所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因表達(dá)的基因載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的OsPAA1基因或降低所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因表達(dá)的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。 為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptII基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。A3)或A4)所述重組載體可含有SEQIDNo.2的第1-1467位所示的用于編碼水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的DNA序列。B3)或B4)所述重組載體可含有SEQIDNo.4所示的降低所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因表達(dá)的DNA序列。上述生物材料中，A5)-A8)中任一所述重組微生物或B5)-B8)中任一所述重組微生物具體可為細(xì)菌,酵母,藻和真菌。其中，細(xì)菌可來自埃希氏菌屬(Escherichia),歐文氏菌(Erwinia),根癌農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium),產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes),假單胞菌屬(Pseudomonas),芽胞桿菌屬(Bacillus)等。A9)-A12)中任一所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，A13)-A16)中任一所述的轉(zhuǎn)基因植物組織，A17)-A20)中任一所述的轉(zhuǎn)基因植物器官，B9)-B12)中任一所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，B13)-B16)中任一所述的轉(zhuǎn)基因植物組織和B17)-B20)中任一所述的轉(zhuǎn)基因植物器官不包括植物的繁殖材料。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種培育水稻穗頂部退化的轉(zhuǎn)基因水稻的方法。本發(fā)明所提供的一種培育水稻穗頂部退化的轉(zhuǎn)基因水稻的方法，是抑制受體水稻中所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因的表達(dá)，得到穗頂部退化的轉(zhuǎn)基因水稻。上述方法中，所述抑制受體水稻中所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因的表達(dá)具體可為降低受體水稻中所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因的表達(dá)水平。上述方法中，所述水稻穗頂部退化體現(xiàn)為結(jié)實(shí)率降低。上述方法中，所述抑制受體水稻中所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因的表達(dá)是通過將如下式I所示的DNA片段導(dǎo)入受體水稻中實(shí)現(xiàn)的：SEQ正向-X-SEQ反向(I)；所述SEQ正向是SEQIDNo.2中的第1-423位的核苷酸序列；所述SEQ反向的序列與所述SEQ正向的序列反向互補(bǔ)；所述X是所述SEQ正向與所述SEQ反向之間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互補(bǔ)。上述方法中，所述式I所示的DNA片段的核苷酸序列為SEQIDNo.4。上述方法中，抑制受體水稻中所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因的表達(dá)可通過將RNA干擾載體導(dǎo)入到受體水稻中實(shí)現(xiàn)的，所述RNA干擾載體具體可為重組表達(dá)載體pLHRNAi-OsPAA1。重組表達(dá)載體pLHRNAi-OsPAA1是將表達(dá)載體pLHRNAi的SacI和SnaBI識別位點(diǎn)間的序列替換為SEQIDNo.4所示的DNA序列。所述重組表達(dá)載體pLHRNAi-OsPAA1可通過使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)、Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞或組織。所述方法還包括從導(dǎo)入SEQIDNo.4所示的DNA分子的受體水稻中篩選所述水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因的表達(dá)量降低的水稻，得到所述OsPAA1基因表達(dá)水平降低的轉(zhuǎn)基因水稻的步驟。上文中，所述轉(zhuǎn)基因水稻理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化受體水稻得到的第一代轉(zhuǎn)基因水稻，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因水稻，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因水稻包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。本發(fā)明所提供的所述核酸分子2也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。上文中，所述水稻具體可為Kita-ake。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的SEQIDNo.4所示的DNA分子(靶基因是OsPAA1基因)導(dǎo)入水稻中,獲得OsPAA1基因表達(dá)水平降低的RNAi干擾轉(zhuǎn)基因水稻的OsPAA1基因表達(dá)水平低于受體親本水稻，而且該RNAi干擾轉(zhuǎn)基因水稻出現(xiàn)了穗頂部退化的表型。本發(fā)明首次鑒定了與水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1，水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因在功能喪失或表達(dá)量下降的條件下會引起水稻穗頂部的小穗發(fā)生退化，證明水稻穗頂部生長發(fā)育相關(guān)蛋白或其基因在控制水稻穗頂部小花發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明不僅為進(jìn)一步闡明水稻穗頂部退化的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)，而且為水稻育種提供新的基因資源和育種資源。本發(fā)明獲得的OsPAA1基因表達(dá)降低的轉(zhuǎn)基因水稻，作為新的水稻種質(zhì)材料，可用于研究水稻穗頂部退化的分子機(jī)理和發(fā)現(xiàn)更多的調(diào)控水稻穗發(fā)育的基因。本發(fā)明對于通過遺傳育種和基因工程方法利用該基因資源有效地控制水稻穗頂部退化現(xiàn)象具有重要的應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為OsPAA1基因表達(dá)水平降低的RNAi干擾轉(zhuǎn)基因水稻的OsPAA1基因的轉(zhuǎn)錄水平的檢測。圖2為OsPAA1基因表達(dá)水平降低的RNAi干擾轉(zhuǎn)基因水稻的表型觀察。圖1和2中的WT代表受體親本Kita-ake植株，RNAi-1代表轉(zhuǎn)入重組載體pLHRNAi-OsPAA1的干擾陽性植株RNAi-1植株和RNAi-2代表轉(zhuǎn)入重組載體pLHRNAi-OsPAA1的干擾陽性植株RNAi-2植株。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的水稻Kita-ake(也稱為野生型水稻，簡稱WT)記載在如下文獻(xiàn)中，GaoH,ZhengXM,FeiG,ChenJ,JinM,RenY,WuW,ZhouK,ShengP,ZhouF,JiangL,WangJ,ZhangX,GuoX,WangJL,ChengZ,WuC,WangH,WanJM.Ehd4encodesanovelandOryza-genus-specificregulatorofphotoperiodicfloweringinrice.PLOSGENET.2013，9(2):e1003281)公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中所用表達(dá)載體pLHRNAi按照下述專利中的方法構(gòu)建：一種RNA干擾載體及其應(yīng)用，專利申請?zhí)枺?01110055864.X。公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌EHA105(AgrobacteriumtumefaciensEHA105)(NewAgrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants.Hood,ElizabethE；Gelvin,StantonB；Melchers,LeoS；Hoekema,Andre.Transgenicresearch,2(4):p.208-218(1993))公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。實(shí)施例1、抗退化相關(guān)蛋白OsPAA1的編碼基因OsPAA1的RNA干擾載體的構(gòu)建1、OsPAA1基因的獲得以水稻Kita-ake(Oryzasativavar.Kita-ake)的基因組DNA為模板，用如下引物primer1和primer2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因。其中的下劃線部分為In-Fusion酶連接用接頭。primer1：5'-ATCCTCTAGAGTCGACATGGACGCCGCCGCGAGGGAA-3'；primer2：5'-ATCCTCTAGAGTCGACTTAGACCTGTTCAGGGTGCTTC-3'。將PCR產(chǎn)物回收純化后連接入pBS-T(購買自北京Tiangen公司)測序載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆后，進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的長度為1.5Kb，序列如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，命名為OsPAA1基因。OsPAA1基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，將該蛋白命名為OsPAA1。2、OsPAA1基因干擾片段的獲得1)使用RNApreppure植物總RNA提取試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)提取水稻Kita-ake(Oryzasativa)的14天幼苗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。2)以步驟1)得到的cDNA為模板，用OsPAA1-sense-F和OsPAA1-sense-R組成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段1(SEQ正向)。OsPAA1-sense-F：5'-TTCTGCACTAGGTACCAGGCCTGATGGACGCCGCCGCGAGGG-3'；OsPAA1-sense-R：5'-CTGACGTAGGGGCGATAGAGCTCGTTCACGCCGAGCGCGAGCAG-3'。3)以步驟1)得到的cDNA為模板，用OsPAA1-antisense-F和OsPAA1-antisense-R組成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段2(SEQ反向)。OsPAA1-antisense-F:5'-CGGGGATCCGTCGACTACGTTCACGCCGAGCGCGAGCAG-3'；OsPAA1-antisense-R:5'-AGGTGGAAGACGCGTTACATGGACGCCGCCGCGAGGG-3'。3、OsPAA1基因RNA干擾載體(重組表達(dá)載體pLHRNAi-OsPAA1)的構(gòu)建1)用限制性內(nèi)切酶SacI酶切表達(dá)載體pLHRNAi，得到線性表達(dá)載體pLHRNAi，回收該線性片段。將步驟2的2)中得到的片段1采用同源重組定向克隆的方法整合到線性表達(dá)載體pLHRNAi上(具體方法參考clontechinfusionkit說明書)，得到同源重組產(chǎn)物1，再將同源重組產(chǎn)物1轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜，得到重組載體pLHRNAi-sense-OsPAA1。2)用限制性內(nèi)切酶SnaBI酶切重組載體pLHRNAi-sense-OsPAA1，得到了線性載體pLHRNAi-sense-OsPAA1，回收該線性載體。將步驟2的3)得到的片段2采用同源重組定向克隆的方法整合到線性載體pLHRNAi-sense-OsPAA1上(具體方法參考clontechinfusionkit說明書)，得到同源重組產(chǎn)物2，再將同源重組產(chǎn)物2轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜，得到重組載體pLHRNAi-OsPAA1。3)對重組載體pLHRNAi-OsPAA1進(jìn)行測序，結(jié)果表明該重組載體pLHRNAi-OsPAA1是在表達(dá)載體pLHRNAi的SacI酶切位點(diǎn)正向插入了SEQIDNo.2的自5’末端第1至423位核苷酸序列所示的雙鏈DNA片段，SnaBI酶切位點(diǎn)插入了與SEQIDNo.2自5’末端第1至423位核苷酸序列所示的雙鏈DNA片段反向互補(bǔ)的雙鏈DNA片段，即成功將pLHRNAi的SacI和SnaBI識別位點(diǎn)(識別序列)間的DNA序列替換為SEQIDNo.4所示的DNA序列。實(shí)施例2、培育OsPAA1基因表達(dá)水平降低的RNAi干擾轉(zhuǎn)基因植株及轉(zhuǎn)基因 植株的鑒定一、培育OsPAA1基因表達(dá)水平降低的RNAi干擾轉(zhuǎn)基因植株將重組載體pLHRNAi-OsPAA1通過根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化Kita-ake粳稻，具體方法如下：1、將實(shí)施例1得到的重組載體pLHRNAi-OsPAA1用熱激法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中得到含有重組載體pLHRNAi-OsPAA1的重組根癌農(nóng)桿菌EHA105。將含有重組載體pLHRNAi-OsPAA1的重組根癌農(nóng)桿菌EHA105在28℃培養(yǎng)16h，收集菌體。采用含有濃度為100μM乙酰丁香酮的N6液體培養(yǎng)基(Sigma，產(chǎn)品目錄號為C1416)將菌體進(jìn)行稀釋，得到稀釋菌液，稀釋菌液的OD600≈0.5。2、將培養(yǎng)至一個(gè)月的水稻成熟胚胚性愈傷組織與步驟1的稀釋菌液混合侵染30min，采用濾紙吸干菌液后轉(zhuǎn)入N6固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，在24℃共培養(yǎng)3d，得到共培養(yǎng)處理后的愈傷組織。3、將步驟2的共培養(yǎng)處理后的愈傷組織接種在含有質(zhì)量濃度為150mg/L潮霉素的N6固體篩選培養(yǎng)基(向N6固體培養(yǎng)基中加入潮霉素得到N6固體篩選培養(yǎng)基，N6固體篩選培養(yǎng)基中潮霉素的質(zhì)量濃度為150mg/L)上進(jìn)行第一次篩選。4、在第一次篩選開始的第16天挑取健康愈傷組織轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量濃度為200mg/L潮霉素的N6固體篩選培養(yǎng)基(向N6固體培養(yǎng)基中加入潮霉素得到N6固體篩選培養(yǎng)基，N6固體篩選培養(yǎng)基中潮霉素的質(zhì)量濃度為200mg/L)上進(jìn)行第二次篩選，每15天繼代一次，共繼代1次。5、挑取步驟4獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入含有質(zhì)量濃度為150mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上(分化培養(yǎng)基：6-BA2mg,NAA0.2mg,N64g,水解酪蛋白1g,肌醇0.1g，蔗糖25g,山梨醇2.4g,瓊脂粉7g，去離子水1L)進(jìn)行分化，在24℃培養(yǎng)45d(此時(shí)植株地上部分高度約為15cm),打開瓶口煉苗3天，然后移栽至溫室栽培，即為轉(zhuǎn)pLHRNAi-OsPAA1植株(T0代)。二、OsPAA1基因表達(dá)水平降低的RNAi干擾轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定提取步驟一獲得的轉(zhuǎn)pLHRNAi-OsPAA1植株的T0代幼苗和受體親本水稻Kita-ake植株的幼苗(簡稱為WT)的基因組DNA，并采用引物1390-F(5’-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3’)和引物FAD2-R(5’-GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3’)進(jìn)行PCR分子檢測鑒定陽性苗，得到562bpPCR產(chǎn)物的植株為陽性苗，取兩株陽性苗，分別命名為轉(zhuǎn)入pLHRNAi-OsPAA1植株RNAi-1(簡稱RNAi-1植株)和轉(zhuǎn)入pLHRNAi-OsPAA1植株RNAi-2(簡稱RNAi-2植株)。三、OsPAA1基因表達(dá)水平降低的RNAi干擾轉(zhuǎn)基因植株的OsPAA1基因表達(dá)水平的鑒定分別提取步驟二得到的RNAi-1植株、RNAi-2植株和受體親本水稻Kita-ake植株(簡稱為WT)葉片的RNA，設(shè)定內(nèi)參為Ubiquitin，利用內(nèi)參引物UBI-F和UBI-R，以及OsPAA1基因特異性定量引物OsPAA1-qRT-F和OsPAA1-qRT-R進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)來檢測不同轉(zhuǎn)基因干擾植株OsPAA1基因的表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明(圖1)，在轉(zhuǎn)入重組載體pLHRNAi-OsPAA1的干擾陽性植株RNAi-1植株和RNAi-2植株中OsPAA1基因的表達(dá)水平均比對照(WT)的OsPAA1基因的表達(dá)水平的顯著下降。上述引物如下：UBI-F：5’-GCTCCGTGGCGGTATCAT-3’UBI-R：5’-CGGCAGTTGACAGCCCTAG-3’OSPAA1-qRT-F：5’-GCCTTTGTCACGTTCCTCTC-3’OSPAA1-qRT-R:5’-CTGGGTTGACCTCTGCTCTC-3’四、OsPAA1基因表達(dá)水平降低的RNAi干擾轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定分別將步驟二得到的RNAi-1植株、RNAi-2植株和受體親本水稻Kita-ake植株(簡稱為WT)種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所昌平實(shí)驗(yàn)基地，觀察整個(gè)生長期內(nèi)RNAi-1植株、RNAi-2植株和受體親本水稻Kita-ake植株(簡稱為WT)的表型差異。觀察結(jié)果如圖2，與受體親本水稻Kita-ake植株相比，RNAi-1植株和RNAi-2植株均出現(xiàn)了穗頂部退化的表型，小花發(fā)育停滯，稻穗成熟之后逐漸干癟并脫落，從而證明了OsPAA1基因參與控制水稻穗頂部小花的生長發(fā)育，即該OsPAA1基因?yàn)樗舅腠敳靠雇嘶嚓P(guān)基因。當(dāng)前第1頁1 2 3